CN105339382A - 脱氢表雄酮及其中间体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及制备脱氢表雄酮(DHEA)的区域选择性和立体选择性方法和制备其中间体的方法。
Description
技术领域
本申请涉及制备脱氢表雄酮(DHEA)的区域选择性和立体选择性方法和制备其中间体的方法。
背景技术
脱氢表雄酮(DHEA)也被称作雄烯醇酮(androstenolone)或普拉睾酮或3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮或5-雄甾烯-3β-醇-17-酮,其为重要的内源性类固醇激素,并且具有式(I)的结构
脱氢表雄酮(DHEA)是合成甾体分子的关键中间体,所述甾体分子包括但不限于醋酸阿比特龙(其为用于去势抗性***癌的治疗的药物)。
J.BryanJones等人的文章″Steroidsandsteroidases.VI.OntheC-17specificityoftheΔ5-3-ketoisomeraseofPsudomonastestosteroneandevidenceforsubstratemicelleformation,″CandianJournalofChemistry,46,1459-1465(1968)描述了制备雄甾-5-烯-3,17-二酮的方法,雄甾-5-烯-3,17-二酮是用于制备DHEA的中间体。在所述参考文献中公开的方法包括在氮气氛下,于20℃下使雄甾-4-烯-3,17-二酮与叔丁醇钾在叔丁醇中反应90分钟,随后通过快速加入10%乙酸水溶液将反应物猝灭,加入过量的碳酸氢钠,用***萃取,在室温下蒸发,并由丙酮重结晶,以得到雄甾-5-烯-3,17-二酮。
然而,上述方法的缺点在于,其涉及使用较高量的碱,即10当量的叔丁醇钾,导致雄甾-5-烯-3,17-二酮的氧化杂质的形成,并具有可能不适于工业规模的后处理过程,从而导致低的和令人不满意的收率。
因此,仍然需要提供制备雄甾-5-烯-3,17-二酮的改进方法,所述方法以方便的方式消除和减少现有技术的缺陷。
第102212099号中国专利申请公布公开了从16-妊娠双烯醇酮醋酸酯开始制备脱氢表雄酮的多步骤方法,并涉及如在以下路线1中描述的反应步骤。
路线1
第102603841号中国专利申请公布公开了从4-雄甾烯-3,17-二酮制备脱氢表雄酮的多步骤方法,并涉及如在以下路线2中描述的反应步骤。
路线2
第102603839号中国专利申请公布记载了从16-妊娠双烯醇酮醋酸酯开始制备脱氢表雄酮的多步骤合成方法,其涉及(i)制备醋酸16-妊娠双烯醇酮肟,(ii)醋酸16-妊娠双烯醇酮肟通过Beckmann重排以得到脱氢表雄酮醋酸酯,(iii)水解脱氢表雄酮醋酸酯以得到脱氢表雄酮。所述方法的反应步骤描述于下面的路线3中。
路线3
第CN101362789和101717422号中国专利申请公布、第2004040555号韩国专利申请公布也公开了制备脱氢表雄酮的合成方法。
上述制备脱氢表雄酮的合成方法包括多个步骤,以及一系列保护/脱保护步骤以实现在C3位置上的立体和区域选择性还原,并且其可能不适于商业规模的合成。
Mamoli等人在US2186906中描述了将环戊并(cyclopentano)-10,13-二甲基多氢菲系列的酮化合物(Δ4,5-雄烯二酮)转化为相应的相同系列的羟基化合物(Δ4,5-雄甾烯醇(androstenole)-17-酮-3)的生物化学氢化方法,其包括使这样的酮化合物经历包含还原酵母的发酵溶液的作用。
Misaki等人在US4791057中描述了对要测定的样品中的组分(其为3β-羟基甾族化合物或3-酮甾族化合物)的高度敏感的定量测定方法,其涉及使样品中的该组分参与3β-羟基甾族化合物&3-酮甾族化合物的循环反应,并测量在包含3β-羟基甾族化合物氧化酶和/或3β-羟基甾族化合物脱氢酶的反应体系中可检测的变化。在所述循环反应中,3β-羟基甾族化合物氧化酶消耗O2并将3-羟基甾族化合物转化为3-酮甾族化合物,3β-羟基甾族化合物脱氢酶在还原型NAD(P)+存在下将3-酮甾族化合物转化为3-羟基甾族化合物并生成NAD(P)。在所述专利中描述的3β-羟基甾族化合物&3-酮甾族化合物的循环反应示意性地表示在以下路线4中:
路线4
虽然上述参考文献公开了3-羟基甾族化合物与3-酮甾族化合物相互之间的酶促转化,但是它们并没有公开制备脱氢表雄酮的方法,并且在研发在还原甾族化合物的3-氧代基而保持17-氧代基不变中表现所需的区域选择性以及在生成相应的3β-羟基化合物中表现立体选择性的改进方法中仍然存在复杂的挑战。
本申请的方法涉及制备脱氢表雄酮的酶促方法。本申请的酶促还原方法是环境友好的、成本经济的和商业上可行的。
发明概述
在一个方面中,本申请提供制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法,
其包括使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
在另一个方面中,本申请提供制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法,
其包括使用具有序列(Sequence)IDNo:1的酮还原酶还原式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基
在一个方面中,本申请提供制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮的方法,
其包括以下步骤:
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3,17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮;
b)由卤代烃将所述式(II)的化合物重结晶。
在另一方面中,本申请提供制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮的方法,
其包括以下步骤:
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3,17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮;
b)在抗氧化剂的存在下分离所述式(II)的化合物。
发明详述
在一个方面中,本申请提供制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法,
其包括使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
所述式(II)的化合物可以通过本领域已知的方法或者通过本申请中公开的方法获得。
所述式(II)的化合物的区域选择性和立体选择性还原是在酮还原酶的存在下进行,并且反应体系还包含辅因子、辅因子再生***、底物和脱氢酶、缓冲液以及有机溶剂。
如本文中所使用的“立体选择性地或立体选择性”是指在化学或酶促反应中一种立体异构体相对于另一种的优先形成。立体选择性可以是部分的,其中一种立体异构体的形成比另一种有利,或者其也可以是完全的,其中只有一种立体异构体形成。当所述立体异构体是对映体时,所述立体选择性被称为对映选择性(一种对映体占两者总和的分数(通常以百分比的形式报告))。在本领域中,通常将其报告为对映体过量(通常为百分比的形式),将其根据下式[主要对映体-次要对映体]/[主要对映体+次要对映体]计算。当所述立体异构体是非对映体时,所述立体选择性被称为非对映选择性(一种非对映体占其与其他异构体的总和的分数(通常以百分比的形式报告))。在本公开的上下文中,立体选择性是指式(I)的3β-羟基化合物(而不是式(I)的3α-羟基化合物)的分数(通常以百分比的形式报告)。
如本文中所使用的“区域选择性地或区域选择性”是指一个方向上的化学键的形成或断裂优先于所有其他可能的方向,或者一种产物的形成优先于另一种。在本公开的上下文中,区域选择性是指式(II)的化合物的3-氧代基的还原优先于17-氧代基或3-氧代基和17-氧代基二者的还原。在一个实施方案中,在本公开的上下文中的区域选择性是指以相当于式(II)的化合物的加入重量的大于90wt%,优选大于95wt%,更优选大于97wt%,更优选大于99wt%优先还原式(II)的化合物的3-氧代基。
所述“酮还原酶”是指催化酮或醛还原以形成相应的醇的酶。所述反应可在辅因子(NAD(P)+或NAD(P)H))的存在下,任选地在辅因子再循环***的帮助下进行。酮还原酶包括例如分类在EC号1.1.1下的那些酶。除了酮还原酶外,给予这样的酶多种名称,其包括但不限于醇脱氢酶、羰基还原酶、乳酸脱氢酶、羟酸脱氢酶、羟基异己酸脱氢酶、β-羟基丁酸脱氢酶、类固醇脱氢酶、山梨醇脱氢酶、羟基类固醇氧化酶、酮类固醇还原酶、醛酮还原酶(AKR)和醛还原酶。NADPH-依赖性酮还原酶被分类于EC号1.1.1.2下,并且CAS号为9028-12-0。NADH依赖性酮还原酶被分类于EC号1.1.1.1下,并且CAS号为9031-72-5。
所述酮还原酶可以是野生型或重组体酶,将其以全细胞或以分离/半纯化形式使用。优选地,将所述酮还原酶分离。可将所述酮还原酶从任意宿主分离,例如哺乳动物、丝状真菌、酵母和细菌。
在另一个实施方案中,酮还原酶包括从Sphingomonaswittichii(菌株RW1/DSM6014/JCM10273)A5VBG8)获得的酶。
在另一个实施方案中,用于上述立体选择性还原的酮还原酶包括但不限于具有与序列IDNO:1相对应的氨基酸序列的酶。如本文中所使用,具有序列IDNO:1的酶与序列IDNO:1相对应或与序列IDNO:1至少约80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
所述酮还原酶可以是具有序列IDNo.1的酶或其等同产品。如本文中所使用,术语“等同”是指具有相似至相同酶活性的酶或产品。
在一个实施方案中,酮还原酶包括辅因子依赖性酮还原酶。
根据本申请的方法,所述辅因子可以选自NADH、NADPH、NAD+、NADP+、其盐及其混合物。优选地,当所述酮还原酶是NADH依赖性时,所述辅因子选自NADH、NAD+、其盐及其混合物。更优选地,所述辅因子是NADH或其盐。优选地,当所述酮还原酶是NADPH依赖性时,所述辅因子选自NADPH、NADP+、其盐及其混合物。更优选地,所述辅因子是NADPH或其盐。所述辅因子的盐的实例包括NAD四(环己基铵)盐、NAD四钠盐、NAD+四钠水合物、NADP+磷酸盐水合物、NADP+磷酸钠盐和NADH二钾盐。
根据本申请的方法,所述辅因子再生***包含一组参与反应的反应物,并将所述辅因子的氧化形式还原(例如NADP+转化为NADPH)。通过式(II)的化合物的酮还原酶催化的还原氧化的辅因子被通过辅因子再生***再生为还原形式。例如,辅因子再生***包含底物,其为还原氢等同物的来源,并能够还原辅因子和催化剂(例如酶催化剂)的氧化形式,其通过还原剂催化辅因子的氧化形式的还原。
优选地,所述辅因子再生***包括底物/脱氢酶对,其选自D-葡萄糖/葡萄糖脱氢酶、甲酸钠/甲酸脱氢酶、乳酸/乳酸脱氢酶和亚磷酸盐/亚磷酸盐脱氢酶。
在一个实施方案中,使用D-葡萄糖/葡萄糖脱氢酶对。葡萄糖脱氢酶(GDH)包括例如被分类于EC号1.1.1.47下并市售可得的那些,例如购自Codexis,Inc.的目录号GDH-CDX-901下的。
例如,当使用葡萄糖/葡萄糖脱氢酶辅因子再生***时,如果所得的葡糖酸水溶液不被另外中和,共同产生的葡糖酸(pKa=3.6)会导致反应混合物的pH下降。可通过标准缓冲技术将反应混合物的pH维持在期望的水平,其中缓冲液以高至所提供的缓冲能力中和葡糖酸,或通过在转化过程中同时添加碱来中和葡糖酸。
所述还原反应可以在pH为约4至约9,更优选为约4至约8,更优选为约5至约8,最优选为约6至约8或者约5至约7的缓冲液的存在下进行。优选地,所述缓冲液是盐的溶液。优选地,所述盐选自磷酸钾或TRIS-盐、硫酸镁及其混合物。任选地,所述缓冲液包含硫醇化合物。
所述还原反应可在约10℃至约50℃的温度下进行。优选地,所述方法在环境温度下,在约20℃至约40℃或约25℃至约35℃的温度下进行。
所述还原反应可以在与水混溶或与与水不混溶的有机溶剂的存在下进行,并且所述溶剂可选自醇(如叔丁醇)、酯(如乙酸乙酯、乙酸异丙酯等)、醚(如四氢呋喃、甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚等)、芳族烃(如甲苯)以及极性非质子溶剂(如二甲基甲酰胺、二甲基亚砜等)。
在一个实施方案中,使用与水不混溶的有机溶剂。在一个优选的实施方案中,使用相对于水的比率为2-98%v/v,更优选为25-75%v/v的与水不混溶的有机溶剂。
在一个实施方案中,式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基的还原在底物(式II)浓度为0.1-500g/L,优选至少50-300g/L下进行。
在另一个实施方案中,式(II)的Δ5雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基的还原在具有序列IDNO:1的酮还原酶的存在下进行。
在另一个实施方案中,式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基的还原在相对于底物(即式(II))的0.1-20重量%,但优选少于相对于底物的10重量%的酶负载下进行。
在另一个实施方案中,式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基的还原在pH6.5并且离子强度为50mM的磷酸钾缓冲液的存在下进行。
在又一个实施方案中,式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基的还原在辅因子NAD+、NAD(P)+,包含葡萄糖和葡萄糖脱氢酶(GDH-CDX-901)的辅因子再生***的存在下进行。
在一个实施方案中,式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基的还原在选自乙酸乙酯、乙酸异丙酯、四氢呋喃、甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚、甲苯、二甲基甲酰胺或二甲基亚砜的有机溶剂的存在下进行。
在一个实施方案中,式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基的还原在约25℃至约35℃的温度下进行。
在一个优选的实施方案中,式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基的还原在序列IDNo.1酮还原酶的酶、pH6.5并且离子强度为50mM的磷酸钾缓冲液、辅因子NAD+、NAD(P)+,包含葡萄糖和葡萄糖脱氢酶(GDH-CDX-901)的辅因子再生***的存在下进行。
本申请的发明人惊奇地发现,本文中所描述的方法是高度区域特异性的(其选择性地还原式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基而不是17-氧代基),并且还是立体特异性的(其将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基选择性地还原,以生成相应的3β-羟基化合物)。
此外,本申请的方法是有益的,其是选择性的、绿色的、定量的并且避免使用保护/脱保护步骤,以及避免使用毒性氧化试剂,在温和条件(温度、pH)下、高底物浓度下进行,并且是得到DHEA及其衍生物的高效和直接的途径。
此外,本申请的方法是有益的,其提供80%至90%的收率,并且具有大于95%,优选大于99%,更优选99.5%的立体选择性程度。
在另一个方面中,本申请提供制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法,
其包括使用具有序列IDNo:1的酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基还原
使用具有序列IDNO:1的酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基还原的方法可以根据如上所述操作或根据实施例中描述的方法来进行。
在一个实施方案中,本申请提供方法,其包括将由如上述方法获得的式(I)的化合物转化为式(III)的化合物的步骤。
在另一个实施方案中,本申请提供制备式(III)的化合物的方法,
其包括以下步骤:
a)使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮;
b)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
可以通过本领域已知的方法或本申请中公开的方法将所述式(I)的化合物转化为所述式(III)的化合物。
在一个方面中,本申请提供制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮的方法,
其包括以下步骤:
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3,17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮;
b)由卤代烃将所述式(II)的化合物重结晶。
步骤a)的反应可在约10℃至约50℃的温度下进行。优选在约20℃至约40℃或约25℃至约35℃的温度下进行。
在一个实施方案中,反应完成后,将包含式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮的反应混合物使用乙酸(优选使用10%乙酸)淬灭,并使用无机碱(优选使用碳酸氢钠)将反应混合物的pH调节至约6.0至约7.5,并通过添加水分离所述式(II)的化合物。
本申请的发明人惊奇地发现,由卤代烃溶剂将所述式(II)的化合物重结晶使式(II)的化合物的收率和纯度更高。
可在步骤b)中使用的卤代烃可选自二氯甲烷、1,2-二氯乙烯、四氯化碳、氯仿、1,1,1-三氯乙烷或其混合物。
在另一方面中,本申请提供制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮的方法,
其包括以下步骤:
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3,17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮;
b)在抗氧化剂的存在下分离所述式(II)的化合物。
步骤a)的反应可以在约10℃至约50℃的温度下进行。优选在约20℃至约40℃或约25℃至约35℃的温度下进行。
本申请的发明人惊奇地发现,在抗氧化剂的存在下分离所述式(II)的化合物使式(II)的化合物的收率和纯度更高,并具有减少的或不可检测的量的在反应过程中形成的氧化杂质,并由此避免了额外的纯化。
在步骤b)中使用的抗氧化剂可以选自抗坏血酸、抗坏血酸钠、抗坏血酸钙、棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚、丁羟甲苯、2,4,5-三羟基苯丁酮、4-羟甲基-2,6-二叔丁基苯酚、异抗坏血酸、没食子酸丙酯、硫代二丙酸、硫代二丙酸二月桂酯、叔丁基氢醌、生育酚或其混合物。在一个实施方案中,使用抗坏血酸钠。
使用的抗氧化剂的量可以是催化量的,例如每摩尔当量的式(IV),约0.1至约0.5当量。
在一个实施方案中,可将步骤a)中获得的包含式(II)的化合物的反应混合物加入到含有乙酸、水和所选择的抗氧化剂的抗氧化剂混合物中。
在一个实施方案中,本申请提供制备式(III)的化合物的方法,
其包括以下步骤:
a)将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3,17-二酮异构化
以得到式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮;
b)使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原,以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮;
c)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
在另一个实施方案中,本申请提供制备式(III)的化合物的方法,
其包括以下步骤:
a)将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3,17-二酮异构化
以得到式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮;
b)使用具有序列IDNo:1的酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原,以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮;
c)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
乙酰化可使用本领域已知的方式进行。可以使用的乙酰化剂包括但不限于乙酰氯、乙酸酐、原甲酸甲酯或等同的乙酰化剂。可以使用的溶剂包括但不限于四氢呋喃、二氯甲烷、甲苯、氯仿、四氯化碳、乙腈、N,N-二甲基甲酰胺或其组合。可以使用的碱包括但不限于二异丙基胺、二甲胺、乙二胺、N,N-二异丙基甲基胺、4-二甲基氨基吡啶、N,N-二异丙基乙基胺、三乙胺、苯胺、吡啶、哌啶等;以及无机碱,如碱金属或碱土金属的碳酸盐、碳酸氢盐、氢氧化物和氧化物,例如碳酸钾、碳酸氢钾、氢氧化钾、乙酸钾、甲醇钾、碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、乙酸钠、甲醇钠、碳酸锂、碳酸氢锂、氢氧化锂、乙酸锂、甲醇锂、氢氧化钡、氧化钙等。
在一个实施方案中,可将上述获得的脱氢表雄酮进一步通过本领域已知的方法转化为醋酸阿比特龙和DHEA庚酸酯。
会参考以下实施例对本发明的某些具体方面和实施方案进行更详细地说明,提供所述实施例仅为了说明的目的,并且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实施例
实施例1:5-雄甾烯-3,17-二酮的制备
在25-30℃下,于氮气气氛下,将叔丁醇(75mL)装入圆底烧瓶中,并在氮气鼓泡下搅拌10分钟。装入叔丁醇钾(9.79g),并在30-35℃下,于氮气氛下搅拌10-15分钟。在30-35℃下,将4-雄甾烯-3,17-二酮(10.0g)装入圆底烧瓶中,并在相同温度下保持约90分钟。将乙酸(5.75g)、水(200mL)和抗坏血酸钠(3.5g)装入第二圆底烧瓶中,并在20-25℃下搅拌。将上述获得的反应混合物加入至第二圆底烧瓶中,并在20-25℃下搅拌约30分钟。将所获得的产物过滤,用水(100mL)洗涤并在真空下干燥。
收率:90.5%
HPLC纯度:93.6%
实施例2:5-雄甾烯-3,17-二酮的制备
在25-30℃下,于氮气气氛下,将叔丁醇(2000mL)装入圆底烧瓶中,并在氮气鼓泡下搅拌10分钟。装入叔丁醇钾(313.4g),并在35-40℃下,于氮气鼓泡下搅拌10-15分钟。在35-40℃下将4-雄甾烯-3,17-二酮(80.0g)装入圆底烧瓶中,并在相同温度下,于氮气鼓泡下搅拌反应混合物约90分钟。在20-25℃下将反应混合物与10%乙酸水溶液(3130mL)合并,并使用碳酸氢钠(200g)将反应混合物的pH调节至6.5-7.0。向上述反应混合物中加入水(2500mL),并搅拌约30分钟。过滤所获得的固体,用水(1000mL)洗涤并抽吸干燥。将所获得的产物在二氯甲烷(500mL)中溶解,分离水层,并将有机层在真空下完全蒸馏以得到5-雄甾烯-3,17-二酮。
收率:81.8%
HPLC纯度:92.30%
实施例3:5-雄甾烯-3,17-二酮的制备
在25-30℃下,于氮气气氛下,将叔丁醇(1500mL)装入圆底烧瓶中,并在氮气鼓泡下搅拌10分钟。装入叔丁醇钾(235g),并在35-40℃下,于氮气鼓泡下搅拌10-15分钟。在35-40℃下,于氮气氛下将4-雄甾烯-3,17-二酮(60.0g)装入圆底烧瓶中,并在相同温度下,于氮气鼓泡搅拌反应混合物约90分钟。在20-25℃下将反应混合物加入10%乙酸水溶液(2500mL),并搅拌10-15分钟。向上述反应混合物中加入水(1000mL),并搅拌约30分钟。用碳酸氢钠(135g)将反应混合物的pH调节至7.0-7.5。将反应混合物搅拌30-40分钟。过滤所获得的固体,用水(500mL)洗涤并抽吸干燥。将所获得的产物在二氯甲烷(1000mL)中溶解,并用无水硫酸钠(50g)处理。过滤内容物,并在40℃以下减压下完全蒸馏,以得到5-雄甾烯-3,17-二酮。
收率:83%
实施例4:脱氢表雄酮(DHEA)的制备
在具有顶部搅拌的50mL反应器中,将甲基四氢呋喃(20mL)中的5-雄甾烯-3,17-二酮(1.80g)加入到含有NAD+(0.1mg/mL)、NADP+(0.1mg/mL)、MgCl2六水合物(2mM,0.4mg/mL)、葡萄糖(100mM,18.75mg/mL)、葡萄糖脱氢酶GDHCDX-901(0.1mg/mL)以及序列IDNO:1的酶(54mg,3%wt/wt)的磷酸钾缓冲溶液(10mL,离子强度50mM,pH6.5)的混合物中。在约30-35℃下以1000rpm搅拌反应物。将反应物的pH使用碳酸氢钠维持在约6.5,并在约30-35℃下以1000rpm持续搅拌约4小时至约24小时。分离有机层。用乙酸乙酯(50mL)萃取水层。用MgSO4干燥合并的有机层,并蒸发至干燥,以得到脱氢表雄酮粗品(1.86g),定量NMR纯度为94.5%,并将其在未进一步纯化下于下一步中使用。1HNMR(CDCl3,400mHz)δ5.38(d,1H),3.50-3.58(m,1H),2.47(dd,1H),2.22-2.39(m,2H),2.04-2.12(m,2H),1.92-1.98(m,1H),1.83-1.89(m,3H),1.44-1.71(m,6H),1.22-1.29(m,2H),0.97-1.14(m,2H),1.04(s,3H),0.89(s,3H)。
实施例5:脱氢表雄酮(DHEA)的制备
在具有顶部搅拌的100mL反应器中,将甲基四氢呋喃(36mL)中的5-雄甾烯-3,17-二酮(3.59g)加入到含有NAD+(0.044mg/mL)、NADP+(0.044mg/mL)、MgCl2六水合物(5mM,1.67mg/mL)、葡萄糖(100mM,18.44mg/mL)、葡萄糖脱氢酶GDHCDX-901(0.26mg/mL)以及序列IDNO:1(100mg,2.8%wt/wt)的磷酸钾缓冲溶液(18mL,离子强度50mM,pH6.5)的混合物中。将反应物在约20-32℃下以1000rpm搅拌。将反应物的pH使用碳酸氢钠维持在约6.5,并在约20-32℃下以1000rpm持续搅拌约4小时至约24小时。将甲基四氢呋喃层真空蒸发,并将沉淀的产物通过过滤分离,并用50mL水洗涤两次,然后在真空下干燥以得到3.47g粗品,定量NMR效能(potency)79%。将0.50g所获得的粗品由乙酸乙酯/庚烷重结晶,以得到脱氢表雄酮。
产量:0.35g
纯度:>98%。
实施例6:醋酸脱氢表雄酮(DHEA醋酸酯)的制备
在25-30℃下,将脱氢表雄酮(10g,35mmol)和吡啶(25ml)装入圆底烧瓶中。将乙酸酐(26mL,277mmol)滴加入上述反应混合物中,并在氩气氛下,于室温下搅拌约12小时。将冰水(20mL)倒入反应混合物中。将形成的白色沉淀在二氯甲烷(200mL)中溶解,并用1M盐酸(3.20mL)、5%碳酸氢钠(1.30mL)、盐水溶液(1.30mL)和水(1.30mL)洗涤有机层,用无水硫酸钠干燥并减压蒸发,得到醋酸脱氢表雄酮粗品。由丙酮将获得的醋酸脱氢表雄酮粗品重结晶得到醋酸脱氢表雄酮。
收率:10.9g
纯度:95%
实施例7:醋酸脱氢表雄酮(DHEA醋酸酯)的制备
在25-30℃下,将脱氢表雄酮粗品(2.21g,7.68mmol)和甲苯(25ml)装入圆底烧瓶中。将4-二甲基氨基吡啶(66mg)、乙酸酐(1.45mL,1.57g,15.36mmol)和三乙胺(2.33g,3.2mL,23.0mmol)装入上述溶液中,并在室温下搅拌约3小时。将获得的反应物用1M盐酸(30mL)淬灭,并将有机层用水(30mL)、碳酸氢钠溶液(30mL)洗涤,硫酸镁干燥并在真空下浓缩,得到醋酸脱氢表雄酮。
收率:85%
HPLC纯度:84.2%。
Claims (11)
1.制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法,
其包括使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
2.权利要求1的方法,其中将式(I)的化合物转化为醋酸阿比特龙。
3.权利要求1的方法,其中将所述式(I)的化合物转化为DHEA庚酸酯。
4.制备式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮的方法,
其包括使用具有序列IDNo:1的酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基还原
5.制备式(III)的化合物的方法,
其包括以下步骤:
a)使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原
以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮;
b)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
6.制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮的方法,
其包括以下步骤:
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3,17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮;
b)由卤代烃将所述式(II)的化合物重结晶。
7.制备式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮的方法,
其包括以下步骤:
a)使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3,17-二酮异构化
以提供式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮;
b)在抗氧化剂的存在下分离所述式(II)的化合物。
8.制备式(III)的化合物的方法,
其包括以下步骤:
a)将式(IV)的Δ4-雄甾烯-3,17-二酮异构化
以得到式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮;
b)使用酮还原酶将式(II)的Δ5-雄甾烯-3,17-二酮中的3-氧代基区域选择性地和立体选择性地还原,以获得式(I)的3β-羟基雄甾-5-烯-17-酮;
c)将所述式(I)的化合物转化为式(III)的化合物。
7.权利要求6的方法,其中所述酮还原酶具有序列IDNo:1。
8.权利要求6的方法,其中将式(I)的化合物转化为醋酸阿比特龙。
9.权利要求6的方法,其中将所述式(I)的化合物转化为DHEA庚酸酯。
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