CN106010990A - 一种胶红酵母及其发酵培养物和应用 - Google Patents

一种胶红酵母及其发酵培养物和应用 Download PDF

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Abstract

本文公开了一种胶红酵母及其发酵培养物和应用，所述的胶红酵母为：胶红酵母TZR2014，CCTCC　NO：M2015574。利用本发明提供的发酵培养基对其进行液态发酵，发酵液的生物量为18g/L，类胡萝卜素的产量为36 mg/L。本发明的胶红酵母具有抗金黄色葡萄球菌，耐胃酸和胆盐的作用，其固态发酵物中还含有丙酮酸，而丙酮酸具有加速脂肪消耗、提高肌肉产量、吞噬体内自由基和抑制自由基的生成功能。因此本发明提供的胶红酵母可用于畜禽水产动物的饲料添加剂，具备广阔的应用前景。

Description

一种胶红酵母及其发酵培养物和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种胶红酵母及其发酵培养物和应用。
技术背景
胶红酵母属担子菌，菌落为奶油色、粉红色至红色的粘液状，是简单的假菌丝，细胞形状为圆形，为营养体细胞出芽生殖。富含虾青素、类胡萝卜素和β-葡聚糖。类胡萝卜素是一种橘黄色脂溶性化合物，具有营养增补剂和食品着色剂的双重功效。动物体内不能合成类胡萝卜素，必须由食物提供，它是动物体内维生素A的重要来源，有补肝明目的作用，可治疗夜盲症。类胡萝卜素也是一种抗氧化剂，进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。同时，在抗癌、预防心脑血管疾病、白内障上有显著的功效。类胡萝卜素作为一种天然色素在畜牧业中越来越受到关注。类胡萝卜素作在家禽沉积可以极大的提高屠体的外观和蛋黄比色扇级数，改善蛋黄色泽。丙酮酸作为膳食补充剂，具有加速脂肪消耗、减轻体重、提高瘦肉率等功效；对心脏有特殊的保护作用，可增强心脏肌肉的效能，减少心脏病或心脏局部缺血造成的损伤；同时，丙酮酸具有吞噬体内自由基和抑制自由基的生成等显著效果。利用胶红酵母发酵生产虾青素、类胡萝卜素和β-葡聚糖具有营养价值简单，培养周期短，成本低廉，菌体无毒且含有丰富的蛋白质的优点，具有重要的研究意义和开发前景。我国西南地区雨水充沛，空气湿度大，气候适宜环境微生物的生长，酵母菌种资源丰富，但红酵母菌种资源挖掘有限。基于此，为了丰富胶红酵母菌种资源库，本发明旨在挖掘具有经济价值的西南地区胶红酵母菌种资源，研究其液体和固态发酵培养方法，将发酵产物应用于畜禽水产养殖业中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶红酵母TZR2014，该酵母富含氨基酸，可产类胡萝卜素和丙酮酸，具有抗金黄色葡萄球菌，耐胃酸和胆盐的作用，可应用于畜禽水产养殖。该菌株已于2015年9月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：胶红酵母(Rhodotorulamuciladinosa)TZR2014，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M 2015574。
本发明的另一个目的在于提供了一种胶红酵母TZR2014发酵液态培养物和固态培养物，本发明的发酵配方简单，成本低廉。利用该发酵液发酵胶红酵母TZR2014，可大量生产酵母菌种，培养物含高产量类胡萝卜素和丙酮酸。
本发明的最后一个目的在于提供了一种胶红酵母TZR2014的应用，包括所述胶红酵母的发酵液态培养物或固态培养物在畜牧水产养殖业中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
胶红酵母从重庆市柑橘研究所柚园的土壤中分离所得；该菌株已于2015年9月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：胶红酵母(Rhodotorula muciladinosa)TZR2014，保藏编号：CCTCC NO：M 2015574；地址：中国武汉武汉大学。
菌落的形态特征：菌落呈圆形或卵圆形，粘稠状，颜色为粉红色，菌落大而厚，易于挑起，微光泽。
胶红酵母生理生化特征
半乳糖 蔗糖 纤二糖 棉籽糖 山梨醇 松三糖 肌醇 海藻糖
+ + - + + + - +
乙酰胺 甘露醇 鼠李糖 蜜二糖 木糖 核糖 甘油 阿拉糖
- + - - + + + +
+：阳性；-：阴性
一种胶红酵母TZR2014液态发酵培养基，包括：葡萄糖3-5％，蛋白胨1-2％，酵母粉0.5-1.5％，pH6.0，其余为水，以上均为质量比。
在以上所述方案中，优选的，液态发酵培养液的配方包括：葡萄糖5％，蛋白胨1％，酵母粉1.5％，其余为水，pH 6.0；此时胶红酵母的生物量、丙酮酸和类胡萝卜素产量达到最大。
一种胶红酵母TZR2014固态发酵培养基，包括：麸皮15-30％，豆粕6-8％，玉米粉1-3％，玉米浆3-5％，米糠2-4％，硫酸铵0.5-1％，磷酸氢二钾0.03-0.08％，硫酸镁0.08-0.12％，其余为自来水，以上均为质量比，所述的固态发酵培养基经121℃高温蒸汽消毒20min，降温至40℃即可接入胶红酵母TZR2014。
在以上所述方案中，优选的固态发酵培养基的配方包括：麸皮22.39％，豆粕7.31％，玉米粉2.32％，玉米浆4.00％，米糠3.12％，硫酸铵0.69％，磷酸氢二钾0.053％，硫酸镁0.103％，其余为自来水，pH6.0，以上均为质量比；在此配方下，胶红酵母的生物量、丙酮酸和类胡萝卜素产量达到最大。
一种胶红酵母TZR2014的应用，包括所述胶红酵母的发酵液态培养物或固态培养物在畜牧水产养殖业中的应用，包括所述的胶红酵母可用于制备抑制金黄色葡萄球菌的菌剂，用于畜禽类或水产类动物的饲料添加剂。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、已公布的胶红酵母是从海洋中分所得，而本发明的胶红酵母从柑橘研究所柑橘园土壤中分离所得，通过动物安全性试验证实此种胶红酵母无毒无副作用；
2、本发明的胶红酵母经发酵后，发酵液中类胡萝卜素含量达36mg/L。
3、本发明的胶红酵母具有抗金黄色葡萄球菌，耐胃酸和胆盐的作用。
4、本发明固态发酵所得胶红酵母还能产丙酮酸。而丙酮酸具有加速脂肪消耗、提高肌肉产量、吞噬体内自由基和抑制自由基的生成功能。
5、固态发酵培养所用原料为畜禽水产饲料原料，成本低廉。培养物中含有丰富的必需氨基酸、类胡萝卜素、丙酮酸，应用于动物产生能改善动物生长和产品品质。
附图说明
图1为实施例1中胶红酵母菌落形态图。
图2为实施例1中胶红酵母细胞形态图。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规技术；所述试剂或材料如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：菌种分离与鉴定
菌株分离
从重庆市柑橘研究所柑橘园采土壤100g，取10g的土样于装有100ml无菌水的250ml三角瓶中，在涡旋仪上振荡后静置片刻，取1ml的菌悬液与9ml的生理盐水混匀，再取1ml的菌悬液与9ml的生理盐水混匀，依次类推，设置不同的浓度梯度，梯度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5，依次取200μl的菌悬液涂布接种于分离平板上，置于28℃培养2～3d，根据菌落形态挑取典型单菌落(菌落呈圆形或卵圆形，粘稠状，颜色为粉红色，菌落大而厚，易于挑起，微光泽)，通过镜检粗筛出胶红酵母菌。
PDA培养基：马铃薯20g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，自然pH，115℃，灭菌20min。
复筛及鉴定
通过牛津杯抑菌试验筛选对金黄色葡萄球菌(G+)致病菌生长抑制性能好的胶红酵母，通过生理生化及26S rDNA D1/D2鉴定，最终筛选到一株产β-胡萝卜素胶红酵母菌，命名为RhodotorulamuciladinosaTZR2014。该细菌已于2015年9月24日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：胶红酵母(Rhodotorulamuciladinosa)TZR2014，地址：中国武汉武汉大学。
TZR2014菌株具体有典型胶红酵母的生理生化特征：该菌株在PDA培养基上繁殖生长形成的菌落为近圆形，粘稠状，颜色为粉红色，菌落大而厚，易于挑起，微光泽(图1，图2)。生理生化特征为：明胶液化。发酵半乳糖、蔗糖、葡萄糖、棉籽糖、山梨醇、松三糖、海藻糖、甘露醇、木糖、核糖、甘油和***糖；果糖、和麦芽糖，不发酵纤二糖、肌醇、乙酰胺、鼠李糖和蜜二糖。最适温度28～32℃，最高温度50℃。
至此，申请人或得了一株胶红酵母，该菌株已于2015年9月24日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：胶红酵母(Rhodotorulamuciladinosa)TZR2014，保藏编号：CCTCC NO：M 2015574；地址：中国，武汉，武汉大学。
实施例2：
胶红酵母(Rhodotorulamuciladinosa)TZR2014的大型发酵：
将保存的胶红酵母TZR2014接种到PDA培养基上，放置于28℃恒温培养箱培养36h，挑取一接种环胶红酵母于种子培养液(质量分数，％)：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉1％，自然pH，其余为双蒸水)中，在28℃，200rpm的恒温震荡器上培养24h。
500升发酵罐装液量为65％(V/V)，液态发酵培养基包括，(质量分数，％)：葡萄糖5％，蛋白胨1％，酵母粉1.5％，pH6.0，经121℃高温蒸汽消毒20min，降温至40℃，向其中接种10％菌龄24h的种子液，在28℃，200r/min发酵96h后，发酵液的生物量为18g/L，类胡萝卜素的产量为36mg/L。
放罐后，过滤板经压滤机，在表压0.2～0.3MPa浓缩至原体积1/8，喷雾干燥，得到活性酵母干粉(每克干粉的有效菌含量是3.2×1011cfu/g)，用于实施例10和11。
实施例3：
胶红酵母TZR2014蛋白质和氨基酸的含量
将实施例2中的发酵液离心收集菌泥，于55℃下烘干得到干菌粉。
氨基酸测定：准确称取干菌粉120mg于试管中，向盛有样品的试管中加入10ml16mol盐酸，震荡混匀。用酒精喷灯把该试管下1/3处拉细到4-6mm，抽真空10分钟后封管。处理过的试管置110℃恒温烘箱中沙浴水解22小时，拿出冷却至室温，摇匀过滤，取1ml滤液于50ml烧杯中，用60℃恒温水浴蒸干滤液，加入0.02mol盐酸稀释4倍，用0.22μm滤膜过滤用日立L-8800型全自动氨基酸分析仪测定。采用凯氏定氮法(GB5009.5-2003)测定粗蛋白含量。
胶红酵母干菌粉含35.75％粗蛋白，2.03％天冬氨酸，1.14％苏氨酸，1.19％丝氨酸，2.29％谷氨酸，1.33％甘氨酸，2.02％丙氨酸，0.19％半胱氨酸，1.25％缬氨酸，0.39％蛋氨酸，1.05％异亮氨酸，1.77％亮氨酸，0.652酪氨酸，1.049％苯丙氨酸，1.259％赖氨酸，0.582％组氨酸，1.74％精氨酸％，1.16％脯氨酸。
实施例4：
胶红酵母TZR2014的固态发酵：
将胶红酵母接种到PDA培养基上，放置于28℃恒温培养箱培养36h，挑取一接种环胶红酵母于种子培养液(各成分质量分数(％)：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母粉1％，自然pH)中，在28℃，200rpm的恒温震荡器上培养24h。
固态发酵培养基包括(质量分数，％)：麸皮22.39％，豆粕7.31％，玉米粉2.32％，玉米浆4.00％，米糠3.12％，硫酸铵0.69％，磷酸氢二钾0.053％，硫酸镁0.103％，其余为自来水，pH6.0，经121℃高温蒸汽消毒20min，降温至40℃。向其中接种菌龄24h的种子液7.5％(质量比)，在28℃的恒温生化培养箱中发酵72h，最终测得每g固态发酵培养物干燥前含109个胶红酵母，190.2μg类胡萝卜素，1.32mg丙酮酸。固态发酵物经40℃干燥制成胶红酵母饲料添加剂，用于实施例12。
实施例5：
胶红酵母TZR2014抗逆性检测
热耐受能力：取胶红酵母生长末期的培养液离心，0.9％生理盐水洗涤两次后重新悬浮(活菌量1～2×l09cfu/ml)于35、45、55、65、75、85、95℃水浴中处理15min后，迅速流水冷却，然后采用稀释平板法测定存活率。结果表明该菌种最高耐受温度为55℃(见表1)。
表1 胶红酵母在不同温度处理下的存活率
胃液耐受能力：取质量分数为10％的盐酸16.4ml加蒸馏水稀释，使pH值为2.0，每100ml盐酸溶液中加1g胃蛋白酶，充分溶解后用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，得到人工胃液。取胶红酵母生长末期培养物离心，0.9％生理盐水洗涤两次后重新悬浮，以107cfu/ml终浓度接种于人工胃液中，震荡混匀，37℃水浴孵育，每隔0.5h取样进行活菌计数。结果表明胶红酵母能够耐受胃液达2小时(见表2)。
表2 胶红酵母在模拟胃酸条件下处理活菌量变化
处理时间(h) 0 0.5 1 1.5 2
菌量(cfu/ml) 1.06×l09 6.90×l08 6.31×l08 5.83×l08 5.10×l08
猪胆盐耐受能力：配制额外添加1.0％，2.0％，3.0％，4.0％，5.0％(w/v)猪胆盐的种子培养液。取1ml取胶红酵母菌液(1～2×l08cfu/mL)，接种于9mL不同浓度高胆盐浓度种子培养液中，30℃培养12h后，测定培养液浊度变化，判定菌体生长情况。结果表明胶红酵母能够耐受猪胆盐质量分数为3％(见表3)。
表3：不同浓度猪胆盐对胶红酵母生长的影响
注：++代表生长良好，+代表生长一般，-代表不能生长。
实施例6：
胶红胶母菌株抑菌能力检测
将已灭菌的NB琼脂培养基加热到完全融化，倒在培养皿内，每皿15ml(下层)，待其凝固。此外，将融化的NB培养基冷却到50℃左右混入致病试验菌培养液5ml加到已凝固的培养基上待凝固(上层)。以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯(内径6mm、外径8mm、高10mm)的圆形小管，管的两端要光滑)，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，在杯中加入待检样品(发酵液)，牛津杯一般可以装200微升，勿使其外溢。加满后置37℃培养16-18小时，观察结果，抑菌圈用尺直接量。结果表明胶红酵母具有抑制金黄色葡萄球菌的作用(见表4)。
表4 胶红酵母对不同致病菌的抑菌圈直径
致病菌 大肠杆菌 鸡白痢沙门氏菌 金黄色葡萄球菌
抑菌圈(mm) 0 0 20
实施例7：
小鼠安全试验
将60只体重20g左右的昆明小鼠随机分为3组，每组20只，雌雄各半。其中一组做空白对照，实验组一每只按1×109cfu/kg小鼠体重(常规剂量100倍)连续一周灌服胶红酵母发酵液，实验组二一次性腹腔注射0.2ml的菌悬液(1×109cfu/ml)。观察一周，记录各组小鼠的生长及死亡情况(表5)。所有小鼠饲喂试验均在干燥、清洁、通风良好的室内完成。结果表明：一周后，3组均无死亡，***组第一天***小鼠进食量减少，精神萎靡，第3天恢复正常，结果如表5所示。
表5：小鼠实验称重结果
实验分组 初重(g) 3天称重(g) 7天称重(g)
对照组 19.26±0.7 20.91±1.67 23.78±1.94
实验组一 19.24±0.81 22.36±0.19 26.93±1.91
实验组二 19.28±0.6 20.31±2.62 22.00±1.93
实验组一为灌胃组，实验组二为***组。
实施例8：
菌剂的早期断奶仔猪实验
选取体重相近的、同批次21日龄仔猪40头，分为4组，每组10头，一组为对照组，实验组A每头按占体重108cfu/kg的菌量拌水灌服，实验组B每头按占体重109cfu/kg的菌量拌水灌服，实验组C每头按占体重1010cfu/kg的菌量拌水灌服实验组每天灌一次，连续灌7天，观察21天。自由采食，每日记录精神及采食状况，实验结束时称重。经过21天的实验观察在大剂量连续灌服下均没有异常反应，采食及生长情况正常，胶红酵母组有较明显的促生长效果(表6)。
表6：仔猪灌服不同剂量TZR2014对增重的影响
组别 初体重kg 末体重kg 增重kg
空白组 5.90 9.93 4.03
实验组A 6.08 10.91 4.83
实验组B 6.03 11.87 5.84
实验组C 5.91 10.62 4.71
实施例9：
菌剂的妊娠母猪实验
选取同一批次妊娠母猪20头，分为2组，每组10头，一组为对照组，另一组为实验组；观察期为每头产前一个月到乳猪断奶；对照组正常喂食日粮；实验组按猪体重2×109cfu/kg的菌量添加到饲料日粮中喂食，每日观察母猪精神及粪便情况，产后称乳猪初重。观察到实验组母猪便秘及生产情况明显改善，对照组平均乳猪初重为1.31公斤，产仔数为8.9，而实验组平均乳猪初重为1.49公斤，产仔数为10.3。
实施例10：
菌粉在蛋鸡和蛋鸭养殖中的应用效果。
选择体况相近、39周龄的海兰褐蛋鸡200只，试验时间为90天，前5天为预试期，后85天为正试期。随机将其分为2个处理组，每个处理组5个重复，每个重复20只。即1个对照组、1个试验组。对照组饲喂基础日粮，试验组为添加了1.5％活性胶红酵母干粉的基础日粮。
选择体况相近、40周龄的金定蛋鸭200只，试验时间为90天，前5天为预试期，后85天为正试期。随机将其分为2个处理组，每个处理组5个重复，每个重复20只。即1个对照组、1个试验组。对照组饲喂基础日粮，试验组为添加了2％活性胶红酵母干粉的基础日粮。
结果如表7所示。
表7 胶红酵母TZR2014在蛋鸡及蛋鸭养殖中的生长促进效果
实施例11：
菌粉在罗氏沼幼虾养殖中的应用效果。
试验挑选同一批次孵化、个体大小均匀、体质健康，体长约为4.2cm、体重1.8g左右的罗氏沼幼虾200尾，随机分为2个处理组，每个处理组5个重复，每个重复20尾虾，即1个对照组、1个试验组。对照组饲喂基础日粮，试验组为饲喂添加了4.0％的活性胶红酵母干粉的基础日粮。称重记录初重，饲养于200L自动充气玻璃纤维桶中。试验期55d。试验期间定时增氧；溶氧4.5-5.0g/L，适时的更换水源。水温范围在22～28℃；水体pH值为7.6左右。每天在08:00、17:00、22:00投饵，记录投饵量，并根据虾的摄食情况及水温变化适时调整，日投饵量为体重的6％～8％，接近饱食投喂，尽量不留残饵，结果如表8所示。
表8 胶红酵母TZR2014在罗氏沼幼虾养殖中的生长促进效果
实验处理 特定生长率(％/d) 饲料转化 存活率
对照组 3.63 1.34 61％
试验组 3.82 1.21 69％
实施例12：
固态发酵物在蛋鸡和蛋鸭养殖中的应用效果。
选择体况相近、39周龄的罗曼蛋鸡200只，试验时间为90天，前5天为预试期，后85天为正试期。随机将其分为2个处理组，每个处理组5个重复，每个重复20只。即1个对照组、1个试验组。对照组饲喂基础日粮，试验组为添加了5.0％活性胶红酵母固态发酵物的基础日粮。
选择体况相近、40周龄的金定蛋鸭200只，试验时间为90天，前5天为预试期，后85天为正试期。随机将其分为2个处理组，每个处理组5个重复，每个重复20只。即1个对照组、2个试验组。对照组饲喂基础日粮，试验组为添加了6.0％活性胶红酵母固态发酵物的基础日粮。
结果如表9所示。
表9 TZR2014在蛋鸡及蛋鸭养殖中的生长促进效果
根椐实施例10和12结果，TZR2014液态发酵物和固态发酵物均能提高蛋鸡和蛋蛋鸭的生长性能，效果相当，但从饲料成本来讲固态发酵物发酵所用原料较液态发酵物廉价，因此固态发酵物饲养成本更低。

Claims (10)

1.一种胶红酵母，其特征在于：所述的胶红酵母为：胶红酵母（Rhodotorulamuciladinosa）TZR2014；保藏编号为：CCTCC NO：M 2015574。
2.权利要求1所述胶红酵母的液态发酵培养基，包括：葡萄糖3-5%，蛋白胨1-2%，酵母粉0.5 -1.5%，pH6.0，其余为水，以上均为质量比。
3.权利要求1所述的的固态发酵培养基，包括：麸皮15-30%，豆粕6-8%，玉米粉1-3%，玉米浆3-5%，米糠2-4%，硫酸铵0.5-1%，磷酸氢二钾0.03-0.08%，硫酸镁0.08-0.12%，其余为自来水，以上均为质量比。
4.权利要求1所述的胶红酵母在制备类胡萝卜素中的应用。
5.权利要求1所述的胶红酵母在制备抑制金黄色葡萄球菌制剂中的应用。
6.权利要求1所述的胶红酵母在制备畜禽动物饲料添加剂中的应用。
7.权利要求1所述的胶红酵母在制备水产动物饲料添加剂中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的胶红酵母在同时提高蛋鸡或蛋鸭的产蛋率和蛋料比中的应用。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的胶红酵母在促进畜禽类动物生长中的应用。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的胶红酵母在促进水产类动物生长中的应用。
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