CN105683361B - 使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及干细胞向适于进一步分化为胰β细胞的均质内分泌祖细胞群的分化。本发明提供用于通过将前体细胞暴露于TGF‑β I型受体抑制剂、BMP拮抗剂、腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺和/或将前体细胞暴露于选择的小分子获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法。

Description

使用小分子从人多能干细胞产生内分泌祖细胞
技术领域
本发明涉及从人多能干细胞例如人胚胎干细胞和诱导多能干细胞产生内分泌祖细胞的方法。
发明背景
β细胞移植潜在地提供了I型糖尿病的最终治疗。然而，供体β细胞有限的可用性制约了该治疗作为临床治疗的用途。
多能干(PS)细胞可无限增殖和分化为多种细胞类型；因此，PS细胞为有希望的β细胞来源。然而，在PS细胞可用于治疗糖尿病前，其需要有效和可重复地分化为胰β细胞。在脊椎动物胚胎发育期间，多能细胞产生三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。
对于形成内胚层衍生组织例如胰组织，定形内胚层(DE)的诱导是第一步。从DE细胞产生胰内胚层(PE)为产生产胰岛素的β细胞所必需的。具有成为内分泌祖细胞(EP)潜能的PE细胞特征在于两个重要转录因子PDX1和NKX6.1的共表达。
对于从PS细胞产生胰细胞已经建立了分步体外分化方案。
这些方案一般模拟胰发育的主要事件，其包括几个阶段例如DE、原肠、后前肠、PE、EP和最后完全分化的胰β细胞的形成。
一些科学论文中描述的方案例示了用于从人胚胎干(hES)细胞和诱导多能干(iPS)细胞获得胰(-样)细胞的方案(Aoi等2008; D'Amour等2006; Jiang等2007; Kroon等2008; Takahashi等2007; Takahashi & Yamanaka 2006；和Wernig等2007)。
迄今为止，hES细胞的有效DE分化已通过激活蛋白A和Wnt处理实现。DE细胞可使用视黄酸(RA) (Cai等2010; D'Amour等2006)和BMP抑制剂(Kunisada等2012; Schulz等2012; Zhang等2009)进一步分化为PE细胞。
在产生胰β细胞的途径中产生PE细胞之后的下一个步骤为产生表达NGN3和NKX2.2标志物的EP细胞。
Nostro等(2012)和Kunisada等(2011)描述了用于将PE分化为EP的方法。
然而，存在对更有效的将PE分化为EP的方法的需求。
发明概述
本发明提供改进的用于通过组合已知方案的特征从而增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞的百分比将胰内胚层(PE)分化为内分泌祖(EP)细胞的方法。通过向前述方法添加小分子所述百分比可进一步增加。小分子的某些组合允许NGN3/NKX2.2双阳性百分比的进一步有利增加。
本发明进一步涉及通过本发明方法可获得的EP细胞。
本发明进一步涉及所述细胞尤其在治疗I型糖尿病中的医学用途。
本发明采用一种替代方法以改进人PE细胞向完全分化的β细胞分化的效率，即通过提供增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞(EP细胞定型为内分泌细胞命运的标志物)百分比的方法。
在一个实施方案中，本发明提供改进的胰β细胞前体群，即，NGN3/NKX2.2双阳性细胞的百分比增加的EP细胞。
在另一个实施方案中本发明提供更均质的EP细胞群，这对于这些细胞向完全分化的胰β细胞进一步发育是重要的。
在另一个实施方案中，本发明还提供更同步的EP群，以到达分化的下一阶段，即葡萄糖响应的完全分化的β细胞。
在一方面，本发明提供用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于基础培养基中的TGF-β I型受体抑制剂和BMP拮抗剂和腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺。
在一方面，本发明提供用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT。
本发明还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。
附图简述
图1显示本发明方法在NGN3 mRNA诱导中的有利作用。
图2显示本发明方法在产生NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞中的有利作用。
图3显示组合本发明小分子的个体作用和有利作用。
图4显示组合本发明几种小分子的个体作用和有利作用。
发明详述
本发明涉及从人源的多能干细胞例如胚胎干(ES)细胞和诱导多能干细胞产生内分泌祖(EP)细胞的方法。
干细胞为通过其在单细胞水平自我更新且分化产生子代细胞(包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞)的能力而界定的未分化细胞。干细胞特征还在于其体外从多胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化为各种细胞谱系的功能细胞以及移植后产生多胚层的组织的能力。
干细胞按照其发育潜能分为：(1) 全能的，意指能够产生所有胚胎和胚外细胞类型；(2) 多能的(pluripotent)，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3) 多潜能的(multi-potent)，意指能够产生细胞谱系的子集，但所有均在一种特定组织、器官或生理***内(例如，造血干细胞可产生的子代包括HSC (自我更新)、血细胞限制的寡能的祖细胞和为血液正常组分的所有细胞类型和成分(例如，血小板))；(4) 寡能的，意指能够产生比多潜能干细胞更受限的细胞谱系子集；和(5) 单能的，意指能够产生单细胞谱系(例如，产生***的干细胞)。
成熟或分化的胰细胞的确不增殖而的确分泌高水平的胰内分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β细胞响应葡萄糖而分泌高水平的胰岛素。当细胞丧失未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，出现细胞相互作用变化和成熟。丧失或获得单个标志物可指示细胞已经“成熟或完全分化”。
本发明采用一种替代方法以改进人PE细胞向完全分化的β细胞分化的效率，即通过提供增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞百分比的方法，所述NGN3/NKX2.2为EP细胞群的标志物，所述EP细胞群是到达产胰岛素胰β细胞所必需的细胞阶段之一。
此外，本发明提供更均质和同步的EP细胞群，这对于这些细胞向产胰岛素的β细胞进一步发育是重要的。
本发明还可解决将从示例性实施方案的公开内容中显而易见的其它问题。
如本文所使用的，“产胰岛素细胞”指响应葡萄糖产生和储存或分泌可检测量的胰岛素的细胞。“产胰岛素细胞”可为单个细胞或细胞集合。
如本文所使用的术语“β细胞”指位于胰内称为胰岛的小细胞簇中的细胞。β细胞通过分泌肽激素胰岛素响应高血糖水平，所述肽激素胰岛素作用于其它组织以促进从血液吸收葡萄糖，例如在肝脏中，其中其促进能量经由糖原合成而储存。
如本文所使用的“分化(differentiate)”或分化“(differentiation)”指细胞从未分化状态发展至分化状态，从不成熟状态发展至较不成熟状态或从不成熟状态发展至成熟状态的过程。例如，早期未分化的胚胎胰细胞能够增殖和表达特征标志物，如PDX1、NKX6.1和PTF1a。
术语“分化因子”指加至ES-或胰前体细胞以促进其分化为EP细胞的化合物。分化因子还可驱使进一步分化为成熟β细胞。
示例性的分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、毒蜥外泌肽(exendin)-4、碱性成纤维细胞生长因子、***-1、神经生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰高血糖素样肽1、吲哚内酰胺V（indolactam V）、IDE1&2和视黄酸。
在一些方面，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。
在一个实施方案中本发明涉及向在其产物中缺乏至少一种胰激素的哺乳动物提供胰内分泌功能的方法，所述方法包括植入足以在所述哺乳动物中产生可测量的所述至少一种胰激素的量的通过本发明的任何方法获得的细胞的步骤。
在一个实施方案中，根据本发明方法制备的EP细胞群可用于，例如通过植入需要此种治疗的患者中治疗糖尿病。
如本文所使用的，术语“人多能干(hPS)细胞”指可从任何来源 衍生的并且能够在适当条件下产生人不同细胞类型(其为所有3个胚 层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物)子代的细胞。hPS细胞具有 在8-12周龄SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养物中形 成所有三个胚层的可鉴别细胞的能力。人多能干细胞的定义中包括 各种类型的胚胎细胞，包括文献中人胚泡衍生的干(hBS)细胞(常称 作人胚胎干(hES)细胞)。
本文中描述的各种方法和其它实施方案可能需要或利用多种来 源的hPS细胞。例如，适用的hPS细胞可从发育的胚胎获得。另外 或替代地，合适的hPS细胞可从已建立的细胞系和/或人诱导多能干 (hiPS)细胞获得。
如本文所使用的术语“hiPS细胞”指人诱导多能干细胞。
如本文所使用的，术语“胚泡-衍生的干细胞”标记为BS细胞， 并且人形式称为“hBS细胞”。在文献中该细胞常常被称为胚胎干 细胞，更特别为人胚胎干细胞(hESC)。本发明继而使用的多能干细 胞因此可为从胚泡制备的胚胎干细胞，如例如WO 03/055992和WO2007/042225中所述，或可为市售可得的hBS细胞或细胞系。然而， 进一步设想本发明继而可使用任何人多能干细胞，包括分化成体细 胞，其通过例如用某些转录因子例如OCT4、SOX2、NANOG和 LIN28处理成体细胞而重编程为多能细胞。如本文所使用的，人胚 胎干细胞(hESC)为市售的细胞或细胞系。
如本文所使用的，“EP细胞群”为其中至少5％的细胞群为 NGN3/NKX2.2双阳性的胰β细胞前体群。
如本文所使用的，术语“PDX1”指胰发育中牵涉的同源结构域转录因子。如本文所使用的“NGN3”为碱性环-螺旋环转录因子的neurogenin家族的成员。如本文所使用的“NKX2.2”和“NKX6.1”为NKX转录因子家族的成员。如本文所使用的“Islet-1”或“IsI-1”为转录因子的LIM/同源结构域家族成员，并且在发育的胰中表达。如本文所使用的“MafA”为在胰中表达的转录因子，并控制胰岛素生物合成和分泌中涉及的基因的表达。
在一个实施方案中本发明提供替代的或比本领域已知的更有效的用于将PE细胞分化为EP细胞从而产生更均质的EP群的方法。
对于进一步分化为完全分化的β细胞均质的EP群为期需的起点。
在一个实施方案中以这样的方式处理PE细胞使得NGN3/NKX2.2双阳性在所得群中的百分比比使用已知用于将PE细胞群分化为EP细胞群的方案可达到的更高。
在一个使用本发明方法的实施方案中，当与用基础培养基处理相比时观察到NGN3mRNA的600倍上调。
在一个实施方案中使用已知的用于将PE分化为EP细胞的方法，以改进所得EP细胞群中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中协同使用已知的用于使PE分化为EP细胞的方法，以改进所得EP细胞群中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中协同使用已知的用于使PE分化为EP细胞的方法的元素，以改进所得EP细胞群中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中，实施例2的方法产生至少8%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法产生至少9%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法产生至少10%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法产生至少15%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，本发明方法产生15-100%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中使用小分子以增加PE至EP分化过程中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中组合使用小分子以增加PE至EP分化过程中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在一个实施方案中组合使用小分子以协同增加PE至EP分化过程中NGN3/NKX2.2双阳性的百分比。
在下列实施方案中列出了可用于促进PE向EP分化的许多小分子和浓度。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为吉非替尼。在一个实施方案中吉非替尼以0.1-100 µM的浓度使用。在一个实施方案中吉非替尼以1-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中吉非替尼以5 µM的浓度使用。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为JNK抑制剂VIII。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII以0.1-100 µM的浓度使用。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII以1-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII以10 µM的浓度使用。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为DNA-PK抑制剂V。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以0.1-100 µM的浓度使用。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以1-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以5 µM的浓度使用。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为DAPT。在一个实施方案中，DAPT以0.1-100 µM的浓度使用。在一个实施方案中，DAPT以1-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中，DAPT以2.5 µM的浓度使用。
在一个实施方案中发现可用于促进PE向EP分化的小分子为吉非替尼和JNK抑制剂VIII。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII和吉非替尼以0.1-100 µM的浓度使用。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII和吉非替尼以1-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中JNK抑制剂VIII和吉非替尼分别以5和10 µM的浓度使用。
在一个实施方案中吉非替尼的浓度约为JNK抑制剂VIII浓度的两倍。
在一个实施方案中除了JNK抑制剂VIII和吉非替尼之外还加入一种或多种小分子。
在一个实施方案中DAPT以任何上述DAPT浓度例如2.5 µM与吉非替尼和JNK抑制剂VIII一起使用。
在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以任何上述DNA-PK抑制剂V浓度例如5 µM与吉非替尼和JNK抑制剂VIII一起使用。
在一个实施方案中吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V以0.1-100 µM的个体浓度组合使用。在一个实施方案中吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V以1-10 µM的个体浓度组合使用。
在一个实施方案中使用1-100 µM 吉非替尼、1-100 µM JNK抑制剂VIII、0.5-50 µM DAPT和1-100 µM DNA-PK抑制剂V。在一个实施方案中组合使用1-10 µM 吉非替尼、5-20µM JNK抑制剂VIII、1-10 µM DAPT和1-10 µM DNA-PK抑制剂V。在一个实施方案中，组合使用5 µM 吉非替尼、10 µM JNK抑制剂VIII和5 µM DNA-PK抑制剂V。
在一个实施方案中DAPT、DNA-PK抑制剂V、吉非替尼和JNK抑制剂VIII以任何上述对于各个化合物的浓度组合使用。
在一个实施方案中吉非替尼、JNK抑制剂VIII、DAPT和DNA-PK抑制剂V以0.1-100 µM的个体浓度组合使用。在一个实施方案中吉非替尼、JNK抑制剂VIII、DAPT和DNA-PK抑制剂V以1-10 µM的个体浓度组合使用。在一个实施方案中组合使用5 µM 吉非替尼、10 µM JNK抑制剂VIII、2.5 µM DAPT和5 µM DNA-PK抑制剂V。
在一个实施方案中使用一种或多种下列化合物将PE分化为EP：Rockout、BPIQ-I、PD174265、p38抑制剂III、PD169316、DMBI、Syk抑制剂、PD98059、DNA-PK抑制剂V、TGF-β RI抑制剂III、L-685、458、Compound E。在一个实施方案中Rockout以5-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中p38抑制剂III以5-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中PD16931以1-5 µM的浓度使用。
在一个实施方案中DMBI以1-50 µM的浓度使用。在一个实施方案中DMBI以10 µM的浓度使用。
在一个实施方案中Syk抑制剂以1-50 µM的浓度使用。在一个实施方案中Syk抑制剂以1 µM的浓度使用。
在一个实施方案中BPIQ-I以0.1-100 µM的浓度使用。
在一个实施方案中BPIQ-I以1-50 µM的浓度使用。在一个实施方案中BPIQ-I以10µM的浓度使用。
在一个实施方案中PD174265以0.1-100 µM的浓度使用。在一个实施方案中PD174265以的1-50 µM浓度使用。在一个实施方案中PD174265以10 µM的浓度使用。在一个实施方案中PD174265以1 µM的浓度使用。
在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以0.1-100 µM的浓度使用。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以1-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中DNA-PK抑制剂V以5 µM的浓度使用。
在一个实施方案中TGF-β RI抑制剂III以0.1-100 µM的浓度使用。
在一个实施方案中TGF-β RI抑制剂III以1-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中TGF-β RI抑制剂III以5 µM的浓度使用。
在一个实施方案中L6以0.1-100 µM的浓度使用。在一个实施方案中L6以1-10 µM的浓度使用。在一个实施方案中L6以5 µM的浓度使用。
在一个实施方案中Compound E以50 nM - 5 µM的浓度使用。在一个实施方案中Compound E以100 nM - 1 µM的浓度使用。在一个实施方案中Compound E以500 nM的浓度使用。
在一个实施方案中，可通过本发明方法获得的EP细胞为产胰岛素细胞，任选和向产胰高血糖素、生长抑素、胰多肽和/或生长素释放肽(ghrelin)的细胞分化的细胞。
在一个实施方案中，包含EP细胞的细胞群从体细胞群获得。在一些方面，体细胞群已被诱导而去分化为胚胎-样干细胞(即，多能)。这样的去分化细胞还称为诱导多能干细胞(iPS)。
在一个实施方案中，包含EP细胞的细胞群继而从胚胎干细胞获得。
在一个实施方案中，包含EP细胞的细胞群继而从hiPS细胞获得。
在一个实施方案中分化在胚状体和/或在单层细胞培养物或其组合中发生。
使用所述小分子增加NGN3/NKX2.2双阳性细胞量的效果的实例在本文档的实施例以及图3和4中显示。
在一个实施方案中用所述小分子处理经历向NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞分化的细胞。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生150-400%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生150-300%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生至少150%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生至少200%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生至少300%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，产生至少400%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，实施例2的方法，加入所述小分子，本发明产生至多400%效果NGN3/NKX2.2双阳性的内分泌祖细胞群。
在一个实施方案中，在用所述小分子处理之前，将经历向NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞分化的细胞暴露于基础培养基中的TGF-β I型受体抑制剂、BMP拮抗剂、腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺。
在一个实施方案中TGF-β I型受体抑制剂为SB431542并且所述BMP拮抗剂为头蛋白。
在一个实施方案中所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯扣林.
本发明进一步的实施方案：
实施方案1：用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于基础培养基中的
TGF-β I型受体抑制剂，和
BMP拮抗剂，和
腺苷酸环化酶激活剂，和
烟酰胺。
实施方案2：实施方案1的方法，其中所述TGF-β I型受体抑制剂为SB431542并且所述BMP拮抗剂为头蛋白。
实施方案3：实施方案1或2的方法，其中所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯扣林。
实施方案4：实施方案1-3的方法，其中所述基础培养基为RPMI1640。
实施方案5：实施方案1-4的方法，其中将内分泌祖细胞另外暴露于DNA-PK抑制剂V、吉非替尼、JNK抑制剂VIII或DAPT或所述小分子的任何组合。
实施方案6：实施方案1-4的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V组合。
实施方案7：实施方案1-4的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT组合。
实施方案8：实施方案1-4的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V组合。
实施方案9：实施方案1-4的方法，其中使用1-100 µM吉非替尼、1-100 µM JNK抑制剂VIII、0.5-50 µM DAPT和1-100 µM DNA-PK抑制剂V。
实施方案10：实施方案9的方法，其中使用1-10 µM吉非替尼、5-20 µM JNK抑制剂VIII、1-10 µM DAPT和1-10 µM DNA-PK抑制剂V。
实施方案11：根据实施方案1-8的方法获得的细胞。
实施方案12：用于药物中的根据实施方案1-8获得的细胞。
实施方案13：用于治疗糖尿病的根据实施方案1-8获得的细胞。
实施方案14：根据实施方案1-8的方法获得的细胞用于治疗糖尿病的用途。
实施方案15：用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群暴露于吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT。
令人惊讶地，关于将PE分化为EP细胞，通过组合已知适于将PE细胞分化为EP细胞的两个已公开的方案的步骤可取得有利效果。同样令人惊讶地显示某些小分子及其组合可进一步驱动PE向EP分化并从而增加EP细胞的产率(导致使用本发明方法制备的细胞群中更高的EP百分比)。
实施例
缩略词表
DAPT：(二氯苯乙酰基)-丙氨酰-苯基甘氨酸-叔丁酯
DMBI：(Z)-3-[4-(二甲氨基)亚苄基]二氢吲哚-2-酮
CompE：Compound E
DE：定型内胚层
DEF-CS：DEF培养***
DNA-Pki：DNA-PK抑制剂V
EP：内分泌祖细胞
hBS：人胚泡衍生的干
hES：人胚胎干
hESC：人胚胎干细胞
hiPS：人诱导多能干
HSC：造血干细胞
iPS：诱导多能干
iPSC：诱导多能干细胞
KOSR：KnockOut™血清替代物
PE：胰内胚层
PEST：青霉素链霉素
SC：干细胞
Rockout：Rho激酶抑制剂III
实施例1：PE细胞群的制备
将hES细胞(DEF-hES SA121)或iPS细胞(DEF-CHiPS2)培养在补充30 ng/ml bFGF(Peprotech #100-18B)和10 ng/ml 头蛋白(Peprotech #120-10C)的DEF培养基(Cellectis)中。DEF培养基或DEF-CS培养基/***为用于人多能干细胞建立和增殖的规定的平衡培养基，DEF-CS培养基/***。
使用下列方案在T75培养瓶中将hES细胞分化为DE：将汇合的培养物在RPMI1640(Gibco #61870)中洗涤一次并用3µM CHIR99021 (Axon#1386)/RPMI1640，0.1% PEST(Gibco #15140)处理。24小时后细胞用RPMI1640，0.1% PEST洗涤并用100 ng/ml激活蛋白A(Peprotech #120-14E)/RPMI1640，0.1% PEST处理。24小时后，向激活蛋白A培养基中加入2% B27 (Invitrogen #17504-044)持续2天，每天更换培养基。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5% CO2下。
DE细胞使用Tryple Select (Invitrogen, #12563-029)胰蛋白酶消化并作为单细胞重新接种在200K/cm2光学96-孔多盘(Corning#3340)中的补充100 ng/ml激活蛋白A、2% B27和0.1% PEST的RPMI1640中。
使用下列方案让DE细胞粘附和分化为PE细胞：DE培养物洗涤一次并用50 nM LDN-193189 (Stemgent#04-0074)/RPMI 1640, 0.1% PEST, 12% KOSR (Gibco # 10828)处理。四天后细胞用RPMI1640洗涤并用1 µM AM580 (Enzo#BML-GR104)、10 µM JNK抑制剂II(Calbiochem#420119)、50 nM LDN-193189和64 ng/mL bFGF/RPMI1640，0.1% PEST，12%KOSR分化持续7天。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5% CO2下，每天更换培养基。
实施例2：使用组合方案的PE向EP的分化
根据实施例1获得的PE细胞用6 µM SB4311542 (Sigma #S4317)、50 ng/ml头蛋白(Peprotech #120-10c)、10 µM弗斯扣林(Sigma #F6886)和10 mM烟酰胺(Calbiochem #481907)/RPMI1640 0.1% PEST和2% B27分化达三天。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5% CO2下，每天更换培养基。
实施例3：实施例2的方法与已知方案的比较
将实施例2的方法分别与Kunisada等(2011) (方案K)和Nostro等(2012) (方案N)中描述的方法比较。
方案K
根据实施例1获得的PE细胞用10 µM弗斯扣林(Sigma #F6886)和10 mM烟酰胺(Calbiochem #481907)/RPMI1640, 0.1% PEST和2% B27分化达3天。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5% CO2下，每天更换培养基。
方案N
根据实施例1获得的PE细胞用6 µM SB4311542 (Sigma #S4317), 50 ng/ml头蛋白(Peprotech #120-10c)/RPMI1640, 0.1% PEST和2% B27分化达3天。分化期间将细胞在增湿培养箱中维持在37℃和5% CO2下，每天更换培养基。
获得下列结果：
响应于方案K和方案N以及组合方案K&N (实施例2)的3天EP分化的内分泌祖细胞标志物NGN3的相对基因表达水平。基因表达相对于在基础培养基中分化的培养物中存在的基因表达（其设为1）显示。
EP第4天收获细胞，使用RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen#74134)提取总RNA并用NanoDrop ND-1000分光光度计(Thermo Scientific)测量RNA浓度。使用iScript cDNASynthesis Kit (Bio-Rad)按照制造商的说明将RNA反转录为cDNA。每个实验使用固定量的RNA (500 ng)用于cDNA合成。反应混合物如下孵育：25℃ 5 min，42℃ 30 min和85℃ 5min。
定量实时聚合酶链反应(qPCR)在10 µl 反应中使用1/100 cDNA/反应、Taqman基因表达测定(库存的(inventoried)针对NGN3或管家基因GAPDH的引物集)和Taqman快速通用PCR预混液一式两份运行。qPCR在Mx3005P qPCR***(Agilent)上使用快速两步程序进行：95℃初始变性3分钟，随后为95℃ 15秒和60℃ 20秒的40个循环。将原始数据从MxPro软件导出并使用Microsoft Excel和GraphPad Prism分析。基因表达的相对定量使用比较循环阈值(DDCt)方法(Schmittgen和Livak, 2008)用GAPDH作为内部参考进行。
结果以相对NGN3表达的形式在下表1和图1中示出。结果显示当组合两个个体方案(方案K&方案N)以制备内分泌祖细胞时，我们可协同提高EP细胞群中的NGN3 mRNA表达水平。
表1：相对NGN3表达
方案 相对NGN3 mRNA表达
基础 1
方案N 63
方案K 338
实施例2的方法 634
EP分化3天后，EP的第四天，吸去培养基，然后用4%低聚甲醛(VWR, 97.131.000)室温固定细胞30分钟。细胞用PBS洗涤并用0.5% Triton X-100 (Sigma, 9002-93-1)透化10分钟，洗涤并在0.5% TNB-缓冲液(Perkin Elmer)中室温封闭30分钟。将第一抗体，绵羊抗-NGN3 (R&D*** #AF3444)和兔抗-NKX2.2 (Sigma #HPA003468)分别在0.1% Triton X-100/PBS中1:1000和1:500稀释，并加入各个孔中以在4℃过夜孵育。用PBS洗涤细胞3次。将DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚, Applichem, A4099.0010)和第二抗体，Alexa Fluor488驴-抗山羊和Alexa Fluor 594驴抗-兔(均为Invitrogen)在0.1% Triton X-100/PBS中1:1000稀释，并加入每个孔中维持45分钟。将细胞洗涤5次，保持在200µL PBS中用于成像。
成像使用InCell分析仪2000 (GE Healthcare)进行。用10× 物镜捕获4个视野/孔。总细胞数目基于DAPI复染，NGN3/NKX2.2双阳性细胞数目使用InCell DeveloperToolbox 1.8 (GE Healthcare)测定。将NGN3/NKX2.2双阳性细胞分数使用InCelldeveloper toolbox 软件(GE Healthcare)定量，归一化至每个板的组合方案K&N (实施例2)并计算%效果(%效果NGN3/NKX2.2双阳性= ((S-Sneg)/(│Spos-Sneg│))*100)。其中S为给定化合物组合的% NGN3/NKX2.2双阳性细胞，Sneg和Spos分别为阴性对照和组合方案K&N的%NGN3/NKX2.2双阳性细胞)。
结果以%效果NGN3 / NKX2.2双阳性细胞的形式在下表2和图2中示出。
表2：%效果NGN3 / NKX2.2双阳性细胞
方案 %效果NGN3 / NKX2.2双阳性细胞
基础 0.1
方案N 7.3
方案K 7.6
实施例2的方法 100
结果显示当组合两个独立的方案(方案K&方案N)以制备内分泌祖细胞时，我们可协同提高EP细胞群中的NGN3/NKX2.2双阳性细胞水平。
实施例4：小分子诱导的EP分化
在下列条件下检验了某些分子诱导和增加PE向EP分化的能力：
根据实施例1和2制备EP细胞群。然而，除了实施例2中使用的试剂外还以下表3中所示浓度指定的浓度加入表3中列出的小分子达三天。
EP分化3天后，吸去培养基，然后用4%低聚甲醛(VWR, 97.131.000)室温固定细胞30分钟。细胞用PBS洗涤并用0.5% Triton X-100 (Sigma, 9002-93-1)透化10分钟，洗涤并在0.5% TNB-缓冲液(Perkin Elmer)中室温封闭30分钟。将第一抗体，绵羊抗-NGN3 (R&D*** #AF3444)和兔抗-NKX2.2 (Sigma #HPA003468)分别在0.1% Triton X-100/PBS中1:1000和1:500稀释，加入各个孔中以在4℃过夜孵育。用PBS洗涤细胞3次。将DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚, Applichem, A4099.0010)和第二抗体，Alexa Fluor 488驴-抗山羊和Alexa Fluor 594驴抗-兔(均为Invitrogen)在0.1% Triton X-100/PBS中1:1000稀释，并加入每个孔中维持45分钟。将细胞洗涤5次，保持在200µL PBS中用于成像。
成像使用InCell分析仪2000 (GE Healthcare)进行。用10× 物镜捕获4个视野/孔。总细胞数目基于DAPI复染，NGN3/NKX2.2双阳性细胞数目使用InCell DeveloperToolbox 1.8 (GE Healthcare)测定。将NGN3/NKX2.2双阳性细胞分数使用InCelldeveloper toolbox软件(GE Healthcare)定量，归一化至每个板的组合方案K&N并计算%效果(%效果NGN3/NKX2.2双阳性= ((S-Sneg)/(│Spos-Sneg│))*100)。其中S为给定化合物组合的% NGN3/NKX2.2双阳性细胞，Sneg和Spos分别为阴性对照和组合方案K&N的% NGN3/NKX2.2双阳性细胞)。超过150%效果的值归类为命中。
已经发现多个分子促进PE细胞向EP细胞分化。这些分子在下表3中列出。
此外，通过加入靶向γ-分泌酶、JNK、Rho激酶、P38MAPK、SYK、DNA-PK、PI3K、PDGFR、FGFR或EGFR的小抑制剂甚至可进一步提高通过NGN3/NKX2.2双阳性细胞测量的该组合方案的效率。
结果在下表4和图3中示出。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Figure DEST_PATH_IMAGE004
Figure DEST_PATH_IMAGE006
Figure DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE010
Figure DEST_PATH_IMAGE012
表4：%效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞
化合物 %效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞
实施例2的方法 100
实施例2的方法 + 10 µM JNK VIII 308
实施例2的方法 + 5 µM JNK VIII 315
实施例2的方法 + 1 µM JNK VIII 204
实施例2的方法 + 0.5 µM JNK VIII 156
实施例2的方法 + 0.1 µM JNK VIII 160
实施例2的方法 + 10 µM Rockout 199
实施例2的方法 + 5 µM Rockout 208
实施例2的方法 + 5 µM 吉非替尼 325
实施例2的方法 + 1 µM 吉非替尼 311
实施例2的方法 + 0.5 µM 吉非替尼 242
实施例2的方法 + 0.1 µM 吉非替尼 222
实施例2的方法 + 10 µM BPIQ-I 350
实施例2的方法 + 10 µM PD174265 274
实施例2的方法 + 5 µM PD174265 374
实施例2的方法 + 1 µM PD174265 240
实施例2的方法 + 10 µM p38抑制剂III 153
实施例2的方法 + 5 µM p38抑制剂III 191
实施例2的方法 + 5 µM PD169316 154
实施例2的方法 + 1 µM PD169316 152
实施例2的方法 + 10 µM DMBI 231
实施例2的方法 + 5 µM DMBI 167
实施例2的方法 + 1 µM Syk抑制剂 157
实施例2的方法 + 1 µM PD98059 165
实施例2的方法 + 5 µM DNA-PK抑制剂V 370
实施例2的方法 + 5 µM TGFbRI抑制剂III 182
实施例2的方法 + 25 µM DAPT 300
实施例2的方法 + 2.5 µM DAPT 350
实施例2的方法 + 0.5 µM DAPT 150
实施例2的方法 + 50 µM L6 150
实施例2的方法 + 500 nM CompE 395
实施例2的方法 + 50 nM CompE 325
实施例2的方法 + 5nM CompE 250
实施例5：小分子组合诱导的PE向EP的分化
在下列条件下检验了表3的某些分子和其组合诱导和增加PE向EP分化的能力。
根据实施例2制备EP细胞群。然而，除了实施例2中使用的试剂外，EP分化的三天期间单独或组合加入表3中列出的某些小分子。
EP分化3天后，吸去培养基，然后用4%低聚甲醛(VWR, 97.131.000)室温固定细胞30分钟。细胞用PBS洗涤并用0.5% Triton X-100 (Sigma, 9002-93-1)透化10分钟，洗涤并在0.5% TNB-缓冲液(Perkin Elmer)中室温封闭30分钟。将第一抗体，绵羊抗-NGN3 (R&D*** #AF3444)和兔抗-NKX2.2 (Sigma #HPA003468)分别在0.1% Triton X-100/PBS中1:1000和1:500稀释，加入各个孔中以在4℃过夜孵育。用PBS洗涤细胞3次。将DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚, Applichem, A4099.0010)和第二抗体，Alexa Fluor 488驴-抗山羊和Alexa Fluor 594驴抗-兔(均为Invitrogen)在0.1% Triton X-100/PBS中1:1000稀释，并加入每个孔中维持45分钟。将细胞洗涤5次，保持在200µL PBS中用于成像。
成像使用InCell分析仪2000 (GE Healthcare)进行。用10× 物镜捕获4个视野/孔。总细胞数目基于DAPI复染，NGN3/NKX2.2双阳性细胞数目使用InCell DeveloperToolbox 1.8 (GE Healthcare)测定。将NGN3/NKX2.2双阳性细胞分数使用InCelldeveloper toolbox 软件(GE Healthcare)定量，归一化至每个板的组合方案K&N并计算%效果(%效果NGN3/NKX2.2双阳性= ((S-Sneg)/(│Spos-Sneg│))*100)。其中S为对于一个给定化合物组合的% NGN3/NKX2.2双阳性细胞，Sneg和Spos分别为阴性对照和组合方案K&N的%NGN3/NKX2.2双阳性细胞。
结果以%效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞的形式在下表5和图4中示出。结果显示当DAPT与JNK抑制剂VIII或吉非替尼或JNK抑制剂III加吉非替尼一起加入时实施例2和4的方案的分化效率增加。
表5：%效果NGN3/NKX2.2双阳性细胞
Figure DEST_PATH_IMAGE014
尽管本发明的某些特征已经在本文中说明和描述，但现在本领域普通技术人员将想到许多修饰、取代、变更和等同物。因此，应理解的是，所附权利要求书意在涵盖落在本发明真实精神内的所有这些修饰和变更。
参考文献
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Claims (14)

1.用于获得NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的方法，其中将包含胰内胚层细胞的细胞群同时暴露于基础培养基中的：
a)TGF-βI型受体抑制剂，
b)BMP拮抗剂，其中所述BMP拮抗剂为头蛋白(noggin)，
c)腺苷酸环化酶激活剂，和
d)烟酰胺。
2.权利要求1的方法，其中所述TGF-βI型受体抑制剂为SB431542。
3.权利要求1或2的方法，其中所述腺苷酸环化酶激活剂为弗斯扣林(forskolin)。
4.权利要求1或2的方法，其中所述内分泌祖细胞为至少8％效果NGN3/NKX2.2双阳性。
5.权利要求1或2的方法，其中所述内分泌祖细胞为至少10％效果NGN3/NKX2.2双阳性。
6.权利要求1或2的方法，其中所述内分泌祖细胞为10-100％效果NGN3/NKX2.2双阳性。
7.权利要求1或2的方法，其中所述基础培养基为RPMI1640。
8.权利要求1或2的方法，其中将内分泌祖细胞另外暴露于DNA-PK抑制剂V、吉非替尼(gefitinib)、JNK抑制剂VIII或DAPT或前述分子的任何组合。
9.权利要求8的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DNA-PK抑制剂V组合。
10.权利要求8的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII和DAPT组合。
11.权利要求8的方法，其中将吉非替尼、JNK抑制剂VIII、DAPT和DNA-PK抑制剂V组合。
12.权利要求8的方法，其中使用1-100μM吉非替尼、1-100μM JNK抑制剂VIII、0.5-50μMDAPT和1-100μM DNA-PK抑制剂V。
13.权利要求8的方法，其中使用1-10μM吉非替尼、5-20μM JNK抑制剂VIII、1-10μMDAPT和1-10μM DNA-PK抑制剂V。
14.包含头蛋白、TGF-βI型受体抑制剂、腺苷酸环化酶激活剂和烟酰胺的组合物用于从胰内胚层细胞诱导NGN3/NKX2.2双阳性内分泌祖细胞的用途。
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Yuya Kunisada et al..Small molecules induce efficient differentiation into insulin-producing cells from human induced pluripotent stem cell.《Stem cell research》.2011,第8卷(第2期),图2和图4，第278页第2栏倒数第1段，第279页第1栏第1段. *
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