CN113728090B - 从干细胞衍生的定形内胚层生成胰腺内胚层 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从人多能干(PS)细胞衍生的人定形内胚层有效地生成胰腺内胚层的方法。本发明还涉及通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞。最后，本发明涉及包含RAR拮抗剂的培养基和组合物以及所述RAR拮抗剂在诱导胰腺内胚层细胞中的用途。本发明提供了效率提高的更均质且同步的胰腺细胞群体。

Description

从干细胞衍生的定形内胚层生成胰腺内胚层
技术领域
本发明涉及从人多能干（PS）细胞衍生的人定形内胚层有效地生成胰腺内胚层的方法。
背景技术
β细胞（BC）移植可能提供最终治愈I型糖尿病的方法。然而，供体β细胞的有限可获得性限制了这种治疗作为临床疗法的应用。多能干（PS）细胞可以无限增殖并分化为多种细胞类型。因此，PS细胞是β细胞的有希望的来源，但在PS细胞能够用来治疗糖尿病之前，它们需要有效且可重复地分化为胰腺细胞。
在脊椎动物胚胎发育过程中，多能细胞产生三个胚层：外胚层、中胚层和内胚层。定形内胚层（DE）的诱导是形成内胚层衍生组织的第一步。从DE细胞生成胰腺内胚层（PE）是生成产生胰岛素的β细胞所必需的。具有成为内分泌祖细胞（EP）潜力的PE细胞的特征在于PDX1和NKX6.1这两种重要转录因子的共表达。
已经建立了用于从PS细胞生成胰腺细胞的逐步体外分化方案。这些方案通常模拟胰腺发育的主要事件，其包括几个阶段，如形成共表达SOX17和FOXA2的DE、原肠、后前肠、PE、EP和最终的成熟β细胞。迄今为止，已经通过激活蛋白A处理实现了hES细胞的有效DE分化。生成胰腺β细胞的下一个主要步骤是生成共表达PDX1和NKX6.1的PE。几个研究小组已经开发了可以将PS细胞分化为DE和PE的体外方案，并且几乎所有已发表的方案都包括在PE诱导中添加视黄酸受体（RAR）激动剂的步骤。
1型糖尿病患者可以通过移植来自人类供体的胰岛进行治疗，一些患者实现了胰岛素非依赖性。然而，供体胰岛稀缺且质量参差不齐，而源自多能干细胞的产生胰岛素的细胞为胰岛提供了有吸引力的替代方案。一个关键的分化步骤是从定形内胚层（DE）向胰腺内胚层（PE）的分化，其特征在于PDX1和NKX6.1的共表达，但效率低于之前向DE的分化步骤并且常常观察到批次间差异。PE诱导效率的提高将增加能够形成β细胞的内分泌祖细胞（EP）的数目，并且还减少不需要的细胞类型的数目。批次间的分化效率差异是众所周知的问题，而随着我们转向大规模生产过程和临床试验，提高分化稳定性将至关重要。因此，分化方案必须在所有阶段都进行优化，以在最后一步产生大量功能性β细胞（BC）。因此，需要提高当前分化方案的效率和稳定性，这对于这些细胞向内分泌谱系的进一步发育至关重要。
发明内容
本发明通过提供增加NKX6.1/PDX1双阳性细胞比例的方法，提高了人PS细胞向成熟β细胞分化的效率，NKX6.1/PDX1双阳性是定向于胰腺命运的PE细胞的标志。
此外，本发明提供了更有效、更均质且同步的胰腺细胞群体，这对于这些细胞向内分泌谱系的进一步发育至关重要。
在一方面，本发明涉及从人多能干（PS）细胞衍生的人定形内胚层诱导胰腺内胚层细胞的方法。
在一方面，本发明涉及从人多能干（PS）细胞衍生的人定形内胚层诱导胰腺内胚层前体细胞的方法，其中所述方法包括将定形内胚层与RAR拮抗剂一起培养的步骤。
在一方面，本发明涉及从人多能干（PS）细胞衍生的人定形内胚层诱导胰腺内胚层细胞的方法，其中所述方法包括将所述定形内胚层与RAR拮抗剂一起培养以获得胰腺内胚层前体，随后通过将所述胰腺内胚层前体与RAR激动剂一起培养来诱导胰腺内胚层细胞的步骤。
在一方面，本发明涉及将源自人多能干细胞的定形内胚层细胞分化为胰腺内胚层前体的方法，其包括在包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂的培养基中培养定形内胚层（DE）的步骤。
在一方面，本发明的方法进一步包括在包含RAR激动剂的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体，从而诱导胰腺内胚层（PE）的步骤，其中所述细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一方面，本发明涉及可通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞或胰腺内胚层细胞前体。
在另一方面，本发明涉及可通过本发明的方法获得的同步胰腺内胚层细胞或同步胰腺内胚层细胞前体。
在一方面，本发明涉及包含RAR拮抗剂和RAR激动剂的培养基和/或组合物。
在一方面，本发明涉及通过以下步骤产生的胰腺内胚层细胞：将源自人多能干细胞的定形内胚层暴露于RAR拮抗剂以获得胰腺内胚层前体，随后将所述胰腺内胚层前体暴露于RAR激动剂以获得胰腺内胚层。
在一方面，本发明涉及RAR拮抗剂从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层前体的用途。
在一方面，本发明涉及使用RAR拮抗剂，随后使用RAR激动剂，从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞。
在一方面，本发明涉及生物反应器，其包含通过本发明的方法获得的胰腺内胚层前体细胞或胰腺内胚层细胞群体。
在一方面，本发明提供了改进的胰腺内胚层细胞群体，即，NKX6.1+/PDX1+双阳性细胞比例增加的PE。
在一方面，本发明提供了更均质的胰腺内胚层细胞群体。
在一方面，本发明提供了更同步的胰腺内胚层细胞群体。
本发明也可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
附图说明
图1显示了通过FACS分析评价的AGN 193109与标准PE诱导方案相比对PE分化第10天（PE10）时Pdx1/Nkx6.1表达的影响。该图显示了在比较标准PE与AGN 193109处理的4个独立实验中Pdx1/Nkx6.1双阳性细胞的百分比平均值（1A），以及来自代表性实验的FACS图的一个示例（1B）。另外，我们还显示了当使用标准方案应用于非最佳诱导时，AGN193109对PE10诱导的影响的示例（1C）。
图2显示了AGN 193109对胰腺内胚层标志物的表达的影响。图2A显示了在PE2-3由AGN193109抑制RA信号传导或由AM580激活RA信号传导对PE10时胰腺内胚层标志物Nkx6.1、CPA1、Ptf1a和Dlk1的表达的影响，这通过基因表达的Nanostring 分析进行评价。图2B显示了与AGN 193109处理相比，在标准方案中，PE11时Dlk1相对于Nkx6.1的表达的FACS图。
图3显示了AGN1931091对PE10时过早内分泌分化的影响。图3A显示了与标准方案相比，在PE2-3由AGN193109抑制RA信号传导以及由AM580激活RA信号传导对胰腺内胚层阶段的胰腺内分泌标志物NeuroD和Ngn3的影响，这通过基因表达的Nanostring分析进行评价。图3B显示了与PE2-3时的AGN 193109处理相比，在标准方案中PE10时胰腺内分泌标志物Nkx2.2的表达的FACS图。
图4显示了与标准方案相比，在PE2-3由AM580激活RAR以及由AGN 193109抑制RAR对胰腺内胚层诱导的影响，这通过对PE10时Pdx1/Nkx6.1的FACS分析进行评价。
图5显示了在2个实例中，AGN 193109对PE诱导的剂量响应效应，这通过对PE10时Pdx1/Nkx6.1的FACS分析进行评价。在一项实验中，我们在PE2-3测试了1、3和10 µM AGN193109的浓度（5A）。在另一个实验中，我们在PE2-3测试了0.5、1、10和20µM AGN193109的浓度（5B）。
图6显示了AGN 193109的时间选择的影响，这通过对PE10时Pdx1/Nkx6.1的FACS分析进行评价。在一项实验中，我们在PE0-3的4天LDN阶段，将10µM AGN 193109的暴露时间从2天（PE2-3）增加到3天（PE1-3）或4天（PE0-3）（6A）。在另一个实验中，我们用10µM AGN193109维持2天处理，并将LDN193109（LDN）阶段从4天缩短到3天或2天（6B）。
图7显示了PE2-3时的AGN 193109对BC阶段细胞诱导的影响，这通过在β细胞分化第6至9天（BC6-9）对C-肽（C-pep）、Nkx6.1和胰高血糖素表达的FACS分析进行评价。图7A显示了在PE2-3比较标准方案与AGN 193109处理的4个独立实验中，C-pep/Nkx6.1双阳性细胞的百分比平均值。图7B显示了将标准方案与AGN 193109处理进行比较的代表性示例。
图8显示了在生物反应器中使用AGN 193109的方案的功能，这通过对PE10时Pdx1/Nkx6.1的FACS分析进行评价。该图显示了在PE2-3添加和不添加10 µM AGN193109的情况下，在生物反应器（DASgip，Eppendorf）中的1L罐中运行的2个代表性实验的示例。
图9显示了冷冻保存并在BC3解冻后，对用标准PE方案或AGN193109处理的细胞延长培养的BC表型，这通过对BC6和BC13时C-pep/Nkx6.1的FACS分析进行评价。
实施方式
本发明涉及从源自人多能干细胞的定形内胚层生成胰腺内胚层前体和胰腺内胚层的方法。
本发明涉及将源自人多能干细胞的定形内胚层细胞分化为NKX6.1+/PDX1+双阳性胰腺内胚层的方法，其包括在包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂的培养基中培养定形内胚层以获得胰腺内胚层前体的步骤，以及随后在包含视黄酸受体激动剂的培养基中培养所述胰腺内胚层前体的步骤。
本发明提供了效率提高的更均质且同步的胰腺内胚层细胞群体。
转录因子NKX6.1和PDX1是PE细胞群体的标志物，这是获得内分泌细胞群体所必需的细胞阶段之一。增加NKX6.1/PDX1双阳性细胞在PE细胞群体中的比例会提高效率。
本发明的分化方法显著增加了PE细胞群体中NKX6.1/PDX1+双阳性细胞的比例，即具有更高的效率。
此外，本发明提供了更均质且同步的胰腺内胚层细胞群体，这对于这些细胞向内分泌谱系的进一步发育，即发育为β细胞或产生胰岛素的细胞至关重要。
在本发明中，我们描述了提高PE诱导效率和稳定性的方法，这也提高了进一步分化为产生胰岛素的β细胞的效率。
通过在PE方案的第一阶段（LDN阶段，即被称为PE0-PE3的4天）包括视黄酸受体（RAR）拮抗剂（AGN 193109），我们可以显著增加在含有视黄酸受体激动剂的第二阶段（即被称为PE4-PE11的8天）的PE诱导（PDX1+/NKX6.1+胰腺内胚层的百分比）。此外，我们减少了批次间差异并稳定了PE诱导。最后，胰腺内胚层的质量得到改善，因为Ptf1a（PE的另一种标志物）的表达增加。
在本发明中，我们还描述了DLK1作为胰腺内胚层的标志物，并表明DLK1主要在PDX1+/NKX6.1-高细胞中表达。DLK1是表面标志物，并且可用于通过使用诸如FACS或MACS等方法进行活细胞分选，在胰腺内胚层阶段富集胰腺内胚层。
PE细胞可分化为EP细胞，EP细胞可进一步分化为BC细胞。最后，PE步骤的改进导致BC分化效率的整体提高，从而产生更高数目的C-pep/NKX6.1双阳性细胞。
定义：
干细胞
干细胞是由其在单细胞水平上自我更新和分化以产生子代细胞的能力来定义的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、非更新的祖细胞以及最终分化的细胞。干细胞的特征还在于其由多个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）体外分化成各种细胞谱系的功能性细胞的能力，以及其在移植后产生多个胚层的组织并且在注射到胚泡中后对大多数（如果不是全部的话）组织有显著贡献的能力。
干细胞按其发育潜力分类为：（1）全能的，意思是能够产生所有胚胎细胞类型和胚胎外细胞类型；（2）多能的（pluripotent），意思是能够产生所有胚胎细胞类型；（3）多潜能的（multi-potent），意思是能够产生细胞谱系的子集，但是全部都在特定组织、器官或生理***内（例如，造血干细胞（HSC）可以产生包括HSC（自我更新）、血细胞限制性寡能祖细胞以及作为血液正常组分的所有细胞类型和元素（例如血小板）在内的子代）；（4）寡能的，意思是能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子集；以及（5）单能的，意思是能够产生单细胞谱系（例如生精干细胞）。
人多能干细胞
如本文所用的，“人多能干细胞”（hPSC）是指可来自任何来源的并且在适当条件下能够产生不同细胞类型的人子代的细胞，所述细胞类型是所有3个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的衍生物。hPSC可具有在8-12周龄的SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力和/或在组织培养中形成所有三个胚层的可识别细胞的能力。在人多能干细胞的定义中包括各种类型的胚胎细胞，包括人胚泡衍生的干（hBS）细胞，它们在文献中通常表示为人胚胎干（hES）细胞（参见，例如，Thomson等人（1998）、Heins等人（2004））以及诱导的多能干细胞（参见，例如，Yu等人（2007）；Takahashi等人（2007））。本文描述的各种方法和其他实施方案可能需要或利用来自多种来源的hPSC。例如，适合使用的hPSC可以从发育中的胚胎中获得。另外地或备选地，合适的hPSC可以从已建立的细胞系和/或人诱导多能干（hiPS）细胞获得。
如本文所用的，“hiPSC”是指人诱导多能干细胞。
ES细胞系还可以源自单个***球，而不会破坏子宫外胚胎，也不会影响临床结果（Chung等人（2006）和Klimanskaya等人（2006））。
胚泡衍生的干细胞
如本文所用的，术语“胚泡衍生的干细胞”被表示为BS细胞，而人形式被称为“hBS细胞”。在文献中，该细胞通常被称为胚胎干细胞，更具体地称为人胚胎干细胞（hESC）。因此，本发明中使用的多能干细胞可以是由胚泡制备的胚胎干细胞，如在例如WO 03/055992和WO 2007/042225中所述，或者是可商购的hBS细胞或细胞系。然而，进一步想到任何人多能干细胞均可用于本发明，包括通过例如用某些转录因子（例如，Yu等人（2007）、Takahashi等人（2007）以及Yu等人（2009）所公开的OCT4、SOX2、NANOG和LIN28）处理成体细胞而重新编程为多能细胞的分化成体细胞。
在一个实施方案中，包含PE细胞的细胞群体从体细胞群体中获得。在另一个实施方案中，体细胞群体已被诱导而去分化为胚胎样干（ES，例如多能）细胞。这类去分化的细胞也被称为诱导多能干细胞（iPSC）。
在一个实施方案中，包含PE细胞的细胞群体从胚胎干（ES，例如多能）细胞获得。在另一个实施方案中，包含胰腺细胞的细胞群体是多能细胞，如ES样细胞。
在一个实施方案中，包含PE细胞的细胞群体是胚胎分化的干（ES或多能）细胞。分化发生在胚状体和/或单层细胞培养物或其组合中。
在一个实施方案中，所述细胞群体是干细胞群体。在另一个实施方案中，所述细胞群体是分化成胰腺内胚层谱系的干细胞群体。
在一个实施方案中，进一步分化的干细胞是人胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
分化
如本文所用的，“分化”是指细胞从未分化状态进展至分化状态、从未成熟状态进展至较成熟状态或从未成熟状态进展至成熟状态的过程。例如，早期未分化的胚胎胰腺细胞能够增殖并表达特征性标志物，如PDX1、NKX6.1和PTF1a。成熟的或分化的胰腺细胞不增殖并且能分泌高水平的胰腺内分泌激素或消化酶。例如，完全分化的β细胞响应于葡萄糖以高水平分泌胰岛素。当细胞失去未分化细胞的标志物或获得分化细胞的标志物时，发生细胞相互作用和细胞成熟的变化。单个标志物的丢失或获得可以表明细胞已经“成熟或完全分化”。
术语“分化因子”是指添加到胰腺细胞中以增强其向成熟内分泌细胞（也包含产生胰岛素的β细胞）分化的化合物。
示例性分化因子包括肝细胞生长因子、角质形成细胞生长因子、毒蜥外泌肽-4、碱性成纤维细胞生长因子、***-1、神经生长因子、表皮生长因子、血小板衍生的生长因子和胰高血糖素样肽1。
在一个实施方案中，细胞的分化包括在包含一种或多种分化因子的培养基中培养细胞。
定形内胚层细胞（DE细胞）
定形内胚层细胞的特征在于标志物SOX17的表达。DE的其他标志物是FOXA2和CXCR4。
如本文所用的“SOX17”（SRY-框17）是参与胚胎发育调节和细胞命运确定的转录因子SOX（SRY相关HMG-框）家族的成员。
如本文所用的“FOXA2”（叉头框A2）是叉头类别的DNA结合蛋白的成员。
如本文所用的“CXCR4”（C-X-C基序趋化因子受体4）是对基质细胞衍生的因子-1具有特异性的CXC趋化因子受体。
DE诱导方案的非限制性实例是常规D'Amour方案（Novocell, Nature Biotec2006, 2008）和WO2012/175633（通过引用将其整体并入本文）中描述的方案。
在一个实施方案中，本发明方法的DE细胞为SOX17+阳性。
在一个实施方案中，本发明方法的DE细胞为SOX17+/FOXA2双阳性的。
在一个实施方案中，本发明方法的DE细胞为SOX17+/FOXA2+/CXCR4+三阳性。
胰腺内胚层前体
如本文所用的，“胰腺内胚层前体”或“胰腺内胚层细胞前体”是通过在包含RAR拮抗剂的培养基中培养源自人多能干细胞的定形内胚层细胞而获得的细胞。
这些细胞在包含RAR激动剂的培养基中进一步培养时导致如下定义的胰腺内胚层细胞的诱导。
胰腺内胚层细胞（PE细胞）
胰腺内胚层细胞的特征在于至少5% NKX6.1+/PDX1+双阳性的标志物的表达。PE的其他标志物是PTF1A和CPA1。
如本文所用的“PDX1”是指参与胰腺发育的同源域转录因子。
如本文所用的“NKX6.1”是NKX转录因子家族的成员。
如本文所用的“PTF1A”是作为胰腺转录因子1复合物（PTF1）的组分并且已知在哺乳动物胰腺发育中起作用的蛋白质。
如本文所用的“CPA1”是锌金属蛋白酶的羧肽酶A家族的成员。这种酶在胰腺中产生。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中所述细胞为NKX6.1+/PDX1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中至少5%的所述PE细胞共表达PDX1和NKX6.1。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中至少5%、至少10%、10-30%、10-40%、5-70%、10-80%或5-100%的所述PE细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中至少70%的所述PE细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中至少80%的所述PE细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中至少90%的所述PE细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中至少95%的所述PE细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中至少98%的所述PE细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中80-100%的所述PE细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中90-100%的所述PE细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的体外或体内胰腺内胚层细胞群体。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的体外胰腺内胚层细胞群体。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的体内胰腺内胚层细胞群体。
在一个实施方案中，本发明提供了胰腺内胚层细胞群体，其具有增加的PDX1和NKX6.1的共表达，即具有增加的PDX1+/NKX6.1+双阳性细胞的表达。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞群体，其具有增加的PDX1+/NKX6.1+双阳性细胞的表达。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞群体，其中所述胰腺内胚层细胞为至少70% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞群体，其中所述胰腺内胚层细胞为80-100% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞群体，其中所述胰腺内胚层细胞为90-100% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明提供了具有较短的LDN阶段的方法，从而缩短LDN阶段。
在一个实施方案中，本发明提供了具有较短的LDN阶段的方法，从而将LDN阶段缩短一半，即缩短至两天。
在一个实施方案中，本发明涉及持续时间比标准方法更短的方法，从而将LDN阶段缩短至两天。
增加功能性β细胞产量的另一种方法涉及在分化过程中的某个阶段对活细胞进行分选。在胰腺内胚层阶段进行分选将会有吸引力，因为在该步骤中所需的细胞定向于胰腺谱系。这种方法需要使用识别表面抗原的抗体，从而允许活细胞分选。在此，我们描述了Delta样非规范Notch配体1（DLK1）作为人ES细胞衍生的胰腺内胚层的表面标志物的发现。
同步的PE群体是这样一种群体，即在将诱导内分泌分化的信号施加至细胞培养物之前，不会发生任何过早的向内分泌祖细胞（EP）的进一步分化。在PE阶段的过早的内分泌分化是许多已发表方案的共同特征。同步的PE群体的优势在于它允许更好地控制内分泌谱系和β细胞的诱导。
获得同步细胞是一个优势，因为它会产生更均质的细胞群体来继续进一步分化为β细胞或产生胰岛素的细胞。
β细胞阶段的分化细胞的移植显示了以下趋势：添加AGN193109提高了β细胞与α细胞之比，这意味着在移植后8周，经AGN193109处理，胰岛素阳性细胞相对于胰高血糖素阳性细胞的比例更高，这通过免疫组织化学和定量图像分析进行评价。
如本文所用的“DLK1”是包含多个表皮生长因子重复序列的跨膜蛋白，其充当细胞生长的调节物。编码的蛋白质参与几种细胞类型的分化。DLK1是一种非规范notch配体。
如本文所用的“NKX2.2”是一种同源域转录因子。Nkx2.2是胰腺发生（pancreagenesis）过程中适当的胰岛细胞谱系特化（specification）的关键调节物。
在一个实施方案中，本发明提供了PE内胚层细胞群体，其将被更具选择性地、更均质地且更有效地诱导为EP细胞和β细胞群体。
在一个实施方案中，通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞群体更均质且更同步，从而更有效地诱导为EP细胞和β细胞群体。
此外，DLK1是一种表面标志物，其在具有改善的PDX1/NKX6.1表达的PE细胞群体中高度表达。
在一个实施方案中，可通过本发明的方法获得的PE细胞为DLK1阳性。
在一个实施方案中，可通过本发明的方法获得的PE细胞表达至少5%的DLK1。
在一个实施方案中，可通过本发明的方法获得的PE细胞表达5-30%的DLK1。
在一个实施方案中，本发明涉及PE细胞群体，其中所述细胞为DLK1阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及PE的表面标志物DLK1，其中所述细胞为NKX6.1+/PDX1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及PE的表面标志物DLK1，其中所述细胞为约80%NKX6.1+/PDX1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及PE的表面标志物DLK1，其中所述细胞为超过80%NKX6.1+/PDX1+双阳性。
在一个实施方案中，本发明提供了改进的PE细胞群体，其具有至少5%的DLK1表达。
在一个实施方案中，本发明提供了改进的PE细胞群体，其具有至少10%的DLK1表达。
在一个实施方案中，本发明提供了改进的PE细胞群体，其具有至少20%的DLK1表达。
在一个实施方案中，本发明提供了改进的PE细胞群体，其具有至少30%的DLK1表达。
在一个实施方案中，本发明提供了改进的PE细胞群体，其具有30-80%的DLK1表达。
在一个实施方案中，本发明提供了改进的PE细胞群体，其具有20-80%的DLK1表达。
在一个实施方案中，本发明涉及源自人多能干细胞的同步细胞群体，其呈现至少70%的表达PDX1+/NKX6.1+双阳性的胰腺内胚层细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及源自人多能干细胞的同步细胞群体，其呈现至少70%的表达PDX1+/NKX6.1+双阳性的胰腺内胚层细胞，其中所述细胞群体进一步表达PTF1a。
在一个实施方案中，本发明涉及源自人多能干细胞的同步细胞群体，其呈现至少70%的表达PDX1+/NKX6.1+双阳性的胰腺内胚层细胞，其中所述细胞群体进一步表达5-30%的DLK1。
在一个实施方案中，本发明涉及源自人多能干细胞的同步细胞群体，其呈现至少70%的表达PDX1+/NKX6.1+双阳性且表达少于1% NKX2.2的胰腺内胚层细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及源自干细胞的同步细胞群体，其呈现少于1%的NKX2.2阳性。
在一个实施方案中，可通过本发明的方法获得的PE细胞为少于1% NKX2.2阳性。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其中所述PE细胞为少于1%NKX2.2阳性。
在一个实施方案中，本发明提供了更均质且同步的胰腺内胚层细胞群体，即在PE阶段的过早内分泌分化诱导较低，其以NGN3和NeuroD的表达降低为标志。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞群体，其具有降低的NGN3和NeuroD表达。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞群体，其具有降低至少2倍的NGN3和NeuroD表达。
在一个实施方案中，本发明涉及可通过本发明的方法获得的胰腺内胚层细胞群体，其中所述PE群体进一步分化为具有至少40% C-PEP+/NKX6.1+双阳性的β细胞。
内分泌祖细胞（EP细胞）
内分泌祖细胞的特征在于NGN3、NeuroD和NKX2.2标志物的表达，这些标志物是定向于内分泌细胞命运的EP细胞的标志。
如本文所用的，“EP细胞群体”是胰腺β细胞前体的群体，其中该细胞群体的至少5%为NKX6.1/NKX2.2双阳性。
如本文所用的“NGN3”是碱性环-螺旋-环转录因子的神经原素（neurogenin）家族的成员。
如本文所用的“NKX2.2”和“NKX6.1”是NKX转录因子家族的成员。
如本文所用的“NeuroD”是碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子的NeuroD家族的成员。
β细胞
如本文所用的，术语“β细胞”是指位于胰腺中被称为胰岛的小细胞簇内的细胞。β细胞的特征在于INS/NKX6.1和C-PEP/NKX6.1的共表达。
β细胞通过分泌肽激素胰岛素（INS）来响应高血糖水平，胰岛素作用于其他组织以促进从血液中摄取葡萄糖，例如在肝脏中，在其中它通过糖原合成促进能量储存。
在一个实施方案中，通过进一步诱导通过本发明方法获得的PE细胞可获得的EP细胞进一步分化为产生胰岛素的细胞，任选地还有向产生胰高血糖素、促生长素抑制素、胰多肽和/或生长素释放肽的细胞分化的细胞。
如本文所用的，“产生胰岛素的细胞”是指产生并储存或分泌可检测量的胰岛素的细胞。“产生胰岛素的细胞”可以是单个细胞或细胞集合。
在一个实施方案中，本发明提供了改进的PE细胞群体，其导致诱导具有增加的C-PEP+/NKX6.1+表达的β样细胞群体。
视黄酸受体（RAR）拮抗剂
视黄酸受体拮抗剂选择性地抵消类视黄醇对视黄酸受体亚型RARα、RARAβ和RARγ中的一种或多种的影响。
AGN 193109是一种口服活性视黄酸受体（RAR）拮抗剂，其靶向所有三种RAR亚型的亲和力（RARα/β/γ Kd = 2 nM）均高于全反式视黄酸/ATRA（RARα/β/γ Kd = 9/12/19nM）。AGN 193109在RARα、RARβ和RARγ转染的CV-1细胞中有效地拮抗ATRA诱导的转录（等摩尔AGN 193109针对ATRA，分别为85%、62%和100%）。AGN 193109还广泛地用于在小鼠和大鼠中通过口服（1-10 mg/kg）或局部（0.3-36 μmol/kg）给药在体内阻断RAR介导的生理和病理过程。
RAR拮抗剂的非限制性实例包括AGN193109、AGN 194431、AGN 194301、SR 11335、BMS 453、BMS 195614、LE 135、LG 100815、MM11253、CD 2665、ER 50891。
在一个实施方案中，所述RAR拮抗剂选自但不限于AGN193109、AGN 194431、AGN194301、SR 11335、BMS 453、BMS 195614、LE 135、LG 100815、MM11253、CD 2665和ER50891。
在一个实施方案中，所述RAR拮抗剂是AGN193109。
在一个实施方案中，本发明涉及将源自人多能干细胞的定形内胚层细胞分化为胰腺内胚层前体细胞的方法，其包括在包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂的培养基中培养定形内胚层的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及将源自人多能干细胞的定形内胚层细胞分化为胰腺内胚层前体细胞的方法，其包括在包含AGN 193109的培养基中培养定形内胚层的步骤。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其包括在包含RAR拮抗剂的培养基中培养DE以获得胰腺内胚层前体的第一步，以及随后在包含RAR激动剂的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体的第二步。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其包括在包含AGN 193109的培养基中培养DE以获得胰腺内胚层前体的第一步，以及随后在包含AM580的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体的第二步。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其包括在包含RAR拮抗剂的培养基中培养DE以获得胰腺内胚层前体的第一步，以及随后在包含RAR激动剂、成纤维细胞生长因子和Rock抑制剂以及可选的BMP抑制剂的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体的第二步。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其包括在包含RAR拮抗剂的培养基中培养DE以获得胰腺内胚层前体的第一步，以及随后在包含RAR激动剂、FGF2和Tiger或Y27632以及可选的LDN193189的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体的第二步。
在一个实施方案中，本发明涉及使用RAR拮抗剂从源自人多能干细胞的定形内胚层诱导胰腺内胚层前体细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及使用RAR拮抗剂从源自人多能干细胞的定形内胚层诱导胰腺内胚层前体细胞，随后用RAR激动剂处理所述胰腺内胚层前体细胞以诱导胰腺内胚层。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度在0.5-100 µM、1-50 µM、1-300 µM、1-250 µM、1-20 µM、3-17 µM、5-15 µM或7-12 µM范围内的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度在0.5-100μΜ范围内的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度在0.5-50 μΜ范围内的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度在0.5-30 μΜ范围内的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度在0.5-25 μΜ范围内的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度在0.5-20 μΜ范围内的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度在1-20 μΜ范围内的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度在10-20 μΜ范围内的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度在7-12 μΜ范围内的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度约为10μΜ的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度约为15μΜ的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明的方法包括浓度约为20μΜ的RAR拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明涉及使用RAR拮抗剂，随后使用RAR激动剂，从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及使用浓度在0.5-100μΜ范围内的RAR拮抗剂，随后使用RAR激动剂，从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及使用浓度为10μΜ的RAR拮抗剂从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层前体细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及使用浓度为10μΜ的RAR拮抗剂，随后使用RAR激动剂，从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及使用浓度为20μΜ的RAR拮抗剂从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层前体细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及使用浓度为20μΜ的RAR拮抗剂，随后使用RAR激动剂，从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及使用与LDN组合的RAR拮抗剂，随后使用AM580，从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及在通过用RAR激动剂处理胰腺内胚层前体细胞诱导胰腺内胚层细胞之前，使用RAR拮抗剂改善胰腺内胚层前体细胞的同步化。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其包括在包含RAR拮抗剂的培养基中培养DE以获得胰腺内胚层前体的第一步，以及随后在包含RAR激动剂的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体的第二步，其中所述第一步的持续时间为1小时至6天或1至4天。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其包括在包含RAR拮抗剂的培养基中培养DE以获得胰腺内胚层前体的第一步，以及随后在包含RAR激动剂的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体的第二步，其中所述第一步的持续时间为两天。
在一个实施方案中，本发明涉及将DE分化为PE的方法，其包括在包含RAR拮抗剂的培养基中培养DE以获得胰腺内胚层前体的第一步，以及随后在包含RAR激动剂的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体的第二步，其中所述第一步的持续时间少于两天。
视黄酸受体（RAR）激动剂
视黄酸受体激动剂选择性地结合并激活视黄酸受体亚型RARα、RARAβ和RARγ中的一种或多种。
RAR激动剂的非限制性实例包括AM580、全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、AC 261066、AC 55649、阿达帕林（Adapalene）、AM 80、BMS 753、BMS 961、CD 1530、CD 2314、CD 437、Ch55、异维A酸（Isotretinoin）、他扎罗汀（Tazarotene）、TTNTB和EC19。
在一个实施方案中，所述RAR激动剂是AM580。
在一个实施方案中，本发明涉及在RAR拮抗剂之后使用浓度在0.05-10μΜ范围内的RAR激动剂从人多能干细胞诱导胰腺内胚层细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及在RAR拮抗剂之后使用浓度为1μΜ的RAR激动剂从人多能干细胞诱导胰腺内胚层细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及在RAR拮抗剂之后使用浓度为10μΜ的RAR激动剂从人多能干细胞诱导胰腺内胚层细胞。
BMP抑制剂
骨形态发生蛋白（BMP）是局部作用于靶细胞以影响细胞存活、增殖和分化的信号分子。虽然最初被确定为骨诱导剂，但现在已知BMP会影响许多器官***的形成和功能。BMP受体拮抗剂或BMP抑制剂通过抑制ALK1、ALK2、ALK3和ALK6引起的Smad1/5/8磷酸化来特异性抑制BMP信号传导。
BMP抑制剂的非限制性实例包括LDN 193189、dorsomorphine、noggin、脊索发生素（chordin）、LDN 212854、LDN 214117、ML 347、DMH1、DMH2和K 02288。
在一个实施方案中，所述BMP抑制剂是LDN193189。
在一个实施方案中，本发明涉及RAR拮抗剂与BMP抑制剂LDN组合的用途，其中所述BMP抑制剂在25-200 nM的浓度范围内。
在一个实施方案中，本发明涉及RAR拮抗剂与BMP抑制剂LDN组合的用途，其中所述BMP抑制剂的浓度为50nM。
在一个实施方案中，本发明涉及RAR拮抗剂与BMP抑制剂LDN组合的用途，其中所述BMP抑制剂的浓度约为50nM。
ROCK抑制剂
Rho相关的含卷曲螺旋的激酶（ROCK）是RhoA小GTP酶的效应物，并且属于丝氨酸/苏氨酸激酶的AGO家族。ROCK激酶具有许多功能，包括细胞收缩、迁移、凋亡、存活和增殖。IRho相关的含卷曲螺旋的蛋白激酶ROCK抑制剂是一系列靶向并抑制rho激酶的化合物。
在一个实施方案中，所述Rock抑制剂是Tiger或Y27632。
在一个实施方案中，本发明涉及RAR拮抗剂与Rock抑制剂组合的用途，其中所述Rock抑制剂在1-20µM的浓度范围内。
在一个实施方案中，本发明涉及RAR拮抗剂与Rock抑制剂组合的用途，其中所述Rock抑制剂的浓度为5µM。
bFGF
碱性成纤维细胞生长因子（FGF），也称为FGF2，是由FGF2基因编码的生长因子和信号蛋白。
在一个实施方案中，所述生长因子是bFGF。
在一个实施方案中，本发明涉及RAR拮抗剂与bFGF组合的用途，其中所述bFGF在25-200nM的浓度范围内。
生物反应器
悬浮培养生物反应器允许在受控和可重复的培养***中大规模扩充并分化干细胞和/或其后代。这些***提供了均质的培养环境，可以监测并控制其中的条件，如温度、pH和氧浓度。此外，这些***允许在一致的培养条件下产生大量细胞，并且具有最小的培养变异性。
培养基/组合物
旨在支持微生物或细胞生长的固体、液体或半固体。不同类型的商业培养基用于培养不同类型的细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及培养基，其包含用于从源自人多能干细胞的定形内胚层生成胰腺内胚层前体的视黄酸受体（RAR）拮抗剂。
在一个实施方案中，本发明涉及培养基，其包含用于从源自人多能干细胞的定形内胚层生成胰腺内胚层前体的AGN 193109。
在一个实施方案中，本发明涉及培养基，其包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂，随后是用于从源自人多能干细胞的定形内胚层生成胰腺内胚层/PDX1+/NKX6.1+的RAR激动剂。
在一个实施方案中，本发明涉及培养基，其包含AGN 193109，随后是用于从源自人多能干细胞的定形内胚层生成胰腺内胚层/PDX1+/NKX6.1+的AM580。
在一个实施方案中，本发明涉及包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂的培养基。
在一个实施方案中，本发明涉及培养基，其包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂，随后添加视黄酸受体（RAR）激动剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及培养基，其包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂和BMP抑制剂，随后添加视黄酸受体（RAR）激动剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及培养基，其包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂、BMP抑制剂和Rock抑制剂，随后添加视黄酸受体（RAR）激动剂和Rock抑制剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及培养基，其包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂、BMP抑制剂和Rock抑制剂，随后添加视黄酸受体（RAR）激动剂、Rock抑制剂和FGF2。
在一个实施方案中，本发明涉及培养基，其包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂，其中所述RAR拮抗剂是AGN 193109，随后添加视黄酸受体（RAR）激动剂，其中所述RAR激动剂是AM580。
在一个实施方案中，本发明涉及包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂的培养基，其中所述RAR拮抗剂是AGN 193109。
在一个实施方案中，本发明涉及进一步包含BMP抑制剂LDN193189的培养基。
在一个实施方案中，本发明涉及进一步包含FGF2的培养基。
在一个实施方案中，本发明涉及进一步包含Rock抑制剂Tiger或Y27632的培养基。
在一个实施方案中，本发明涉及组合物，其包含：
a) 包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂如AGN 193109的培养基
b) 源自人多能干细胞的定形内胚层细胞和/或胰腺内胚层细胞。
方案
如本文所用的，术语“LDN阶段”是指从PE0至PE3的4天，其中前两天，即在PE0-PE1，添加LDN，并且在最后2天，即PE2-PE3，添加LDN和RAR拮抗剂。
在摇瓶或生物反应器中的悬浮培养中分化至DE阶段的细胞继续进行PE分化（WO2012/175633，其通过引用整体并入本文）。在LDN阶段向培养基中添加AGN193109两天。PE分化方案第二阶段中的PE诱导是在不改变标准方案（WO2014/033322，其通过引用整体并入本文）的情况下进行的。
从干细胞获得胰腺细胞的方案由D'Amour, K. A.等人(2006)、Jiang, J.等人(2007)、Kroon, E.等人(2008)描述的方案举例说明，但不限于此。
从体细胞或被诱导去分化为多能细胞如ES样细胞的体细胞获得胰腺细胞的方案由Aoi, T.等人(2008)、D'Amour, K. A.等人(2006)、Jiang, J.等人(2007)、Kroon, E.等人(2008)、Takahashi, K.等人(2007)、Takahashi, K.和Yamanaka, S. (2006)以及Wernig, M.等人(2007)描述的方案举例说明，但不限于此。
除非在本说明书中另有说明，否则以单数形式呈现的术语也包括复数情况。
通过以下非限制性实施方案进一步描述本发明。
1. 将源自人多能干细胞的定形内胚层细胞分化为胰腺内胚层前体的方法，其包括在包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂的培养基中培养定形内胚层（DE）的步骤。
2. 根据实施方案1所述的方法，其中所述方法进一步包括在包含RAR激动剂的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体，从而诱导胰腺内胚层（PE）的步骤，其中所述细胞为NKX6.1+/PDX1+双阳性。
3. 根据实施方案2所述的方法，其中所述培养基任选地进一步包含BMP抑制剂、生长因子和/或Rock抑制剂。
4. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂是AGN 193109。
5. 根据前述实施方案中任一项的方法，其中所述RAR激动剂是AM580。
6. 根据实施方案3-5所述的方法，其中所述可选的BMP抑制剂是LDN193189。
7. 根据实施方案3-5所述的方法，其中所述可选的生长因子是bFGF2。
8. 根据实施方案3-5所述的方法，其中所述可选的Rock抑制剂是Tiger或Y27632。
9. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。
10. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为0.5-100 µM、1-50 µM、1-300 µM、1-250 µM、1-20 µM、3-17 µM、5-15 µM或7-12 µM。
11. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为0.5-100 µM。
12. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为0.5-50 µM。
13. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为0.5-30 µM。
14. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为0.5-25 µM。
15. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为0.5-20 µM。
16. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为1-20 µM。
17. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为10-20 µM。
18. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为7-12 µM。
19. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为10µM。
20. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为15µM。
21. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度为20µM。
22. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中实施方案1的所述步骤的持续时间为1小时至6天或1至4天。
23.根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中实施方案1的所述步骤的持续时间为两天。
24. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中实施方案1的所述步骤的持续时间少于两天。
25. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中至少5%的所述胰腺内胚层细胞共表达PDX1和NKX6.1。
26. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞为至少5%、至少10%、10-30%、10-40%、5-70%、10-80%或5-100% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
27. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞为至少70% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
28. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞为至少80% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
29. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞为至少90% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
30. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞为至少95% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
31. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞为至少98% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
32. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述定形内胚层细胞为SOX17+/FOXA2+/CXCR4+三阳性。
33. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述胰腺内胚层细胞为少于1%NKX2.2阳性。
34. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法能够拯救非最佳的PE分化。
35. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法包括LDN阶段。
36. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其中所述方法比标准方法短，其中所述LDN阶段为两天。
37. 根据前述实施方案中任一项所述的方法，其包括在体外孵育所述DE细胞。
38. 根据前述实施方案1-35中任一项所述的方法，其包括在体内孵育所述DE细胞。
39. 根据前述实施方案1-35中任一项的方法，其进一步包括分离所分化的细胞。
40. 根据前述实施方案1-35中任一项的方法，其进一步包括分选所分化的细胞。
41. 胰腺内胚层细胞，其中所述胰腺内胚层细胞是根据前述实施方案中任一项的方法的产物。
42. 胰腺内胚层细胞培养物或胰腺内胚层细胞群体，其包含多个根据实施方案41的细胞。
43. 可通过实施方案1-40的方法获得的胰腺内胚层细胞。
44. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其具有增加的Nkx6.1+/Pdx1+双阳性表达。
45. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述胰腺内胚层细胞为至少70% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
46. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述胰腺内胚层细胞为至少80% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
47. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述胰腺内胚层细胞为至少90% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
48. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述胰腺内胚层细胞为至少95% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
49. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述胰腺内胚层细胞为至少98% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
50. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述胰腺内胚层细胞为80-100% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
51. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述胰腺内胚层细胞为90-100% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
52. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述胰腺内胚层细胞为少于1% NKX2.2阳性。
53. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其具有降低的NGN3和NeuroD表达。
54. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其具有降低2倍的NGN3和NeuroD表达。
55. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述PE进一步分化为具有至少40% C-PEP+/NKX6.1+的β细胞。
56. 实施方案43的胰腺内胚层细胞，其中所述PE被更具选择性地、更均匀地且更有效地诱导为EP细胞并进一步诱导为β细胞。
57. 实施方案43-56的胰腺内胚层细胞，其中所述PE细胞在体外或体内被诱导。
58. 实施方案57的胰腺内胚层细胞，其中所述PE细胞在体外被诱导。
59. 实施方案57的胰腺内胚层细胞，其中所述PE细胞在体内被诱导。
60. 根据实施方案43-59中任一项所述的胰腺内胚层细胞，其用于进一步分化为β细胞，以用作药物。
61. 根据实施方案43-59中任一项所述的胰腺内胚层细胞，其用于进一步分化为β细胞，以通过向受试者施用干细胞或源自干细胞的组织或器官，或者通过将干细胞或源自干细胞的组织或器官移入（graft）受试者中，或者通过将干细胞或源自干细胞的组织或器官移植（transplant）到受试者中，而用作治疗糖尿病的药物。
62. 培养基，其包含用于从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞生成胰腺内胚层前体的视黄酸受体（RAR）拮抗剂。
63. 实施方案62的培养基，其进一步包含用于生成胰腺内胚层的视黄酸受体（RAR）激动剂，其中所述胰腺内胚层细胞为至少70% PDX1+/NKX6.1+双阳性。
64. 实施方案62的培养基，其进一步包含BMP抑制剂。
65. 实施方案62的培养基，其进一步包含Rock抑制剂。
66. 实施方案63的培养基，其进一步包含FGF2。
67. 实施方案62的培养基，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂是AGN 193109。
68. 实施方案63的培养基，其中所述视黄酸受体（RAR）激动剂是AM580。
69. 实施方案62的培养基，其中所述进一步的BMP抑制剂是LDN193189。
70. 实施方案62的培养基，其中所述Rock抑制剂是Tiger或Y27632。
71. 浓度在0.5-100μΜ范围内的视黄酸受体（RAR）拮抗剂从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞的用途。
72. 实施方案71的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度在0.5-50μΜ的范围内，以从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞。
73. 实施方案71的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度在0.5-30μΜ的范围内，以从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞。
74. 实施方案71的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂的浓度在0.5-20μΜ的范围内，以从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层细胞。
75. 实施方案71的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂浓度在10-20μΜ的范围内。
76. 实施方案71的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂浓度约为10 μΜ。
77. 实施方案71的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂浓度约为20 μΜ。
78. 浓度在0.5-100μΜ范围内的视黄酸受体（RAR）拮抗剂AGN193109从源自人多能干细胞的定形内胚层细胞诱导胰腺内胚层前体细胞的用途。
79. 实施方案78的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂AGN193109的浓度为0.5-50μΜ。
80. 实施方案78的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂AGN193109的浓度为0.5-30μΜ。
81. 实施方案78的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂AGN193109的浓度为0.5-20μΜ。
82. 实施方案78的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂AGN193109的浓度约为10μΜ。
83. 实施方案78的用途，其中所述视黄酸受体（RAR）拮抗剂AGN193109的浓度约为20μΜ。
84. 视黄酸受体（RAR）拮抗剂AGN193109与BMP抑制剂组合，随后AM580与FGF2和/或Rock抑制剂组合，从人多能干细胞诱导胰腺内胚层细胞的用途。
85. 实施方案84的用途，所述BMP抑制剂是LDN193189。
86. 实施方案84的用途，所述Rock抑制剂是Tiger或Y27632。
87. 源自人多能干细胞的同步胰腺内胚层细胞群体，其呈现至少70%的表达PDX1+/NKX6.1+双阳性的胰腺内胚层细胞。
88. 实施方案87的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述细胞群体进一步表达PTF1a。
89. 实施方案87的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述细胞群体进一步表达至少30%的DLK1。
90. 实施方案87的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述细胞群体进一步表达20-80%的DLK1。
91. 实施方案87的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述细胞群体进一步表达至少30-80%的DLK1。
92. 实施方案87的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述细胞群体表达少于1%的NKX2.2。
93. 实施方案87的同步胰腺内胚层细胞群体，其具有降低的NGN3和NeuroD表达。
94. 实施方案87的同步胰腺内胚层细胞群体，其具有降低2倍的NGN3和NeuroD表达。
95. 实施方案87的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述PE进一步分化为具有至少40% C-PEP+/NKX6.1+的β细胞。
96. 实施方案87-95的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述PE被更具选择性地、更均匀地且更有效地诱导为EP细胞并进一步诱导为β细胞。
97. 实施方案87-95的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述PE细胞在体外或体内被诱导。
98. 实施方案97的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述PE细胞在体外被诱导。
99. 实施方案97的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述PE细胞在体内被诱导。
100. 实施方案87-99的同步胰腺内胚层细胞群体，其用于进一步分化为β细胞，以用作药物。
101. 实施方案87-100的同步胰腺内胚层细胞群体，其用于进一步分化为β细胞，以通过向受试者施用干细胞或源自干细胞的组织或器官，或者通过将干细胞或源自干细胞的组织或器官移入受试者中，或者通过将干细胞或源自干细胞的组织或器官移植到受试者中，而用作治疗糖尿病的药物。
102. 实施方案41-61的胰腺内胚层细胞或实施方案87-101的同步细胞群体在制备用于刺激或增强受试者的组织或器官形成和/或再生和/或修复的药物中的用途。
103. 组合物，其包含：
a. 包含视黄酸受体（RAR）拮抗剂（AGN 193109）的培养基
b. 源自人多能干细胞的定形内胚层细胞和/或胰腺内胚层细胞。
104. 药物组合物，其包含根据实施方案41-61或87-101中任一项的用于将PE细胞进一步分化为β细胞的胰腺内胚层细胞或其细胞群体和药学上可接受的载体。
105. 组合物，其包含根据实施方案41-61或87-101中任一项的用于将PE细胞进一步分化为β细胞的胰腺内胚层细胞或其细胞群体和生物相容性支架或基质。
106. 生物反应器，其包含通过实施方案1-40的方法获得的胰腺内胚层细胞。
107. 治疗1型糖尿病患者的方法，其包括施用根据实施方案41-61或87-101的细胞、根据实施方案1-40的方法获得的细胞或实施方案1-40的细胞以进一步分化为β细胞的步骤。
108. 治疗1型糖尿病患者的方法，其包括施用根据实施方案41-61或87-101的细胞的步骤，所述细胞用于进一步分化为β细胞。
109. 预防或治疗糖尿病的方法，所述方法包括向所述受试者施用、移植或移入有效量的根据实施方案41-61或87-101中任一项的胰腺内胚层细胞或胰腺内胚层细胞群体，所述细胞或细胞群体已经进一步分化为β细胞，从而预防或治疗所述受试者的糖尿病。
110. 用于再生和/或修复和/或构建组织或器官的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
（i）根据实施方案41-61或87-101中任一项的胰腺内胚层细胞或胰腺内胚层细胞群体，其用于进一步分化成β细胞，
（ii）生物相容性支架或基质；
（iii）任选地，至少一种生长因子或其功能片段；
（iv）任选地，选自BMP抑制剂、生长因子和/或Rock抑制剂及其组合的药剂；以及
（iv）任选地，关于制备、维持和/或使用所述细胞的说明，所述细胞包括任何细胞培养物或由其衍生的组织或器官。
材料与方法
缩写列表
+ve： 阳性
BC： β细胞（例如，BC7：β细胞分化的第7天）
bFGF： 碱性成纤维细胞生长因子（FGF）（也称为FGF2）
Cyc： 环巴胺
db： 双阳性
DE： 定形内胚层
EP： 内分泌祖细胞
hBS： 人胚泡衍生干
hBSC： 人胚泡衍生干细胞
hES： 人胚胎干
hESC： 人胚胎干细胞
hiPSC： 人诱导多能干细胞
hPSC： 人多能干细胞
KOSR： 敲除血清替代品
NKX6.1：NK6同源框1
PDX1： 胰腺和十二指肠同源框1
PE： 胰腺内胚层（例如，PE10：胰腺内胚层分化的第10天）
PEST： 青霉素链霉素
PS： 多能干
Rocki： Rho激酶抑制剂III
RT： 室温
通用制备方法
多能干细胞的培养
将人胚胎干（hES）细胞系SA121（Cellectis）在纤连蛋白（Sigma）包被的培养瓶（Corning）中的DEF-CS培养基（Takara BIO Europe）中扩充，该培养基中含有30 ng/mlbFGF（Peprotech）和10 ng/ml noggin（Peprotech）。细胞用10µM Rock抑制剂Y-27632（Sigma #Y0503）进行单细胞传代，并以0.5-1 mio/ml的密度接种在摇瓶或生物反应器（DASBOX，DASGIP，Eppendorf）中，并允许在恒定搅拌条件下形成簇。
多能干细胞向定形内胚层（DE）的分化
在每天更换培养基的DEF-CS培养基中1-3天后，簇分化为DE，如WO2012/175633（其通过引用整体并入本文）所述。将细胞簇在RPMI1640（Gibco #61870）中洗涤一次，并用RPMI1640中的2-7µM CHIR99021（Axon#1386）处理。24小时后，将细胞用RPMI1640洗涤，并用RPMI1640中的25-100 ng/ml激活蛋白A（Peprotech #120-14E）和2% B27（Invitrogen #17504-044）处理3天，每24或48小时更换培养基。在向DE分化期间在加湿摇床培养箱（Infors）中，或在生物反应器***（DASBOX，DASGIP，Eppendorf）中，将细胞保持于37°C和5%CO2。在向DE分化结束时，该群体的95%表达SOX17，而少于1%表达多能性标志物OCT4。
实施例
向LDN阶段添加AGN193109改善了定形内胚层向胰腺内胚层的分化
在分化为胰腺内胚层的标准方案中，将分化为DE的簇在RPMI1640（Gibco #61870）中洗涤一次，并在含有12% KOSR（Gibco 10828-028）的RPMI1640中在LDN193189（Stemgent04-0074）和Rock-I（Sigma Y27632-Y0503）的存在下分化4天，然后在含有AM580（ENZO/Biomol GR104-0025）、bFGF（#100-18B，Peprotech）JnkiII（Calbiochem 420119）和Rock-I的培养基中培养6-9天，如WO2014/033322（其通过引用整体并入本文）中所述。每天或每隔一天更换培养基。在PE分化结束时，通过流式细胞术或基因表达分析（Nanostring）对簇进行分析。在PE分化的LDN阶段添加10 µM AGN193109（Tocris 5758），而该方案的其余部分没有改变。
在LDN阶段的最后2天（PE2-3）添加10µM AGN 193109导致Pdx1/Nkx6.1双阳性胰腺内胚层的比例在PE分化第10天（PE10）显著增加（图1A、B）。使用AGN193109，我们观察到至少70% Pdx1/Nkx6.1双阳性，而在标准条件下约为40%，以及少于10% Pdx1/Nkx6.1双阴性细胞。
此外，似乎所描述的AGN193109添加能够拯救其他非最佳的PE分化，因为我们观察到采用AGN193109处理，Pdx1/Nkx6.1双阳性细胞从20%增加到75%（图1C）。
我们还观察到通过添加AGN 193109，胰腺内胚层的其他标志物如PTF1A、CPA1和DLK1增加（图2A）。相反，当在PE2-3用AM580激活RAR信号传导时，我们观察到Nkx6.1、PTF1A和DLK1的显著下调，指示RAR信号传导的抑制特异性介导AGN193109的作用（图2A）。
当在PE2-3添加AGN 193103时，通过流式细胞术也证实了DLK1在更高百分比的胰腺内胚层中表达（31%对13%）。我们将DLK1确定为主要在表达高水平Nkx6.1的细胞中的胰腺内胚层标志物（图2B）。
另外，与未添加AGN193109的情况相比，所述分化更加同步，在PE阶段的过早内分泌分化程度较低，其特征在于较低的Ngn3和NeuroD表达（图3A）。再者，AM580对RAR信号传导的激活似乎具有相反的效果，导致PE10时的Ngn3和NeuroD1显著增加（图3A）。
采用AGN193109处理，PE阶段的Nkx2.2阳性细胞（标记出被指定为内分泌命运的细胞）的百分比降至低于1%，而与之相比，在对照中为2.9%（图3B）。
正如基因表达所证明的，我们还通过流式细胞术证明了AGN193109的作用可能是视黄酸受体（RAR）抑制的特定作用。我们通过添加AM580（一种RAR激动剂）观察到相反的表型，即PE10时PDX1/NKX6.1双阳性胰腺内胚层的比例显著降低（图4A）。采用AGN193109处理，Pdx1/Nkx6.1双阳性的数目从52%增加到76.9%，而采用AM580处理，则减少到约14%。
AGN193109的正面作用可以在1L生物反应器（DASgip，Eppendorf）中重现。数据表明，AGN0193109方案修改与生物反应器格式兼容，并且尽管实验不是平行运行的，但结果表明，与标准方案相比，生物反应器格式的AGN 193109可以在PE诱导方面具有优势（图8A）。使用标准方案，我们获得了58.4% Pdx1/Nkx6.1双阳性，而对于AGN193109处理，该数字为82.2。
AGN193109的添加可以在LDN阶段从2天延长到4天，而对PE诱导没有任何负面影响，如通过Pdx1/Nkx6.1双阳性所测量的（图6A）。
非常令人惊讶的是，在AGN 193109的存在下，LDN阶段的长度可以缩短到仅2天，从而将PE诱导方案的长度缩短2天（图6B）。
AGN193109的作用是剂量响应性的，在0.5µM至20µM的范围中记录到。我们观察到Pdx1/Nkx6.1双阳性细胞的数目随着浓度的增加而增加，而仅Pdx1阳性细胞的数目减少（图5A）。将浓度从10µM增加到20µM，我们没有观察到额外的影响（图5B）。
实施例
在LDN阶段添加AGN193109后，向Cpep/Nkx6.1双阳性β样细胞的分化得到改善
使用如WO2015/028614、WO2017/144695和WO/2019/048690（全部通过引用整体并入本文）中描述的内分泌和β细胞诱导方案，洗涤人ES细胞或人iPS细胞衍生的PE簇，并进一步分化为内分泌祖细胞（EP）和β细胞样细胞（BC）。
在BC分化结束时对簇取样，用TrypLE-Select（Gibco 12563-011）解离成单细胞，在10%***中固定，用Cpep/Nkx6.1和胰高血糖素染色，并通过流式细胞术进行分析。
我们观察到在PE方案的LDN阶段包含AGN193109后，Cpep/Nkx6.1双阳性β样细胞的比例明显增加，表明当使用AGN193109时PE质量得到改善。通过添加AGN193109，Cpep/Nkx6.1双阳性从大约35%增加到大约50%（图7A、B）。这种增加并未伴随有胰高血糖素阳性细胞的增加，从而指示AGN193109对PE在后期分化中形成β样细胞的能力的特定影响（图7B）。
在细胞疗法的情况下，治疗性细胞类型的稳定表型是一个显著的优势，因为这允许在移植到患者之前运输和储存细胞产品。通过在PE诱导过程中添加AGN193109，我们观察到随着体外培养时间的延长，β细胞表型的稳定性得到改善。在BC分化第6天具有几乎相同表型的实验中，对于标准方案，我们观察到1周后在BC第13天显著减少。标准方案从53%降至27% Cpep/Nkx6.1双阳性，而AGN193109方案从BC第6天到BC第13天，仅具有从59%到57%双阳性的非常小的下降（图9）。
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附权利要求书涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和改变。

Claims (21)

1.从人多能干细胞衍生的人定形内胚层诱导胰腺内胚层细胞的方法，其中所述方法包括在包含RAR拮抗剂的培养基中培养所述定形内胚层以获得胰腺内胚层前体的步骤，以及随后
在包含RAR激动剂的细胞培养基中培养所述胰腺内胚层前体，从而诱导胰腺内胚层的步骤，其中所述胰腺内胚层细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性的，
并且其中所述RAR拮抗剂选自AGN193109、AGN 194431、AGN 194301、SR 11335、BMS453、BMS 195614、LE 135、LG 100815、MM11253、CD 2665和ER 50891。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述RAR拮抗剂是AGN 193109。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述RAR拮抗剂的浓度为0.5-100 µM。
4. 根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述RAR拮抗剂的浓度为1-300 µM。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述RAR拮抗剂的浓度为1-250 µM。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中所述RAR拮抗剂的浓度为1-50 µM。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述RAR拮抗剂的浓度为1-20 µM。
8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述RAR拮抗剂的浓度为3-17 µM。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述RAR拮抗剂的浓度为5-15 µM。
10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述RAR拮抗剂的浓度为7-12 µM。
11.根据权利要求1-2和5-10中任一项所述的方法，其中权利要求1中的在包含RAR拮抗剂的培养基中培养所述定形内胚层以获得胰腺内胚层前体的步骤的持续时间为1小时至6天。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述步骤的持续时间为1至4天。
13.根据权利要求12所述的方法，其中将所述步骤减至两天。
14.源自人多能干细胞的同步胰腺内胚层细胞群体，其中至少70%的胰腺内胚层细胞为PDX1+/NKX6.1+双阳性的，并且所述细胞群体进一步表达PTF1a和至少30%的DLK1，并且具有降低的NGN3和NeuroD表达。
15.根据权利要求14所述的同步胰腺内胚层细胞群体，其中所述细胞群体表达少于1%的NKX2.2。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的同步胰腺内胚层细胞群体在制备药物中的用途，其中所述同步胰腺内胚层细胞群体用于进一步分化为β细胞。
17.根据权利要求14-15中任一项所述的同步胰腺内胚层细胞群体在制备药物中的用途，其中所述同步胰腺内胚层细胞群体用于进一步分化为β细胞，以通过向受试者施用干细胞或源自干细胞的组织或器官，或者通过将干细胞或源自干细胞的组织或器官移入受试者中，或者通过将干细胞或源自干细胞的组织或器官移植到受试者中，而用作治疗糖尿病的药物。
18.生物反应器，其包含通过权利要求1-13中任一项所述的方法获得的胰腺内胚层细胞或胰腺内胚层细胞群体或权利要求14-17中任一项所述的同步胰腺内胚层细胞群体。
19.用于再生和/或修复和/或构建组织或器官的试剂盒，其中所述试剂盒包括：
（i）通过权利要求1-13中任一项所述的方法获得的胰腺内胚层细胞或胰腺内胚层细胞群体，或根据权利要求14-17中任一项所述的同步胰腺内胚层细胞群体，其用于进一步分化为β细胞；
（ii）生物相容性支架或基质；
（iii）任选地，至少一种生长因子或其功能片段；
（iv）任选地，选自BMP抑制剂、生长因子和/或Rock抑制剂及其组合的药剂；以及
（iv）任选地，关于制备、维持和/或使用所述细胞的说明，所述细胞包括任何细胞培养物或由其衍生的组织或器官。
20.药物组合物，其包含根据权利要求14-15中任一项所述的同步胰腺内胚层细胞群体和药学上可接受的载体。
21.组合物，其包含根据权利要求14-15中任一项所述的同步胰腺内胚层细胞群体和生物相容性支架或基质。
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