CN102864188A

CN102864188A - 一种木质纤维素生产生物柴油的方法

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Publication number: CN102864188A
Application number: CN2011101890933A
Authority: CN
Inventors: 崔球; 宋晓金; 朱新术; 高莽; 刘亚君
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2011-07-07
Filing date: 2011-07-07
Publication date: 2013-01-09

Abstract

本发明属于微生物发酵工程领域，具体是利用整合生物加工(Consolidated Bioprocessing，CBP)技术，通过纤维素降解菌株(如热纤梭菌)发酵降解纤维素产生糖类和有机酸类如葡萄糖，乳酸，乙酸等，联合微藻(如裂壶藻、小球藻和微拟球藻)的大规模异养或兼养培养，串联发酵生产生物柴油和联产高附加值副产品如二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、蛋白质饲料等。其特征是利用厌氧纤维素降解细菌降解经过预处理的木质纤维素原料，使其中的纤维素和半纤维素转变为可溶性糖类和有机酸类等微藻能够利用的碳源，利用这种碳源并补加一定氮源和其它营养元素后，接入微藻种液进行后续发酵，积累油脂生产生物柴油和其它高附加值产品。

Description

一种木质纤维素生产生物柴油的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵工程领域，具体是利用整合生物加工(Consolidated Bioprocessing，CBP)技术，建立以纤维素降解菌株(如热纤梭菌)发酵降解纤维素产生糖类和有机酸类如葡萄糖，乳酸，乙酸等，联合微藻(如裂壶藻和微拟球藻)的大规模异养或兼养培养，发酵生产生物柴油和具有高附加值的产品如二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)的串联发酵工艺。

背景技术

随着全球能源和环境危机的加剧，寻求替代能源已成为许多国家的研究热点，这其中清洁，可再生的生物能源是替代能源研究的重要方面，生物柴油是新能源中替代石化柴油的最适合产品，在欧美等国已作为石化柴油添加剂开始使用，但要规模化应用还存在一定的瓶颈，即原材料的选择和生产工艺中涉及成本的问题。

纤维素是地球上最丰富的可再生资源，但只有极少数被有效利用，绝大部分被作为废物弃置在环境中，反而造成一定的环境污染，比如城市垃圾。所以用纤维素物料生产新型生物燃料，因为具有重大战略意义而引起世界各国的广泛重视(闻志强，姜薇，2010)。但是木质纤维素由于极其复杂的结构，导致其降解十分困难(Christian Weber & Alexander Farwick et.al，2010)。嗜热厌氧的热纤梭菌(Clostridium thermocellum)因能直接将纤维素转化为单糖而吸引了众多研究者的注意力(Lynd.et al，2002)。研究表明(Lamedr，1984)，厌氧纤维素降解细菌中广泛存在的纤维小体(cellulosome)是其能够直接把纤维素转化为单糖的关键所在，因为纤维小体具有类似核糖体的大分子结构，能协调、有序、高效地降解纤维素。

微藻作为一种新型水生生物质资源，具有生长周期短、生物质产量高和油脂含量高的特点，其生物质生产能力可达陆地植物的30倍，具有不与粮争地及不与人争粮的巨大优势；微藻在可再生能源领域有非常吸引人的巨大发展潜力，如微藻具有很强的油脂生产能力，其油脂含量可高达细胞干重的40-80％。因此，微藻有可能为我国生物质能资源短缺提供一条有效解决途径，开发能源微藻资源，发展能源微藻生物炼制产业，不仅符合我国可持续发展的能源战略需求，而且符合我国建立资源节约型和环境友好型社会的目标，有助于促进人与自然和谐发展与经济社会可持续发展。利用异养方式大规模培养微藻具有以下优势：(1)微藻生长繁殖速度加快，藻生物量浓度大大提高：在异养培养时，藻细胞浓度可达到或接近大肠杆菌及酵母的浓度。(2)从工业化角度分析，异养培养***更便于生产过程的控制以实现纯种培养及稳定的生产。(3)使用异养培养***可降低微藻生产成本。

裂壶藻Schizochytrium limacinum是一种重要的海洋经济微藻，其特点是生长快、抗逆性强、脂类含量高(达到细胞干重的50％以上，且细胞中90％以上的油脂以甘油三脂的形式存在)。此外，在它的脂肪酸中C14:0，C16:0，C22:5(DPA)，C22:6(DHA)，占总脂肪酸含量的90％左右，具有很高的营养价值并且相对容易分离，可以通过副产高附加值产品进一步提高生物柴油的经济性，因此裂壶藻被认为是最具潜力的能源微藻物种之一。

微拟球藻(Nannochloropsis sp.)是一种单细胞的海洋绿藻，具有利用乙醇、醋酸盐和葡萄糖等有机碳进行混合营养生长的能力。提高培养液中CO₂浓度或添加葡萄糖，可以促进微拟球藻细胞的生长和油脂产率(Hu & Gao 2003；Xu et al.，2004)。微拟球藻属(Nannochloropsis)的种类通常具有很高含量的油脂含量(能达到细胞干重的50％-80％)，EPA含量能达到油脂的30％-40％，因而被认为有望成为生产生物柴油和EPA产品的生物资源(Sukenik 1999)。

整合生物加工技术(Consolidated BioProcessing，简称“CBP”)针对当前纤维素利用技术中采用单元操作与集成优化模式面临的诸多挑战，通过将纤维素酶的生产、纤维素的酶水解、戊糖发酵与己糖发酵等原本分立的反应步骤进行整合，因此大大降低运行成本，从而提高纤维素生物转化利用的综合技术经济指标。基于这些显著的特色，CBP被认为是最有前景的低成本纤维素生物转化利用技术路线之一。

现有生物柴油的生产存在着成本高，与人争粮等诸多问题。因此，寻求一种低成本，又能利用的非粮食作物作为底物实现生物柴油的生产是本发明所面临的新课题。

发明内容

本发明建立了以厌氧纤维素降解细菌(如热纤梭菌和解纤维梭菌)发酵降解纤维素产生糖类和有机酸如葡萄糖，乳酸，乙酸等，联合微藻(如裂壶藻和微拟球藻)的大规模异养或兼养培养，发酵生产生物柴油和具有高附加值的多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)的串联发酵工艺。所要解决的技术问题可以通过以下方案来实现：

1.木质纤维素(秸秆)的预处理。

将秸秆与浓度为20％-30％的氢氧化钙(Ca(OH)₂)溶液按照1∶7-1∶15的固液比混合，加热至90-120℃并保持100-150min，处理结束后冷却至室温，加入稀酸调节悬浊液pH为7.5-8.0。此混合液即可作为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)或解纤维梭菌(Clostridium cellulolyticum)降解纤维素生产后续CBP发酵所需碳源的底物。

2.热纤梭菌发酵生产下游发酵所需的混合碳源

热纤梭菌高密度发酵培养基配方：KH₂PO₄ 1.0-1.5g/L，K₂HPO₄ 4.0-10.0g/L，氮源3.0-7.0g/L，MgCl₂·6H₂O 1.0-5.0g/L，CaCl₂·2H₂O 50-250mg/L，FeSO₄·6H₂O 0.5-2.5mg/L，Cysteine hydrochloride 1.0-5.0g/L，Resazurin 1.0-10.0mg/L，碳源10.0-40.0g/L，Morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)5.0-20.0g/L，Yeast extract 5.0-20g/L，Sodium citrate·2H₂O 0.2-1.5g/L配制发酵培养基，并灭菌。其中，碳源为纤维素质生物质(包含但不限于秸秆，木菊)，氮源为有机或无机氮源(包含但不限于尿素，酵母提取物，蛋白胨，玉米浆，硝酸钠，谷氨酸钠)；灭菌前调节pH为7.0-8.5；若需扩大底物浓度，则仍应保持碳氮比为2∶1-10∶1。

热纤梭菌的发酵条件为：温度50℃-65℃，厌氧，罐压为0.05MPa-0.5MPa，搅拌转速为30-100rpm。高底物浓度(碳源浓度大于15g/L)发酵时应控制pH恒定为7.0-7.5左右，发酵时间为12-48h。

3.热纤梭菌发酵液的分离和微藻利用CBP串联的大规模异养培养

热纤梭菌发酵结束后，发酵液用离心机进行分离，弃去固体收集液体，分离的发酵液中糖含量在10％-20％，加入海水(或人工海水)进行稀释，同时控制稀释后液体的盐度在10-36之间。向混合液中添加适量的氮源，维生素，配制成培养液进行微藻的发酵培养。

小球藻或裂壶藻异养发酵培养基的配方：碳源7％-10％，氮源2％-4％，：维生素B1，10-50mg/L；维生素B6，10-30mg/L；维生素B12，1-10mg/L；生物素(维生素H)1-10mg/L。碳源包含但不限于热纤梭菌产糖液，葡萄糖，果糖，木糖，乳酸，甘油，乙酸钠等，氮源为有机或无机氮源(包含但不限于尿素，酵母提取物，蛋白胨，玉米浆，硝酸钠，谷氨酸钠，无机铵盐)；溶液pH为5-7。

小球藻或裂壶藻的发酵条件为：温度23℃-28℃，通气量0.5-2.0L min^-1 L^-1(VVM)，罐压为0.04MPa-0.08MPa，搅拌转速为100-250rpm。控制pH为5.0-7.5，发酵时间为72-96h。

微拟球藻兼养培养基的配方：碳源0.1％-1％；KNO₃，300-500mg/L；NaH₂PO₄·2H₂O，40-70mg/L；FeCl₃·6H₂O，6-15mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.01-0.05mg/L；ZnSO₄·7H₂O，0.02-0.08mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.01-0.05mg/L；MnCl₂·4H₂O，0.3-0.5mg/L；NaMoO₄·2H₂O，0.01-0.05mg/L；thiamine·HCl，100-500μg/L；维生素B12，1-10μg/L；生物素(维生素H)1-10μg/L。碳源包含但不限于热纤梭菌产糖液，葡萄糖，乙酸钠等；溶液pH为6-8。

微拟球藻的兼养发酵条件为：温度20℃-28℃，通气量0.1-0.5L min^-1 L^-1(VVM)，罐压为0.02MPa-0.05MPa，搅拌转速为30-100rpm，光照强度50-300μmol photons m^-2 s^-1。控制pH为5.0-7.5，培养时间为8-10天。

4.按照以上步骤，由木质纤维素生产生物柴油是本技术领域的技术人员能够实现的。本发明基于CBP工艺思路，开发的直接转化纤维素质生物质为生物柴油的工艺，突破了传统的单菌种培养，采用木质纤维素降解菌株(包含但不限于热纤梭菌Clostridium thermocellum JYT01和Clostridium cellulolyticum H10)，与高产油微藻(包含但不限于裂壶藻属Schizochytrium，微拟球藻属Nannochloropsis，小球藻属Chlorella，金藻Isochrysis等)串联发酵，实现了纤维素的降解和生物油脂的转化积累并同时附产高值产品，进一步降低了生物柴油的生产成本。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

5.利用木质纤维素降解菌株降解经过预处理的纤维素原料，使其中的纤维素转变为糖类和有机酸类等微藻能够利用的碳源物质，利用这种碳源并补加一定氮源和其它营养元素后，接入微藻种子液进行CBP联合异养(或兼养)发酵，积累油脂生产生物柴油和其它高附加值产品。

附图说明

无

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

下面结合具体实验针对以下问题作详细的说明：

Ⅰ、木质纤维素材料的预处理工艺的确定；

Ⅱ、热纤梭菌降解木质纤维素时生长情况；

Ⅲ、CBP联合裂壶藻异养发酵时裂壶藻的生长情况；

Ⅳ、CBP联合微拟球藻兼养发酵时微拟球藻的生长情况。

实施例1：秸秆预处理实验

1.将秸秆轧成小段，并用粉碎机粉碎成40目的粉末。

2.称取1.5g秸秆粉至封管中，按比例(质量比)加入NaOH和Ca(OH)₂，并按照固液比加入水。

3.100℃处理2h。

4.冷却后用硫酸调pH至中性，并用过滤干锅抽滤。抽滤后用水清洗几遍，弃滤液。干锅并处理后的秸秆粉80℃烘干至恒重。

5.称取处理后的秸秆粉100mg于酶解瓶中，加入2mL 0.05mol/L pH＝5.47 Citric acid buffer。按1g固体加入25U ctec(诺维信的纤维素酶)，50℃酶解24h。空白对照为2mL 0.05mol/L pH＝5.47 Citric acid buffer中不加底物，只加等量的纤维素酶。

6.48h后，将酶解瓶中的所有物质转移至容量瓶中，定容，抽取部分溶液，以0.2μm滤膜过滤。HPLC检测得糖率(表1)。

表1.不同预处理方式的效果(按总得糖率计算)

处理1：1％NaOH；处理2：27％Ca(OH)₂；处理3：1％NaOH+10％Ca(OH)₂；

处理4：1％NaOH+27％Ca(OH)₂；处理5：对照(滤纸)；处理6：对照(纤维素)

根据实验结果，考虑到与处理效果和经济成本，最终确定处理2，即利用质量比为27％的Ca(OH)₂处理秸秆的效果最好。

实施例2：5L发酵罐发酵热纤梭菌

1.按配方“KH₂PO₄ 1.0g/L，K₂HPO₄(anhydrous)6g/L，urea 17.8g/L，MgCl₂·6H₂O 2.49g/L，CaCl₂·2H₂O 135mg/L，FeSO₄·6H₂O 5mg/L，Cysteine hydrochloride 2.0g/L，Resazurin 2.0mg/L，cellobiose 30.0g/L，Yeast extract 12.0g/L，Sodium citrate·2H₂O 0.752g/L”配制发酵培养基(钙、镁、铁盐母液灭菌后加入)，115℃，15min湿热灭菌。

2.灭菌结束后，不断向发酵罐中通入氮气，以去除培养基及发酵罐内的氧气。待培养基由淡蓝色或粉红色(刃天青的颜色)变回其自身的颜色后，调节培养基pH恒定为7.0，罐温60℃，同时接入所需体积的JYT01一级种子液，停止通气，80rpm搅拌发酵。

3.约48h后碳源被全部消耗，发酵液中菌体浓度达12.7(OD₆₀₀)。

实施例3：CBP联合裂壶藻异养发酵生产生物柴油

采用以上实施例所得热纤梭菌产糖液(碳源含量10％)，另加酵母提取物3％，维生素B1，40mg/L；维生素B6，20mg/L；维生素B12，10mg/L；生物素(维生素H)10mg/L。按以下条件进行发酵培养：温度25℃，通气量1.0L min-1 L-1(VVM)，罐压为0.06MPa，搅拌转速为200rpm。控制pH为6.0，发酵时间为96h。

发酵结束后，5L发酵罐获得裂壶藻的产量为44.15g/L，获得生物油脂23.8g/L，DHA含量为9g/L(表2，3)。

表2 CBP联合发酵获得裂壶藻的成分分析结果

表3 CBP发酵获得裂壶藻的脂肪酸分析结果

实施例4：CBP联合微拟球藻兼养发酵生产生物柴油

微拟球藻兼养培养基的配方：热纤梭菌产糖液(碳源含量)0.6％，KNO₃，400mg/L；NaH₂PO₄·2H₂O，60mg/L；FeCl₃·6H₂O，10mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.02mg/L；ZnSO₄·7H₂O，0.05mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.02mg/L；MnCl₂·4H₂O，0.4mg/L；NaMoO₄·2H₂O，0.02mg/L；thiamine·HCl，200μg/L；维生素B12，5μg/L；生物素(维生素H)5μg/L。

微拟球藻的兼养发酵条件为：温度22℃，通气量0.2L min-1 L-1(VVM)，罐压为0.02MPa，搅拌转速为60rpm，光照强度300μmol photons m^-2 s^-1。控制pH为7.2，培养时间为10天。

发酵结束后，5L发酵罐获得微拟球藻的产量为2.73g/L，获得生物油脂1.49g/L，EPA含量为226mg/L(表4)。

表4 CBP发酵获得微拟球藻的脂肪酸分析结果

以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种木质纤维素生产生物柴油的方法，其特征是利用整合生物加工技术(CBP)，以木质纤维素降解菌株降解纤维素产生糖类和有机酸如葡萄糖，乳酸，乙酸等，联合微藻的大规模异养或兼养培养，发酵生产生物柴油和具有高附加值的多不饱和脂肪酸的串联发酵工艺，包括以下步骤：

1)木质纤维素(秸秆)的预处理

将秸秆与氢氧化钙(Ca(OH)₂)溶液按照1∶7-1∶15的固液比混合，加热至90-120℃并保持60-150min，处理结束后冷却至室温，加入稀酸调节悬浊液pH为7.5-8.0；

2)降解纤维素发酵生产下游发酵所需的混合碳源

热纤梭菌高密度发酵培养基配方：KH₂PO₄ 1.0-1.5g/L，K₂HPO₄ 4.0-10.0g/L，氮源3.0-7.0g/L，MgCl₂·6H₂O 1.0-5.0g/L，CaCl₂·2H₂O 50-250mg/L，FeSO₄·6H₂O 0.5-2.5mg/L，Cysteinehydrochloride 1.0-5.0g/L，Resazurin 1.0-10.0mg/L，碳源10.0-40.0g/L，Morpholinopropanesulfonic acid(MOPS)5.0-20.0g/L，Yeast extract 5.0-20g/L，Sodium citrate·2H₂O 0.2-1.5g/L配制发酵培养基，并灭菌；

发酵条件为：温度50℃-65℃，厌氧，罐压为0.1MPa-0.5MPa，搅拌转速为30-100rpm，pH为7.0-7.5，发酵时间为12-48h；

3)利用CBP技术串联的大规模培养微藻

热纤梭菌发酵结束后，发酵液用离心机进行分离，弃去固体收集液体，分离的发酵液中糖含量在10％-20％，加入海水(或人工海水)进行稀释，同时控制稀释后液体的盐度在10-36之间。向混合液中添加适量的氮源，维生素，配制成培养液进行微藻的发酵培养；小球藻或裂壶藻异养发酵培养基的配方：碳源7％-10％，氮源2％-4％，维生素B1，10-50mg/L；维生素B6，10-30mg/L；维生素B12，1-10mg/L；生物素(维生素H)1-10mg/L；

小球藻或裂壶藻的发酵条件为：温度23℃-28℃，通气量0.5-2.0L min^-1 L^-1，罐压为0.04MPa-0.08MPa，搅拌转速为100-250rpm，控制pH为5.0-7.5，发酵时间为72-96h；

微拟球藻培养基的配方：碳源0.1％-1％，KNO₃ 300-500mg/L；NaH₂PO₄·2H₂O40-70mg/L；FeCl₃·6H₂O 6-15mg/L；CuSO₄·5H₂O 0.01-0.05mg/L；ZnSO₄·7H₂O 0.02-0.08mg/L；CoCl₂·6H₂O 0.01-0.05mg/L；MnCl₂·4H₂O 0.3-0.5mg/L；NaMoO₄·2H₂O 0.01-0.05mg/L；thiamine·HCl 100-500μg/L；维生素B12，1-10μg/L；生物素(维生素H)1-10μg/L；

微拟球藻的兼养发酵条件为：温度20℃-28℃，通气量0.1-0.5L min^-1 L^-1，罐压为0.02MPa-0.05MPa，搅拌转速为30-100rpm，光照强度50-300μmol photons m^-2 s^-1，控制pH为5.0-7.5，培养时间为8-10天。

2.根据权利要求1所述的方法，预处理时优选氢氧化钙的浓度为20％-30％，优选加热温度为100℃-110℃。

3.根据权利要求1所述的方法，热纤梭菌高密度发酵培养时，碳源为纤维素质生物质(包含但不限于秸秆，木菊)，氮源为有机或无机氮源(包含但不限于尿素，酵母提取物，蛋白胨，玉米浆，硝酸钠，谷氨酸钠，无机铵盐)；若需扩大底物浓度，则仍应保持碳氮比为2∶1-10∶1。

4.根据权利要求1所述的方法，热纤梭菌高密度发酵培养时，优选条件为：温度58℃-62℃，厌氧，搅拌转速为30-70rpm，发酵时间为24-48h；

5.根据权利要求1所述的方法，CBP串联发酵小球藻或裂壶藻时，碳源包含但不限于热纤梭菌产糖液，葡萄糖，果糖，木糖，乳酸，甘油，乙酸钠等，氮源为有机或无机氮源包含但不限于尿素，酵母提取物，蛋白胨，玉米浆，硝酸钠，谷氨酸钠，无机铵盐；CBP串联兼性培养微拟球藻时，碳源包含但不限于热纤梭菌产糖液，葡萄糖，乙酸钠等。

6.根据权利要求1所述的方法，CBP串联发酵小球藻或裂壶藻时，优选配方为：碳源7％-9％，氮源2％-3％，维生素B1，30-50mg/L；维生素B6，10-20mg/L；维生素B12，5-10mg/L；生物素5-10mg/L；CBP串联兼性培养微拟球藻时，优选配方为：碳源0.3％-0.6％；KNO₃400-450mg/L；NaH₂PO₄·2H₂O 40-60mg/L；FeCl₃·6H₂O 8-12mg/L；CuSO₄·5H₂O0.01-0.03mg/L；ZnSO₄·7H₂O 0.04-0.05mg/L；CoCl₂·6H₂O 0.01-0.02mg/L；MnCl₂·4H₂O0.3-0.4mg/L；NaMoO₄·2H₂O 0.01-0.03mg/L；thiamine·HCl 150-250μg/L；维生素B12，1-5μg/L；生物素1-5μg/L；微拟球藻优选兼养发酵条件为：温度20℃-23℃，通气量0.1-0.3L min^-1 L^-1，搅拌转速为30-70rpm，光照强度70-200μmol photons m^-2 s^-1。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征是所用木质纤维素降解菌株包含但不限于热纤梭菌Clostridium thermocellum JYT01与Clostridium cellulolyticum H10，高产油微藻包含但不限于裂壶藻属Schizochytrium，微拟球藻属Nannochloropsis，小球藻属Chlorella，金藻Isochrysis，以及在它们基础上进行的任何突变株等。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述发酵的方式分批发酵，补料-分批发酵，连续发酵或半连续发酵。