CN105555966A - 核酸分析用流动池和核酸分析装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种核酸分析用流动池，其是用于借助能够光化学切断的核苷酸的测序反应的核酸分析用流动池，可在提高光切断反应的反应效率的同时减少荧光检测时的干扰，从而可提高确定序列的正确性，缩短操作时间，使结合碱基长度变长。本发明的核酸分析用流动池贴合有具备滤光片(102)的第一基板(101)、具有用于形成流路的中空部中空板(103)和透过第一光的第二基板(105)，所述滤光片(102)反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光。

Description

核酸分析用流动池和核酸分析装置
技术领域
本发明涉及核酸分析用流动池(flowcell)和核酸分析装置。
背景技术
确定DNA、RNA的碱基序列的新技术正逐步实用化。
在利用一直以来使用的电泳的方法中，预先调制由用于确定序列的DNA片段或RNA试样进行逆转录反应而合成的cDNA片段试样，利用众所周知的桑格(Sanger)法实施双脱氧(dideoxy)反应后进行电泳，通过计测分子量分离展开图案进行解析。
对此，近年来，提出了通过将大量作为试样的DNA片段固定于基板而并行确定大量片段的序列信息的方法。
在非专利文献1中，使用微粒作为担载DNA片段的载体，在微粒上进行PCR。之后，向设置有大量的使孔径与微粒的尺寸配合的孔的板放入担载有PCR扩增的DNA片段的微粒，以焦磷酸测序方式进行读取。
此外，在非专利文献2中，使用微粒作为担载DNA片段的载体，在微粒上进行PCR。之后，将微粒散布在玻璃基板上进行固定，在玻璃基板上进行酶反应(连接(ligation))，与带有荧光色素的引物结合而进行荧光检测，得到各片段的序列信息。
进一步，在非专利文献3中，将具有同一序列的许多DNA探针预先固定在基板上。此外，将DNA试样切断后，使DNA探针序列和互补链的接头(adaper)序列附加于各DNA试样片段的端点。使它们在基板上杂交，从而使每一分子试样DNA片段随机固定在基板上。在该情况下，基板上不发生DNA延伸反应，结合带有荧光色素的基质后，进行未反应基质的洗涤、荧光检测，得到试样DNA的序列信息。
如上所述，开发了通过在基板上固定大量核酸片段试样而并行确定大量片段的序列信息的方法，从而逐步实用化。
专利文献1中公开了并行确定大量序列信息的详细内容。测序反应在内部具有流路的流动池中进行。流路表面涂覆有丙烯酰胺，在丙烯酰胺上接枝有正向引物和反向引物。将包含作为测定对象的多种模板的溶液导入流动池内后，对流动池施以温度循环而在基板上进行扩增反应，从而在基板上形成与模板具有相同序列的多个菌落。一个菌落是扩增的多个复制模板的集合体，复制模板与测定对象模板具有相同的序列或互补的序列。扩增后，使测序引物与菌落内的模板杂交来进行测序反应。在测序反应中，使用WO2004/018493所公开的核苷酸。核苷酸具有经由能够被切断的连接物(linker)连接的的荧光分子和位于糖的第3位氧的离去基团。在测序反应中，使用来源于4种碱基A、T、C、G的4种核苷酸。4种核苷酸被各自不同的荧光色素标记。向流动池内注入包含聚合酶和4种核苷酸的溶液，使核苷酸与测序引物结合。之后，对结合有荧光的测序引物进行荧光检测。此时，由于以形成与模板序列互补的序列的方式结合核苷酸，因此通过检测结合后的核苷酸的荧光，可确定作为测定对象的模板的碱基序列。荧光检测后，化学切断分子内连接物而去除荧光分子。通过反复进行核苷酸结合、荧光检测、荧光分子去除的循环而确定模板的碱基序列。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第US2012/208194号说明书
专利文献2：国际专利WO2004/018493
专利文献3：美国专利第US7897737B1号说明书
专利文献4：美国专利第US8039817B1号说明书
专利文献5：美国专利申请公开第US2009/208194号说明书
非专利文献
非专利文献1：Nature2005,vol.437,pp.376-380
非专利文献2：Science2005,vol.309,pp.1728-1732
非专利文献3：Science2008,vol.320,pp.106-109
发明内容
发明所要解决的课题
关于专利文献1、专利文献2中记载的方法，由于以一定比例结合有与模板的碱基序列无关的错误的核苷酸，因此存在确定序列的正确性低的课题。此外，随着模板的碱基长度变长，一个菌落中结合错误的核苷酸的模板的比例变高，从而正确的荧光信号减少。作为结果，存在无法使结合碱基长度变长的课题。一般而言，在序列确定过程中，确定短且零散的模板的碱基序列后，在电脑上比对零散的序列，如果结合碱基长度短，则还产生比对的精度降低或比对时间变长的课题。此外，一般而言，由于化学切断中反应时间长，因此也存在每1次操作(run)所需的操作时间长的课题。
专利文献3中公开了能够提高核苷酸结合的正确性、缩短切断反应时间的核苷酸。通过消除核苷酸内的糖的第3位氧的离去基团来提高聚合酶与核苷酸的亲和性，从而提高结合时的正确性。此外，通过导入能够以光化学切断的分子内连接物而缩短切断时间。另一方面，专利文献3的核苷酸存在流动池内的光化学切断反应的反应效率本身就低，结合碱基长度不够长的课题。由于测序反应中进行多个循环的反应，因此一点点的反应效率的差异就会对增加循环数的结合时的荧光信号产生大的影响。例如，当1个循环的反应效率为99％时，250个循环后的荧光强度在将1个循环时的荧光强度设为100％时变为0.99250×100＝8.1(％)。另一方面，当为98％时，变为0.98250×100＝0.6(％)，仅仅1％的反应效率的差异形成8.1-0.6＝7.5(％)的荧光强度的差异。作为提高光化学切断反应的反应效率的方法，还有使光强度变强的方法，但如果使光强度过强，则会产生如下课题：发生由溶解氧等引起的自由基，并且发生由自由基导致的模板的二聚化反应等副反应，从而使与引物结合的核苷酸的量减少。在如专利文献4所示的那样对流路的上下两面进行检测的情况下，一般而言，离光化学反应的光源近的面的光强度比远的面的光强度强，为了使远的面的光强度变强，如果使光源的光强度变强，则近的面的光强度强于所需以上，从而发生上述的副反应。
本发明提供用于借助能够光化学切断的核苷酸的测序反应的核酸分析用流动池，其为提高切断反应的反应效率的流动池。
用于解决课题的方法
本发明的核酸分析用流动池贴合有具备滤光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板(中抜きシート)和透过第一光的第二基板，所述滤光片反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光。
发明效果
根据本发明，用于借助能够光化学切断的核苷酸的测序反应的核酸分析用流动池能够提高光切断反应的反应效率并且减少荧光检测时的干扰。由此，能够提高确定序列的正确性，缩短操作时间，使结合碱基长度变长。
附图说明
图1是用于说明本发明的核酸分析用流动池构成的一例的图。
图2是用于说明本发明的核酸分析用流动池构成的一例的图。
图3是用于说明本发明的核酸分析用流动池构成的一例的图。
图4是用于说明本发明的核酸分析用流动池构成的一例的图。
图5是用于说明本发明的核酸分析用流动池构成的一例的图。
图6是用于说明本发明的核酸分析用流动池构成的一例的图。
图7是用于说明本发明的核酸分析用流动池构成的一例的图。
图8是用于说明本发明的核酸分析用流动池制造方法的一例的图。
图9是用于说明本发明的核酸分析装置的一例的图。
图10是用于说明本发明的核酸分析装置的一例的图。
图11是用于说明本发明的核酸分析用流动池构成的一例的图。
图12是用于说明本发明的核酸分析用流动池构成的一例的图。
具体实施方式
本发明的发明人进行了深入研究，结果完成了能够实现核苷酸结合正确性高、切断时间短、切断效率也高的测序反应的核酸分析用流动池。
本发明是一种核酸分析用流动池，其贴合有具备滤光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板和透过第一光的第二基板，所述滤光片反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光。通过透过第二基板的第一光被滤光片反射，能够对第二基板上、或第二基板和第一基板的滤光片上的分子内具有连接物的化合物从多个方向效率良好地照射第一光，因此能够提高光化学反应的效率。高光化学反应的效率能够提高确定碱基序列的正确性，使结合碱基长度变长，缩短操作时间。
此外，本发明的特征在于，滤光片反射用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光，透过激发流路内物质的第二光，还透过由流路内物质放射的第三光。通过提高光化学反应的效率的同时，使荧光检测用的激发光和来自第二基板以及滤光片上的干扰荧光分子的荧光向流动池外透过，能够减少来源于检测对象菌落以外的荧光分子的干扰。干扰荧光分子是指，在第二基板上进行菌落检测时，附着于第二基板上的菌落以外的区域的荧光分子，除此以外，有流路内携带的荧光分子、第一基板滤光片上的荧光分子等。在第一基板滤光片上进行菌落检测时，同样，除了滤光片上以外，有流路内携带的分子、第二基板上的分子等。
此外，本发明的特征在于，滤光片被图案化，图案化的滤光片存在于第一基板的与流路接触的面。一般而言，滤光片是将利用蒸镀法等方法成膜后的无机氧化物、金属氧化物的薄膜进行多层化而成的，比常规的玻璃平坦性高，因此存在如下课题：与PDMS(聚二甲基硅氧烷)、压敏性两面粘接胶带等中空板的粘接力低、流动池的耐压低。通过对滤光片进行图案化，中空板形成为与获得高粘接力的玻璃等第一基板直接接触的结构，因此能够提高流动池的耐压。
此外，本发明的特征在于，第二基板具备近紫外线截止滤光片，所述近紫外线截止滤光片透过使流路内物质的化学结构发生变化的第一光，并且反射具有比第一光短的波长的第四光。一般而言，DNA吸收波长320nm以下的光，一部分进行二聚化，从而使测序反应的反应效率降低。此外，已知波长184.9nm的近紫外线生成臭氧，生成的臭氧被波长253.7nm的紫外线分解而产生具有强氧化力的O原子。这些臭氧、O原子会氧化分解测序反应中使用的聚合酶、核苷酸、模板，因此使测序反应的反应效率降低。本发明的近紫外线截止滤光片防止这些近紫外线向流路内透过。
此外，本发明的特征在于，第二基板具有防止第一光和第二光反射的反射防止膜。一般而言，已知在玻璃表面反射小于10％的光。本发明的反射防止膜防止第一光、第二光在基板表面的反射，使进入流路的第一光、第二光的光强度的降低最小化。
此外，本发明的特征在于，在使第一基板和第二基板或者使第一基板、第二基板和带槽板贴合的核酸分析用流动池中，用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光透过第二基板，在隔着流路与第二基板相对的流路底面，具有反射第一光的滤光片。在没有图7的(a)～(c)所示的那样的中空板的结构中，能够以与上述同样的机理得到同样的效果。
此外，本发明的特征在于，在使第一基板和第二基板或者使第一基板、第二基板和带槽板贴合的核酸分析用流动池中，滤光片反射用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光，透过激发流路内物质的第二光，还透过由流路内物质放射的第三光。与上述同样，在没有图7的(a)～(c)所示的那样的中空板的结构中，能够以与上述同样的机理得到同样的效果。
以下，参照附图对上述和其他本发明的新的特征和效果进行说明。
在此，为了完全理解本发明，对特定的实施方式进行详细的说明，但本发明不限于此处所记载的内容。此外，各实施例能够进行适当组合，对于该组合的形态，本说明书也进行了公开。
实施例1
图1表示本发明的核酸分析用流动池的例子。
本发明的核酸分析用流动池为贴合有具有滤光片102的第一基板101、具有用于形成流路的中空部104的中空板103和第二基板105的结构。由第一基板上的滤光片102、中空板103和第二基板105所包围的空间形成流路。在第二基板上打开的孔形成用于向流路注入液体的注入口106、排出口107。图1的核酸分析用流动池的一例为第二基板具有孔的例子，但也可第一基板具有孔并且使这些孔形成注入口、排出口。
图10中示出将本发明的核酸分析用流动池1010设置于核酸分析装置时的构成。光源1019发出用于使作为测定对象的流路内物质的化学结构发生变化的第一光1020。检测单元1017发出用于激发流路内物质的第二光1021，并检测由激发后的流路内物质放射的第三光1022。在图10的一例中，测定对象即流路内物质的多个分子存在于载体珠1023的表面。支撑单元1011保持核酸分析用流动池1010。从光源1019发出的第一光1020通过第一基板1020后，照射载体珠1023上的流路内物质。透过载体珠1023的一部分第一光1020被滤光片1002反射，反射的第一光1020从下面照射载体珠1023，从而提高存在于载体珠1023的下侧的流路内物质的光反应的反应效率。通过第二基板1005的第二光1021激发载体珠1023上的流路内物质后，通过载体珠1023的第二光1021透过滤光片1002，射出至流路1004的外部。测序反应中作为测定对象的流路内物质是指在分子内具有经由能够被光切断的连接物连接的荧光分子的核苷酸。测序反应的概要如下：在核酸分析用流动池1010的外部将扩增模板导入到载体珠1023上后，将具有扩增模板的载体珠1023固定在与流路接触的第二基板上，然后使测序引物与扩增模板杂交。杂交后，将包含核苷酸和酶的水溶液供给于流路1004内，使核苷酸与引物结合后，对流路1004内进行洗涤，去除未反应核苷酸。去除未反应核苷酸后，向结合后的核苷酸照射第一光1020而进行光切断反应，然后对流路1004内进行洗涤。此时，流路内洗涤中未能去除而残留的核苷酸会在荧光检测时成为干扰。同样，残留的光切断后的荧光色素也会成为干扰。核苷酸、光切断后的荧光色素残留在载体珠1023的表面、与流路1004接触的第二基板1005表面、与流路1004接触的滤光片1002上。本发明的滤光片将第二光1021向流路外射出，从而能够降低来源于残留的核苷酸、光切断后的荧光色素的干扰。另一方面，滤光片1002还将被第二光1021激发而产生的第三光1022向流路1004的外部射出。图10表示了仅在流路的上面固定有载体珠1023的例子，但对于载体珠1023还被固定在滤光片1002上的例子，在流路上面检测时，来自流路下面的载体珠1023的第三光1022、来自残留于流路内的核苷酸或光切断后的荧光色素的第三光1022成为干扰，本发明的滤光片1002将这些第三光1022向流路1004外射出，从而能够降低干扰。此时，通过将能够吸收第二光、第三光的有机物涂布于支撑单元上，防止从流路1004射出至外部的第二光、第三光被支撑单元表面反射而再次返回至流路1004内，从而进一步降低干扰。
第一光的波长只要能够切断在分子内具有经由能够被光切断的连接物连接的荧光分子的核苷酸的连接物就没有特别限制，作为能够切断专利文献3所记载的核苷酸、并且不与激发常规的荧光分子的第二波长重叠的波长，其优选为450nm以下。此外，作为防止因自由基生成而导致DNA的二聚化的波长，其优选为比320nm大的波长。
第二光的波长只要能够激发荧光分子就没有特别限制，但由于在测序反应中需要同时使用4种荧光色素进行检测，因此优选容易选定能够减少4色色素间的发光波长的重叠的色素的450nm以上的波长。第三光的波长也没有特别限制，与第二光的波长同样地，优选容易选定能够减少4色色素间的发光波长的重叠的色素的480nm以上的波长。作为第二光的波长450nm以上、第三光的波长480nm以上、以及能够减少4色色素间的发光波长的重叠的色素的组合，分别从如下组中选择一个色素进行组合即可：第一组为AlexaFluor488、FAM、FITC、OregonGreen488，第二组为AlexaFluor532、BODIPYTMR-X、Cy3、HEX、JOE，第三组为AlexaFluor594、TexasRed-X，第四组为BODIPY650/665、Cy5。
本发明中使用的第一基板101的材质没有特别限制，可以使用玻璃、蓝宝石(Sapphire)、硅等无机材料，铝、铜等金属和不锈钢等合金，聚甲基丙烯酸甲酯树脂、聚碳酸酯树脂、环烯烃树脂等树脂材料。另一方面，在测序反应中使用的情况下，由于第一基板1001所接触的支撑单元1011具有调温功能，因此优选导热性高的玻璃、硅、不锈钢，配合有碳纤维、无机填料的高导热性树脂材料等。作为不使导热性降低而贴合后可得到流动池的强度的厚度，优选为0.1mm以上100mm以下。
作为第二基板102的材质，只要透过光就没有特别限制，可使用玻璃、蓝宝石、石英等无机材料，丙烯酸树脂、环烯烃树脂等树脂材料。关于厚度，配合检测单元1017所搭载的物镜的规格，优选为0.1mm以上10mm以下。
中空板203的材质没有特别限制，可使用热固性、光固性等的环氧系粘接剂、丙烯酸系粘接剂等。此外，也可使用将丙烯酸树脂作为基体的两面胶带等。作为更优选的材料，可举出玻璃、石英、蓝宝石或与透明树脂粘接强度高的聚二甲基硅氧烷。隔板厚度没有特别限制，厚度越薄越能够减少流路内容量，从而能够减少使用的试剂量。隔板506优选为厚度1mm以下。
滤光片104通过将SiO2、TiO2、Ta2O2、Nb2O3等介电体多层膜任意重叠成10层至40层左右来制作，可以使期望的波长的光反射，其他波长的光透过。图11表示适合于本发明的、反射波长小于400nm的第一光、透过波长400nm以上的第二光和第三光的滤光片的光学特性。此外，如图1、图3～图7所示，通过使滤光片形成配置于第一基板上面的结构，在将核酸分析用流动池1001设置于支撑单元1011时，能够防止滤光片1002与支撑单元1011直接接触，从而能够防止滤光片发生损伤。此外，通过将滤光片的最外表面设为SiO2，能够防止Al2O3、TiO2等多层膜构成材料与测序反应中使用的包含氯离子的缓冲液接触，从而防止这些氧化膜的腐蚀。
图2至图7表示本发明的核酸分析用流动池的进一步构成。图2中滤光片202配置于第一基板201的下面，图3中被图案化的滤光片302的特征在于，以与流路接触的方式存在于第一基板上。一般而言，由于滤光片比常规的玻璃平坦性高，因此存在如下课题：与PDMS(聚二甲基硅氧烷)、压敏性两面粘接胶带等的中空板的粘接力低，从而流动池的耐压低。图2、图3的核酸分析用流动池形成中空板与可得到高粘接力的玻璃等第一基板直接接触的结构，因此能够提高流动池的耐压。图4或图5的核酸分析用流动池在第二基板上具备反射波长320nm以下的近紫外线的近紫外线滤光片。近紫外滤光片防止近紫外线向流路内进入。一般而言，DNA吸收波长320nm以下的光而使一部分进行二聚化，从而使测序反应的反应效率降低。此外，已知波长184.9nm的近紫外线生成臭氧，生成的臭氧被波长253.7nm的紫外线分解而产生具有强氧化力的O原子。这些臭氧、O原子会氧化分解测序反应中使用的聚合酶、核苷酸、模板，因此使测序反应的反应效率降低。图4或图5的核酸分析用流动池防止由近紫外线引起的测序反应的反应效率降低。图6的核酸分析用流动池在第二基板605上具备反射防止膜609。反射防止膜609防止第一光1020、第二光1021在第二基板上面反射，从而将进入流路604的第一光1020、第二光1021的光强度的降低最小化。通常，已知波长400nm至800nm的可见光被玻璃表面反射小于10％的光。图12表示本发明的反射防止膜的光学特性，可使反射率为2％以下。这样的反射防止膜可利用Al、MgF2、SiO2和Al2O3的多层膜等形成。图7的核酸分析用流动池的特征在于，其是使第一基板和第二基板或者使第一基板、第二基板和带槽板720贴合的核酸分析用流动池，用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光透过第二基板，在隔着流路与第二基板相对的流路底面，具有反射第一光的滤光片。在没有图7的(a)～(c)所示的那样的中空板的结构中，也可得到同样的效果。这样的流动池可通过将玻璃、蚀刻的玻璃用作第二基板，将蚀刻的硅、PDMS用作带槽板，将玻璃、硅用作第一基板而制作。
使用图8对本发明的核酸分析用流动池的制造方法的一例进行说明。使用模切冲压加工、激光加工等将具有能够脱模的保护膜的带有保护膜的板821的内部挖空，形成形成有流路的中空部804。接着，在第一基板801上利用蒸镀法等形成滤光片802。从上述的带有保护膜的板821剥离保护膜822后，使剥离了保护膜822的带有保护膜的板与具有滤光片802的第一基板801贴合。为了提高滤光片802与中空板803的粘接力，可在贴合前将滤光片802的表面和中空板的表面暴露于准分子(Excimer)、氧等离子体或大气压等离子体。此外，可在贴合后进行加热处理来提高粘接性。接着，将残留的保护膜822去除后，与第二基板805贴合。为了提高第二基板805与中空板803的粘接力，可暴露于之前的准分子、氧等离子体或大气压等离子体、进行加热处理。
将这样制作的核酸分析用流动池设置于核酸分析装置进行核酸分析。本发明也包括设置本发明的核酸分析用流动池后进行核酸反应的核酸分析装置。本发明的核酸分析装置至少包括：支撑单元，保持上述核酸分析用流动池；检测单元，观察上述核酸分析用流动池内的试样；光源，向上述核酸分析用流动池照射使流路内物质的结构发生变化的第一光；送液单元，向上述核酸分析用流动池送液试剂。
使用图9对本发明的核酸分析装置的一例进行说明。核酸分析装置具有：本发明的核酸分析用流动池910；能够固定核酸分析用流动池910，并且能够调整核酸分析用流动池910的温度的支撑单元911；使核酸分析用流动池910和支撑单元911移动的平台单元912；容纳多种试剂、洗涤水的试剂容器913；作为将试剂容器913所容纳的试剂吸引并注入核酸分析用流动池910的驱动源的送液单元914；在吸引/吐出试剂时，实际与试剂容器913、核酸分析用流动池910连通的喷嘴915；搬送喷嘴915的喷嘴搬送单元916；用于观察固定于核酸分析用流动池910的试样的检测单元917；发出使流路内物质的结构发生变化的第一光的光源919；和容纳废液的废液容器918等。检测单元917例如由荧光检测装置构成，可向平台单元上的核酸分析用流动池910照射激发光，从而检测发生的荧光。
本发明的核酸分析装置如下进行工作。首先，将保持了测定对象即核酸试样的核酸分析用流动池910设置于支撑单元911。接着，喷嘴916与试剂容器913连通，利用送液单元914吸引试剂。喷嘴915被喷嘴搬送单元916搬送至核酸分析用流动池910上面，向核酸分析用流动池910注入试剂。之后，支撑单元911对核酸分析用流动池910的流路内所含的溶液进行温度调整，控制测序反应。为了观察反应后的核酸试样，利用平台单元912使核酸分析用流动池910移动而照射激发光，从而检测处于检测区域内的多个核酸试样的荧光。此时，优选的是，通过固定有核酸试样或在表面具有核酸试样的载体的一侧的基板照射激发光，检测荧光即可。通过稍微挪动核酸分析用流动池910并利用相同的方法反复进行多次检测。全部检测区域中的观察结束后，利用送液单元914吸引试剂容器913所容纳的洗涤水，并向核酸分析用流动池910注入，从而对核酸分析用流动池910的流路内进行洗涤。接着，注入其他试剂后，向与核酸试样结合的流路内物质照射第一光，使流路内物质的结构发生变化以便继续下一循环的反应。之后，同样地，对核酸分析用流动池910内的流路内进行洗涤。通过反复进行多次包括试剂的注入、利用温度控制的测序反应、荧光检测、流路内的洗涤、第一光照射、流路内的洗涤的循环，可读取核酸试样。核酸分析装置可利用电脑进行控制而自动进行上述工作。
实施例2
对使用本发明的核酸分析装置的核酸分析方法进行说明。分析方法基于Science2005，vol.309，pp.1728-1732(非专利文献2)所公开的方法。
(1)文库(library)制作
使用Dneasy组织试剂盒(DneasyTissuekit(QIAGEN公司))将测定对象即流路内物质精制后，将核酸试样片段化。对于片段化DNA，使用End-itDNA末端修复试剂盒(End-itDNAEndRepairkit(EpiCentre公司))将标签序列附加于模板DNA的两端。将附加有标签序列的模板精制后，利用核酸外切酶对附加有间隔序列的模板进行处理，制作用于RCA(滚环扩增(RollingCircleAmplification))的模板。对于得到的模板，进行使用了随机六聚体的RCA而扩增模板。利用Microcon-30(Millipore公司)将扩增产物精制后，用限制酶片段化。对片段化的产物进行凝胶精制，提取70碱基长度的标签文库。对于提取的标签文库，在连接引物后，进行PCR扩增而制作文库。
(2)乳液PCR
向包含轻质矿物油(Lightmineraloil(Sigma公司))的油溶液加入PCR溶液、MyOne(商标)、顺磁链霉亲和素(paramagneticstreptavidin)磁珠(Dynal公司)和文库溶液进行乳液PCR。对于扩增溶液，加入包含表面活性剂的溶液进行高速离心后，使用磁体进行溶剂置换，制作表面具有测定用DNA的珠的水溶液，所述测定用DNA的表面具有大量扩增产物。
(3)向核酸分析用流动池固定表面具有DNA的珠子
将4.2×107个珠子分散于19.2μl的包含10mM的十二烷基硫酸钠的TE缓冲液后，将珠子分散溶液注入核酸分析用流动池内。在恒温槽内将流路内的珠子悬浊液干燥后，向流路内注入6％丙烯酰胺水溶液而固定珠子。在本实施例中，使用丙烯酰胺来固定珠子，但也可像专利文献5所公开的那样，使用硅烷、聚赖氨酸、生物素与链霉亲和素的结合等进行固定。
(4)核酸分析
使用专利文献3所公开的核苷酸进行核酸分析。本发明的核酸分析装置设置了固定有前项的珠子的核酸分析用流动池。借助喷嘴915将包含引物的水溶液注入核酸分析用流动池910。使用支撑单元911将核酸分析用流动池910内的水溶液加热至57℃后，保持于4℃。将之前包含核苷酸和DNA聚合酶的水溶液注入后，在60℃保持5分钟进行延伸反应。用缓冲液对核酸分析用流动池910内的流路进行洗涤，去除未反应的核苷酸。利用平台单元912使核酸分析用流动池910移动后，利用检测单元917照射激发光，从而检测处于检测区域内的多个带有核酸试样的珠子所导入的荧光。检测后，注入50mM的叠氮化钠水溶液后，以0.7W/cm2照射波长365nm的UV光4分钟，切断荧光色素。之后，用缓冲液对流动池内进行洗涤。反复进行之前的延伸反应、荧光检测、荧光色素的切断，确定核酸的碱基序列。
实施例3
使用专利文献1所公开的模板准备方法代替实施例1的(2)乳液PCR、(3)向核酸分析用流动池固定表面具有DNA的珠子。对形成于基板上的菌落进行测序反应。
(1)文库制作
与实施例1同样地进行。
(2)向核酸分析用流动池内流路涂覆丙烯酰胺
将溶解有100mg/ml的BRAPA的DMF溶液165μl、TEMED11.5μl、50mg/ml的过硫酸钾100μl与2％丙烯酰胺水溶液10ml混合后，将混合溶液注入流路内。将核酸分析用流动池在室温保持1小时30分钟后，用水对流路内进行洗涤。
(3)引物在丙烯酰胺上的接枝化
使包含0.5μM的正向引物、0.5μM的反向引物的水溶液以流量60μl/秒向流路内流入75秒后，将核酸分析用流动池在50℃保持1小时。保持后，用5×SSC缓冲液对流路内进行洗涤。
(4)核酸分析用内流动池内的菌落形成
(5)将由文库制作得到的文库注入核酸分析用流动池内，进行扩增反应而形成菌落。
(6)核酸分析
按照实施例1的方法，确定核酸的碱基序列。
实施例4
向实施例1的叠氮化钠水溶液加入微玻璃珠(品名：EMB-10、Potters-Ballotini株式会社制)。微玻璃珠的平均粒径为5μm。微玻璃珠可使进入流路内的UV光发生漫反射，从而可进一步提高切断荧光色素的效率。
产业上的可利用性
使用本发明的核酸分析用流动池或核酸分析装置，能够进行各种核酸反应，并且能够进行DNA测序等核酸的分析。
符号说明
101、201、301、401、501、601、701(a)、701(b)、701(c)、801：第一基板
102、202、302、402、502、602、702(a)、702(b)、702(c)、802：滤光片
103、203、303、403、503、603：中空板
104、204、304、404、504、604、704(a)、704(b)、704(c)、804：中空部(或流路)
105、205、305、405、505、605、705(a)、705(b)、705(c)：第二基板
106、206、306、406：注入口
107、207、307、407：排出口
408、508、608：近紫外线截止滤光片
609：反射防止膜
720：带槽板
821：附保护膜板
822：保护膜
910核酸分析用流动池
911：支撑单元
912：平台单元
913试剂容器
914送液单元
915：喷嘴
916：喷嘴搬送单元
917：检测单元
918：废液容器
919：光源
1020第一光
1021：第二光
1022：第三光
1023：载体珠
1024：第四光

Claims (14)

1.一种核酸分析用流动池，其贴合有具备滤光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板和透过第一光的第二基板，所述滤光片反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光。
2.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，所述滤光片透过激发流路内物质的第二光和由流路内物质放射的第三光。
3.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，所述滤光片在第一基板上被图案化成与流路接触。
4.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，所述第二基板具备近紫外线截止滤光片，所述近紫外线截止滤光片透过使流路内物质的化学结构发生变化的第一光，并且反射具有比第一光短的波长的第四光。
5.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，所述第二基板具备防止第一光和第二光反射的反射防止膜。
6.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，第一光的波长为450nm以下。
7.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，第一光的波长为320nm以上。
8.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，第二光的波长为450nm以上。
9.根据权利要求1所述的核酸分析用流动池，第三光的波长为480nm以上。
10.一种核酸分析用流动池，其特征在于，是使第一基板和第二基板贴合而成的核酸分析用流动池，
在第一基板侧具有多个流路槽，进一步，在该流路槽的底面具备反射用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光的滤光片，第二基板透过第一光。
11.一种核酸分析用流动池，其特征在于，是使第一基板和第二基板贴合而成的核酸分析用流动池，
在第二基板侧具有多个流路槽，进一步，在与该流路槽相对的第一基板面具备反射用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光的滤光片，第二基板透过第一光。
12.一种核酸分析用流动池，其特征在于，是使第一基板和第二基板贴合而成的核酸分析用流动池，
在基板间配置有板，
在板中具有多个流路槽，在这些流路槽的第一基板侧的底面具备反射用于使流路内物质的化学结构发生变化的第一光的滤光片，第二基板透过第一光。
13.根据权利要求10～12中任一项所述的核酸分析用流动池，所述滤光片透过激发流路内物质的第二光，还透过由流路内物质放射的第三光。
14.一种核酸分析装置，其是分析核酸的核酸分析装置，具备：
核酸分析用流动池，其贴合有具备滤光片的第一基板、具有用于形成流路的中空部的中空板和透过第一光的第二基板，所述滤光片反射使流路内物质的化学结构发生变化的第一光；
支撑单元，保持所述核酸分析用流动池；
检测单元，观察所述核酸分析用流动池内的试样；
光源，向所述核酸分析用流动池照射使流路内物质的结构发生变化的第一光；
送液单元，向所述核酸分析用流动池输送试剂。
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