CN116256500A - 一种测定生物大分子及生物细胞组织细微结构的信息控制***及其自动化装置 - Google Patents

Abstract

本发明基于将生物大分子表位信息转码为线性信息及其放大、检测的自动化，涉及测定生物大分子及生物细胞组织细微结构的方法，及其在生物大分子结构分析、组织化学、显微镜技术、设计分子机器、分子机器质量控制方面应用，属于生物医学分子领域。对微观结构的解析受光学本身分辨率限制，可以从分子层面完成这一任务。本发明利用核苷酸序列互补连接、细胞骨架可以生长的特性，将核苷酸链、细胞骨架与抗体连接成分子机器，通过分子机器间相互连接所需核苷酸链、细胞骨架的长度测定出抗原表位间的距离。该发明可以用于细微结构表位距离测定、测定蛋白质相互作用、生产特定距离的分子的复合物。

Description

一种测定生物大分子及生物细胞组织细微结构的信息控制系 统及其自动化装置

技术领域

本发明基于将生物大分子表位信息转码为线性信息及其放大、检测的信息控制***，及其自动化装置，涉及测定生物大分子及生物细胞组织细微结构的方法，及其在生物大分子结构分析、组织化学、显微镜技术、设计分子机器、分子机器质量控制方面应用，属于生物医学分子领域。

背景技术

生物医学领域研究主要是经验性研究，实验结果评估人为性很大，可靠性与重复性较差；细胞研究、荧光技术皆以10的幂为单位，单位过大，难以微量检测；这要求实验方法向微观计量上发展、向数学推理证明发展。传统光学显微镜无法突破光的波长限制，电子显微镜存在样本制作困难与价格昂贵的问题。

而合成生物学发展方向正是利用基因工程改造或制造产生标准化的分子机器库，然后通过不同的分子机器组合线路产生一定生物学功能，解决一些生物学问题或者用于工业生产制造。对微观结构的解析乃至操纵微观的生化进程，需要一系列的定制的分子机器自动转导生物信息完成。

发明内容

1.本发明第一目的是提供一种将生物大分子及生物细胞组织细微结构上的不同表位信息转化为线性信息的转码***，至少包括分子机器，分子机器上连接分子标签，其特征在于：所述的转码***包括：

(1)、分子机器：

1)、能与生物大分子及生物细胞组织细微结构上的表位结合：抗体与抗原表位，配体与受体，反应底物与酶、核苷酸链结合结构域与核苷酸链，序列匹配的核苷酸链、纳米分子与能与之结合的生物结构之间存在靶向相互作用，通过将抗体、配体或受体、反应底物或酶、核苷酸链结合结构域或核苷酸片段设计改造成的分子机器，保持与生物大分子上表位的相互作用；

2)、连接了可以延伸或在不同分子机器上进行连接的分子标签；

3)、在分子合成过程中被同位素标记；

(2)、分子标签可以延伸或在不同分子机器上进行连接：

1)、分子标签可以是细胞骨架生长的起始点，细胞骨架具有自我延伸的作用，可以加入细胞骨架自起始点延伸的底物和酶类，以及稳定其结构的物质，最终形成连接的细胞骨架；

2)、分子标签可以是核苷酸链，与核苷酸序列偶联时除已有的化学连接外(如链霉素-生物素亲和反应)，还可以通过将分子机器上不影响功能的结构(如抗体Fc段)改造成核苷酸链结合结构域以非化学键的方法连接核苷酸链，或者两者结合以免在核苷酸链复制、转录过程中与分子标签的长度与分子机器失去匹配，核苷酸链可以在连接酶类或修复酶类作用下完成DNA黏性末端的连接，最终将表位信息转化为分子机器两两连接的核苷酸链、多个分子机器连接的核苷酸链；

3)分子机器连接的核苷酸链，全部或者部分携带特异性DNA内切酶或CRISPR-CAS9等核酸切割工具的酶切位点，使分子机器每次连接的位点可能不同的连接方式；

4)在分子机器与位点中的作用过程中，加入切割的酶，以及供连接酶连接的寡核苷酸链，使寻找出分子机器间最短的连接方式。

2.一种生物大分子及生物细胞组织细微结构上的不同表位信息转化为线性信息的转码***产物进行信号放大方法，其特征在于：将分子标签设计来既有长度差别，又还能有可选功能：指导生化反应产生编码产物产生扩增效果，能被靶向切割，自适应优化DNA连接效果，具体设计为：

1)、使不同的分子机器有不同长度的核苷酸；

2)、全部或者部分携带DNA聚合酶起始复制、RNA聚合酶起始转录、核糖体起始翻译，逆转录酶起始逆转录的序列及其终止序列；

3)、在制作好分子机器后，将涉及信号放大的复制、转录、翻译、逆转录酶***加入分子机器预混液，使复制转录、翻译同步启动，并被终止与一定位置，这些酶***或者加入的单链结合蛋白能够结合并保护DNA 序列、防止形成高级结构，使DNA长度不至于过度折叠，同时使核酸切割工具不能首先进行切割将所测量的距离适当缩短，切割也可以引入一些序列使测量距离延长，实现非同步自动缩短或延长DNA长度，即自适应优化，寻找最短的连接方式，产生较多种类分子机器连接方式的扩增产物；

4)、通过靶点表位数量、研究目的调整较长DNA、较短DNA的分子机器数量比例，根据反应结果实时调整加入内切酶、连接DNA片段等的种类和时间，优化检出率与精确性复杂性的关系，获取更多不同位点的分子机器间两两连接，最终形成多个连接的更准确的表位信息。

3、一种将生物大分子及生物细胞组织细微结构上的不同表位信息转化为线性信息的转码***产物解码方法，其特征在于：

1)、连接的分子机器，分子量更大，电荷也将变化，将其更直接凝胶电泳，通过凝胶阻滞实验，确定分子机器是否连接；

2)、连接的是不同分子机器会有不同同位素，可以区分其分子机器成分；

3)、最后进行PCR扩增，凝胶电泳及测序确定，DNA链的大小、序列；细胞骨架则通过质谱、色谱方法检测大小、序列；

4)、不断缩短分子机器上连接的分子标签的长度，重复进行，直到确定不同表位的最小距离。

4、扩增产物的信息解码方法，其特征在于：

1)、分析扩增产物的分子机器组成：不同种类的分子机器有特定同位素标记、特定序列、特定的黏性末端、特定长度的DNA序列、能够被特异性核苷酸链酶切工具酶切，通过分析同位素种类、连接的DNA序列、长度、能被哪种酶切酶酶切、黏性末端能连接哪种分子机器和连接的寡核苷酸就能确定分子机器的组成；

2)、对比酶切前、酶切后、酶切掉的核苷酸链长度、黏性末端接头类型、核苷酸链序列、同位素标记是特异的能够对应特定分子机器，也就对应了特定的表位，能够相互连接的分子机器间分子标签的距离就代表不同表位间的距离；

3)、通过带放射性同位素标记的核苷酸底物，产物直接以及酶切电泳显影看长度及所带同位素类型，或者通过色谱、质谱、核磁共振、测序辅助确定片段之间的前后顺序、长度、序列

4)、不同分子机器对应不同的表位，不同分子机器之间连接的核苷酸链的长度代表表位间的距离；

5)、辅助现有软件预测结构或者免疫组织化学技术的结果，分析生物大分子及生物细胞组织细微结构。本发明生物大分子及生物细胞组织、纳米材料等细微结构分析测定，生物化学反应中物质结构变化动态分析，药品、生物制品、化妆品质量评价分析，组织化学技术中。

5.本发明还提供了一种原位生物化学反应器设计，其特征在于：通过电流分离清洗带电分子，凝胶可以移除、其浓度可以实时调整，实现分子机器原位反应、结果实时分析：

1)、如附图示，将待检测的生物大分子及生物细胞组织固定在胶孔中，使生物大分子及生物细胞组织、分子机器只能留在孔内，且未与其结合的带点物质会随电流离开，起到代替PBS等缓冲剂洗涤的效果；

2)、将不同的浓度的凝胶预制好，多个电极可以使在反应孔处电势的情况下切下影响显影的末端凝胶，或者将凝胶取出在其他地方电泳或者进行酶切、测序、PCR等操作；

3)、通过许多小管将分子机器、各种反应物、抑制剂等投放入反应孔内或将液体吸走，以实现孔内的反应可以操纵；

4)、凝胶的使不同大小的核苷酸链分开，根据带点粒子在其中的泳动速率测算核苷酸的长度大小，并将影响观察的带点的小分子底物留在正极或者负极且不会像一般电泳一样可能从缓冲液回流；

5)、上方是高频摄像头，及放射线拍摄工具，观察反应产物实时产生情况，以便计算机或人工分析，最终计算机建模产生比现有组织化学技术更精细的数据化病理图片或者实验测量验证的生物大分子及生物细胞组织细微结构图像。

该反应装置可用于生物化学原位反应、PCR、免疫印迹、及其自动化生物中。

附图说明

图1为原位生物化学反应器设计示意图。

如附图示，由凝胶板、电压控制***、多个电极、中央的加样孔，样品固定于其上，多根微量加样、取样管、拍摄工具组成；反应时，将待检测物固定在不会随电流移动的物质上，放入胶孔，通过加样管加入反应物，反应时也可以根据程序胶乳酶、寡核苷酸、抑制剂等反应物，或者补充缓冲液，胶孔四周可以高于凝胶使加入样品不会流入也不会因为吸走样品而影响凝胶的的电流；随着生化反应进行，核苷酸底物会随反应进行而随底物快速涌动离开，当到达底部时改变连接的电极维持反应孔间电压，切去底部的凝胶避免这些底物留在缓冲液中增加电泳拍照的背景；而产生长的片段可以涌动速度更慢，且有放射性标记，从而将其分离出。

具体实施方式

实施例1：分子机器应用于制备与评估胞内病原体假受体，其特征在于：

1)、制备胞内病原体假受体：将HIV致病相关的CD4或CCR5、COVID19致病相关的ACE2与TMPRSS2或其他致病相关分子、增强脂质膜稳定性、改变脂质体电荷而与病原体高亲和等不同功能的蛋白连接形成的特定距离的复合体，将DNA上与一些改造后的疏水性DNA结合蛋白质加入实现复合体的定向排列并与脂质体高度亲和，将一些水解酶包在脂质体内，形成胞内病原体的假细胞受体；

2)、制备后，用相应蛋白的抗体分子机器评估蛋白之间的距离、成分等对脂质体的电荷、大小、功能等之间的关系；

3)、该胞内病原体假受体可用于血液制品中、动物、患者胞内病原体的防治。

实施例2：辅助电子显微镜技术

分子机器的分子标签若是细胞骨架可以形成较大纤维足以放大信号，帮助电子显微镜定位一些细微结构。

实施例3：辅助免疫共沉淀技术

在比较微量的情况下，为实证两物质的相互作用，可以用其抗体制作分子机器，得出含量、表位距离变化，找到或者排除它们之间的作用位点，辅助免疫共沉淀技术。

实施例4：酶促反应中酶结构变化动态分析

酶促反应前、反应中、添加抑制剂、激动剂时，酶自身表面表位信息的变化可以通过本方法测量，本方法还提供了延时DNA酶切，为测量酶动态结构变化提供了可能。

Claims (11)

1.一种将生物大分子及生物细胞组织细微结构上的不同表位信息转化为线性信息的转码***，至少包括分子机器，分子机器上连接分子标签，其特征在于：所述的转码***包括：

(1)、分子机器：

1)、能与生物大分子及生物细胞组织细微结构上的表位结合：抗体与抗原表位，配体与受体，反应底物与酶、核苷酸链结合结构域与核苷酸链，序列匹配的核苷酸链、纳米分子与能与之结合的生物结构之间存在靶向相互作用，通过将抗体、配体或受体、反应底物或酶、核苷酸链结合结构域或核苷酸片段设计改造成的分子机器，保持与生物大分子上表位的相互作用；

2)、连接了可以延伸或在不同分子机器上进行连接的分子标签；

3)、在合成过程中被同位素标记；

(2)、分子标签可以延伸或在不同分子机器上进行连接：

1)、分子标签可以是细胞骨架生长的起始点，细胞骨架具有自我延伸的作用，可以加入细胞骨架自起始点延伸的底物和酶类，以及稳定其结构的物质，最终形成连接的细胞骨架；

2)、分子标签可以是核苷酸链，与核苷酸序列偶联时除已有的化学连接外(如链霉素-生物素亲和反应)，还可以通过将分子机器上不影响功能的结构(如抗体Fc段)改造成核苷酸链结合结构域以非化学键的方法连接核苷酸链，或者两者结合以免在核苷酸链复制、转录过程中与分子标签的长度与分子机器失去匹配，核苷酸链可以在连接酶类或修复酶类作用下完成DNA黏性末端的连接，最终将表位信息转化为分子机器两两连接的核苷酸链、多个分子机器连接的核苷酸链；

3)分子机器连接的核苷酸链，全部或者部分携带特异性DNA内切酶或CRISPR-CAS9等核酸切割工具的酶切位点，使分子机器每次连接的位点可能不同的连接方式；

4)在分子机器与位点中的作用过程中，加入切割的酶，以及供连接酶连接的寡核苷酸链，使寻找出分子机器间最短的连接方式。

2.权利要求1述将生物大分子及生物细胞组织细微结构上的不同表位信息转化为线性信息的转码***在生物大分子及生物细胞组织、纳米材料等细微结构分析测定，生物化学反应中物质结构变化动态分析，药品、生物制品、化妆品质量评价分析，组织化学技术中的运用。

3.一种将权利要求1所述生物大分子及生物细胞组织细微结构上的不同表位信息转化为线性信息的转码***产物进行信号放大方法，其特征在于：将分子标签设计来既有长度差别，又还能有可选功能：指导生化反应产生编码产物产生扩增效果，能被靶向切割自适应优化DNA连接效果，具体设计为：

1)、使不同的分子机器有不同长度的核苷酸链；

2)、全部或者部分携带DNA聚合酶起始复制、RNA聚合酶起始转录、核糖体起始翻译，逆转录酶起始逆转录的序列及其终止序列；

3)、在制作好分子机器后，将涉及信号放大的复制、转录、翻译、逆转录酶***加入分子机器预混液，使复制转录、翻译同步启动，并被终止与一定位置，这些酶***或者加入的单链结合蛋白能够结合并保护DNA序列、防止形成高级结构，使DNA长度不至于过度折叠，同时使核酸切割工具不能首先进行切割将所测量的距离适当缩短，切割也可以引入一些序列使测量距离延长，实现非同步自动缩短或延长DNA长度，即自适应优化：寻找最短的连接方式，产生较多种类分子机器连接方式的扩增产物；

4)、通过靶点表位数量、研究目的调整较长DNA、较短DNA的分子机器数量比例，根据反应结果实时调整加入内切酶、连接DNA片段等的种类和时间，优化检出率与精确性复杂性的关系，获取更多不同位点的分子机器间两两连接，最终形成多个连接的更准确的表位信息。

4.一种将权利要求1述将生物大分子及生物细胞组织细微结构上的不同表位信息转化为线性信息的转码***产物解码方法，其特征在于：

1)、连接的分子机器，分子量更大，电荷也将变化，将其更直接凝胶电泳，通过凝胶阻滞实验，确定分子机器是否连接；

2)、连接的是不同分子机器会有不同同位素，可以区分其分子机器成分；

3)、最后进行PCR扩增，凝胶电泳及测序确定，DNA链的大小、序列；细胞骨架则通过质谱、色谱方法检测大小、序列；

4)、不断缩短分子机器上连接的分子标签的长度，重复进行，直到确定不同表位的最小距离。

5.一种将权利要求2所述扩增产物的信息解码方法，其特征在于：

1)、分析扩增产物的分子机器组成：不同种类的分子机器有特定同位素标记、特定序列、特定的黏性末端、特定长度的DNA序列、能够被特异性核苷酸链酶切工具酶切，通过分析同位素种类、连接的DNA序列、长度、能被哪种酶切酶酶切、黏性末端能连接哪种分子机器和连接的寡核苷酸就能确定分子机器的组成；

2)、对比酶切前、酶切后、酶切掉的核苷酸链长度、黏性末端接头类型、核苷酸链序列、同位素标记是特异的能够对应特定分子机器，也就对应了特定的表位，能够相互连接的分子机器间分子标签的距离就代表不同表位间的距离；

3)、通过带放射性同位素标记的核苷酸底物，产物直接以及酶切电泳显影看长度及所带同位素类型，或者通过色谱、质谱、核磁共振、测序辅助确定片段之间的前后顺序、长度、序列；

4)、不同分子机器对应不同的表位，不同分子机器之间连接的核苷酸链的长度代表表位间的距离；

5)、辅助现有软件预测结构或者免疫组织化学技术的结果，分析生物大分子及生物细胞组织细微结构。

6.一种权利要求5所述过程可以通过仪器自动完成的原位生物化学反应器装置，其特征在于：通过电流分离清洗带电分子，凝胶可以移除、其浓度可以实时调整，实现分子机器原位反应、结果实时分析：

1)、自动化装置由凝胶板、电压控制***、左右分别有多个电极、中央的加样孔，样品固定于其上，多根微量加样、取样管，拍摄工具组成；

2)、将待检测的生物大分子及生物细胞组织固定在胶孔中，使生物大分子及生物细胞组织、分子机器只能留在孔内，且未与其结合的带点物质会随电流离开，起到代替PBS等缓冲剂洗涤的效果；

3)、将不同的浓度的凝胶预制好，多个电极可以使在反应孔处电势的情况下切下影响显影的末端凝胶，或者将凝胶取出在其他地方电泳或者进行酶切、测序、PCR等操作；

4)、通过许多小管将分子机器、各种反应物、抑制剂等投放入反应孔内或将液体吸走，以实现孔内的反应可以操纵；

5)、凝胶的使不同大小的核苷酸链分开，根据带点粒子在其中的泳动速率测算核苷酸的长度大小，并将影响观察的带点的小分子底物留在正极或者负极且不会像一般电泳一样可能从缓冲液回流；

6)、上方是高频摄像头，及放射线拍摄工具，观察反应产物实时产生情况，以便计算机或人工分析，最终计算机建模产生比现有组织化学技术更精细的数据化病理图片或者实验测量验证的生物大分子及生物细胞组织细微结构图像。

7.用权利要求1所述的分子机器应用于制备与评估胞内病原体假受体，其特征在于：

1)、制备胞内病原体假受体：将HIV致病相关的CD4或CCR5、COVID19致病相关的ACE2与TMPRSS2或其他致病相关分子、增强脂质膜稳定性、改变脂质体电荷而与病原体高亲和等不同功能的蛋白连接形成的特定距离的复合体，将DNA上与一些改造后的疏水性DNA结合蛋白质加入实现复合体的定向排列并与脂质体高度亲和，将一些水解酶包在脂质体内，形成胞内病原体的假细胞受体；

2)、制备后，用相应蛋白的抗体分子机器评估蛋白之间的距离、成分等对脂质体的电荷、大小、功能等之间的关系；

3)、该胞内病原体假受体可用于血液制品中、动物、患者胞内病原体的防治。

8.权利要求4所述的生物大分子及生物细胞组织细微结构上的不同表位信息转码解码在生物大分子及生物细胞组织、纳米材料等细微结构分析测定，生物化学反应中物质结构变化动态分析，药品、生物制品、化妆品质量评价分析，组织化学技术中的运用。

9.权利要求5所述的生物大分子及生物细胞组织细微结构上的不同表位信息转码放大解码在生物大分子及生物细胞组织、纳米材料等细微结构分析测定，生物化学反应中物质结构变化动态分析，药品、生物制品、化妆品质量评价分析，组织化学技术中的运用。

10.权利要求6所述的原位生物化学反应器设计、电流分离产物、减少或代替缓冲剂洗涤的方法，在生物化学反应及其自动化设备中的应用。

11.权利要求11所述胞内病原体假受体在于生物制品生产、动物、患者胞内病原体的防治中的应用。

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