CN101460953B - 用于合成分析的序列的***和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明包括用于从无性系扩增单分子阵列对例如短DNA序列等核酸进行测序的***和装置。

Description

用于合成分析的序列的***和装置
技术领域
本发明涉及核酸测序领域。更具体来说，本发明提供用于对例如来自无性系扩增单分子阵列的短DNA序列等核酸进行序列分析的***和装置。
本申请要求2006年3月31日提交的USSN 60/788248和2006年4月26日提交的USSN 60/795368的优先权，通过引用将其完整地结合到本文中以用于所有目的。
背景技术
近来生物学研究的许多进展获益于核酸的分析和测序的改进方法。例如，人类基因组项目确定了人类基因组的完整序列，这有希望引起从疾病治疗到基础科学进步范围内的领域中的进一步发现。虽然已经对“人类基因组”进行测序，但是仍然存在要分析的大量基因组材料，例如不同个体、组织、附加种类等之间的遗传变异。
基于不同长度片断的分离的DNA测序的装置首先在二十世纪八十年代被开发，并且多年来在市场进行销售。但是，这种技术涉及使各个样本通过填充了聚丙烯酰胺凝胶的毛细管柱，因此由于移动各样本所需的时间而在通过量方面受到限制。近来报道了许多新的DNA测序技术，它们基于未扩增(WO00006770；Proceedings of theNational Academy of Sciences U.S.A，100，3960-3964(2003))或扩增单分子的大规模平行分析，采取平面阵列(WO9844151)或小珠(WO04069849；Nature，437，376-380(2005)；Science，309，5741，1728-1732(2005)；Nat Biotechnol.6，630-6344(2000))的形式。
以这类新的测序技术分析核酸的序列的方法往往基于荧光核苷酸或寡核苷酸的检测。用于读取关于这类阵列的荧光信号的检测仪器通常基于落射荧光(epifluorescence)或全内反射显微术，如WO9641011、WO00006770或WO02072892中所述。虽然全内反射显微术用于对表面的DNA的单分子和扩增分子进行成像，但是，本文首次描述一种强的可靠的四色DNA测序平台(例如包括加热***、流体控制、均匀照射、光束形状的控制、自动聚焦(Autofocus)***以及所有组件的全软件控制)。
不断地需要核酸的快速可靠测序的更好、更强健且更经济的装置和***。本发明提供这些及其它有益效果，通过阅读本说明书、权利要求书和附图，这些有益效果将会非常明显。
发明内容
在本文的各个方面，本发明包括用于对一个或多个多核苷酸进行测序的***和装置。这些***可用于对平面衬底进行成像，其中衬底可包括未扩增单分子、扩增单分子、一个或多个成阵列的珠子的集合或者它们的各种组合。在用于测序时，这些***可选地包括：平面固体衬底，其上陈列有例如直接附连或者与可选地排列在衬底上的小珠的一个或多个多核苷酸；导流***，其可控地移动各种试剂(例如缓冲剂、酶、荧光标记核苷酸或寡核苷酸等)至与多核苷酸接触；温度控制***，其调节衬底和/或试剂的温度；光学***，其用于获得具有均匀光束印迹(其中印迹形状是可选可控的)对衬底的全内反射照射、用于激励荧光部分(fluorescent moiety)的光源(例如一种包括一个或多个激光器)；检测器组件(例如CCD相机和物镜等)，其邻近衬底，并且用于捕捉和检测来自被激励部分(moiety)的荧光；计算机，其与检测器连接，其具有用于控制***的各个组件、获取来自检测器的荧光数据以及可选地用于从荧光数据确定多核苷酸的序列的指令集。
在一些这类实施例中，衬底可离开检测器，以便与温度控制***进行交互，因而调节衬底的温度(例如允使得聚合酶反应能够进行等)。在这类实施例中，***可包括可选的计算机控制的扫描台或移动平台。加热装置可以是相对于扫描台移动的计算机控制的帕贴耳(Peltier)器件或其它加热/冷却组件，或者扫描台可选地可移动，以便确保帕贴耳器件与衬底接触。
在本文的各个实施例中，衬底可包括流通池。流通池可具有其中陈列有多核苷酸的一个或多个流体通道(例如其中多核苷酸直接与流通池附连或者多核苷酸与排列在流通池上的一个或多个小珠附连)，并且可由玻璃、硅、塑料或者其各种组合来组成。
在典型的实施例中，试剂包括用于合成与一个或多个多核苷酸互补的第二序列的组分。合成可使用标记核苷酸来进行，标记核苷酸可单独添加，或者作为核苷酸的混合物或者作为标记寡核苷酸来添加。在标记寡核苷酸的情况下，可确定与标记寡核苷酸互补的一个或多个碱基的身份。标记核苷酸可采取荧光标记三磷酸盐的形式，其可包含封闭部分，以便控制添加并确保将单核苷酸加入每个多核苷酸。荧光团可与封闭部分附连，其可位于糖的3’位置，或者可通过核苷酸碱基、通过可以可选地使用与去除封闭部分相同的条件进行***的链接剂来附连。链接剂和封闭部分可使用相同的试剂来***。
在本文的各个实施例中，全内反射(TIRF)***可包括例如灯或激光器。***可包括可通过光纤装置耦合的一个以上激励激光器。这类激光器可照射相同区域的至少一部分(即重叠)。本文的TIRF激光器还可选地包括摇动、振动、波片调制或压电致动器挤压光纤搅模器(mode scrambler)，以便使光学强度在激光器的整个照射印迹上是大致均匀的。本文描述多种用于控制照射强度和均匀性的机制。光纤的形状也可用来控制照射印迹的形状。
本文的各个实施例中的检测器组件可包括一个或多个物镜、附加镜筒透镜、调整台位置和/或物镜位置以确保衬底保持在焦点上的自动聚焦***、适合于透射荧光团的发射波长而阻挡来自激励源的光线的滤光件以及用于记录来自荧光团的荧光发射的***、例如电荷耦合器件(CCD)或类似相机。
通过结合附图和权利要求书阅读以下详细描述，本发明的这些及其它特征将变得更为清楚。
附图说明
图1示出本发明的示范***的主要组件的一般化概览。
图2示出在没有包封机箱或盖板的情况下所示的本发明的示范***的图片。
图3示出本发明的***中的示范流通池、物镜和光纤激光器设置的图片。
图4的画面A-D示出流通池的示范配置。
图5的画面A和B示出形成***的流通池(画面A)的方法和Foturan玻璃的透射光谱(画面B)。
图6的画面A-E示出构造本文的流通池的一种可能的示范蚀刻方法。
图7的画面A-C示出推送(画面A)和拉取(画面B和C)配置的***可能的流体流动组件/布置的示范示意图。
图8示出独立于本发明的其它方面的***的示范加热/冷却组件。
图9的画面A-D示出本发明可能的流通池和流通池支座配置的示意图。
图10的画面A和B示出本发明的示范实施例的图片，说明加热/冷却组件和流通池支座的移动(画面A)以及加热/冷却组件相对于示范***的其它组件的示意图(画面B)。
图11的画面A和B示出示图，示出保持光学元件、光纤激光器支架、加热/冷却和流通池支座组件的示范框架(A)以及示范流通池水平调整配置(B)。
图12示出说明***的框架和收容体的***的示范实施例的图片。
图13-16示出本文的***中的相机、光源和其它组件的各种可选配置。
图17-19示出本文的***的各个实施例中的TIRF激光器的光束形状和尺寸的各种示意图。
图20示出与本文的***和装置配合使用的TIRF棱镜的可选实施例。
图21示出通过抛光多模光纤输出端来创建方形激光束。
图22的画面A和B示出本文的各个实施例中可选的示范滤光件和滤光轮配置(A)以及那些滤光件相对于以激光器波长所激励的四个示范荧光团的光谱(B)。
图23示出本发明的***的光学组件的示范标称1G设计、30X K4***光线迹线。
图24示出本发明的示范***的30X K4成像性能。
图25示出本文的示范***的自动聚焦特征的示意图。
图26-27示出本文的***/装置的各个实施例进行的聚焦和未聚焦测量的图片。
图28示出自动聚焦激光束的简图。
图29示出根据本发明的一个实施例所检测的检测到的核酸聚类的数量作为总聚类数和最小聚类区域的函数的的曲线图。
图30-32示出核酸聚类以及采用本发明的***/装置对它们进行测序的略图。
图33的画面A-D示出圆形光纤的三种不同形式的物理变形对于从光纤射出的光束的影响。振动或挤压光纤使得从光纤射出的光线在图像的积分时间内是均匀的。
图34的画面A-D示出矩形光纤的三种不同形式的物理变形对于从光纤射出的光束的影响。振动或挤压光纤使得从光纤射出的光线在图像的积分时间内是均匀的。
图35的画面A-L示出各种搅模方案对于来自多个不同光纤的射出光线的影响。
图36示出本发明的双相机***实施例的一种可能布置。
图37示出包含用于同时记录相同图像上的2种颜色的2个相机的本发明的示范实施例。
图38示出λ/2波片的示意图。
图39示出包括多个不同取向部分的λ/2改性波片的示意图。
图40示出本发明的实施例的模式波片调制混合***的略图。
图41的画面A-D示出来自多模光纤的照射印迹区域的图片以及通过使用波片而产生于混合光模的结果。
图42的画面A和B示出通过使用波片而由于多模混合的激光覆盖区域的大致均匀性。
图43示出本发明的双流通池支座实施例，使得化学操作可并行进行，以便使仪器的扫描时间为最大。
图44的画面A-F示出底流流通池、棱镜和侧面/顶部TIRF照射的示范实施例。
图45示出流通池和棱镜下方的示范温度调节组件。
图46示出示范流体阀和示范流管(例如与底流流通池配合使用)。
图47示出本发明的示范流体阀。
图48的画面A和B示出本发明的一种可能的双流通池配置。
图49的画面A-F示出能够与本发明的底流流通池配合使用的各种示范底部温度调节配置。
具体实施方式
本发明包括用于从例如流通池内的无性系扩增单分子DNA阵列或者从固定小珠的阵列分析大量不同核酸序列的***和装置。本文的***可选地可用于例如比较基因组的测序(例如用于基因分型、SNP发现、BAC末端测序、染色体断点映射以及全基因组序列拼接)、跟踪基因表达、微RNA序列分析、表基因组学(例如用甲基化映射DNAsel过敏部位映射或染色质免疫沉淀)，以及适体和噬菌体陈列库表征。本领域的技术人员当然会易于理解，本发明也可修改以用于其它无数测序应用。本文的***包括光学、机械、流体、热、电和计算装置/方面的各种组合，下面更全面地进行描述。另外，即使本发明在某些实施例中针对这类方面的具体配置和/或组合，但是本领域的技术人员会理解，并非所有实施例必须包括所有方面或具体配置(除非另有说明)。
简言之，在图1中概述本发明的一般方面，其示出背光设计实施例的示范TIRF成像配置。在图1中可看到，流体传送模块或装置100将试剂流(例如荧光核苷酸、缓冲剂、酶、***试剂等)导向流通池110和排废阀120(并通过其中)。在具体实施例中，流通池包括可选地与流通池的衬底以及可选的其它组件附连的待测序核酸序列(例如长度大约为200-1000碱基)的聚类。流通池还可包括小珠的阵列，其中各小珠可选地包含单序列的多个副本。这类小珠的制备可按照各种技术来进行，例如USPN6172218或WO04069849(小珠乳剂核酸扩增)中所述。
***还包括温度站致动器130和加热器/冷却器135，它们可以可选地调节流通池中的流体的状态的温度。如下所述，各个实施例可包括加热/冷却组件的不同配置。由相机***140(例如CCD相机)监视流通池以及跟踪测序，相机***140可与滤光件切换组装件145中的各个滤光件、物镜142和聚焦激光器/聚焦激光器组装件150进行交互。激光器装置160(例如可选地包括多个激光器的组装件中的激励激光器)起作用以便由激光通过光纤光学元件161(它可以可选地包括一个或多个重新成像透镜、光纤光学元件支架等)照射来照射流通池中的荧光测序反应。低功率灯165、反射镜180和反二色元件(reverse dichronic)185也在所示实施例中提供。参见以下所述作为补充，安装台170允许流通池、温度致动器、相机等相对于本发明的各个组件的适当对准和移动。聚焦(z轴)组件175还可帮助各个组件(例如物镜)的操纵和定位。这类组件可选地布置在框架上和/或装入收容体结构中。大家会理解，本文的照射属于示范实施例，而不一定理解为限制。因此，例如，不同的实施例可包括组件相互之间的不同放置(例如，实施例A包括如图1中的加热器/冷却器，而实施例B包括其流通池下方的加热器/冷却器组件)。
定义
在详细描述本发明之前，大家要理解，本文的本发明并不局限于与特定的核酸或生物***配合使用，本发明当然可以有变化。还要理解，本文所使用的术语仅用于描述具体实施例，而不是要进行限制。本说明书及所附权利要求书中所使用的单数形式“一个”和“该”、“所述”包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“流通池”的提法可选地包括两个或更多流通池的组合等。
本文所使用的术语“多核苷酸”或“核酸”指的是脱氧核糖核酸(DNA)，但在适当的情况下，技术人员会知道，本文的***和装置也可与核糖核酸(RNA)配合使用。术语应当理解为包括由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物作为等效物。本文所使用的术语还包含cDNA，即，例如通过反转录酶的作用从RNA模板产生的互补或复制DNA。
由本文的***和装置测序的单链多核苷酸分子可起源于如DNA或RNA等单链形态，或者起源于双链DNA(dsDNA)形态(例如基因组DNA片段、PCR和扩增产物等)。因此，单链多核苷酸可以是多核苷酸双链体的正义或反义链。适合用于使用标准技术的本发明的方法的单链多核苷酸分子的制备方法是本领域众所周知的。原生多核苷酸分子的准确序列对于本发明一般并不重要，并且可以是已知或未知的。单链多核苷酸分子可表示包括内含子和外显子序列(编码序列)的基因组DNA分子(例如人类基因组DNA)以及非编码调序列、如启动子和增强子序列。
在某些实施例中，待通过使用本发明来测序的核酸固定在衬底上(例如流通池中的衬底或者例如流通池等衬底上的一个或多个小珠)。本文所使用的术语“固定”意在包含直接或间接、共价或非共价附连，除非明确地或者通过上下文另加说明。在本发明的某些实施例中，共价附连可以是优选的，但一般来说，所需的是分子(例如核酸)保持固定或者打算使用支承的条件下与该支承附连，例如在需要核酸测序的应用中。
本文所使用的术语“固体支承”(或者某些使用中的“衬底”)指的是核酸可与其附连的任何惰性衬底或基体，例如玻璃表面、塑料表面、乳胶、葡聚糖、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面和硅晶圆。在许多实施例中，固体支承是玻璃表面(例如流通池通道的平面)。在某些实施例中，固体支承可包括惰性衬底或基体，它例如已经通过涂敷包括允许与分子、如多核苷酸进行共价附连的反应基的中间材料层或涂层进行官能化。作为非限制性示例，这类支承可包括支承在惰性衬底、如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶。在这类实施例中，分子(核苷酸)可以直接共价地与中间材料(例如水凝胶)附连，但是中间材料本身可以与衬底或基体(例如玻璃衬底)非共价地附连。与固体支承的共价附连将被相应地理解为包含这种类型的布置。
***概述
如上所述，本发明包括用于对核酸进行测序的新***和装置。本领域的技术人员将会清楚地知道，本文对具体核酸序列的提法根据上下文也可指包含这种核酸序列的核酸分子。目标片段的测序表示建立碱基的先后顺序的读取。被读取的碱基不需要是连续的，但这是优选的，在测序期间也不需要对整个片断上的每一个碱基进行测序。测序可使用任何适当的测序技术来进行，其中将核苷酸或寡核苷酸连续加入自由3’羟基团，从而产生5’至3’方向的多核苷酸链的合成。所添加的核苷酸的性质优选地在每次核苷酸添加之后来确定。其中不是对每一个邻接碱基进行测序的使用通过缚法(ligation)测序的测序技术以及例如从表面上的链去除碱基而不是加入碱基的大规模平行信号测序(MPSS)等技术也可修改以便与本发明的***和装置配合使用。
在某些实施例中，本发明利用合成测序(SBS)。在SBS中，四个荧光标记改性核苷酸用于对衬底表面(例如流通池)上存在的扩增DNA的密集聚类(可能数百万个聚类)进行测序。本发明人和同事描述了有关可与本文的***和装置配合使用的SBS过程及方法的各个附加方面。参见例如WO04018497、WO04018493和US7057026(核苷酸)、WO05024010和WO06120433(聚合酶)、WO05065814(表面附连技术)、WO9844151、WO06064199和WO07010251，通过引用将其内容完整地结合到本文中。
在本文的***/装置的具体使用中，将包含用于测序的核酸样本的流通池放置在本发明的适当的流通池支座中(本文描述它们的各种实施例)。用于测序的样本可采取单分子、聚类形式的扩增单分子或者包括核酸的分子的小珠的形式。可制备核酸，使得它们包括与未知目标序列相近的寡核苷酸引物。为了发起第一SBS测序循环，由流通子***(本文中描述它的各种实施例)使一个或多个不同标记的核苷酸和DNA聚合酶等流入/流经流通池。单核苷酸每次可添加单核苷酸，或者用于测序过程的核苷酸可专门设计成具有可逆端接性质，因而允许测序反应的每次循环当存在全部四个标记核苷酸(A、C、T、G)时同时发生。在四个核苷酸混合在一起的情况下，聚合酶能够选择要结合的正确碱基，并且各序列通过单碱基来扩展。在使用本发明的***的这类方法中，全部四个选择之间的自然竞争引起比只有一个核苷酸存在于反应混合物(其中序列的大部分因此没有暴露于正确的核苷酸)的情况更高的精度。与任何其它序列相似并且以高精度来解决其中特定碱基一个接一个地重复的序列(例如均聚物)。
流通子***还使适当的试剂流动，以便从每个结合的碱基中去除阻挡的3’端(适当的时候)和荧光团。衬底可暴露于四个阻挡核苷酸的第二轮，或者可选地暴露于不同的个体核苷酸的第二轮。然后可重复进行这类循环，并且在多个化学循环读取各聚类的序列。本发明的计算机方面可以可选地排列从每个单分子、聚类或小珠所收集的序列数据，以确定较长聚合物的序列等。备选地，图像处理和排列可在独立的计算机上进行。
***的加热/冷却组件调节流通池通道和试剂存储区域/容器(以及可选的相机、光学器件和/或其它组件)中的反应条件，而流通组件允许衬底表面暴露于适当的试剂以便结合(例如待结合的适当的荧光标记核苷酸)，同时冲洗掉未结合的试剂。其上设置了流通池的可选可移动台允许流通池进入用于衬底的激光(或其它光线)激励的适当取向，并且可选地相对物镜移动，以便允许读取衬底的不同区域。另外，***的其它组件可选地也是可移动/可调的(例如相机、物镜、加热器/冷却器等)。在激光激励期间，来自衬底上的核酸的发射荧光的图像/位置通过相机组件来捕捉，由此在计算机组件中记录每个单分子、聚类或小珠的第一碱基的标识。
图2示出本发明的***的示范布置的图片。可以看到，***可分为若干基本组，例如包括流体和试剂存储装置(包括用于产生和调节流体流量的泵和电机等、用于适当的试剂温度的加热器/冷却器等)的区域200、包括流通池和检测(包括一个或多个相机或类似装置、一个或多个激光器或其它光源、一个或多个适当的滤光件和透镜、温度控制致动器，例如具有用于控制流通池的温度条件的Peltier加热/冷却、可移动分级平台以及控制它以正确定位***中的各种装置/组件的电机)的区域210以及包括计算机模块(包括存储器和用户接口，例如显示面板和键盘等)的区域220。
图3示出设置在示范***中的流通池(流通池300)的图片。通过光纤320耦合的激光器放置在用于照射流通池(它包含待测序的核酸样本)，同时一旦通过激光或其它光线照射荧光团，物镜组件(组件310)即捕捉和监视各种荧光发射。在图3中还可以看到，试剂通过与适当的试剂存储装置等连接的一个或多个管道(管道330)流过流通池。图3的流通池设置在流通池支座340(这又设置在可移动输运区域350上)中。流通池支座在测序进行的同时，使流通池相对于激光器、棱镜(它将激光照射导向成像表面)和相机***的适当位置同时进行测序。下面阐明其它流通池和流通池配置。
本发明的各个实施例提供若干新特征(大家同样会理解，并非所有特征都一定存在于所有实施例中，除非另加说明)。例如，本文的***可使用通过光纤光学装置耦合的两个激励激光器，以确保它们照射同一个区域(即激光器的照射区域或印迹重叠)。另外，本发明可包含摇动、挤压或波片调制光纤(搅模器)，使得可使来自多模光束的光学强度在整个照射印迹上均匀。光纤的形状可以调整为例如正方形或矩形，使得照射的形状可与数据采集装置(例如具有正方形区域像素的CCD)的形状匹配。另外，在某些实施例中，单个激光器激励两个荧光团，一个具有接近波长的窄发射滤光件，而一个具有更长波长的更宽能带发射滤光件。这种布置使两种染料的相对强度规格化(对于相同的带宽滤光件，远离激光波长的颜色会更弱)。本文的实施例还可包括移动台，使得化学(它需要加热和冷却)可在相同仪器上发生，但出于光学行列。本文的***往往还包含自动聚焦***，以便允许许多块的自动成像，并且包含用于进行在线流体改变的流体***。***/装置的各个组件(例如光源、相机等)可以可选地各具有其自己的电源，或者可以可选地由一个源供电。大家会理解，虽然本文的组件往往孤立地或者仅结合一个或两个其它组件来描述，但是实施例中的各种组件通常在操作和/或功能上与本文的***/装置连接并且与其共同工作。
流通池
在各个实施例中，本文的***包括一个或多个衬底，在其上固定、附连或关联有待测序的核酸。参见例如WO9844151或WO0246456。在某些实施例中，衬底处于作为“流通池”的组成部分的通道或其它区域中。用于本发明的各个实施例的流通池可包括数百万个体的核酸聚类，例如每个通道大约2-8百万个聚类。这些聚类的每个对于DNA测序可给出至少25个碱基的读取长度以及对于基因表达分析可给出20个碱基的读取长度。本文的***可以生成每个行程的序列的千兆碱基(十亿碱基)(例如每个通道5百万核酸聚类，每个流通池8个通道，每个多核苷酸25个碱基)。
图4A和图4B示出流通池的一个示范实施例。可以看到，具体流通池实施例即流通池400包括(例如深度为1000μm的硼硅玻璃的)基层410、重叠在基层上的(例如深度为100μm的蚀刻硅的)通道层420以及(例如深度为300μm的)覆盖或顶层430。当这些层装配在一起时，形成封装的通道，其具有穿过覆盖任一端形成具有的入口/出口。通过下面对其它实施例的描述将会显而易见，一些流通池可在流通池底部包括通道的开口。
通道层可以可选地使用标准光刻方法来构造，这是本领域的技术人员熟悉的。可用于本发明的一种这样的方法涉及露出100μm的硅层，并使用深反应离子蚀刻或湿式蚀刻来蚀刻掉外露通道。
大家会理解，虽然本文提供具体流通池配置，但是这类配置不应当一定看作是限制。因此，例如，本文的各种流通池可包括不同数量的通道(例如1个通道、2个或更多通道、4个或更多通道或者6、8、10、16或者更多通道等)。另外，各种流通池可包括不同深度和/或宽度的通道(在不同流通池的通道之间不同以及在同一个流通池的通道之间不同)。例如，虽然在图4B的池中形成的通道为100μm深，但是，其它实施例可以可选地包括更大深度(例如500μm)或更小深度(例如50μm)的通道。其它示范流通池设计如图4C和图4D所示(例如具有其中包括两个通道的“宽”通道、如图4C的通道440，其中具有保持流动均匀性的8个入口和出口端口(端口445-8入口和8入口)以及用于附加结构支承的中心壁、如壁450；或者具有补偿通道、例如16个补偿通道(通道480)的流通池等)。流通池可设计成使来自照射表面的荧光集合为最大，并且获得衍射限制成像。例如，在图4C所示设计中，在具体实施例中，光线通过可由硼硅玻璃、熔融硅石或者本文所述的其它材料制成的1000μm厚的底层460进入通道，以及发射光线穿过通道中的水溶液的100μm深度以及“顶”层材料470的300μm深度。但是，在一些实施例中，“顶”层的厚度可小于300μm，以防止球面像差，以及对衍射限制光斑进行成像。例如，顶层的厚度可以是170μm左右，以便与标准衍射限制光学***配合使用。为了使用更厚的顶层而没有遇到球面像差，物镜可以是定制设计的，如本文所述。
在本文的各个实施例中，可由多种可能的材料来创建流通池。例如，在一些实施例中，流通池可包括可根据需要来形成和操纵的光敏玻璃，例如
Figure G2007800201225D00141
(德国美因兹的Mikroglas)或
Figure G2007800201225D00142
(日本东京的Hoya)。其它可能的材料可包括具有优良光学性质的并且可在必要时耐受高温(例如高达100℃)的塑料，例如环烯烃共聚物(例如
Figure G2007800201225D00143
(肯塔基州佛罗伦萨的Ticona)或
Figure G2007800201225D00144
(肯塔基州路易斯维尔的Zeon Chemicals)。从图4中显而易见，流通池可在同一个池中包括许多不同的材料。因此，在一些实施例中，基层、通道的壁和顶/覆盖层可以可选地属于不同材料。
虽然图4B的示例示出由3层组成的流通池，但是，其它实施例可包括2层，例如其中蚀刻/消融/形成了通道的基层以及顶覆盖层等。另外，其它实施例可包括仅具有包括在其中蚀刻/消融/以其它方式形成的流动通道的一层的流通池。
在一些实施例中，流通池包括
Figure G2007800201225D00151
Foturan是光敏玻璃，它可构造用于各种目的。它结合了各种预期玻璃性质(例如透明度、硬度、化学和热阻等)以及实现具有精密公差和高纵横比(孔深度/孔宽度)的极精细结构的能力。采用
Figure G2007800201225D00152
可能的最小结构通常是例如25μm，粗糙度为1μm。
图5A给出对流通池(例如一种包括的)形成图案的一种可能方式的示意图。首先，采用掩模500在衬底510的表面掩模出预期图案，然后暴露于UV光。在这种曝光步骤中，使玻璃暴露于以290与330nm之间的波长的UV光。可以能够照射达2mm的材料厚度。大约20J/cm2的能量密度通常足够构造1mm厚的
Figure G2007800201225D0015104927QIETU
板。在UV曝光步骤期间，银或其它掺杂原子接合在照射区域(区域520)中。随后，在500℃与600℃之间的热处理期间，玻璃在区域520的银原子周围结晶。最后，结晶区在室温以10％氢氟酸溶液进行蚀刻(各向异性蚀刻)时，具有比玻璃体区要高总共20倍的蚀刻速率，因而产生通道530。如果通过超声波蚀刻或者通过喷雾蚀刻来支持湿式化学蚀刻，则所得结构呈现大纵横比。图5B示出来自Foturan玻璃的样本(d＝1mm)的透射谱。
图6的画面A至E示出构造本文所使用的示范流通池的示范蚀刻工艺。图6A中，通道600(在端视图中看到)和通孔605(在端视图中看到)被暴露/蚀刻到层630中。层630是两层流通池的“顶”层，在图6E中可以看到(与底层620紧密配合)。通孔(试剂/流体进入流通池通道的位置)和通道可通过例如从Invenios(加利福尼亚的圣巴巴拉)得到的3D工艺蚀刻到层630中。顶层630可包括Foturan，如上所述，它可经过UV蚀刻。Foturan在暴露于UV时改变颜色，并且变为不透光(或者伪不透光)。因此，图6B中，层630经过掩模和曝光，以便在层中产生暗区域610(与图5A的掩模相似，但没有进一步蚀刻)。这类不透光区域在阻挡错误定向光线、光散射或者可能不利地影响本文的序列读取的质量的其它不希望的反射方面是有帮助的。在其它实施例中，例如铬或镍等的薄(例如100-500nm)金属层可选地沉积在流通池的层之间(例如在图6E的顶层和底层之间)，以帮助阻挡不希望的光散射。图6C和图6D示出底层620与通道层630的紧密配合，以及图6E示出它们的剖视图。
在各个实施例中，流通池的层通过许多不同方式的任一种相互附连。例如，这些层可经由粘合剂、接合(例如热、化学等)和/或机械方法来附连。本领域的技术人员会熟悉将各种玻璃/塑料/硅层相互附连的许多方法和技术。
同样，虽然本文描述了具体流通池设计和构造，但是，这类描述不应当一定看作是限制；本发明的其它流通池可包括与本文所提供的不同的材料和设计，和/或可通过与本文公开的不同的蚀刻/消融技术或其它创建方法来创建。因此，具体流通池构成或构造方法不应当一定看作是对所有实施例的限制。
流体流通
在本文的各个实施例中，核酸的测序中所使用的试剂、缓冲剂等经由流通子***或方面来调节和分发。图7A-C提供本发明的示范流通布置的总图，它分别以一路推送、八路拉取以及一路拉取配置来建立。一般来说，流通子***以适当速率以及可选地以适当温度通过流通池从试剂存储区域(例如瓶或其它存储容器)传输适当试剂(例如酶、缓冲剂、染料、核苷酸等)，并且可选地传输到废料接收区域。
流体流通方面可选地是计算机控制的，并且可以可选地控制各种试剂组分的温度。例如，某些组分可选保持在例如4℃+/-1℃的冷却温度(例如对于含酶溶液)，而其它试剂可选地保持在高温(例如当特定酶反应在高温发生时流经流通池的缓冲剂)。
在一些实施例中，各种溶液在流经流通池之前可选地经过混合(例如与稀释剂、适当的核苷酸等混合的浓缩缓冲剂)。这种混合和调节也可选地由本发明的流通方面来控制。在许多实施例中，如果使混合流体和流通池之间的距离为最小，则是有利的。因此，泵可设置在流通池之后，并且用于将试剂拉入流通池(图7B和图7C)，与由泵将试剂推入流通池(如图7A中那样)相反。这类拉取配置表示陷入泵中的死体积中的任何材料没有污染流通池。泵可以是注射器式泵，并且可配置成具有每个流动通道一个注射器，以确保通过流通池的各通道的均匀流动。如果希望使用8路流通池，则泵可以是8路泵，例如Kloehn 8路注射泵(内华达州拉斯维加斯的Kloehn)。8路拉取配置的流体图如图7B所示。图7A中，流体试剂存储在试剂容器700中(例如，室温的缓冲剂，5X SSC缓冲剂，酶学缓冲剂，水，***缓冲剂等)和710(例如，酶、酶混合物、水、扫描混合物等的冷却容器)。泵730通过试剂阀740、起动阀/排废阀770将流体从试剂容器移动，并进入/通过流通池760。
图7B中，流体试剂存储在试剂容器702中(例如，与以上列示相似的室温的缓冲剂)和703(例如，酶等的冷却容器，与以上列示相似)，通过试剂阀701联接。本领域的技术人员将会熟悉用于允许对多个管线/容器的可控接入的多路阀(例如试剂阀)。试剂阀经由与可选的起动泵706连接的可选起动阀(或排废阀)704联接到流通池705。起动泵可以可选地通过管道从容器中抽取试剂，使得试剂“准备妥当”进入流通池。因此，将避免(例如由于管道中搁置引起的)静止空气、错误温度的试剂等。当起动泵正抽取时，流出物将分流到排废区。在非起动使用期间，可使用与排废池708连接的8通道泵707通过流通池来拉取试剂。
在任一个实施例(推送或拉取)中，流体配置可包括“吸”管道等，它延伸到各种试剂容器中，以便从容器中抽取试剂。图7C示出单通道泵而不是8通道泵。单通道泵726还可充当可选起动泵，因而可选起动泵或排废阀723可通过旁路725直接与泵726连接。这个实施例中，组件的布置与图7B相似。因此，它包括试剂容器721和722、多路选择阀720、流通池724等。
流通本身可选地通过多种泵类型的任意种来驱动(例如正/负位移、真空、蠕动等)，例如
Figure G2007800201225D0018105005QIETU
2-1泵(科罗拉多州格里利的Encynova)或
Figure G2007800201225D0018105008QIETU
 V3注射泵(加利福尼亚拉斯维加斯的Kloehn)。同样，大家会理解，本文的具体泵的特定激励等不应当一定看作是限制，以及各种实施例可包括与本文列示不同的泵和/或泵类型。在某些实施例中，对于8通道，流体传送速率从大约50μL至大约500μL/min(例如控制在+/-2μL)。在8路拉取配置中，流动可以在10-100微升/分钟/通道，取决于工艺。在一些实施例中，对25个碱基的多核苷酸测序的核苷酸试剂的最大容积大约为12mL。
本文中无论使用哪一种泵/泵类型，试剂都可选地通过管道从其存储区传输到流通池。可选择这种管道、例如PTFE，以便例如使得与试剂的相互作为为最小。管道的直径可在实施例之间(和/或可选地在不同试剂存储区之间)有所改变，但是可根据例如减少管线中留下的流体的量或“死体积”的需求来选择。此外，管道的尺寸可以可选地在每个流动通路的区域之间改变。例如，来自试剂存储区的管道尺寸可具有与从泵到流通池等的管道尺寸不同的直径。
本发明的流通子***还可控制所涉及的试剂的流率。流率对于各流动通路可选地是可调的(例如，某些流动通路能以比其它流动通路更高的流率进行；流率可以可选地反转；不同的通道可接收不同的试剂流动或者试剂流动的不同定时等)。流率可结合各流动通路的管道直径来设置，以便在给定时间在流通池中具有正确的试剂容量等。例如，在一些实施例中，通过其中流动试剂的管道为0.3毫米ID、0.5毫米或1.0毫米，而流率为480微升/分钟或120微升/分钟。在一些实施例中，可选地平衡流动速度，以便优化受关注反应。高流量可引起有效清洗管线并使改变给定流通池体积中的试剂所需时间为最小，但是也可导致衬底表面的较高剪切流等级，并且可导致泄漏或气泡的更大问题。在一些实施例中，引入试剂的一种典型流率可以是15微升/分钟/通道。
***还可配备压力传感器，它们自动检测和报告***的流体性能的特性，例如泄漏、阻塞和流动容积。这种压力或流量传感器在仪器维护和故障排除方面是有用的。流体***可由一个或多个计算机组件来控制，如下面所述。大家会理解，本发明的各种实施例中的流通配置例如在试剂容器的数量、管道长度/直径/构成、选择阀和泵的类型等方面可以改变。
加热/冷却
在一些实施例中，本文的***包括例如通过Peltier器件等而具有加热/冷却能力的加热/冷却控制组件。可选地，本文的各种组件(例如流通池及其内容)可通过电阻加热元件进行加热以及通过对流进行冷却，以便创建高于环境温度的反应条件。这种(这类)加热/冷却组件可在合成测序所需的各种反应中控制流通池(以及其中的流体)的温度。示范流通池温度控制***如图8所示(独立于***的其它组件)。图8中，相对于散热件810和Peltier加热器820示出Peltier风扇800。流通池加热/冷却组件可选地是相对于***的其它组件(例如流通池和流通池支座等)可定位和/或可移动的。因此，加热/冷却组件可在需要时移动到位(例如升高流通池中的试剂的温度，以便考虑到酶活性等)以及在不需要时移开。作为补充和/或替代，流通池和流通池支座可以可选地相对加热/冷却组件移动。参见以下的图10A和图10B。在各种实施例中，温度控制元件控制流通池温度，例如从大约20℃到大约60℃或者将在***/装置中进行的反应所需的任何其它温度/温度范围。加热元件的温度可调整为控制流通池以及其中的试剂的温度。当流通池遇到冷却试剂流时，加热元件的温度可高于流通池的表面需要的温度。例如，加热元件可设置成55℃以获得45℃的流通池温度。
本领域的技术人员将会熟悉用于温度控制的Peltier器件(它可以可选地用于本文的***)。同样，大家会理解，虽然描述某些加热/冷却装置，但不应当一定理解为限制。因此，在某些实施例中，与Peltier器件不同的加热/冷却装置可选地包含在本发明中。在典型实施例中，不管装置的类型，加热/冷却组件可选地由计算机组件来控制(例如在温度、在特定温度的时间、组件的移动、如流通池等其它装置对加热/冷却组件的移动方面)(参见下文)。
在一些实施例中，作为对流通池的补充或替代，附加加热/冷却元件可以可选地调节其它组件的温度。例如，加热/冷却组件可以可选地调节相机、试剂池的温度，它们可被冷却到例如4℃以便在长测序行程中延长存储寿命，以及调节仪器内部的大气的温度等。
多个流通池以及备选TIRF和加热/冷却方法
在本文的某些实施例中，***/装置可对于流通池配置、TIR照射、流通池的加热/冷却配置以及在装置中如何保持/稳定流通池方面包括附加方法。虽然在某些实施例中，这类方法可以可选地共同使用，但是大家会理解，它们分别可以任何组合使用，例如相互组合、与本文所述的其它方式的任何组合等。
在一些实施例中，本文的流通池可以是“底流”流通池。因此，与例如图4、图6和图9所示的、其中流通池被夹住并且流通从流通池的顶部进入的流通池相反，某些流通池可包括允许流通从流通池的底部进入的配置。这类底部流通池在结构和构成方面可以与“顶流”流通池相似。在一些实施例中，底流流通池可包括较少流体死体积(并且比顶流流通池使用整个通道长度的更多，例如因为流通池的末端未被夹具/流管等覆盖)。参见例如图44-49。
底流流通池可以可选地通过真空吸件而不是夹具保持到流通池支座。因此，真空可使流通池保持进入装置的正确位置，使得可进行正确的照射和成像。比较图44-49与图9。因此，本文的一些实施例还包括创建真空(或部分真空等)的一个或多个真空创建装置，以便使流通池和/或棱镜保持到流通池支座、XY台等。
流通池支座流管的各种示例如图46所示，它们可与底流流通池配合使用。可以看到，注入/流经/流出流通池的流体通过流管中的各种分支管道导向流通池中的特定通道或者从流通池中的特定通道被导向。同样，这类实施例可以可选地不阻碍流通池的任何(或者大致上不阻碍任何)顶面，否则可能干扰通道全长的照射/成像。图47示出示范流体阀。这种阀没有移动部件或振动以及具有低的死体积。在这类布置中，各试剂瓶/容器可具有开/闭阀。在抽取流体之后，可在关闭池阀之前注入空气，由此推动试剂之间的气隙阀。冷却试剂可返回到其池中，在***关机的情况下，所有试剂可返回到其池中。空气注入泵也可加入推送/拉取泵(例如kloehn泵)。
照射的另一种方法可包括“自顶向下”照射。这种自顶向下方法在与真空吸件(以及下面的底部温度控制)结合时可以是有用的。在采用真空吸盘和底部温度控制的配置中从底部(例如图1等中那样)进行照射可能可选地是有问题的，因为这类实施例往往利用流通池下方的空间。在图44中可以看到，自顶向下或侧照射从上方进入流通池4402所在的棱镜4401(并且可选地通过真空保持)。这种布置还可帮助防止流通池的弯曲，它的呈现可帮助自动聚焦和平场成像，并且可帮助对于具有同时读取的多个流通池的配置等。图44中，激光照射4400还表示为进入作为反射镜4405的棱镜以及流管/流体连接器4404。
图45示出流通池(以及其中的试剂和反应)的热力学控制的另一种方法。图45示出底部温度控制装置的一个示范实施例。在一些这样的实施例中，该方面可包括水冷工作台，它可帮助确保读取周期中的尺寸稳定性以及可控扫描缓冲剂温度。热板可延伸超过棱镜和流通池并且到达流管之下，以便可选地帮助均匀温度控制。流体可以可选地在通过入口流管时预先加热。RTD温度反馈还可嵌入棱镜顶部，以确保流通池处于预期设置温度以及可使棱镜的热阻效应为最小。
流通池支座中具有多个流通池的配置如图48所示。可以看到，图48A中，总共四个流通池可装载到支座(或者例如各具有18-20个通道的两个双宽流通池)。Peltier或其它类似装置可处于流通池之下，并且可以可选地通过支座台方面(它可以可选地保持在室温)进行水冷却。
台和流通池支座
流通池的放置和移动(因而待测序核酸)例如由流通池和流通池支座(或其它衬底)设置在其上的可移动台来控制和固定。这种可移动台可以可选地允许流通池相对于激光照射和物镜而移动，以便读取通道中的测序反应。需要时，扫描台或其它组件可在扫描周期中主动被冷却，以便在成像周期中控制衬底的温度。
图9的画面A至D示出本***的示范流通池支座配置的示意图。图9A示出流通池设置到其上之前的流通池支座900。可以看到，支座包括可调夹具910(可选地为装有弹簧)以将流通池牢固地固定到支座，并且可选地包括一个或多个流管(例如可选地包含在夹具中)以便以流体方式将流通池通道与流体***的其余部分连接。流管可单独地与通道的每个平行连接。备选地，流管可连接通道，使得它们经由分离成平行流向各通道的单入口管线进行连接，或者可配置为“蛇形”配置以形成单流通。这种流管可配置成包含单1-8分离，或者可包括二元分离器，其中各流体通道仅分为2以得到从1-2-4-8的分离，以便沿8个通道的每个提供更均匀流动。在8路拉取配置中，流通池的“出口”流管可包括8个独立端口，各与8路注射泵的筒连接，而“入口”流管可包含单入口管道，以减少填充流通池所需的管道长度。入口流管可包含1-8个分离器或二元1-2-4-8分离器，用于沿8个通道的每个往下均匀地划分流量。图9B还示出存在可调棱镜920，它可选地可升高/降低以接触到流通池的下侧。棱镜与激光器结合用于TIRF活动。在具体实施例中，油(例如可从Cargille得到的浸油等，目录号#19570)以均匀连续层放置于棱镜与流通池之间，以便通过棱镜与流通池玻璃之间的空气层来创建全内反射。图9C示出流通池930在支座上和棱镜的放置，而图9D示出夹在流通池支座的流通池，其中手柄/夹具940下降以帮助固定夹具和流通池。
流通池和流通池夹具可设置在可移动台或平台上。这种台可选地是沿X、Y和Z轴可调的。这允许流通池相对于激光器、相机、透镜光学元件等的精密标度高度和位置调整，并且允许流通池的表面相对于成像装置保持在焦点上。此外，可移动台可以可选地允许流通池在加热/冷却组件与光学/激光器组件之间来回移动(即，在被加热时允许酶反应，以及用相机/激光器组件量化这类反应的结果)。图10示出说明流通池1020和流通池支座1010在加热/冷却元件(左图)与相机/激光器元件(右图)之间的移动的图片。因此，x和y分量可允许流通池横向移动(例如移动数十厘米)，而高度可以垂直调节(例如调节数十纳米)，以便允许图像的聚焦。备选地，台还可以简化为没有垂直设定的XY台，而物镜在Z平面是可调的，以便确保保持聚焦。大家会理解，加热/冷却元件可选地也是可移动的，例如以便更接近流通池等。比较图10的左图(升高的加热/冷却装置)与图10的右图(加热/冷却装置下降到流通池上)。
图10A示出加热步骤之前和期间的仪器的图片。Peltier器件1000(由风扇1001、散热件1002和加热器单元1003组成)在垂直方向移动，以接触到安装在XY台1050上的流通池1020和流通池支座1010。试剂经由管道1040引入流通池。流通池可移动到相机1030下面的位置以便成像。位于成像位置的装置的示意表示如图10B所示，其中Peltier器件1070处于升高位置(具有风扇1071、散热件1072和加热器1073)，流通池1085和台1086位于光纤光学元件支架1090旁边以及物镜1080之下。光纤光学元件支架与Z台1075连接，Z台1075还控制物镜1080的高度。流通池通过流管操作杆/手柄1095适当地夹到流通池支座上。
另外，大家会理解，本文的各种组件、例如激光器组件、加热/冷却组件等通常设置在脚手架、底架或框架上，并且可选地装入收容体以便完全或部分封装该仪器。这种框架和/或收容体的具体配置在不同实施例中可以可选地根据例如具体组件及其尺寸等而改变。但是，在典型实施例中，框架使各种组件保持牢固以及保持在适当位置和取向，同时还可选地在必要时帮助移动组件。框架应当足够刚硬，以防止仪器和各种组件中的振动。例如，搅模器可为运动阻尼的，并且在振动上与台隔离，以防止成像期间的流通池的摇动。图11A示出说明保持相机(1100)、加热/冷却组件1110(比较图8)、流通池和流通池支座以及可移动台1120的示范框架的示意图。帮助使装置/***的各种组件和方面进行配合的框架和支架的附加方面包括各种对准，以及在图11B中可看到安装脚/位置，图11B示出激光件垂直调整的滑动轴承1165和流通池水平调整组件1175。在图12中可看到包括收容体的外部覆盖(外壳)的其它框架和收容体连同计算机监视器1201。
激励和观察
在本文的某些实施例中，经由激光器激励和相机观察来跟踪特定核酸碱基与其伴随特定荧光的结合。在各个实施例中，使用包括激光器组件的全内反射(TIR)来进行照射。大家会理解，本文的“TIRF激光器”、“TIRF激光器***”、“TIR激光器”和其它相似术语指的是使用激励、例如激光或者来自例如LED、卤素、氙弧灯等光源的其它类型(它们也全部包含在本文的TIRF、TIRF激光器、TIRF激光器***的本描述中)的非激光激励的基于TIRF(全内反射荧光)的检测仪器/***。因此，“TIRF激光器”是与TIRF***配合使用的激光器，而“TIRF激光器***”是使用激光器的TIRF***，等等。但是，本文的TIRF***(即使在按照具有激光器使用等进行描述时)同样也应当理解为包括包含基于非激光器的激励源的那些TIRF***/仪器。本领域的技术人员会清楚地知道TIRF***及其一般使用的不同方面。在各个实施例中，相机组件包括CCD相机。在一些实施例中，激光器包括与TIRF棱镜耦合的双独立调制50mW至500mW固态和/或半导体激光器，可选地激励波长为532nm和660nm。激光器到仪器的耦合可经由光纤进行，以帮助确保两个激光器的印迹聚焦在衬底的相同区域(即重叠)。
搅模
在本文的各个实施例中，通常希望激光器或其它激励源照射样本的区域(其照射区域称作“印迹”)在空间上是平坦和均匀的。在许多实施例中，本文的装置/***利用多模光纤的性质，它们允许所有光学模式以接近相等的幅度通过其芯线进行传播，以便在照射衬底表面(例如流通池的表面等)产生来自激光器的平的或大礼帽轮廓照射印迹。但是，这类光纤中存在的有限数量的模式可以建设性和破坏性地相互干扰，并产生激光(或其它光线)的强度分布的局部最小值和最大值。参见例如图33A和图34A，它们示出产生于来自多模光纤的未调整输出的最小值/最大值。为了改善这个问题，通过不断改变照射光束中的折射率，例如通过用波片来调制光束，或者通过摇动、挤压或压缩传送照射光束的光纤的一个或多个区域，本文的一些实施例通过使用动态搅模来产生大致上均匀的印迹。因此，通过照射光束中的动态搅模，例如通过挤压/压缩其长度上的一个或多个区域中传送光束的光纤，本发明的一些实施例产生大致上均匀的平顶输出(即，来自激光器或光源的大致上均匀的照射/激励印迹)。图33和图34总结本文所述的搅模的各个实施例。参见以下所述
动态搅模和低损耗光束成形
在某些实施例中，本文的装置包括在特定照射印迹上产生“大礼帽”照射、如均匀或大致均匀照射的组件，在图35中看到。这类实施例包括在一个或多个节点动态改变传输照射的介质(如光纤)中的折射率的一个或多个方面。例如，可在沿其长度各个位置上挤压光纤，以引起不断变化的折射率。光纤、如阶跃折射率光纤的这种挤压可用于光纤中的空间/时间搅模，以便在输出照射的预期积分时间引起充分重叠。又如本文所述(参见以下所述)，还可通过其它方式使光纤摇动、旋转、振动或物理变形以改变通过光纤的光路。
一般来说，光纤中的动态搅模允许在最小用户定义积分时间内实现空间均匀照射。因此，这防止会在所得光束中产生亮和暗图案的多模光纤中的单色光的传播模式的干扰。可选地，这些模式在最小积分时间消失是足够的。因此，在一些实施例中，通过例如经由机械方式将时变曲率和折射率变化引入光纤，迅速改变照射光束的这些模式的相对光程长度。
大家会理解，动态搅模的若干参数可以可选地改变，或者可包括一系列不同配置。但是，一般来说，动态搅模包括用于动态改变照射光束的折射率以平均出末端照射印迹的一个或多个方面/组件。虽然许多现有折射光概念要求输入高斯光束，并且现有折射光概念往往是波长相关的，但是本发明不要求高斯光束输入，并且是波长无关的。
在它们的各种实施例中，本文的装置/***需要用于激励/测量测序反应等的均匀照射场。因此，产生于多模光纤中的单色光的传播模式的干扰的不均匀亮/暗图案通常是不希望的。平均照射印迹上的的光输出(在观察时间周期、例如相机在成像期间进行捕捉的时间内)以允许光线积分意味着亮/暗图案“消失”或被平均化，因而表面上因为各荧光团所看到的激励强度应当是均匀的。
动态搅模的基础是光束在某个点或节点的折射率随时间的恒定变化(例如通过随时间物理挤压光纤)，它使光线被加扰并行走不同的光程，因而平均出照射印迹中的光线输出。因此，干扰最小值和最大值的位置随输入光束的折射率改变而改变。如果折射率以比图像获取时间更快的频率改变，则可在观察的时间尺度中产生空间均匀图像。
大家会理解，本实施例不应当与往往指输入模式或者相对于输出的模式的随机化的“搅模”的通常用法混淆。本实施例的预期功能是在时间以及在空间使模式随机化，即产生动态加扰。
本实施例的动态搅模还可与包括特定形状的芯线的光纤结合使用，以实现具有均匀照射的光束形状。例如，挤压具有正方形芯线的光纤将产生均匀照射的正方形光束。光束可沿特定轴成形以形成矩形或卵形，当它碰到成像表面时，它的光束成像为正方形或圆形。参见图17-18。例如，可从光纤产生矩形光束，如图34所示。
图35示出来自各种不同的激光器、光纤和搅模方面的光学输出。在装置操作期间，光纤末端重新成像到光束分析仪上。图35通过比较来自不同波长激光器(例如532nm和550nm)和激光器次数(固态的和二极管)结合不同的光束成形器(矩形和圆形两种形式)的图像，对每个激光器类型示出动态搅模“接通”时的输出以及对于搅模“关闭”时的光输出等来示出动态搅模(即通过在一个或多个节点采用例如压电致动器来操纵光纤)的效果。
大家会理解，装置的一个实施例因此可包括与静态搅模器相反的动态搅模器。正是折射率的动态变化使模式在预期积分时间内重叠。在一个或多个位置(节点)不断地改变折射率。例如，在某点处以变化的强度(例如从没有挤压到最大挤压并再次返回)不断挤压传输照射的光纤。光纤可通过这种挤压而在时间上变形，使得它的形状从圆形改变为椭圆、再改变为圆形等，这又保持改变折射率。挤压一停止，则搅模停止。
平均印迹中的照射输出的效率取决于图像捕捉的长度、折射率的变化程度、光源的类型/强度等。因此，它是用户可控变量，并且不应当一定作为限制。用户可以可选地控制加扰程度，以便微调印迹中的光线输出的平均。
因此，测量光线输出平均的时间周期是可变的，例如它可以是捕捉光线输出照射的区域(例如，本文的某些测序实施例中的流通池上的块(特定图像捕捉区域))的图像的周期。在某些实施例中，加扰效率的时间周期相当于或者大致上相当于相机(例如，本文的具体测序实施例中的CCD相机)所捕捉的各图像的曝光周期。大家会理解，这类曝光时间可以实施例之间改变，例如从小于1毫秒改变为超过1小时或以上，取决于实施例的具体要求(例如，至少1、5、10、25、50、100、250、500微秒或以上；至少1、5、10、25、50、100、250、500毫秒或以上；至少1、5、10、25、50、100、250、500秒或以上等)。对于本文所述的测序反应，成像时间可以是每次曝光大约50-500毫秒。
在各种实施例中，不管它与其配合使用的整个***，当前动态搅模器可与不同光源/类型、不同光束介质、改变折射率的不同方式、其中折射率被改变的不同数量的节点等配合使用。
动态搅模不受所使用的特定光线/照射限制。因此，例如，虽然本文的许多实施例可选地使用特定波长(例如532和/或660nm)的激光器，但是其它实施例可使用完全不同波长的照射。与动态搅模配合使用的激光器可以是例如可见光激光器、IR激光器、窄对准激光器、宽行宽激光器等。同样，虽然本文提到具体激光器波长，但是这种描述不应当一定看作是限制。大家当然会理解，对于所使用的每个不同激光器类型/强度，可选地相应调整其它参数以实现大致均匀的照射。例如，其中折射率被改变的节点的数量和/或这类节点的折射率的变化率可选地对于不同光源是不同的，以便实现印迹的相同程度的均匀性。
另外，虽然在光纤线路的搅模方面一般提出本文的示例，但是，动态搅模还可选地与通过玻璃、塑料、非光纤线路、空气、真空等传输的光线配合使用。因此，动态搅模不受传输光线的介质限制。在此，传输介质的差别也可以可选地与实现大致均匀输出所需的搅模器的其它方面的差别进行匹配。例如，对于通过空气/真空传输(即没有包含在光线等中)的光线，折射率根据温度的变化而不是传输介质的任何机械变化来变更/改变。
折射率可以可选地通过许多方式来改变。例如，如上所述，当光线不是通过缆线/光纤来传输、而是穿过空气/真空时，光束的折射率可通过温度的变化来改变。因此，一个或多个加热器/冷却器可用于改变光束的一个或多个节点的温度，以改变折射率。对于穿过光纤/缆线的光束，可改变光纤的物理性质以改变折射率。例如，光纤可在一个或多个节点上以物理方式弯曲、摇动、扭曲、挤压、压缩、拉或加热/冷却，以改变那些点处的折射率。与光纤的物理交互作用可通过实际机械操纵(例如通过滚件()、钳子等和/或通过挤压光纤的压电致动器(例如与从Genral Photonics(加利福尼亚，奇诺)得到的相似)等)。一般来说，可使用改变折射率的任何方式。
除了改变折射率的不同方式之外，折射率的变化率、节点的数量等也是可选地可变的。因此，在不同的实施例中，动态搅模可包括照射光束上的一个或多个节点(即其中折射率被改变的区域)，其节点沿光束可以是固定/静态或者是可移动的。非限制性地一般来说，节点数量越大，则发生更多加扰。类似地，对于多个节点，通常优选的是折射的变化相互不同步(即，优选的是折射率的变化是随机的)。
图33-35示出采用各种光纤形状和各种光源的搅模的示例。从图中可以看到，当使用扰动或挤压光纤来进行动态搅模时，实现大致均匀的“大礼帽”照射。附图还示出可通过使用成形芯线光纤对图像成形。图33示出未加扰光束输出(A)与其中例如通过使用PointSource(英国，汉布尔)的MKIII MS来摇动光纤(B)、例如采用PointSource的MKIV MS来振动光纤(C)或者例如通过使用一个或多个压电挤压器/压缩器来挤压(例如以每个节点大约500-600Htz对6个节点进行挤压)(D)的光束输出进行比较。图33所示的结果全部采用相同光纤和激光器类型(例如15微米阶跃折射率光纤和532nm固态激光器)来进行。对于矩形芯线光纤的相似结果如图34A-D所示：未加扰(A)、摇动(B)、振动(C)或挤压(D)。图34中，示例全部采用相同光纤/激光器类型来进行。图35示出对于多个不同激光器源和加扰过程的相似结果。因此，在图35中，画面对应于：没有搅模的矩形芯线光纤(A)以及具有动态搅模的相同光纤(B)中的660um波长二极管激光器；没有搅模(C)以及具有动态搅模的相同光纤(D)的532um波长固态激光器；没有搅模(E)以及具有动态搅模的相同光纤(F)的660um波长二极管激光器(第二矩形)；没有搅模(G)以及具有动态搅模(H)的532固态第二矩形光纤；没有搅模(I)以及具有动态搅模(J)的660um二极管激光器(圆形)；没有搅模(K)以及具有动态搅模(L)的532um固态激光器。
低损耗光束成形器
在本文的一些实施例中，可选地使用特定光束成形、如正方形或矩形激光束。这种成形照射允许例如包含核酸样本的表面上的有效曝光和倾斜，它可在本文的各种装置中产生更高的通过量。在使用具有正方形区域像素的CCD装置来进行成像的情况下，这可以是有利的，因为照射印迹和成像区域可倾斜以防止图像捕捉区域之外的区域的照射和光褪色。
在本文的一些实施例中，不是使用掩模来对光束成形以及将掩模重新成像至样本表面(它可能可选地浪费掩模外面的能量)，而是将激光器耦合到正方形或矩形(或其它形状)芯线光纤。因此，所有可用激光器功率有效地用于照射。沿这种形状光纤的充分长度进行传播有效地填充芯线，以便产生预期照射形状。然后，可将这个光纤的末端重新成像到样本、例如流通池衬底。在具体实施例中，通常希望来自光纤的照射的这种重新成像没有实质上干扰从加扰和/或光束成形所实现的大礼帽轮廓和/或光束形状(或者在没有经过光束成形或加扰时使光束失真)。因此，重新成像方面(例如透镜等)经过适当选择，以便不会使所实现的分布失真，或者可选地将光线输出正确放大到流通池等。在具体实施例中，重新成像还可选择成为消色差的(即能够对于任何波长光线起作用)。在一些实施例中，重新成像组件还可通过略微移动重新成像组件来“活塞式”，以便使照射适当地落在流通池的特定区域。
在这类实施例中，照射均匀性可以可选地通过进入与光纤的长度耦合而成形的光纤的光束的条件来控制。照射均匀性可以可选地通过成形光纤中的动态搅模来增强。例如，利用在各个位置连续挤压成形芯线光纤的装置。参见以上所述在样本表面传送的光束尺寸可以可选地通过成像透镜来操纵。
图34和图35示出使用矩形芯线光纤的结果。将光纤的末端重新成像到光束分析仪上。来自光束分析仪的图像说明垂直和水平尺寸中的均匀照射的预期矩形光束。
动态搅模和/或光束成形***包括生成大致均匀且波长可转换的渐消失光束并将它传送到SBS读仪器中的流通池通道(或其它衬底)的下表面。显而易见，这些组件与整个SBS***中的若干其它模块/组件(例如以上所述的各种光学组件等)进行交互，并且可通过一个或多个计算机组件来控制/定向。
即使动态搅模和波束成形的本实施例包括核酸测序***(如本文所述的各种合成测序配置)并且通篇按照与其进行的交互来描述，但是本领域的技术人员会理解，这类实施例也适用于大量其它使用/***。因此，动态搅模可包含在混合***中，其中包括一个或多个方面来动态改变照射光束的折射率以混合多模光纤的光学模式，以便在预期时帧中(例如在相机等的图像捕捉时间中)产生大致均匀的图像或输出。动态搅模可以可选地与诸如跟踪波片或微阵列等上的荧光等的***配合使用，即没有包括跟踪测序反应的使用。
使用波片的搅模
在本文的各个方面，本发明包括用于通过使用波片来混合多模光纤中的光学模式的***。这类***包括光源(例如激光器)，它通过多模光纤以及可选地还通过至少一个波片发送光线，然后可选地通过重新成像透镜、棱镜并发送到衬底(流通池)上。这类***中的波片可包括“旋转”波片。在一些实施例中，波片实际上在物理上以各种转速(rpms)旋转，而在例如具有液晶波片的其它实施例中，通过改变液晶上的电压，波片“旋转”并改变经过它的光线的偏振。在某些实施例中，波片包括定向推迟器的两个或更多部分，它们的每个在不同方向旋转偏振。在典型的实施例中，来自光纤的光线输出包括在定义的时间周期中在表面的大致均匀的光线输出。在本文的各种实施例中，与来自没有包括一个或多个旋转波片的多模光纤的输出相比，表面上的光线输出包括减小的强度最小值和减小的强度最大值。
在其它方面，本发明包括用于通过经由多模光纤以及经由一个或多个旋转波片发送来自光源(例如激光器)的光线，在定义的时间周期均衡来自多模光纤在表面上的光线输出的方法。在一些实施例中，与来自没有包括一个或多个旋转波片的多模光纤的输出相比，表面上的光线输出包括减小的强度最小值和减小的强度最大值。在一些实施例中，波片实际上在物理上以各种转速旋转，而在例如具有液晶波片的其它实施例中，通过改变液晶上的电压，波片“旋转”并改变经过它的光线的偏振。在某些实施例中，波片包括定向推迟器的两个或更多部分，它们的每个在不同方向旋转偏振。
如本文的一些实施例中所使用的“波片”(或推迟板或者移相器等)指的是改变光线通过其中时的速度的光学装置，因而产生相差。波片通常由双折射晶体组成。一些实施例可包括液晶波片。
如上所述，在包括激光器或其它源激励的具体实施例中，样本的照射(其照射区域称作“印迹”)在空间上是平的和均匀的。本文的光学仪器利用多模光纤的性质：允许通过其芯线以接近相等的幅度传播所有光学模式，这产生印迹的平的或大礼帽式印迹轮廓。但是，这类光纤中存在的有限数量的模式可以建设性和破坏性地相互干扰，因而产生激光(或其它光线)的强度分布的局部最小值和最大值。一些实施例通过以比捕捉图像的相机的曝光时间更短的时间尺度物理摇动光纤来产生均匀印迹，这对强度最小值和最大值平均，并产生均匀的平坦顶部印迹。这种摇动可能需要旋转并摇动光纤的不平衡DC电机，在一些情况下，这可能引起需要抑制以免引起成像问题的不希望的噪声和振动。摇动也可不利地影响可靠性，因为不平衡DC电机具有比平衡电机更短的故障间平均时间，并且可增加光纤的物理磨损。由于这些因素，在一些情况下，没有机械振动以及一些情况下没有移动部件、通过使用波片的多模光纤中的模式混合可以是有利的。
通过使用旋转λ/2波片(推迟板)混合多模光纤的模式，本发明的一个实施例产生大致均匀的平顶光束(即照射/激励区域或印迹)。模式的空间内容取决于输入光线的偏振状态。当偏振改变时，空间内容改变。因此，干扰最小值和最大值的位置随输入光束的偏振改变而改变。如果波片以比图像获取时间更快的角频率旋转，则可在观察的时间尺度中产生空间均匀图像。因此，在具体实施例中，波片在某个时间周期中完成一次或多次旋转。时间周期是捕捉光线输出所照射的区域(例如本文的某些测序实施例中的流通池的衬底区域)的图像的周期。因此，在某些实施例中，时间周期相当于或者大致上相当于相机(例如，本文的具体测序实施例中的CCD相机)所捕捉的各图像的曝光周期。大家会理解，这类曝光时间可以在实施例之间改变，例如从小于1毫秒改变为超过1小时或以上，取决于实施例的具体要求(例如，至少1、5、10、25、50、100、250、500微秒或以上；至少1、5、10、25、50、100、100、250、500毫秒或以上；至少1、5、10、25、50，100、100、250、500秒或以上等)。对于本文所使用的相机，曝光时间可以是50-500毫秒。在某些实施例中，波片可在该时间周期中旋转少于或多于全旋转，因此，在一些实施例中，还可包括重叠。
虽然偏振的旋转可通过多种方式来实现，但是典型的实施例旋转波片。在本文的具体实施例中，适当收容体中的λ/2波片(参见图38的波片3800)通过适当的DC电机等进行旋转，以足够快的速度进行操作，使得在适当的图像捕捉时间中产生空间上大致均匀的图像。其它实施例包括改性的波片，它由取向波片的若干部分或者更小段组成，其中快轴以不同方向来取向(参见图39中的波片3900)。由于这些部分以不同方式/数量来旋转偏振，因此，模式的更快混合可发生，并且在具有若干部分的实施例中，DC电机可选地没有很快地旋转。在又一些实施例中，其它装置、如液晶(例如但不限于Meadowlark Optics(马里兰州，弗雷德里克)制造的)可用于旋转激光器的偏振。通过这类液晶，偏振可通过改变装置上的电压来旋转。
图40示出表示本发明的实施例的示范布置的示意图。图40中，通过使用若干OD滤光件来衰减来自二极管泵浦固态激光器(4200)的线性偏振光线4100(200mW，532nm)。光束的强度由λ/2波片4900(例如Casix，中国福建福州)和偏振分束立方4300(例如Thorlabs，新泽西州的牛顿)进一步控制。在各种实施例中，不需要整个激光器强度，因此，在所述示例中，仅使用大约0.1μW。波片4900的旋转允许精确控制输入激光功率，同时使偏振保持固定。然后，光束通过第二λ/2推迟波片4400，并由两个反射镜4500和4600引入显微镜物镜4700(例如Nikon，20x NA 0.3)。显微镜物镜将光束减小到多模光纤、4800 200μm芯线、0.22NA(例如OZ optics，加拿大的渥太华)可接受的所需大小。所示实施例中的光纤的输出端直接设置在CCD相机4905(例如Cascade 512，Photometries，亚利桑那州的图森)的芯片上。在所示的示范实施例中，以帧传输模式操作相机，并且100ms的曝光量足以捕捉光束分布，如本文所述。
在各种实施例中，不管与其配合使用的整个***，本发明可包括不同的波片(例如在类型、放置、设置、构造等方面不同)、不同的反射镜和分束器(例如在类型、位置、角度等方面不同)。因此，不同的实施例可包括例如λ/2波片、λ/4波片(例如当输入偏振为圆形时)、其它特定推迟的λ/n波片，并且在各种布置中可包括至少1个波片、至少2个波片、至少3个波片或者至少5个或更多波片。本发明的波片不一定由其构造限制。因此，固态晶体(例如晶体石英或者任何其它适当物质)和液晶波片包含在其中。
虽然本实施例包括核酸测序***(如本文所述的各种合成测序配置)并且通篇按照与其进行的交互来描述，但是本领域的技术人员会理解，本发明也适用于大量其它使用/***。因此，实施例可包括其中包含一个或多个波片(通常进行旋转)的***，其中一个或多个波片混合多模光纤的光学模式，以便在预期时帧中(例如在相机等的图像捕捉时间中)产生空间上大致均匀的图像或输出。本波片方面可以可选地与诸如跟踪波片或微阵列等上的荧光等的没有测序反应的***配合使用。相应地，波片方面还可包括通过使光纤的光学模式经过一个或多个波片(通常进行旋转并且通常以比图像捕捉时间或预期时帧更快的速度旋转)在预期时帧从多模光纤创建大致均匀的图像或输出的方法。
从这类示范实施例中通过相机曝光得到的各种图像如图41所示。通过单次曝光，亮和暗像素的突出区域在图41A中显而易见。亮/暗图像产生于多模光纤中存在的各种模式的建设性和破坏性干扰。波片的旋转引起暗和亮区域的空间重新分布，如图41B中的图像系列所示。在这些附图中，以不同波片设定拍摄每个图像。如前面所述，如果比图像获取时间更快地旋转波片，则平均空间分布，并且产生图像的均匀平滑。这种均匀平滑相当于获得大量图像并对它们平均。图41C和图41D示出具有其线轮廓(41C)以及与线轮廓关联的54个图像的平均(41D)的单个图像。图42示出使用波片所产生的印迹的大致均匀度。
确保光束在成像印迹上是均匀的其它方法包括使用螺线管、使用法拉第或普克尔室在电场或磁场中旋转光束以及在光线经过扩散器之后对它重新成像。扩散器可以是全息扩散器，它以波重叠并产生所需光束形状的方式将光纤末端(如果是光纤耦合的)或者激光器(如果不存在光纤)始发的光波重叠。一种这样的示例是强度分布为sinc(x)^2(sinc为sin(x)/x)的扩散器，它将高斯光束变换为大礼帽光束。
本文的各种搅模方面可以可选地通过一个或多个计算机组件来控制/操纵，并且通常与光照射和光检测组件(通常也通过本文的计算机方面)进行协调和同步。
检测荧光的装置
存在许多用于检测荧光的装置，例如光电二极管和相机，它们可包括本发明的检测/检测器组件。在本文的一些实施例中，检测器组件可包括基于1兆像素CCD的光学成像***、如具有8μm像素的1024×1024薄型背照式CCD相机，它以40x放大可以可选地使用0.5×0.5mm的激光器光斑大小(例如正方形光斑或者0.5mm直径的圆或椭圆光斑等)对每个块0.33×0.33mm的区域成像。相机可以可选地具有多于或少于1百万像素，例如可使用4兆像素相机。在许多实施例中，希望相机的读出速率应当尽可能快，例如传输速率可以为10MHz或更高，例如20或30MHz。更多像素一般意味着对于单次曝光可对更大的表面区域、因此更多测序反应同时成像。其优点在于需要更少台移动以及滤光轮变化，并且帮助加速成像。在具体实施例中，本文的CCD相机/TIRF激光器每个周期能够采集大约6400个图像以询问1600个块(因为可选地以4种不同颜色来制作图像，其中可选地具有不同的适当滤光件)。对于1兆像素CCD，某些图像可选地可包含大约5000至50000之间随机间隔的唯一核酸聚类(即，流通池表面的图像)。每单位面积(或图像)的可解析聚类的理论强度与聚类的大小相关，如图29所示，它示出作为总聚类数量和最小聚类面积的函数的所检测聚类的数量的1兆像素图像。在对于四色的每块2秒的成像速率以及每块25000个聚类的密度，本文的***可以可选地每小时量化大约4.5百万个特征。在更快的成像速率以及更高的聚类密度，成像速率可显著提高。例如，在20MHz的最大读出速率的相机以及每20个像素的解析聚类，读出可以是每秒1百万个聚类。仪器可配置成具有一个以上相机。光线可分离，以便同时将两种颜色成像到两个相机上，或者甚至同时将四种颜色同时成像到四个相机上。如果四个相机并行使用，因而能够每秒对1百万碱基或者每天对864亿碱基进行测序。
存在分离双相机***的光学信号的两种方式。如果使用两个激光器，则可存在红光激励和绿光激励，其中向每个相机分离一半发射光。备选地，两个激光器均可用于两个照射周期，并且光线可通过适当的分色镜，因此在一个方向发送红光而在不同方向发送绿光，如图36所示。这种***防止与分束关联的信号损失，但是并不表示染料中的两种在其强度被记录之前暴露于激光器。在一些这类实施例中，如图36所示的激励阻挡器可包括双陷波滤光件(例如532和660nm)。具有两个检测相机3700和两个流体***3701(以及两个流通池3702)的仪器的图片如图37所示。
本文的“块”在功能上相当于映射到衬底表面的图像大小。这可以是例如0.33mm2、0.5mm2、1mm2、2mm2等，但是块的大小在很大程度上取决于相机上的像素的数量和大小以及预期放大等级。大家还会理解，块无需等于与来自激光器(或其它光源)的照射印迹相同的大小或形状，但是，这在希望光褪色为最小时可以是有利的。
如前面所述，在本文的各个实施例中，相机/激光器***采集来自4个不同荧光染料(即加入流通池的每个核苷酸碱基类型一个)的荧光。关于SBS测序的其它方面以及与其有关的其它概念的附加资料可见于申请人的共同未决申请，例如WO04018497、WO04018493和US7057026(核苷酸)、WO05024010和WO06120433(聚合物)、WO05065814(表面附连技术)、WO9844151、WO06064199和WO07010251(聚类制备和测序)。
图1和图13-16示出本发明的相机和激光器的各种可能的配置，包括背光设计、TIRF成像配置、激光器聚焦配置、白光取景配置和备选激光器聚焦设计。白光激励源是可选的，并且也可用于代替激励激光器。图1示出背光设计***，同时在TIRF成像配置中记录图像。图1的用于TIRF成像的配置可选地是图13所示的背光设计建立的配置。图1中，两个激光器(在激光器组装件160中)其中之一用于照射样本(在流通池110中)，并且选择四个发射滤光件(在滤光件交换部件145中)的单滤光件来记录单发射波长以及切去任何杂散激光。在成像期间，聚焦激光器(150)和可靠的白光灯(165)均未照射样本，因为它们被快门阻挡或者被切断。还示出激光器照射101以及通过物镜和相机102来自流通池的照射。图13示出背光设计的***的所有组件，但没有特定的TIRF成像配置。比较图1与图13。因此，图13示出：流体传送模块1300、流通池1310、排废阀1320、温度致动器1330、加热/冷却组件(例如Peltier)1335、相机(例如CCD相机)1340、物镜1342、滤光件交换部件1345、聚焦激光器部件1350、激励激光器部件1360、低功率灯1365、精密XY台1370、聚焦(z轴)装置1375、反射镜1380、“反向”分色镜1385和激光器光纤1390。
图14示出与图1相似的***，只不过是在激励激光器(在激光器部件1460中)和可选的白光1465被断开的激光器聚焦配置中。聚焦激光器1450接通并照射到***中，碰到分束器1485(例如pick-off反射镜1％分束器)，它顺物镜定向弱光束1402，以碰撞样本(在流通池1410中)上的小光斑。来自样本的散射光通过滤光轮交换部件1445中的空隙沿物镜(1442)返回，并由CCD相机1440成像。相机上的光斑的位置用来确保样本处于与物镜正确的距离，因此图像将在焦点上。图14中的元件的编号与图13中的元件相似，但编号为“14”而不是“13”，例如1460与表示为1360的相似元件对应，等等。下面更详细地描述自动聚焦***。
图15示出可选白光取景配置，其中聚焦激光器1550和照射激光器1560关闭。在这种配置中，来自低功率灯1565的白光作为光束1503进入***，并且直接在相机上成像。在这里，除了光束1503等，元件的编号按照图13和图14。图16示出一种备选聚焦配置，其中，***包含第二聚焦相机1641，它可以是测量从表面所反射的散射光束的位置的四分检测器PSD或类似的检测器。这种配置允许与数据采集同时的焦点控制。聚焦激光器波长可选地比最红的染料发射滤光件要长。
图17-19示出通过使用本文的本***所进行的TIRF分析的光束形状和尺寸的各种示图，而图20示出与本文的***配合使用的TIRF棱镜的可选实施例。因此，大家会理解，激光束和/或激光束照射的成像区域的形状(例如圆形、正方形等)在不同实施例之间可以可选地改变。图17示出光束从光纤发出时的尺寸和几何形状。为了照射衬底上的圆形，必须从光纤投射作为椭圆形的光束，因为光束与法线成某个角度碰到衬底表面。圆形的边缘视图1700通过椭圆1730(例如光纤出口处所需的椭圆光束形状)来投影(以22°俯视光纤中心线)。棱镜面偏轮廓线1710没有依比例，并且椭圆1730的边缘视图1720表示为在短轴上。同样，为了照射衬底上的正方形，必须将作光束投影到表面为矩形，如图18所示。图18中，示出矩形1830。在光纤出口处需要圆形-椭圆光束形状(以22°俯视光纤中心线)。通过矩形1830所投影的正方形的边缘视图1800还表示为圆-椭圆1830的棱镜面偏轮廓线1830(未依比例)(短轴)。
如图19所示，棱镜设计成允许成像光束以大约68°(相对于法线)碰撞衬底表面以实现全内反射，并且产生激励表面上的荧光团的渐消失光束。为了控制通过棱镜的光束的光程、因此当流通池移动时直接在固定物镜上保持照射印迹，棱镜可具有棱镜与表面夹角也为68°的几何形状，由此确保光线始终以90°碰到棱镜。在申请WO03062897中更全面地描述棱镜的预期几何形状，并且示范尺寸和几何形状如图20等所示。
本文的激光器的光束形状可选地通过抛光多模光纤输出端以创建例如正方形光束来控制。参见例如图21。图21示出产生于这种抛光的成像光束。在其它实施例中，光束可选地为圆形。在一些情况下，光束性质可以是具有以下性质的高斯分布：标称图像大小为半径0.17mm，最大光斑大小为半径0.25mm，0.32mm作为其后实际上不存在激光强度的点。在某些实施例中，标称图像大小中的所有位置上的光束强度大于最大强度的90％；最大光斑大小以内的所有位置上的80％的最大强度，并且半径0.32之外不小于最大强度的1％。在各种实施例中(在没有动态搅模器的情况下)，任何点上的强度没有改变超过1s-1h的时间尺度中的5％RMS，并且总(集成的)激光器功率的变化不超过在24小时所测量的3％RMS。
照射***
各种照射***可用于根据本发明的装置。照射***可包括灯和/或激光器。***可包含不同波长的一个或多个照射激光器。例如，本文的***可包含532nm和660nm的两个激光器，但也可使用其它波长的激光器。另外，在各种实施例中，本文的***中的激光器主动温度控制到0.1C，具有上升时间小于100ms的660nm激光器二极管的TTL调制；具有532nm激光器的快速调制的集成手动快门，具有集成光束成形光学元件以确保将最佳光束纵横比保持在仪器界面以使信噪比为最大，具有集成搅模器以减少多模光纤的输出上的波纹，以及具有最小热生成。快门和TTL调制用于确保在相机正记录图像的同时照射仅在样本表面上。荧光团的照射可引起光褪色，因此衬底对激光的曝光在不需要时一般为最小，特别是在记录图像之前。
图22A和图22B示出与各种光学配置配合使用的某些实施例的各种滤光轮布置。用于检测四个荧光团的双激光器激励***的使用意味着荧光团中的两个被激励远离其最大吸收波长，如图22B所示。如果全部四个通道中使用的发射滤光件为相同带宽，则最接近532和660nm激光器的两个荧光团将会明显地比远离激光器所激励的两个荧光团要亮。但是，通过改变滤光件的带宽可消除这个因素。例如，如图22B所示，在532nm激光器的情况下，在例如530和560nm吸收的染料均可由532激光器来激励。接近激光器、例如560/20、允许来自550-570nm的光线通过的窄滤光件的使用仅允许来自532nm染料的光线通过。远离激光器、例如610/75、允许来自572nm至647nm的光线通过的较宽带通滤光件的使用允许来自两种荧光团的光线通过。通过560/20滤光件的532荧光团的强度与通过610/75滤光件的560荧光团的强度相似。因此，可使用单个激光器和两个发射滤光件清楚地区分两个荧光团。
效果不是波长特定的，并且可使用任何激励波长来进行。因此，可使用红光激光器来实现相同的效果。可使用接近激光器(例如682/22)的窄滤光件以及远离的例如700长通更宽滤光件来区分在650nm和680nm吸收的两个荧光团。通过其相应滤光件的两种染料的强度同样是相似的，同时来自682/22滤光件中的680染料的信号大为减小。两种染料散发到700长通通道，但是由于窄滤光件中的不同发射等级而可以清楚地确定信号。激光器波长、荧光团选择和滤光件带宽的适配可用于使用任何数量的波长来获得一组四个荧光团，并且通过各通道的发射的强度可使用滤光件的带宽进行标准化，以控制传输的光量。
图23示出30x***光线追迹的一个实施例的标称设计，而图24示出30x成像性能。***的成像性能取决于***中的物镜和其它透镜的放大倍率。较小的放大倍率将允许对衬底的较大区域进行成像，但是以密集聚类的分辨率和各聚类的亮度为代价。优选的放大倍率可选地在10X-40X之间，例如20X或30X。物镜可定制设计成当通过非标准几何形状(例如较厚玻璃衬底)查看荧光对象、因此去除原本存在的球面像差时允许保留衍射限制成像。物镜可经由另一个镜筒透镜与检测器连接。
自动聚焦***
在具体实施例中，本文的***可包括帮助成像聚类的适当聚焦的组件。一般来说，在本文的具体实施例中，在自动聚焦建立时，自动聚焦激光束通过物镜照射到样本，从流通池表面反射，回到透镜然后再到相机，因而在图像上创建光斑。当物镜相对于固定样本上/下移动时，光斑质心在图像上的直线周围对准(校准曲线)。沿这个校准线的位移“dr”与物镜和焦平面之间的距离的变化“d(z-zf)成比例。在许多实施例中，在该行程之前，软件建立校准线的取向(它的斜率)和“灵敏度”：dz/dr(纳米/像素)。这通过在z方向围绕视觉上建立的焦点位置以1000nm的阶跃拍摄21个图像来实现。当样本在焦点xf，yf时，软件还可要求光斑的x，y像素坐标。这从21个校准图像集合的第一(中心)焦点图像来确定。例如，本文的装置可选地包括实现100nm分辨率的以高达50mmZ轴运动安装的自动聚焦功能物镜。物镜可以可选地相对于衬底垂直移动，并且照射激光器可与Z轴运动耦合，使得照射输入也相对于衬底移动。对于具有自动聚焦能力的实施例，可选地沿显微镜物镜的边缘发送自动聚焦光束(可选地尽可能远地离轴，以便对应于最大灵敏度)。自动聚焦光束可来自照射激光器或者来自可选地与照射激光器不同波长的独立源，例如488nm、630nm或700nm或更红的红外激光器。然后，可选地通过四单元或者通过经由二色分束器到荧光成像相机的泄漏来监视反射光束。在这类实施例中，透镜和相机可选地与仪器中所使用的相同(例如20X透镜)。例如在WO03060589中，先前已经描述了可选地包含在本***和装置中的类似自动聚焦***。
通过本文的特定自动聚焦方面，当成像平面相对于物镜移动时，反射监视光束也可选地横向移动(即，虚线是在焦平面中，而实线表示焦平面外，它产生图25的被检测光束的横向位移)。在这类实施例中，所选的分色镜通常是反射自动聚焦光束的分色镜。实际传输的小泄漏(大约<5％)完全足以在CCD相机上进行观察而无需发射路径中的发射滤光件。图26示出在成像相机上看到光斑的焦点外和焦点中图像的样本图片。下面的图像示出成像相机上的所检测自动聚焦光斑。还可在独立检测器上看到光斑，如图27所示。
在包括自动聚焦方面的实施例中，计算机组件可选地包括自动聚焦算法。这类算法可选地帮助确定正确焦点(例如通过监视上述测量并且相应地进行调整)。可使自动聚焦光斑以ID方式、例如只在y方向而不是x和y方向移动，因而简化该过程。假定物镜的焦点位置在z方向移动。
在一些实施例中，自动聚焦分析的第一步骤是“建立响应功能”，其中，对于物镜的若干位置(z1，z2，...zn)在成像相机上测量自动聚焦光斑的位置(y1，y2，...yn)。通常5个位置就足够。图27所示的是只对于3个位置的分析。在下面的画面中，反射光斑的移动表示为在荧光相机上被成像。对于每个Z平面，在相机上存在反射光斑(质心)的关联y位置。这五个数据点(z1，y1)、(z2，y2)、(z3，y3)、(z4，y4)、(z5，y5)可通过线条来描述。
等式1
z＝my0+c
通过最小平方拟合来自数据点的m和c值表示为：
等式2
c = &Sigma;z . &Sigma; y 2 - &Sigma;y . &Sigma; ( yz ) 5 &Sigma; y 2 - ( &Sigma;y ) 2
等式3
m = 5 . &Sigma; ( yz ) - &Sigma;y . &Sigma;z 5 &Sigma; y 2 - ( &Sigma;y ) 2
等式4
y 0 = - c m
因此，从5个数据点确定c、m和y0的值，给出已知的响应函数。
在这类实施例中，自动聚焦分析的下一个步骤包括“计算NewC(对于焦点外的位置)”，其中，对于每个位置，c为常数，即对于焦点外或焦点中的位置没有改变。但是，它对于不同位置会改变。因此，当台移动到新位置时，NewC根据变化的Z和y值计算为：
等式5
newC＝Zmeasured-m.ymeasured
该过程中的第三步骤是使用newC来计算所需Z位置(newZ)，以获得焦点中的y位置(y0)。已知
等式6
newC＝newZ-m.y0
因此，等式7
newZ＝newC+m.y0
从步骤1测量m和y0(每个芯片一次)。从步骤2测量newC(每一个位置)。因此可计算newZ。
本发明的自动聚焦组件的另一个方面包括激光器指向稳定性要求。为了评估自动聚焦激光器中可容许多少指针误差，可将物镜看作是具有适当焦距的简单薄透镜，如图28的放大图所示。
然后，简单几何形状y产生使自动聚焦激光束看起来位移一个像素的角度Φ只是在对于小角度近似于Δ/F的(Δ/F)。
对于20X物镜(在一些实施例中存在镜筒透镜中继透镜组合)，像素大小大约为0.3μm。透镜的焦距为10mm。因此，与1像素对应的误差角大约为30μrad。该***的一些实施例针对z运动每微米自动聚焦激光器光斑大约4像素位移的灵敏度来设置其自动聚焦。
假定0.5μm聚焦误差(对应于激光器光斑的位置中的两个像素位移)可以容许，看到对于自动聚焦激光器可容许的最大指向变化为60μrad。
为了满足对于常规室温变化的那种稳定性要求，强烈推荐使用光纤光耦合激光器。除非固态激光器经过非常仔细的温度控制，否则在适当的环境温度规定范围(例如20-30C.)内将难以保持这种指向精度。
为了提供关于焦点跟踪算法的其它信息和理论，下面给出实现自动聚焦***的更详细示例。
在一些实施例中，焦点跟踪过程的第一步骤是在可以是成像相机的成像装置上获得自动聚焦激光器光斑的图像。来自这个初步光斑的数据分两遍提取-确定光斑的大致位置和大小的第一粗略遍，之后是确定COL(光线中心)和其它光斑特征之前正确地确定光斑边界的第二细化遍。第一遍分析可分5个步骤进行：(1)将16位图像转换成8位图像，其中图像的最大值设置为255，图像的最小值设置为0，并且所有其它灰度值线性地位于中间；(2)计算图像的图片质量。图片质量定义为图像就单位像素向左和单位像素向下位移的与自身的归一化自相关的平均值。如果图像有噪声，则由于噪声没有与自身相关，所以这个测量将会很低；(3)随后，将这个图像确定阈值为128。这个值以上的任何值可看作是前景，而这个等级以下的所有值将看作是背景。从灰度255(即热点)开始，区域生长以找到所有8个已连接前景组分；(4)在所有这些候选前景组分中，具有最高平均亮度的组分被选作指定初始光斑的位置和大致大小的“所述”组分；以及(5)计算这个组分的边界框。
第二(细化)遍分析可分3个步骤进行：(1)从8位灰度图像中切去与边界框的面积的两倍对应的子图像。这使前景和背景像素的数量大致相等，由此使得更易于令基于标准图像直方图的阈值技术可选地工作；(2)计算子图像的直方图，并确定将前景与背景分离的“最佳”灰度阈值。所使用的阈值称作“Otsu阈值”(参见IEEE Trans.Systems，Man，and Cybernetics，vol.9，pp.62-66，1979，或者Computerand Robot Vision，volume 1，Addison-Wesley，1992)；以及(3)图像确定阈值为Otsu阈值，并确定8连接前景组分。这是初始光斑光泡，在其上进行每一个后续特征提取。
可进行附加遍以提取二次光斑的位置。可进行四个步骤以进行这种附加遍：(1)8位图像(来自第一遍)确定阈值为16的低阈值；(2)应当注意，在这个较低阈值，初始光斑组分的像素的数量(面积)增加。初始光斑的这个面积被记录，并用于确定它的紧密或扩散程度；(3)距离上接近初始光斑组分的(充分大小的)组分标识为二次光斑；(4)记录二次光斑的几何质心。
光线中心确定
为了确定自动聚焦的光线中心(COL)，(x，y)表示为初始光斑的光线中心。然后，对于初始光斑光泡将其计算为：
x &OverBar; = &Sigma; g i x i &Sigma; g i and y &OverBar; = &Sigma; g i y i &Sigma; g i
其中，对于光泡中具有基于图像的坐标(xi，yi)和灰度gi(上述阈值)的所有像素i进行求和。
其它光斑特征
除了图片质量和光线中心之外，对于初始光斑光泡所计算的特征的列表包括作为初始光泡的扩散(非紧密)方式的量度的面积。这设置成低阈值处的初始光泡的面积(像素的计数)除以它在Otsu处的面积。所计算的其它特征包括体积(平均亮度，上述阈值×初始光泡的面积)；作为光泡中的像素的灰度值之和除以其面积的平均亮度；以及最大亮度：最大灰度值。
然后，提取的数据可用于校准Z焦点，由此确定为了使图像在焦点上而移动物镜的程度。校准过程的概述如下：(1)在每一个行程开始时(借助于用户帮助)进行Z焦点的校准；(2)在校准开始时，用户确保图像在焦点上、即在焦平面上。他/她因而设置Z焦点zF；(3)自动聚焦的这个实施例依靠用户输入以及图像上的自动聚焦激光器光斑的坐标；(4)当z在校准过程中改变时，光斑与沿线条的z的变化成线性比例地移动。
校准算法过程开始于随着z改变获取的自动聚焦光斑图像的序列中所提取的光线中心的序列(x，y)。理想地，这些点在用图表表示时应当全部完全落在直线上，如下所示。
Figure G2007800201225D00471
理想光线中心序列
然而，由于物理和计算的各种噪声源，这些点偏离理想直线，如下所示：
Figure G2007800201225D00481
实际光线中心序列
因此，在X与Y之间进行基于XY主组分分析(参见例如I.T.Jolliffe，Principal Component Analysis，2nd ed.Springer Series inStatistics，2002)回归，产生新的坐标系R和Q，如下所示：
(R，Q)坐标空间
应当注意：(1)(R，Q)坐标系的原点在(x，y)点的质量中心；(2)最佳拟合(主组分)线定义R轴；以及(3)与R轴的正交线定义Q轴。该模型要求X与Y之间的高度相关。因此，Q坐标值可看作是来自最佳拟合线的错误“残余”-思路是去除这些残余并校正观察。
最后，由于该模型要求空间坐标与z值之间的线性关系(如下所示)，所以在r与z之间进行线性回归以确定这个线条的系数：
R-Z线性关系
另外，自动聚焦跟踪可涉及回归引擎的各种训练。
训练XY PCA回归引擎
 
输入： 随着z改变获取的自动聚焦光斑图像的序列中所提取的光线中心的序列(x，y)。                                 
输出： PCA回归系数，即，到(R，Q)坐标空间的变换。
描述： 进行主组分分析并保存系数。另外，假定二次光斑的质心位置，确定它是沿主轴朝初始光斑的左还是右。                                      
训练RZ线性回归引擎
 
输入： 从PCA回归得到的r坐标、对应z值以及Z焦点zF。
输出： 将(z-zF)与r相关的线性回归系数。
描述： 进行线性回归分析并保存系数。
训练离群点检测器
离群点检测方案用来警告存在气泡或者标记滤光轮问题。
运行自动聚焦***
行程从自动聚焦光斑的图像开始，并使用校准过程中学习的变换的系数对于移动焦点所需的z位移进行最佳估计。
 
输入： 自动聚焦激光器光斑的图像。
输出： 移动到焦点的(z-zF)。还提供关于是否根据离群点检测进行移动的建议。                                            
描述： 使用以下各项来得出(z-zF)的最佳估计：1.光斑提取算法。2.基于PCA的XY回归系数。3.线性RZ回归系数。在一个实现中，离群点检测方案仅在大q残余的情况下才允许移动。在低图片质量、高容积或大面积的情况下，建议不移动。如果在可由流通池中的大气泡/污染触发的z非移动的长周期中，流通池的表面充分漂移以使二次光斑完全相对于校准中看到的初始光斑局部出现，则这种算法在该周期的其余部分将占有这种光斑，即使气泡/污染不再存在于流通池中。为了恢复这种问题，可采取以下步骤：如果建议移动，则可进行进一步检查，以便查看与训练表明应当是这样的方向相对的方向中是否存在二次光斑。如果是，则可建议使用基于PCA的XY回归和线性RZ回归系数移动为这个运动。
计算机
如上所述，本***的各种组件与适当编程的处理器或计算机耦合，适当编程的处理器或计算机起作用以指示这些仪器按照预先编程或用户输入指令的操作，接收来自这些仪器的数据和信息，以及解释、操纵这种信息并向用户报告。因此，通常与这些仪器/组件(例如根据需要包括模数或数模转换器)适当耦合。
计算机可选地包括用于接收用户指令的适当软件，用户指令采取对例如GUI中的规定参数字段的用户输入的形式，或者采取例如对于各种不同具体操作(例如自动聚焦、SBS测序等)预先编程的预先编程指令的形式。软件则将这些指令转换成适当语言，用于指示进行(例如导流和传输、自动聚焦等的)预期操作的正确操作。
例如，计算机可选地用于例如通过各种管道来定向流通组件以控制流通。流通组件可选地定向适当缓冲剂、核苷酸、酶等通过流通池移动或者移动到流通池中。
计算机还可选地接收来自***中包含的一个或多个传感器/检测器的数据，以及解释该数据，按照编程，例如在监视和控制流率、温度等时，或者以用户理解格式来提供数据或者使用那个数据来发起其它控制器指令。
在本发明中，计算机通常包括用于监视和控制流通池中的材料的软件。另外，软件可选地用于控制激励荧光标记和监视所产生的发射。计算机通常还例如向加热/冷却组件和自动聚焦***等提供指令。
任何控制器或计算机可选地包括监视器，它通常是阴极射线管(“CRT”)显示器、平板显示器(例如有源矩阵液晶显示器、液晶显示器)等。从本***产生的数据、例如核酸序列结果可选地以电子形式在监视器上显示。另外，从***采集的数据、例如来自核酸阵列的光线发射分布或者其它数据可通过打印形式输出。无论打印形式还是电子形式(例如在监视器上显示)的数据可采取各种或多种格式，例如曲线、直方图、数字系列、表、图表等。
计算机电路往往设置在包括例如微处理器、存储器、接口电路等许多集成电路芯片的盒中。该盒还可选地包括硬盘驱动器、软盘驱动器、例如可写CD-ROM等高容量可移动驱动器和其它常用***元件。例如键盘或鼠标等输入装置可选地提供来自用户的输入以及用户选择在相干计算机***中进行比较或者以其它方式操纵的序列。
示范使用和组件变化
在许多实施例中，本文的SBS***包括基于CCD/TIRF激光器的激励和成像子***，它们可对每个样本的数百万核酸聚类(通常在流通池中)进行成像，并且可检测四种荧光染料的每种(四个碱基的每个各一种)。例如WO04018497、WO04018493和US7057026的核苷酸、WO05024010和WO06120433的聚合酶、WO05065814的表面附连技术、WO9844151、WO06064199和WO07010251的聚类制备和测序等的SBS化学组分与本文的通道流通池组分等兼容。该***的计算机或数据分析***方面可选地能够每小时将数千个图像处理为序列信息。
作为概述，在SBS进行的测序的具体示例中，基因组DNA随机分段，采用已知序列进行封端，并且例如通过到共价引物的杂化共价地与衬底(例如流通池中的通道)附连。从这种附连DNA创建核酸聚类的阵列，如WO9844141和WO07010251所述。SBS分析(例如使用本文的***和装置)可生成聚类的一系列图像，这些图像然后可经过处理以读取各聚类中的核酸的序列，它则可对准参考序列以确定序列差、较大整体序列等。对准核酸的短读取的算法如WO05068089所述。
如上所述，各测序循环将包括到生长核酸链的一轮结合。这种循环通常通过添加全部四个dNTP来进行，它们各属性，使得各碱基是通过唯一荧光团可识别的。另外，三磷酸盐在3’位置经过改性，使得扩展受到控制，并且在各循环中可将最多单碱基加入各分子。进行从随机阵列的单模板分子扩增的聚类的一般概念以及所述阵列的后续测序如图30-32所示，它示意示出测序过程的各个方面以及由本文的***所进行的方法。例如，形成核酸聚类、所产生的聚类阵列的基本概述步骤(以及这类聚类阵列相对更“传统”阵列的比较)以及测序方法的概述均已提供。图30示出核酸聚类创建和测序的基本概述，而图31比较阵列(左侧)与例如能够与本发明的***/装置配合使用的核酸聚类衬底(右侧)之间的核酸密度。图32给出概述例如通过本发明的实施例进行的SBS测序过程的草图。
在荧光标记核苷酸通过可***链接剂附于聚类成员的核酸的结合步骤之后，流通池的通道通过流通子***来冲洗，以便去除任何未结合的核苷酸和酶。
随后，由***进行读取步骤，由此使用光学显微术来记录结合步骤中结合的各个标记(作为各聚类中的基团被读取)的标识，并记录所结合的对应碱基。测序***可使用不同波长的两个激光器经由全内反射显微术(TIRF)以及光谱的不同部分的四个不同的发射滤光件读取四个不同的荧光团。将图像记录到CCD相机，并向附连的计算机模块报告。
在读取特定结合时，脱保护步骤从表面束缚DNA去除标记部分和块。脱保护允许重复上述结合和读取步骤，直至获得充分的信息循环以便将各核酸聚类(存在于流通池上)的序列唯一地放入其基因组上下文。例如，在人类基因组的情况下，这将>16次循环，例如大约25-50次循环。图像可离线存储或者实时处理，使得各个碱基在测序过程中被读取。处理图像的步骤提供从每一个聚类所读取的序列的数据库，其中各聚类从整个样本(例如基因组)某处的随机位置得出。因此，在此过程期间，通常构造覆盖基因组的每一个部分的数百万序列读取的数据库。这种数据库可以例如与从参考序列等得出的每一个序列的数据库进行比较。在各种实施例中，图像分析、序列确定和/或序列对准可选地在捕捉荧光图像之后“离线”进行。这类过程还可选地通过与本***中存在的计算机独立的计算机来进行。
如通篇所述，本发明可在实施例之间(例如在组件或子***的数量和类型方面)改变。例如，在本发明的一个实施例(实施例“b”)中，组件可包括：各具有75mW功率(或者可选地更大)的532和660nm的照射激光器(用于激励测序反应中的荧光团)，在流通池的通道底部投影为0.5mm的圆；TIR玻璃棱镜(68度或71度)；通道为1×61mm面积、具有100μm深(对于查看，39×1mm可用或者可接近)的玻璃流通池；相机组件中的物镜，包括Nikon Plan Apo 20x、0.75NA(对于玻璃厚度进行校正)；发射滤光件，包括557±11nm、615±40nm、684±11nm和740±50nm的带通滤光件(或者可选地如图22所示的或者与图22所示相似的滤光件)；中继光学元件，包括用于大约23x的净放大倍率的Navitar 1.33x适配器或者无放大镜筒透镜；以及数字CCD相机，包括Photometrics Cascade 1Mpix或1K相机，像素大小为8μm，读出速率为10MHz，以及具有0.75NA(数字光圈)的20x放大倍率的显微物镜。级联实施例“b”可给出具有大约0.8μm光学分辨率(略大于衍射极限)的0.35mm场的净性能。
这种1兆像素实施例可照射0.5mm圆，并检测其中的0.35mm正方形。这类实施例中的流通池在通道中可具有总共156个非重叠块或更大。聚类可以大约为1μm。显微镜的NA可以可选地给出700nm的大约0.6μm的PSF。因此，“典型”聚类获得大约1.2μm的视直径。在图像平面中，1像素表示大约0.35μm，因此典型聚类将具有大约3.5个像素的直径。聚类的面积为大约9.25个像素。1兆像素CCD上的10个面积像素对象的泊松分布显示最大大约38000对象为非重叠，如图29所示。图29示出来自本发明的***的示范配置的信息通过量的一个示例。所检测聚类的数量是总聚类数量和最小聚类面积的函数。
对于示范“b”实施例，分辨率极限(使用瑞利标准)大约为0.6μm，并且聚类对于大约1.2μm的外观大小大约为1μm。像素映射到图像平面中的大约0.35μm，因此聚类横向大约为3.5个像素，面积大约为10个像素。对于随机分布聚类，1兆像素相机中未混淆聚类的最大数量在0.35mm正方形块中大约为38000。对于每个流通池总共1200个块，“b”流通池每个通道接纳150个非重叠照射块。这为每循环45.6兆碱基以及25循环行程中大约为1千兆碱基。重叠照射并且使块密集表示每个通道可对200个块、因此每个流通池1600进行成像。
对于“b”照射子***通过量，激光器波长为：绿光激光器波长532nm；绿光激光器功率可选地为75mW、红光激光器波长660nm；红光激光器功率可选地为75mW；投影TIRF光束直径0.5mm；以及光束的容许变化20％。
在另一个实施例(实施例“g”)中，本发明的***可包括：532和660nm的照射激光器，各具有500mW功率(理想地投影为0.5mm正方形)，TIR玻璃棱镜(68度)；玻璃流通池，具有100μm深、可用50mm的1×61mm面积的8个通道；物镜，包括Nikon Plan Fluor40x、0.6NA可调环或者对于SBS流通池进行校正的定制40x、0.75NA；发射滤光件，包括557±11nm、615±40nm、684±11和740±50nm的带通滤光件；图像光学器件，包括30x的***放大倍率的150mm消色差双合透镜；以及CCD数码相机，包括Photometrics CoolSNAPK4，2048×2048像素，4兆像素相机，7.4μm像素大小，20MHz读出。这种实施例可提供小于0.7μm衍射极限的0.5mm场的净性能。它可包括总共30x***放大倍率的0.75x的中继透镜。
在一些这类“g”实施例中，希望均匀地照射0.5mm正方形以及检测相同的0.5mm正方形(2048×7.4/30000)。本文的流通池上的聚类可以小到0.5μm。700nm的PSF大约为0.7μm。因此，聚类表现为0.86μm，其中1像素表示0.25μm。因此，典型聚类为3.5个像素，并且聚类的面积为9.25个像素。4兆像素CCD给出每个块大约135000个可检测的非重叠聚类的最大值。
照射印迹大四倍，表示需要激光器功率的4倍增加在相同曝光时间中获得相同的信号电平。为了使曝光时间为最少，激光器功率可进一步增加。因此，如果使用下列参数，则这种***每个实验能够产生序列的20亿个碱基：数字光圈0.8的物镜；20x放大倍率；4兆像素相机；760μm×760μm照射块；每个流动通道1个成像道；每个成像道48个块；每个芯片8个通道；平均大小0.7μm的聚类；以及40个碱基的读取长度。因此，总通过量＝8个通道×48个块×135000个聚类/块×40个循环＝20.7亿个碱基(G)。
增加流通池的大小以增加所成像的块的数量、聚类的密度或者读取长度的步骤将实现每个流通池所产生的碱基的数量的改进。两个或四个相机可平行安装，以便获得具有两倍或四倍通过量的***。双相机配置如图36和图37所示。例如使用例如时间延迟积分(TDI)等技术可减少扫描时间，表示表面被连续扫描而不是在分立块上成像。仪器可配置成进行多个化学步骤，其中多个流体***与单个光学***耦合。在单个化学***中，光学***没有在化学步骤正发生时进行成像。如果循环的化学和成像部分取相似长度，则在50％的时间，仪器没有记录数据。如果***的扫描部分进一步加速，则实验运行时间的更高百分比用于进行化学。如果***配置成使得同时处理多个流通池，其中一个流通池始终经过成像，则可缓解这种情况。双流通池支座的示意表示如图43所示。
虽然所述的***表示为从下面进行照射并且物镜在顶部，但是，所示的***可转化成从顶部照射并且检测***在下面。参见以上所述加热和照射可从衬底的任一面进行，使得底侧加热和顶侧照射也落入本发明的范围之内。在以下一般方法中进一步描述本发明的范围之内的***的操作。
在测序中使用***的示例
下面是一般技术等(例如用于核酸聚类形成)的示例，它们可以可选地应用于与本发明的***配合使用。大家会理解，这类描述和示例不一定是对本***及其使用的限制，除非另加具体说明。在专利申请WO07010251中全面描述了用于对核酸聚类进行形成和测序的方法，通过引用将它的协议完整地结合到本文中，但是下面概述这些协议的一些要点。
衬底的制备和核酸聚类的形成
玻璃芯片的丙烯酰胺涂层
用于待测序核酸的附连的固体支承可选地为例如SilexMicrosystems(瑞典)所提供的8通道玻璃芯片。但是，实验条件和过程也完全适用于其它固体支承。在一些实施例中，芯片按照下述方式冲洗：30分钟纯Decon，30分钟milliQ H2O，15分钟NaOH1N，30分钟milliQ H2O，15分钟HCl0.1N，30分钟milliQ H2O。聚合物溶液制备包含：
对于10ml的2％聚合混合。
-milliQ H2O中的10ml丙烯酰胺的2％溶液；
-DMF中的165μl的100mg/ml N-(5-bromoacetamidylpentyl)丙烯酰胺(BRAPA)溶液(235μl DMF中的23.5mg)；
-11.5μl的TEMED；以及
-milliQ H2O中的100μl的过硫酸钾的50mg/ml溶液(400μlH2O中的20mg)。
在这类实施例中，首先以氩对丙烯酰胺的10ml溶液脱气15分钟。BRAPA、TEMED和过硫酸钾的溶液相继加入丙烯酰胺溶液。然后该混合物经过快速涡流处理并且立即使用。然后以RT进行聚合1小时30分钟。此后，通道用milliQ H2O冲洗30分钟，并且填充0.1M磷酸钾缓冲剂以便存放到需要时。
N-(5-溴丙烯酰胺戊基(bromoacetamidylpentyl))丙烯酰胺(BRAPA)的合成
Figure G2007800201225D00571
从Novabiochem获得N-Boc-1，5-二甲基苯磺酸(diaminopentane)溶液。从Fluka得到溴乙酰氯和丙烯酰氯。所有其它试剂为Aldrich产品。
Figure G2007800201225D00581
通过压力均衡滴液漏斗，在1小时的时间内，在0℃对THF(120ml)中的N-Boc-1，5-二甲基苯磺酸(diaminopentane)的搅动悬浮液(5.2g，13.88mmol)和三乙胺(4.83ml，2.5eq)添加烯丙酰氯(1.13ml，1eq)。然后在室温搅动反应混合物，并且通过TLC(石油醚:乙酸乙酯为1:1)检查反应进度。两个小时之后，反应期间所形成的盐被滤除，而滤出液蒸发到干。残余通过快速色谱(纯石油醚之后是高达60％的乙酸乙酯的梯度)净化，以产生作为浅褐色固体的2.56g(9.98mmol，71％)的产物2。1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：1.20-1.22(m，2H，CH2)，1.29-1.43(m，13H，tBu，2xCH2)，2.86(q，2H，J＝6.8Hz和12.9Hz，CH2)，3.07(q，2H，J＝6.8Hz和12.9Hz，CH2)，5.53(dd，1H，J＝2.3Hz和10.1Hz，CH)，6.05(dd，1H，J＝2.3Hz和17.2Hz，CH)，6.20(dd，1H，J＝10.1Hz和17.2Hz，CH)，6.77(t，1H，J＝5.3Hz，NH)，8.04(bs，1H，NH)。对于C13H24N2O3 256所计算的质量(电子喷射+)，建立279(256+Na+)。
Figure G2007800201225D00582
产物2(2.56g，10mmol)溶解于三氟乙酸：二氯甲烷(1:9，100ml)并在室温下搅动。反应的进度通过TLC(二氯甲烷:甲醇为9:1)来监视。完成时，反应混合物蒸发到状态，残留与甲苯共同蒸发三次，然后通过快速色谱(纯二氯甲烷之后是总共20％的甲醇的梯度)来净化。得到作为白色粉末的产物3(2.43g，9mmol，90％)。1H NMR(400MHz，D20)：1.29-1.40(m，2H，CH2)，1.52(quint.，2H，J＝7.1Hz，CH2)，1.61(quint.，2H，J＝7.7Hz，CH2)，2.92(5，2H，J＝7.6Hz，CH2)，3.21(5，2H，J＝6.8Hz，CH2)，5.68(dd，1H，J＝1.5Hz和10.1Hz，CH)，6.10(dd，1H，J＝1.5Hz和17.2Hz，CH)，6.20(dd，1H，J＝10.1Hz和17.2Hz，CH)。对于C8H16N2O156所计算的质量(电喷射+)，建立179(156+Na+)。
通过压力均衡滴液漏斗，在超过1小时的时间，以-60℃对THF(120ml)中的产物3的悬浮液(6.12g，22.64mmol)和三乙胺(6.94ml，2.2eq)添加溴乙酰氯(2.07ml，1.1eq)(真空瓶中的cardice和异丙醇浴)。然后在室温搅动反应混合物一夜，并在次日通过TLC(二氯甲烷:甲醇为9:1)检查反应的完成。反应期间所形成的盐被滤除，而反应混合物蒸发到干燥状态。残余通过色谱(纯二氯甲烷之后是总共5％的甲醇的梯度)。得到作为白色粉末的3.2g(11.55mmol，51％)的产物1(BRAPA)。在石油醚：乙酸乙酯(petroleum ether:ethyl acetate)中进行的进一步再结晶化给出3g的产物1.1H NMR(400MHz，d6-DMSO)：1.21-1.30(m，2H，CH2)，1.34-1.48(m，4H，2xCH2)，3.02-3.12(m，4H，2xCH2)，3.81(s，2H，CH2)，5.56(d，1H，J＝9.85Hz，CH)，6.07(d，1H，J＝16.9Hz，CH)，6.20(dd，1H，J＝10.1Hz和16.9Hz，CH)，8.07(bs，1H，NH)，8.27(bs，1H，NH)。对于C10H17BrN2O2276或278所计算的质量(电喷射+)，建立279(278+H+)，299(276+Na+)。
聚类形成过程
流体
对于聚类形成过程中的所有流体步骤，可选地使用配备了管道Ismatec Ref 070534-051的蠕动泵Ismatec IPC(橙色/黄色，0.51mm内直径)。泵在前向运行(推送流体)。安装废料盘以在蠕动泵管道的出口收集用过的溶液。在该过程的每个步骤中，每个芯片入口管道使用1个管道将所使用的不同溶液分发到8个管道微管带，以便监视溶液正确泵入各通道。对于各步骤规定每个通道所需的容积。
热控制
为了在聚类形成过程中以不同温度实现培养，石英玻璃芯片安装到MJ-Research温度循环器。基芯片位于与温度循环器的平坦加热块附连的定制铜块之上。芯片用小Perspex块覆盖，并通过胶带保持到位。泵和温度循环器均通过计算机运行脚本来控制，它们提示用户改变每个步骤之间的溶液。
将引物嫁接到SFA涂层芯片的表面
SFA涂层芯片放置到修改MJ-Research温度循环器，并与蠕动泵附连，如上所述。由10mM磷酸缓冲剂(pH 7.0)中的0.5μM的正向引物和0.5μM的反向引物组成的嫁接混合在20℃以60μl/min的流速被泵入芯片的通道。然后将温度循环器加热到51.6℃，并在这个温度将芯片培育1小时。在这个时间内，嫁接混合经过18次抽吸循环。以15μl/min泵入嫁接混合物20秒，然后来回泵该溶液(5秒15μl/min正向，然后5秒15μl/min反向)180秒。在18个抽吸循环之后，通过在51.6℃以15μl/min泵入5xSSC/5mM EDTA300秒来冲洗芯片。然后将温度循环器冷却到20℃。
模板DNA杂化
将待杂化到嫁接芯片的DNA模板在5xSSC/0.1％Tween中稀释成预期浓度(当前为0.5-2pM)。在加热块上以100℃加热稀释的DNA5分钟，以便使双链DNA改变性质成适合于杂化的单链。然后，DNA立即在冰/水槽中快冷3分钟。包含DNA的管子在离心分离机中短暂旋转以聚集任何凝聚物，然后被传递到预冷8管带并立即使用。
通过在20℃以60μl/min泵入5xSSC/0.1％Tween75秒，预先制备来自上述步骤的嫁接芯片。然后将温度循环器加热到98.5℃，并以15μl/min泵入改变性质的DNA300秒。进行以100μl/min进行10秒的附加泵动作以涌过加热杂化混合所形成的气泡。然后，经过19.5分钟缓慢冷却到40.2℃之前，温度保持为98.5℃30秒。然后通过在40.2℃以15μl/min泵入0.3xSSC/0.1％Tween300秒，来冲洗芯片。然后脚本直接运行到下一个步骤。
扩增
通过使用嫁接引物和热稳定聚合酶的桥连聚合酶链反应来扩增杂化模板分子。由10mM Tris(pH9.0)、50mM KCl、1.5mMMgCl2、1M三甲铵乙内酯(betaine)和1.3％DMSO组成的扩增缓冲剂在40.2℃以15μl/min被泵入芯片200秒。用200μM dNTP和25U/ml Taq聚合酶补充的上述缓冲剂的扩增混合在40.2℃以60μl/min被泵入。然后将温度循环器加热到74℃，并保持在这个温度90秒。这个步骤实现DNA模板链与其杂化的表面束缚引物的扩展。然后，温度循环器通过加热到98.5℃进行50个扩增循环进行45秒(桥连链的改性)、加热到58℃进行90秒(链到表面引物的退火)以及加热到74℃进行90秒(引物扩展)。在98.5℃的每次培育结束时，以15μl/mn将新PCR混合物泵入芯片的通道10秒。同样为PCR的每次循环提供新试剂，这个步骤还去除已经变成与表面分离并且可能导致聚类之间的污染的DNA链和引物。在温度循环结束时，将芯片冷却到20℃。然后通过在74℃以15μl/min泵入0.3xSSC/0.1％Tween300秒，来洗芯片。然后将温度循环器冷却到20℃。
线性化
在20℃以15μl/min将由0.1M高碘酸钠和0.1M乙醇胺组成的线性化混合物泵入芯片1小时。然后通过在20℃以15μl/min泵入水中300秒，来冲洗芯片。
阻挡(可选)
这个步骤使用末端转移酶将双脱氧核苷酸结合到DNA链的自由3’OH末端(嫁接引物以及扩增聚类分子)。
由50mM醋酸钾、20mM三醋酸盐(Tris-acetate)、10mM醋酸镁、1mM二硫苏糖醇(pH7.9)和250μM CoC12的阻挡缓冲剂在20℃以15μl/min被泵入芯片200秒。用2.4μM ddNTP和250U/ml末端转移酶补充的上述缓冲剂的阻挡混合物在37.7℃以15μl/min被泵入。温度循环器保持在37.7℃30分钟，在这个时间中，阻挡混合物每隔3分钟以15μl/min被泵入芯片20秒。在阻挡之后，则通过在20℃以15μl/min泵入0.3xSSC/0.1％Tween中300秒，来冲洗芯片。
聚类的改变性质和测序引物的杂化
这个步骤使用NaOH对扩增、线性化和阻挡聚类的链其中之一改变性质和冲洗。在去除NaOH的冲洗之后，测序引物则被杂化到表面留下的单链。
在阻挡之后，通过在20℃以15μl/min泵入0.1N NaOH300秒，对聚类中的双链DNA改变性质。然后通过在20℃以15μl/min泵入TE(10mM Tris pH 8.0，1mM EDTA)300秒，来洗芯片。测序引物在5xSSC/0.1％Tween中稀释成0.5μM，并在20℃以15μl/min被泵入通道300秒。然后将温度循环器加热到60℃，并保持在这个温度15分钟。然后将温度循环器冷却到40.2℃，以及通过以15μl/min泵入0.3xSSC/0.1％Tween 300秒，来冲洗芯片。
聚类这时准备就绪例如采用本发明的***和装置进行第1循环测序酶学。
这个过程中使用的DNA序列是400个碱基的单一单模板序列，其中具有对嫁接引物互补的末端。对双链体DNA改性，如上所述。
引物的嫁接
引物通常是结合***所需的任何特定序列或改性的5’-硫代磷酸酯(phosphorothioate)寡核苷酸。它们的序列和供应商按照它们用于的实验而改变，在这种情况下是对模板双链体的5’-末端的补充
线性化聚类的测序
扩增聚类包含嫁接引物之一中的二醇联接。可通过将适当的二醇联接包含到用于固相扩增的引物之一，来引入二醇联接。
可通过标准自动DNA合成技术使用可向商业供应商(例如Fidelity Systems Inc.，ATD)购买的组分来制造包括任何预期模板特定序列的适当引物。
包含可***二醇的引物通常具有以下结构：
5′-硫代磷酸酯(phosphorothioate)-臂(Arm)26-二醇(Diol)22A-序列-3′OH。
其中“序列”表示能够杂化到待扩增模板的核苷酸的序列。
臂26和二醇22A组分(来自美国MD的Fidelity SystemsInc)的结构如下：
Figure G2007800201225D00631
包含这类二醇联接的产物可如上所述使用高碘酸盐来***，并且所得单链多核苷酸按照以上所述进行杂化。
DNA测序循环
使用国际专利申请WO2004/018493所述方式制备并采用四种不同的市场销售的荧光团(Molecular Probes Inc.)所标记的改性核苷酸来进行测序。
突变体9°N聚合酶(包括三元突变L408Y/Y409A/P410V和C223S的外变体)用于核苷酸结合步骤。
结合混合物、结合缓冲剂(50mM Tris-HCl pH 8.0，6mMMgSO4，1M EDTA，0.05％(v/v)Tween-20，50mM NaCl)加上110nMYAV exo-C223S以及四个标记改性核苷酸的1μM的每个被施加到聚类模板，并加热到45℃。
将模板保持在45℃30分钟，冷却到20℃，并用结合缓冲剂、然后用5x XXC/0.05％Tween 20冲洗。然后将模板暴露于成像缓冲剂(100mM Tris pH7.0，30mM NaCl，0.05％Tween 20，50mM抗坏血酸钠(sodium ascorbate)，新溶解)。
在RT以4种颜色扫描模板。
然后，模板暴露于***和结合的测序循环，如下所述：
***
具有***缓冲剂(0.1M Tris pH 7.4，0.1M NaCl和0.05％Tween 20)的引物。加热到60℃。
采用***混合物(***缓冲剂中的100mM TCEP)来处理聚类。
除了每隔4分钟抽吸新缓冲剂之外还等待总共15分钟。
冷却到20℃。
用酶学缓冲剂洗。
用5XSSC/0.05％Tween 20洗。
具有成像缓冲剂的引物。
在RT以4种颜色扫描。
结合
具有结合缓冲剂的引物。加热到60℃
采用结合混合物进行处理。除了每隔4分钟抽吸新结合混合物之外还等待总共15分钟。
冷却到20℃。
用结合缓冲剂冲洗。
用5XSSC/0.05％Tween 20冲洗。
具有成像缓冲剂的引物。
在RT以4种颜色扫描。
重复结合和***的过程所需次循环。使用上述荧光成像设备来检测结合核苷酸。
备选地，可完全自动地对流通池测序，其中对这个仪器进行第一结合，如以下所述：
在仪器流管上设置流通池之后，可将模板暴露于测序循环，如下所述：第一碱基结合，成像然后交换***、成像和结合、成像步骤所需次数的测序循环。
第一碱基结合
以RT泵1000ul的结合缓冲剂
将温度设置在55℃并保持
等待2分钟
泵600ul的结合混合物
等待4分钟
泵200ul的结合混合物
等待4分钟
泵200ul的结合混合物
等待4分钟
将温度设置在22℃
等待2分钟
泵600ul的结合缓冲剂
泵600ul的高盐缓冲剂
泵800ul的扫描混合物
停止活性冷却
成像步骤
***
以RT泵1000ul的***缓冲剂
将温度设置在55℃并保持
等待2分钟
泵600ul的***混合物
等待4分钟
泵200ul的***混合物
等待4分钟
泵200ul的***混合物
等待4分钟
将温度设置在22℃并保持
等待2分钟
泵600ul的结合缓冲剂
泵600ul的高盐缓冲剂
泵800ul的扫描混合物
停止活性冷却
成像步骤
结合
以RT泵1000ul的结合缓冲剂
将温度设置在55℃并保持
等待2分钟
泵600ul的结合混合物
等待4分钟
泵200ul的结合混合物
等待4分钟
泵200ul的结合混合物
等待4分钟
将温度设置在22℃并保持
等待2分钟
泵600ul的结合缓冲剂
泵600ul的高盐缓冲剂
泵800ul的扫描混合物
停止活性冷却。
以对应于标记核苷酸的四种颜色的每个来记录上述非全自动过程的各芯片的每个块。分析图像以挑选各聚类的最亮颜色，并且这种图像强度分析用于在每次循环调用各聚类的碱基。共同定位来自各循环的图像以获得对应于各聚类的序列。因为各聚类的序列为已知，并且在上述实验中对于每一个聚类均相同，所以可对核苷酸结合的各循环分析误差率(即，聚类没有作为正确序列被调用)。误差率对于实验的前20次循环小于1％，表示单模板的已知序列被正确调用。
虽然为了清晰起见和理解相当详细地描述了上述本发明，但是通过阅读本公开，本领域的技术人员清楚地知道，可进行形式和细节上的各种变更，而没有背离本发明的真实范围。例如，以上所述的所有技术和设备可用于各种组合。为了所有目的，本申请中提到的所有出版物、专利、专利申请或其它文献通过引用完整地结合，好像各个出版物、专利、专利申请或其它文献单独表示为了所有目的通过引用结合的一样。

Claims (21)

1.一种用于对一个或多个多核苷酸测序的***，所述***包括：
a)平台，其设计用于支持固体衬底，所述固体衬底上附连有一个或多个多核苷酸；
b)导流***，其用于可控地将一种或多种具有荧光标记的试剂移动至与所述多核苷酸接触；
c)温度控制***，其用于调节至少所述固体衬底和所述试剂之一的温度；
d)照射***，其用于经由全内反射来激发荧光标记，所述照射***包括至少一个通过具有一定折射率的多模光纤耦合的激发激光器，其中所述折射率被动态改变，从而获得大致均匀的照射印迹；
e)检测器组件，其设计配置接近所述固体衬底，其用于检测所述照射***激发所述荧光标记产生的荧光；
f)计算机***，其可操作与所述检测器组件耦合，其中所述计算机***包括用于从所述检测器组件获取荧光图像的指令集。
2.如权利要求1所述的***，其中，所述固体衬底可被移动远离所述检测器组件，以便所述温度控制***调节所述固体衬底的温度。
3.如权利要求1所述的***，其中，所述固体衬底包括具有一个或多个流体通道的流通池，其中所述多核苷酸附连于流体通道中。
4.如权利要求1所述的***，其中，所述固体衬底包括玻璃、硅或塑料。
5.如权利要求1所述的***，其中，所述固体衬底是小珠阵列。
6.如权利要求1所述的***，其中，所述试剂包括用于扩展与所述一个或多个多核苷酸互补的第二序列的组分。
7.如权利要求6所述的***，其中，所述试剂是荧光标记的三磷酸核苷。
8.如权利要求6所述的***，其中，所述试剂是荧光标记的寡核苷酸。
9.如权利要求1所述的***，其中，所述照射***包括通过所述多模光纤光学耦合的多个激发激光器。
10.如权利要求1所述的***，其中，使所述多模光纤物理变形以获得大致均匀照射印迹。
11.如权利要求10所述的***，其中，所述物理变形包括挤压所述多模光纤。
12.如权利要求1所述的***，其中，所述动态改变折射率包括振动所述多模光纤。
13.如权利要求1所述的***，其中，所述检测器组件包括CCD相机。
14.如权利要求1所述的***，其中，所述检测器组件包括两个CCD相机。
15.如权利要求1所述的***，其中，所述检测器组件包括四个CCD相机。
16.如权利要求1所述的***，其中，所述检测器组件还包括适合于所述荧光标记试剂的荧光发射以及适合于来自所述至少一个激发激光器的光的一个或多个波长的一个或多个光学滤光件。
17.如权利要求1所述的***，其中，所述检测器组件包括自动聚焦机械装置。
18.如权利要求1所述的***，包括用于同时对两个流通池进行操作的两个流体站。
19.如权利要求1所述的***，其中，所述照射***包括两个通过具有一定折射率的多模光纤耦合的激发激光器，其中所述两个激发激光器照射至少相同区域的部分。
20.如权利要求16所述的***，其中，所述试剂包括具有各自荧光标记的四种不同核苷酸，所述检测器组件还包括适合于所述四种荧光标记核苷酸的荧光发射以及适合于来自所述激光器的光的波长的四个光学滤光件。
21.如权利要求19所述的***，其中，所述两个激发激光器分别以532nm和660nm波长进行发射光。
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