CN105503827B - Egfr抑制剂及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了EGFR抑制剂及其制备方法和用途。具体地，本发明涉及一种具有式(I)化合物N‑(5‑((4‑((2‑(烷基取代磺酰基)吡啶‑3‑基)氨基)嘧啶‑2‑基)氨基)‑苯基)丙烯酰基酰胺类似物，其中式(I)中的各取代基与说明书中的定义相同。该系列化合物具有抑制L858R EGFR突变体、T790MEGFR突变体和外显子19缺失激活突变体的活性，可以用来治疗单独或部分地由EGFR突变体活性介导疾病，例如在预防与治疗癌症尤其是非小细胞肺癌药物中的具有广泛应用，有望开发成新一代EGFR抑制剂。
Description
技术领域
本发明属于药物合成领域，具体涉及一种EGFR抑制剂即N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)烯丙酰胺类似物及其制备和应用。
背景技术
EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是跨膜蛋白酪氨酸激酶erbB受体家族的一员。通过与其配体-例如表皮生长因子(EGF)的结合，EGFR在细胞膜上可以形成同源二聚体，或者与家族中其他的受体(比如erbB2，erbB3，或erbB4)形成异源二聚体。这些二聚体的形成，可引起EGFR细胞内关键的酪氨酸残基磷酸化，从而激活细胞内多个下游的信号通路。这些细胞内信号通路在细胞增殖、生存及抗凋亡中起重要作用。EGFR信号传导通路失调，包括配体及受体的表达增高、EGFR基因扩增以及突变等，可促进细胞向恶性转化，并在肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移以及血管形成中起重要作用。因此，EGFR是抗癌药物开发的合理靶点。
第一代小分子EGFR抑制剂，包括吉非替尼(易瑞沙TM)和厄洛替尼(特罗凯TM)，在肺癌治疗中显示出较好的疗效，已作为一线药物用于治疗伴随EGFR激活突变的非小细胞肺癌NSCLC(New England Journal of Medicine(2008)Vol.358,1160-74，Biochemical andBiophysical Research Communications(2004)Vol.319,1-11)。
相对于野生型(WT)EGFR而言，激活突变型EGFR(包括L858R和外显子19缺失突变delE746_A750)对三磷酸腺苷(ATP)亲和力下降，而对小分子抑制剂的亲和力增加，从而导致肿瘤细胞对第一代EGFR抑制剂例如吉非替尼或厄洛替尼的敏感性增加，达到靶向治疗的目的(Science[2004]第304期，1497-500；New England Journalof medicine[2004]第350期，2129-39)。
然而，经第一代小分子EGFR抑制剂治疗10-12月后，几乎所有的NSCLC患者均产生对此类小分子抑制剂的抗药性。其耐药机制包括EGFR继发突变、旁通路激活等。其中半数患者的耐药是由于EGFR看门基因残基T790M的继发突变，从而降低了药物与靶点的亲和力而产生抗药性，造成肿瘤的复发或病情进展。
鉴于这种突变在肺癌EGFR靶向治疗中产生耐药的重要性和普遍性，多家药物研发公司(辉瑞，BI，AZ等)试图开发第二代小分子EGFR抑制剂，通过抑制EGFR T790M突变株来达到治疗此类耐药的肺癌患者，但均因选择性差而以失败告终。即使afatinib已被FDA批准用于肺癌的治疗，但仅用于伴有EGFR激活突变患者的一线治疗；而对伴有EGFR T790M突变患者，由于afatinib对野生型EGFR具有更强的抑制作用，造成严重的皮肤和胃肠道毒性而限制了给药剂量，没有显示出治疗效果。
因此，有必要开发第三代小分子EGFR抑制剂，能高选择性抑制EGFR T790M突变体，而对野生型EGFR没有或低度活性。由于这一高选择性，可以大大降低因野生型EGFR抑制引起的皮肤和胃肠道的损伤，以达到治疗EGFR T790M继发突变耐药的肿瘤。另外，保留对EGFR激活突变体(包括L858R EGFR、外显子19缺失突变delE746_A750)的抑制活性，也很有意义。由于对野生型EGFR抑制较弱，第三代EGFR抑制剂具有比第一代EGFR抑制剂更好的安全性，有望作为第一线治疗，在治疗伴随EGFR激活突变的NSCLC同时，也可清除初始治疗患者可能存在的少量EGFRT790T突变株，以延缓耐药的发生。
肺癌是威胁人类健康的重大疾病，肺癌死亡已占所有恶性肿瘤的首位。在我国，肺癌发病率逐年上升，每年新发病例近70万。在欧美，伴有EGFR激活性突变的肺癌病例占所有NSCLC约10％；而在中国，此比例高达30％。因此，对EGFR靶点而言，中国具有更大的市场。
发明内容
发明人在研究过程中发现一类具有式(I)结构N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物具有抑制EGFR突变体，尤其是L858R EGFR突变体、T790MEGFR和外显子19缺失激活突变体的活性，可以用来治疗单独或部分地由EGFR突变体活性介导疾病，例如在预防与治疗癌症尤其是非小细胞肺癌药物中的具有广泛应用。
本发明一方面提供一种具有如下式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐：
其中，
X、Y各自独立的选自CH或N，且X、Y不相同；
R1选自C1-8烷基、C3-8环烷基，任选进一步被一个或多个选自氟、氯、溴、碘、羟基、C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤取代C1-8烷氧基、C3-8环烷基或C3-8环烷氧基的取代基所取代；
R2选自氢、氘、氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、C1-8烷氧基、三氟甲基、三氟甲氧基、SO2R5、C(O)OR5、C(O)R6或P(O)R7R8；
R3选自如下结构：
R4选自C1-8烷基、C3-8环烷基；
R5选自C1-8烷基、C3-8环烷基、卤取代C1-8烷基、苯基或对甲基苯基；
R6、R7、R8各自独立的选自C1-8烷基、C3-8环烷基、卤取代C1-8烷基、C1-8烷氧基、氨基或二C1-8烷基氨基。
作为更进一步优选的方案，所述的N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)烯丙酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，R3选自：X、Y、R1、R2、R4、R5、R6、R7、R8如式(I)化合物所定义。
作为更进一步优选的方案，所述的N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，R1选自C1-4烷基、C3-6环烷基，任选进一步被一个或多个选自氟、氯、溴、碘、羟基、C1-8烷基、C1-8烷氧基、卤取代C1-8烷氧基、C3-8环烷基或C3-8环烷氧基的取代基所取代；X、Y、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8如式(I)化合物所定义。
作为更进一步优选的方案，所述的N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，R1选自C1-4烷基、C3-6环烷基，任选进一步被一个或多个选自氟、氯、溴、碘或羟基的取代基所取代；X、Y、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8如式(I)化合物所定义。
作为更进一步优选的方案，所述的N-(5-((4-((2-(烷取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，R1选自C1-4烷基，任选进一步被一个或多个选自氟或羟基的取代基所取代；X、Y、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8如式(I)化合物所定义。
作为更进一步优选的方案，所述的N-(5-((4-((2-(烷取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，R1选自甲基、乙基、异丙基、三氟甲基、二氟甲基；X、Y、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8如式(I)化合物所定义。
作为更进一步优选的方案，前述的N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，R2选自氢、氟、氯、氰基、C1-8烷氧基、二氟甲基、三氟甲基或三氟甲氧基；R4选自异丙基或环丙基；X、Y、R2、R3、R5、R6、R7、R8如式(I)化合物所定义。
作为最优选的方案，所述的N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，选自如下化合物：
本发明另一方面提供了前述N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐的制备方法，包括如下步骤：
其中，X1、X2选自氟、氯、溴或碘；X、Y、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8如式(I)化合物所定义。
本发明再一方面提供一种药物组合物，其包括治疗有效剂量的前述N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐及可药用的载体。
本发明再一方面提供了一种前述N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或前述药物组合物在制备用于治疗对L858R EGFR突变体、T790M EGFR突变体和外显子19缺失激活突变体活性介导疾病的治疗药物中的应用。
作为进一步优选的方案，前述N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或前述药物组合物在制备用于治疗单独或部分地由EGFR突变体活性介导疾病的治疗药物中的应用。
作为更进一步优选的方案，前述N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或前述药物组合物在制备用于治疗癌症药物中的应用。
作为更进一步优选的方案，所述癌症选自卵巢癌、***、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤,黑色素瘤、***癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠道间质瘤(GIST)、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤、黑色素瘤或间皮瘤；优选自非小细胞肺癌。
具体实施方式
详细说明：除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。
“C1-8烷基”指包括1至8个碳原子的直链烷基和含支链烷基，烷基指饱和的脂族烃基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2，3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2-二甲基戊基、3，3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基或其各种支链异构体等。
“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，“C3-8环烷基”指包括3至8个碳原子的环烷基，例如：
单环环烷基的非限制性实施例包含环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等。
多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。“螺环烷基”指单环之间共用一个碳原子(称螺原子)的多环基团，这些可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子***。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺环烷基、双螺环烷基基或多螺环烷基，螺环烷基的非限制性实施例包含：
“稠环烷基”指***中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对碳原子的全碳多环基团，其中一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子***。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠环烷基，稠环烷基的非限制性实施例包含：
“桥环烷基”指任意两个环共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环基团，这些可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子***。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥环烷基，桥环烷基的非限制性实施例包含：
所述环烷基环可以稠合于芳基、杂芳基或杂环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实施例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等。
“烷氧基”指-O-(烷基)，其中烷基的定义如上所述。“C1-8烷氧基”指含1-8个碳的烷基氧基，非限制性实施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
“环烷氧基”指和-O-(未取代的环烷基)，其中环烷基的定义如上所述。“C3-8环烷氧基”指含3-8个碳的环烷基氧基，非限制性实施例包含环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。
“卤取代的C1-8烷基”指烷基上的氢任选的被氟、氯、溴、碘原子取代的1-8个碳烷基基团，例如二氟甲基、二氯甲基、二溴甲基、三氟甲基、三氯甲基、三溴甲基等。
“C(O)R6”指R5取代的羰基。
“P(O)R7R8”指R7、R8取代的磷酰基，R7、R8任选相同或不同的取代基。
“二C1-8烷基氨基”指两个C1-8烷基取代的氨基基团。
“THF”指四氢呋喃。
“DCM”指二氯甲烷。
“DMF”指N、N-二甲基甲酰胺。
“DIPEA”指二异丙基乙胺。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
“取代的”指基团中的一个或多个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
下面结合实施例对本发明做进一步详细、完整地说明，但决非限制本发明，本发明也并非仅局限于实施例的内容。
本发明的化合物结构是通过核磁共振(NMR)或/和液质联用色谱(LC-MS)来确定的。NMR化学位移(δ)以百万分之一(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，氘代甲醇(CD3OD)和氘代氯仿(CDCl3)内标为四甲基硅烷(TMS)。
液质联用色谱LC-MS的测定用Agilent 1200Infinity Series质谱仪。HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18 150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18 150×4.6mm色谱柱)。
薄层层析硅胶板使用烟台黄海HSGF254或青岛GF254硅胶板，TLC采用的规格是0.15mm～0.20mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。柱层析一般使用烟台黄海硅胶200～300目硅胶为载体。
本发明实施例中的起始原料是已知的并且可以在市场上买到，或者可以采用或按照本领域已知的方法来合成。
在无特殊说明的情况下，本发明的所有反应均在连续的磁力搅拌下，在干燥氮气或氩气氛下进行，溶剂为干燥溶剂。
中间体的制备
1、中间体1：4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺的制备
4-氟-2-甲氧基硝基苯(10g，58.44mmol)溶于甲醇中，加入1g钯/碳，氢气置换，在氢气环境下反应三天。过滤，收集滤液，蒸除甲醇，得油状粗产品。0℃下此粗产品中加入浓硫酸，使混合液中固体全部溶解，分批次加入硝酸钾(5.91g)。反应液缓慢升温至室温，搅拌过夜。此反应液倒入冰水中，加入NaHCO3，调节pH 6.0-8.0。二氯甲烷萃取水相三次，收集有机相，干燥。蒸除有机溶剂，残留物经柱层析分离纯化得4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(4.0g)。
2、中间体2：4-氟-2-异丙氧基-5-硝基苯胺的制备
4-氟-2-异丙氧基-5-硝基苯胺的制备方法同中间体1的制备。
3、中间体3：4-氟-2-乙氧基-5-硝基苯胺的制备
4-氟-2-乙氧基-5-硝基苯胺的制备方法同中间体1的制备。
4、中间体4：2-(二氟甲氧基)-4-氟硝基苯的制备
将5-氟-2-硝基苯酚(3.0g,19.1mmol)，碳酸钾(5.28g,38.2mmol)溶于DMF中，加入一氯二氟醋酸钠(4.37g,28.6mmol)，反应在氮气保护下加热至100℃，搅拌16小时，将反应液浓缩，剩余物加入H2O(50mL)和甲基叔丁基醚(50mL)，萃取分液，有机相水洗三次后经硫酸镁干燥，过滤后滤液浓缩，残留物通过快速硅胶柱层析纯化得到2-(二氟甲氧基)-4-氟硝基苯(3.0g,75％)。
5、中间体5：2-(二氟甲氧基)-4-氟-5-硝基苯胺的制备
将2-(二氟甲氧基)-4-氟硝基苯(3.0g,14.5mmol)溶于甲醇(30mL)中，加入Pd/C(500mg)，在氢气氛室温下反应2小时，点板反应完全，反应液通过硅藻土过滤，滤液浓缩得到粗产品(1.7g,66％)。将此粗产品在冰浴下小心溶于浓硫酸(5mL)中，冰浴下搅拌至澄清后，分批缓慢加入硝酸钾(1.1g,9.5mmol)，反应在冰浴下继续搅拌3小时，LCMS显示反应完全，将反应液缓慢淬灭至饱和碳酸钠水溶液(100mL)中。淬灭完全后，水相用甲基叔丁基醚(3X20mL)萃取，有机相用硫酸镁干燥后过滤，滤液浓缩，残留物通过快速硅胶柱纯化得到2-(二氟甲氧基)-4-氟-5-硝基苯胺(2.0g 90％)。
6、中间体6：4-氟-1-硝基-2-(三氟甲氧基)苯的制备
冰水冷却下将3-氟-三氟甲氧基苯(20g)溶于40毫升浓硫酸，快速搅拌下分批加入硝酸钾(28g),0℃下搅拌3小时，室温下搅拌过夜，反应液小心地请到入1公斤碎冰上，搅拌30分钟，用乙酸乙酯萃取，硫酸钠干燥，过滤，蒸出滤液，残留物柱层析纯化得12克淡黄色液体。
7、中间体7：4-氟-2-(三氟甲氧基)苯胺的制备
将上一步制备中间体6 4-氟-1-硝基-2-(三氟甲氧基)苯粗品(12g)溶于100毫升无水乙醇，冰水冷却下加入二水合氯化亚锡(25g),反应液室温搅拌过夜。加入1N氢氧化钠水溶液调节pH值到12左右，过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，萃取液经硫酸钠干燥，过滤，蒸出溶剂，残留物经柱层析纯化得到淡黄色油状液体4-氟-2-(三氟甲氧基)苯胺(4.78g)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.94(d,J＝8.8Hz,1H),6.83(m,1H),6.76(dd,J＝5.4,8.8Hz,1H),3.87-3.59(2H)。
8、中间体8：4-氟-5-硝基-2-(三氟甲氧基)苯胺的制备
将4-氟-2-(三氟甲氧基)苯胺(2.5g)溶于冰水冷却的浓硫酸(10ml)中，加入硝酸钾(3g)，室温搅拌3小时，反应液请到入冰水中，加3N氢氧化钠水溶液调节pH值到10左右，乙酸乙酯萃取，用无水硫酸钠干燥，过滤后蒸出溶剂，残留物经柱层析纯化得4-氟-5-硝基-2-(三氟甲氧基)苯胺(1.79g)。
9、中间体9：环丙亚磺酸钠的制备
将亚硫酸钠(1.32g,1.1mmol),碳酸氢钠(1.6g,20.0mmol)溶于纯水(15mL),反应在55℃下搅拌10分钟后，缓慢滴加环丙磺酰氯(1.4g,10.0mmol)，反应在60℃搅拌3小时后，将水直接浓缩干，得到环丙亚磺酸钠(4g)。
实施例化合物的制备
实施例1：N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
第一步：2-异丙基巯基-3-硝基吡啶的制备
将2-氟-3-硝基吡啶(500mg,3.52mmol),碳酸钾(973mg,7.04mmol)置于100mL圆底瓶中,加入15ml DMF，在搅拌下加入异丙硫醇(0.36mL,3.87mmol),将混合物在室温下反应1小时，反应完毕后旋去反应溶剂，所得粗品经水洗，乙酸乙酯萃取，干燥后浓缩，再柱层析得产物2-异丙基巯基-3-硝基吡啶(660mg，产率95％)。
LC-MS：t＝4.31min,198.9(M+H+)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.61(dd,J＝4.8，1.6Hz,1H),8.40(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),7.10(dd,J＝8.4,4.8Hz,1H),4.13-4.06(m,1H),1.35(d,J＝6.8Hz,6H)。
第二步：2-异丙基砜基-3-硝基吡啶的制备
将2-异丙基巯基-3-硝基吡啶(660mg,3.33mmol)和间氯过氧苯甲酸(mCPBA)(85％,2.2g，9.99mmol)置于100mL圆底瓶中,加入15ml二氯甲烷，将混合物在室温下搅拌过夜，反应完毕后旋去反应溶剂，所得粗品依次用饱和亚硫酸钠溶液，饱和碳酸钾溶液，饱和食盐水洗，二氯甲烷萃取，干燥，旋干，再经柱层析得产物2-异丙基砜基-3-硝基吡啶(700mg，产率91％)。
LC-MS:t＝3.39min,230.2(M+H+)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(dd,J＝4.4,1.6Hz,1H),8.06(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),7.68(dd,J＝8.0,4.4Hz,1H),4.03-3.96(m,1H),1.36(d,J＝6.8Hz,6H)。
第三步：2-异丙基砜基-3-氨基吡啶的制备
将2-异丙基砜基-3-硝基吡啶(700mg,2.18mmol)置于100mL氢化瓶中,加入15ml甲醇，氮气置换后将100mg钯/炭(10％)加入到瓶中，用氢气球置换后搅拌过夜，反应完毕后将溶液过滤，滤液减压旋干即得产品(600mg，产率90％)。LC-MS:t＝2.85min,201.0(M+H+)。
第四步：2,5-二氯-N-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺的制备
将2-异丙基砜基-3-氨基吡啶(200mg,1.0mmol)溶于DMF(6mL)中,在0℃下慢慢加入NaH(44mg,1.1mmol),加完后反应液继续在0℃下搅拌半小时,再将2,5,6-三氯嘧啶(201mg,1.1mmol)在0℃下滴入反应液，滴毕，混合物自然升至室温搅拌过夜。完毕后加入200mL水并用乙酸乙酯萃取(30mL*3),合并有机相后干燥，旋去反应溶剂，所得粗品经柱层析得产物(90mg，产率26％)。
LC-MS:t＝3.95min,346.9(M+H+)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.48(s,1H),9.17(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),8.38(dd,J＝4.4,2.8Hz,1H),8.26(s,1H),7.55(dd,J＝8.8,3.2Hz,1H),3.90-3.87(m,1H),1.31(d,J＝6.8Hz,6H)。
第五步：5-氯-N2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将2,5-二氯-N-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-4-胺的制备(130mg，0.37mmol)与4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(70mg，0.37mmol)溶于2-戊醇(10mL)，加入对甲苯磺酸(129mg，0.75mmol)，加热至120℃反应过夜。冷却至室温，蒸除溶剂，剩余物用二氯甲烷(30mL)溶解，有机相水洗两次，干燥。蒸除有机相溶剂得粗产品5-氯-N2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(100mg)，不经纯化，直接投入下一步使用。
LC-MS：tR＝3.01min，497.0([M+H]+)。
第六步：5-氯-N2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将5-氯-N2-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(100mg，0.2mmol)溶于5ml N,N-二甲基乙酰胺中，加入三甲基乙二胺(204mg)，微波反应1小时。冷却至室温。蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析分离纯化得5-氯-N2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(70mg)。LC-MS：tR＝2.30min，579.1([M+H]+)。
第七步：N4-(5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)-N1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺
将5-氯-N2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(70mg)溶于6mL乙醇-水混合溶剂(5:1)中，加入65mg铁粉，50mg氯化铵，加热至回流反应2小时。冷却至室温，过滤，收集滤液。蒸除滤液中的乙醇，加入5ml水和5ml二氯甲烷-甲醇(20:1)。分离有机相，干燥。蒸除有机溶剂，残留物经制备薄层层析分离得N4-(5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)-N1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(40mg)。LC-MS：tR＝2.08min，549.3([M+H]+)。
第八步：N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
将N4-(5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)-N1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(40mg)溶于3ml无水四氢呋喃中，氮气置换保护，0℃下加入DIPEA(0.1mL)，滴加1M丙烯酰氯四氢呋喃溶液(0.3mL)。0℃下搅拌1小时。反应液中加入5ml水与5ml二氯甲烷，分离水相与有机相，水相再分别用3ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相，干燥，蒸除溶剂，残留物经制备薄层层析分离得粗产品，粗产品再用反相柱层析纯化(水：甲醇＝25:75)得N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺(6mg)。
LC-MS：tR＝2.19min，603.3([M+H]+)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.01(s,2H)，9.14(m,2H)，8.28(d,1H)，8.22(s,1H)，7.34(m,2H)，6.79(s,1H)，6.30(m,2H)，5.68(d,1H)，3.88(s,3H)，3.80(m,1H)，2.93(br,2H)，2.73(s,3H)，2.36(m,8H)，1.43(d,6H)。
实施例2：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步。
LC-MS：tR＝2.02min，569.3([M+H]+)；
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.81(s,2H)，9.01(m,2H)，8.57(d,1H)，8.02(s,1H)，7.24-7.35(m,3H)，6.79(s,1H)，6.10(m,2H)，5.48(d,1H)，3.88(s,3H)，3.80(m,1H)，2.93(br,2H)，2.73(s,3H)，2.36(m,8H)，1.43(d,6H)。
实施例3：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 587.1。
实施例4：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 636.7。
实施例5：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲氧基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲氧基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 653.1。
实施例6：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-异丙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-异丙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 597.3。
实施例7：N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-异丙氧基苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-异丙氧基苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 632.2。
实施例8：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-异丙氧基苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-异丙氧基苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 615.2。
实施例9：N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-异丙氧基苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-异丙氧基苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 622.3。
实施例10：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-异丙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-异丙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 665.1。
实施例11：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-乙氧基-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-乙氧基-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 601.3。
实施例12：N-(5-((5-(叔-丁氧基)-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-乙氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-(叔-丁氧基)-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨
基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-乙氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 655.3。
实施例13：N-(4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 605.2。
实施例14：N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 639.6。
实施例15：N-(4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 622.7。
实施例16：N-(4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 673.1。
实施例17：N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 629.8。
实施例18：N-(4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-异丙氧基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-(二氟甲氧基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-异丙氧基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 663.2。
实施例19：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 622.7。
实施例20：N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 657.1。
实施例21：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 640.7。
实施例22：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 690.7。
实施例23：N-(5-((5-(二氟甲基)-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-(二氟甲基)-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 672.7。
实施例24：N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲氧基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲氧基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法同实施例1的第四～八步，m/z 706.7。
实施例25：N-(4-异丙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
第一步：N2-(2-异丙氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将N2-(4-氟-2-异丙氧基-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(98mg，0.2mmol)溶于5ml N,N-二甲基乙酰胺中，加入1-甲基哌嗪(20mg，0.2mmol)，微波反应1小时。冷却至室温。蒸除溶剂，残留物经硅胶柱层析分离纯化得N2-(2-异丙氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(72mg)，m/z 570.7。
第二步：N2-(5-氨基-2-异丙氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将N2-(2-异丙氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(72mg，0.13mmol)溶于6mL乙醇-水混合溶剂(5:1)中，加入70mg铁粉，50mg氯化铵，加热至回流反应2小时。冷却至室温，过滤，收集滤液。蒸除滤液中的乙醇，加入5ml水和5ml二氯甲烷-甲醇(20:1)。分离有机相，干燥。蒸除有机溶剂，残留物经制备薄层层析分离得N2-(5-氨基-2-异丙氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(41mg)，m/z 540.7。
第三步：N-(4-异丙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
将N2-(5-氨基-2-异丙氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)-N4-(2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(41mg，0.076mmol)溶于3ml无水四氢呋喃中，氮气置换保护，0℃下加入DIPEA(0.1mL)，滴加1M丙烯酰氯四氢呋喃溶液(0.3mL)。0℃下搅拌1小时。反应液中加入5ml水与5ml二氯甲烷，分离水相与有机相，水相再分别用3ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相，干燥，蒸除溶剂，残留物经制备薄层层析分离得粗产品，粗产品再用反相柱层析纯化(水：甲醇＝25:75)得N-(4-异丙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺(8mg)，m/z 594.7。
实施例26：N-(5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-异丙氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-异丙氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z 612.7。
实施例27：N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-异丙氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-异丙氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z 628.7。
实施例28：N-(4-异丙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-异丙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z663.1。
实施例29：N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z 592.2。
实施例30：N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z 601.6。
实施例31：N-(5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-4-甲氧基-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z634.7。
实施例32：N-(4-乙氧基-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-乙氧基-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z 598.7。
实施例33：N-(4-乙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-乙氧基-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z 610.7。
实施例34：N-(4-(二氟甲氧基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-(二氟甲氧基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z 602.7。
实施例35：N-(4-(二氟甲氧基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-(二氟甲氧基)-5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z620.7。
实施例36：N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(二氟甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(二氟甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z637.6。
实施例37：N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(二氟甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-4-(二氟甲氧基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z627.8。
实施例38：N-(4-(二氟甲氧基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-(二氟甲氧基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲氧基嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z632.8。
实施例39：N-(4-(二氟甲氧基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(4-(二氟甲氧基)-5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z 670.8。
实施例40：N-(5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z 621.2。
实施例41：N-(5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氟-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z638.6。
实施例42：N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备
N-(5-((5-氰基-4-((2-(异丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-(4-甲基哌嗪-1-基)-4-(三氟甲氧基)苯基)丙烯酰基酰胺的制备方法与实施例25类似，m/z645.7。
实施例43：N-(5-((4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
第一步：N-(3-溴吡啶-2-基)-2-氯嘧啶-4-胺的制备
将3-溴吡啶-2-胺(680mg,4.0mmol)溶于无水DMF(5mL)中，在冰浴下分批加入NaH(320mg,8.0mmol)，搅拌20分钟后，将所得混悬液加入2,4-二氯嘧啶(650mg,4.4mmol)的DMF(5mL)中，反应在冰浴下搅拌2小时，LCMS显示反应完全。反应液用饱和NH4Cl(3mL)淬灭，浓缩干后，用二氯甲烷(20mL)，水(20mL)，有机相干燥过滤浓缩，剩余物通过快速柱层析得到N-(3-溴吡啶-2-基)-2-氯嘧啶-4-胺(850mg,产率75％)。
第二步：N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将N-(3-溴吡啶-2-基)-2-氯嘧啶-4-胺(850mg,3.0mmol),4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(560mg,3.0mmol),一水对甲苯磺酸(680mg,3.6mmol)溶于1,4-二氧六环(15mL)。反应加热至120℃，搅拌16小时，LCMS显示反应完全，反应液浓缩，剩余物加入水(10mL)，甲醇(5mL)，混合物搅拌10分钟后，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗后得到N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺(800mg,产率60％)。
第三步：N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺(800mg,1.84mmol)，三乙胺(1mL)，N,N,N-三甲基乙二胺(280mg,2.76mmol)溶于DMF(10mL)中，反应加热至110℃搅拌2小时，LCMS显示反应，反应浓缩干，剩余物用二氯甲烷(20mL)，水(20mL)分层，将不溶物过滤，有机相干燥，过滤，浓缩，剩余物通过快速柱层析得到N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺(300mg,产率32％)。
第四步：N-(3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺(70mg,0.14mmol)，环丙亚磺酸钠(86mg,0.7mmol)，CuI(27mg,0.14mmol)，脯氨酸钠(20mg,0.14mmol)溶于DMSO(5mL)。反应液用氮气置换三次，加热至120℃，反应2小时。LCMS显示反应完全，反应液加入二氯甲烷(10mL),水(10mL)。有机相水洗三次，硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩，剩余物用厚制备板分离纯化得到N-(3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺(30mg,产率40％)。
第五步：N-(4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-2-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-甲基苯-1,2,4-三胺的制备
把N-(3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)嘧啶-2,4-二胺(30mg,55.3umol)溶于甲醇(5mL)，加入Pd/C(10mg)。反应在氢气氛下室温搅拌10分钟，LCMS显示反应完全，反应液过滤，滤液旋干得到N4-(4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-2-基)-N1-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(20mg,产率70％)，不作纯化直接用于下一步反应。
第六步：N-(5-((4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
将N-(4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-2-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-甲基苯-1,2,4-三胺(20mg,39.0umol)，三乙胺(0.2mL)溶于四氢呋喃(10mL),反应液冷却至-10～-5℃。氮气保护下，缓慢加入丙烯酰氯(78ul,1M in THF)。反应在-10～-5℃下搅拌30分钟，反应结束,加入甲醇(3mL)继续搅拌10分钟，反应液浓缩干，剩余物先经过制备板分离后在经反相过柱纯化，得到N-(5-((4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺(3.5mg,产率16％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.78-8.67(m,1H),8.43-8.31(m,1H),8.19–8.13(m,1H),7.92-7.84(m,1H),7.83-7.76(m,1H),7.54-7.42(m,1H),7.02(s,1H),6.66-6.55(m,1H),6.52-6.44(m,1H),5.98-5.86(m,1H),3.98(s,3H),3.59-3.47(m,2H),3.33(dt,J＝3.3,1.6Hz,2H),2.89(s,6H),2.76(s,3H),1.31(s,4H),1.17-1.11(m,1H).m/z 567.3。
实施例44：N-(5-((4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
第一步：N-(3-溴吡啶-2-基)-2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺的制备
将3-溴吡啶-2-胺(350mg,2.0mmol)溶于无水DMF(5mL)中，在冰浴下分批加入NaH(160mg,4.0mmol)，搅拌20分钟后，将所得混悬液加入2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(440mg,2.0mmol)的DMF(5mL)中，反应在冰浴下搅拌2小时，LCMS显示反应完全。反应液用饱和NH4Cl(3mL)淬灭，浓缩干后，用二氯甲烷(20mL)，水(20mL)，有机相干燥过滤浓缩，剩余物通过快速柱层析得到N-(3-溴吡啶-2-基)-2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(500mg,产率70％)。
第二步：N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将N-(3-溴吡啶-2-基)-2-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-4-胺(500mg,1.41mmol),4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(290mg,1.56mmol)，一水对甲苯磺酸(325mg,1.7mmol)溶于1,4-二氧六环(30mL)。反应加热至120℃，搅拌16小时，LCMS显示反应完全，反应液浓缩，剩余物加入水(10mL)，甲醇(5mL)，混合物搅拌10分钟后，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗后得到N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(400mg),不作纯化直接用于下一步反应。
第三步：N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(400mg,0.79mmol)，三乙胺(1mL)，N,N,N-三甲基乙二胺(120mg,1.19mmol)溶于DMF(10mL)中，反应加热至110℃搅拌2小时，LCMS显示反应，反应浓缩干，剩余物用二氯甲烷(20mL)，水(20mL)分层，将不溶物过滤，有机相干燥，过滤，浓缩，剩余物通过快速柱层析得到N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(270mg,产率58％)。
第四步：N-(3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺的制备
将N-(3-溴吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(270mg,0.46mmol)，环丙亚磺酸钠(120mg,0.92mmol)，CuI(176mg,0.92mmol)，脯氨酸钠(126mg,0.92mmol)溶于DMSO(5mL)。反应液用氮气置换三次，加热至120℃，反应2小时。LCMS显示反应完全，反应液加入二氯甲烷(10mL),水(10mL)。有机相水洗三次，硫酸镁干燥，过滤，滤液浓缩，剩余物用厚制备板分离纯化得到N-(3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(50mg,产率18％)。
第五步：N-(4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺的制备
把N-(3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2,4-二胺(50mg，81.8umol)溶于甲醇(5mL)，水(5mL)，加入铁粉(50mg)，氯化铵(50mg)。反应在室温下搅拌2小时，LCMS显示反应完全，反应液过滤，滤液旋干，剩余物通过快速硅胶柱纯化得到N-(4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺(30mg，产率63％)。
第六步：N-(5-((4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
将N-(4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-甲基苯-1,2,4-三胺(30mg,51.0umol)，三乙胺(0.2mL)溶于四氢呋喃(10mL),反应液冷却至-10～-5℃。氮气保护下，缓慢加入丙烯酰氯(78ul,1M inTHF)。反应在-10～-5℃下搅拌30分钟，反应结束,加入甲醇(3mL)继续搅拌10分钟，反应液浓缩干，剩余物先经过制备板分离后在经反相过柱纯化，得到N-(5-((4-((3-(环丙基磺酰)吡啶-2-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺(3.0mg,产率10％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.70-8.62(m,1H),8.61-8.53(m,1H),8.50-8.42(m,1H),8.09-7.93(m,1H),7.53-7.39(m,1H),7.09-7.00(m,1H),6.65-6.41(m,3H),5.97-5.85(m,1H),3.97(s,3H),3.59-3.53(m,2H),3.32-3.27(m,2H),2.89(s,6H),2.78(s,3H),1.69-1.57(m,1H),1.17-1.06(m,3H),1.00-0.84(m,1H).m/z 635.2。
实施例45：N-(5-((4-((2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
第一步：2-(环丙基磺酰)-3-硝基吡啶的制备
将2-氯-3-硝基吡啶(1.0g，6.31mmol),环丙亚磺酸钠(1.2g，9.5mmol)溶于DMSO(15mL)中，反应加热至120℃，搅拌8小时，LCMS显示反应完全，反应液用二氯甲烷(30mL),水(30mL)分层，有机相干燥过滤，浓缩，剩余物通过快速硅胶柱纯化得到2-(环丙基磺酰)-3-硝基吡啶(1.2g,产率84％)。
第二步：2-(环丙基磺酰)吡啶-3-胺的制备
将2-(环丙基磺酰)-3-硝基吡啶(1.2g,5.26mmol)，Pd/C(200mg),溶于甲醇(20mL),氢气氛下室温搅拌30分钟，反应液过滤，滤液浓缩，剩余物通过快速硅胶柱纯化得到2-(环丙基磺酰)吡啶-3-胺(800mg,产率76％)。
第三步：2-氯-N-(2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-4-胺的制备
将2-(环丙基磺酰)吡啶-3-胺(400mg，2.0mmol)溶于无水DMF(10mL)中，在冰浴下分批加入NaH(160mg,4.0mmol)，搅拌20分钟后，将所得混悬液加入2,4-二氯-5-甲基嘧啶(400mg,2.4mmol)的DMF(10mL)中，反应在冰浴下搅拌2小时，LCMS显示反应完全。反应液用饱和NH4Cl(3mL)淬灭，浓缩干后，用二氯甲烷(20mL),水(20mL)，有机相干燥过滤浓缩，剩余物通过快速柱层析得到2-氯-N-(2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-4-胺(500mg,产率75％)。
第四步：N-(2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)-N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-甲基嘧啶-2,4-二胺的制备
将2-氯-N-(2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)-5-甲基嘧啶-4-胺(500mg，1.54mmol)，4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(350mg，1.85mmol)，一水对甲苯磺酸(440mg,2.31mmol)溶于1,4-二氧六环(20mL)。反应加热至120℃，搅拌16小时，LCMS显示反应完全，反应液浓缩，剩余物加入水(10mL),甲醇(5mL)，混合物搅拌10分钟后，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗后得到粗品N-(2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)-N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-甲基嘧啶-2,4-二胺(600mg,产率80％)。
第五步：N-(2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-甲基嘧啶-2,4-二胺的制备
将N-(2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)-N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-甲基嘧啶-2,4-二胺(600mg，1.26mmol)，三乙胺(1mL)，N,N,N-三甲基乙二胺(200mg，1.9mmol)溶于DMF(10mL)中，反应加热至110℃搅拌2小时，LCMS显示反应，反应浓缩干，剩余物用二氯甲烷(20mL)，水(20mL)分层，将不溶物过滤，有机相干燥，过滤，浓缩，剩余物通过快速柱层析得到N4-(2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)-N2-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-甲基嘧啶-2,4-二胺(600mg,产率85％)。
第六步：N-(4-((2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N1-甲基苯-1,2,4-三胺的制备
把N-(2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)-N-(4-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-5-甲基嘧啶-2,4-二胺(300mg,0.54mmol)溶于甲醇(20mL)，水(10mL)，加入铁粉(300mg)，氯化铵(500mg)。反应在室温下搅拌2小时，LCMS显示反应完全，反应液过滤，滤液旋干，剩余物通过反相柱纯化得到N-(4-((2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-甲基苯-1,2,4-三胺(250mg,产率88％)。
第七步：N-(5-((4-((2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺的制备
将N-(4-((2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)-N-(2-(二甲氨基)乙基)-5-甲氧基-N-甲基苯-1,2,4-三胺(250mg,0.47mmol)，三乙胺(0.5mL)溶于四氢呋喃(20mL),反应液冷却至-10～-5℃。氮气保护下，缓慢加入丙烯酰氯(0.72mL,1M in THF)。反应在-10～-5℃下搅拌30分钟，反应结束,加入甲醇(3mL)继续搅拌10分钟，反应液浓缩干，剩余物先经过制备板分离后在经反相过柱纯化，得到N-(5-((4-((2-(环丙基磺酰)吡啶-3-基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧苯基)丙烯酰基酰胺(150mg,产率54％)。
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.68-8.59(m,1H),8.58-8.51(m,1H),7.95-7.80(m,1H),7.66-7.60(m,1H),7.57(s,1H),7.00(s,1H),6.66-6.46(m,2H),6.03-5.88(m,1H),3.95(s,3H),3.56-3.48(m,2H),3.32-3.27(m,2H),3.20-3.08(m,1H),2.90(s,6H),2.73(s,3H),2.26(d,J＝0.8Hz,3H),1.34-1.24(m,2H),1.21-1.11(m,2H).m/z 581.3。
生物学测试评价
1.EGFR T790M突变型酶学实验
本实验采用荧光共振能量转移(TR-FRET)的方法测试化合物对外显子20T790M突变型EGFR酶的抑制作用，并得出化合物对该酶活性的半数抑制浓度IC50。
1)在384孔板中加入1～5ul EGFR T790M酶溶液，酶终浓度为0.1～1nM。
2)加入1～5ul梯度稀释好的化合物溶液。
3)室温孵育10分钟。
4)加入1～5ul底物混合液包含底物多肽终浓度5～50nM和ATP终浓度1～10uM。
5)室温孵育0.5～2小时。
6)加入5ul EDTA终止液终止反应5分钟。
7)加入5ul含标记抗体的检测液，室温孵育1小时。
8)酶标仪测定各板的665nm荧光信号值。
9)通过荧光信号值计算抑制率。
10)根据不同浓度的抑制率通过曲线拟合得出化合物的IC50。
2.EGFR野生型(WT)酶学实验
本实验采用荧光共振能量转移(TR-FRET)的方法测试化合物对野生型EGFR酶的抑制作用，并得出化合物对该酶活性的半数抑制浓度IC50。
1)在384孔板中加入1～5ul EGFR野生型酶溶液，酶终浓度为0.1～1nM。
2)加入1～5ul梯度稀释好的化合物溶液。
3)室温孵育10分钟。
4)加入1～5ul底物混合液包含底物多肽终浓度5～50nM和ATP终浓度0.1～5uM。
5)室温孵育0.5～2小时。
6)加入5ul EDTA终止液终止反应5分钟。
7)加入5ul含标记抗体的检测液，室温孵育1小时。
8)酶标仪测定各板的665nm荧光信号值。
9)通过荧光信号值计算抑制率。
10)根据不同浓度的抑制率通过曲线拟合得出化合物的IC50。
本发明化合物的生化学活性通过以上的试验进行测定，测得的IC50值见下表。
其中实施例6到实施例45化合物EGFR IC50值与实施例1近似，均表现出良好的EGFR突变型激酶抑制活性。
结论：本发明实施例对EGFR突变型激酶具有很强的抑制活性，同时对野生型激酶具有较弱的抑制活性，显示出很好的选择性。
3.NCI-H1975细胞增殖抑制实验
本实验采用CellTiter-Glo的方法测试化合物对NCI-H1975细胞增殖的抑制作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC50。
1)在96孔细胞培养板中接种90μL的H1975细胞悬液，密度为1～5*103细胞/ml，将培养板于培养箱培养16～24小时(37℃，5％CO2)。
2)向培养板细胞中加入梯度稀释的不同浓度的待测化合物溶液，将培养板在培养箱孵育72小时(37℃，5％CO2)。
3)每孔加入50～100μL CellTiter-Glo试剂，并振荡10分钟，室温静置10分钟。
4)酶标仪测定各板的化学发光信号值。
5)通过化学发光信号值计算抑制率。
6)根据不同浓度的抑制率通过曲线拟合得出化合物的IC50。
4.A431细胞增殖抑制实验
本实验采用CellTiter-Glo的方法测试化合物对A431细胞增殖的抑制作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC50。
1)在96孔细胞培养板中接种90μL的A431细胞悬液，密度为1～5*103细胞/ml，将培养板于培养箱培养16～24小时(37℃，5％CO2)。
2)向培养板细胞中加入梯度稀释的不同浓度的待测化合物溶液，将培养板在培养箱孵育72小时(37℃，5％CO2)。
3)每孔加入50～100μL CellTiter-Glo试剂，并振荡10分钟，室温静置10分钟。
4)酶标仪测定各板的化学发光信号值。
5)通过化学发光信号值计算抑制率。
6)根据不同浓度的抑制率通过曲线拟合得出化合物的IC50。
本发明化合物的生化学活性通过以上的试验进行测定，测得的IC50值见下表。
其中实施例3到实施例45化合物EGFR IC50值中对H1975和A431抑制活性与实施例1近似，均表现出良好的抑制活性。
结论：本发明实施例对EGFR突变型细胞H1975的增殖具有很强的抑制活性，而对野生型A431细胞的增殖具有较低的抑制，实施例对野生型/突变型细胞具有很好的选择性。
Claims (14)
1.一种具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐：
其中，
X、Y各自独立的选自CH或N，且X、Y不相同；
R1选自C1-8烷基、C3-8环烷基，任选进一步被一个或多个选自氟、氯、溴、碘或羟基的取代基所取代；
R2选自氢、氘、氟、氯、溴、碘、氰基、硝基、C1-8烷氧基、三氟甲氧基；
R3选自如下结构：
R4选自C1-8烷基、C3-8环烷基。
2.根据权利要求1所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，其特征在于，R1选自C1-4烷基、C3-6环烷基，任选进一步被一个或多个选自氟、氯、溴、碘或羟基的取代基所取代；X、Y、R2、R3、R4如权利要求1所定义。
3.根据权利要求1所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，其特征在于，R1选自C1-4烷基，任选进一步被一个或多个选自氟或羟基的取代基所取代；X、Y、R2、R3、R4如权利要求1所定义。
4.根据权利要求1所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，其特征在于，R1选自甲基、乙基、异丙基、三氟甲基或二氟甲基；X、Y、R2、R3、R4如权利要求1所定义。
5.根据权利要求1所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，其特征在于，R2选自氢、氟、氯、氰基、C1-8烷氧基或三氟甲氧基；R4选自异丙基或环丙基；X、Y、R3如权利要求1所定义。
6.根据权利要求1所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，其特征在于，选自如下化合物：
7.根据权利要求1所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐的制备方法，包括如下步骤：
其中，X1、X2各自独立地选自氟、氯、溴或碘；X、Y、R1、R2、R3、R4如权利要求1所定义。
8.药物组合物，其包括治疗有效剂量的根据权利要求1-6中任一项所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐及可药用的载体。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗对EGFR突变体或外显子19缺失激活突变体活性介导疾病的治疗药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述EFGR突变体选自L858REGFR突变体和T790MEGFR突变体。
11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，根据权利要求1-6中任一项所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗单独或部分地由EGFR突变体活性介导疾病的治疗药物中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，根据权利要求1-6中任一项所述的具有式(I)化合物N-(5-((4-((2-(烷基取代磺酰基)吡啶-3-基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)-苯基)丙烯酰基酰胺类似物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗癌症药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述癌症选自卵巢癌、***、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤,黑色素瘤、***癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、肝细胞癌、胃肠道间质瘤、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤或间皮瘤。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述癌症选自非小细胞肺癌。
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