CN110642836B - Egfr抑制剂及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及具有式(I)结构的2‑氨基嘧啶衍生物、含有式(I)化合物的药物组合物及所述化合物在制备预防或治疗表皮生长因子受体(EGFR)激酶相关疾病的用途，特别是用于预防或治疗与表皮生长因子受体激酶相关的癌症的用途。其中式(I)中的各取代基与说明书中的定义相同。

Description

EGFR抑制剂及其制备和应用
技术领域
本申请属于医药技术领域，具体涉及2-氨基嘧啶衍生物及其用于制备抗肿瘤药物的用途。
本申请要求中国专利CN201810704812.2(申请日2018年6月27日，发明名称EGFR抑制剂及其制备和应用)的优先权。
背景技术
表皮生长因子受体(Epidermal Rrowth Factor Receptor,EGFR)是一种广泛分布于人体组织细胞膜上的具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体蛋白，是酪氨酸激酶erbB受体家族的一员。通过与配体表皮生长因子(EGF)结合，EGFR在细胞膜上形成同源二聚体，或者与家族中其他的受体(比如erbB2，erbB3，或erbB4)形成异源二聚体而活化，引起EGFR细胞内关键的酪氨酸残基磷酸化，激活激酶结构域，进一步激活细胞内多个下游的信号通路。这些细胞内信号通路在细胞增殖、生存及抗凋亡中起重要作用。
EGFR的酪氨酸激酶结构域可发生突变，导致组成性的信号激活，这种活性信号通路在肿瘤细胞的生长、生存和迁移过程中起至关重要的作用。最常见的激活突变是19号外显子的框内缺失突变和858密码子的错义突变(L858R)。带有EGFR突变的肺癌对EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)高度敏感(Science[2004]第304期，1497-500)，第一代以EGFR为靶点的酪氨酸激酶抑制剂(如吉非替尼、厄洛替尼)等药物已在非小细胞肺癌的临床治疗中获得巨大成功(New England Journal of medicine[2004]第350期，2129-39；The LancetOncology[2012]第13卷第3期，239-46)。然而，接受TKI抑制剂治疗的患者往往由于形成耐药性而面临复发的问题。最常见的耐药机制就是EGFR的T790M二次突变，存在约50％的耐药肿瘤病人中(PLOSMedicine[2005]第2期，1-11)。第二代EGFR不可逆抑制剂如卡奈替尼(Canertinib)、阿法替尼(Afatinib)等可以克服耐药，但这些分子对EGFR T790M突变体的选择性差，对野生型EGFR产生的抑制作用较强，在体内的耐受剂量较低。
因此，有必要开发活性和选择性更好的第三代小分子EGFR抑制剂，能高选择性抑制T790M、19号外显子缺失、L858R错义突变等突变体。同时，对IGFR受体激酶有较低的抑制活性，避免脱靶造成的高血糖副作用(Transl Lung Cancer Res[2015]第5期，576-83)。
发明内容
本发明的目的是提供一种2-氨基嘧啶类EGFR抑制剂，其对EGFR突变具有高度选择性且安全性更好。
本发明的另一个目的是提供所述的EGFR抑制剂在制备预防或治疗表皮生长因子受体(EGFR)激酶相关疾病的药物的用途。
为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：
本发明所述的如下式(I)所示的化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐：
Figure BDA0002096183510000021
其中，R1选自C1-C8烷基或C3-C8环烷基，任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、卤取代C1-C8烷氧基、C3-C8环烷基或C3-C8环烷氧基的取代基所取代；
R2选自氢、氘、卤素、氰基、硝基、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、C3-C8环烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、三氟甲基、二氟甲基或三氟甲氧基；
R3选自氢、氘、卤素、氰基、硝基、C1-C8烷基、C3-C8环烷基、C2-C8烯基或C2-C8炔基，任选进一步被一个或多个选自卤素、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、卤取代C1-C8烷氧基、C3-C8环烷基或C3-C8环烷氧基的取代基所取代；
R4选自氢、卤素、氰基、硝基、C1-C8烷基、卤代C1-C8烷基、-C(O)R5、-C(O)NR5R6、-OR5、-NR5R6、-NR5C(O)R6、-NR7(CH2)mNR5R6、-NC(O)R7(CH2)mNR5R6、-NR7(CH2)mNR5C(O)R6、-NR7(CH2)mOR6、-NC(O)R7(CH2)mOR6、-O(CH2)mNR5R6或-O(CH2)mNR5C(O)R6；
R5、R6和R7各自独立选自氢、C1-C8烷基或C3-C8环烷基，其中C1-C8烷基、C3-C8环烷基任选进一步被一个或多个选自卤素、羟基、-NR8R9、C1-C8烷基、C1-C8烷氧基、卤取代C1-C8烷氧基、C3-C8环烷基或C3-C8环烷氧基的取代基取代；
或R5、R6、R7两两间可独立地形成4-10元杂环基；
m为1，2，3，4；
R8和R9各自独立选自氢、C1-C8烷基或C3-C8环烷基。
本发明优选方案，所述的式(I)化合物，其中：R1选自C1-C8烷基或C3-C8环烷基，任选进一步被一个或多个选自卤素或羟基的取代基所取代；
R2选自氢、氘、卤素或C1-4烷基；
R3选自氢、氘、卤素、C1-C8烷基或C3-C8环烷基；
R4选自氢、卤素、氰基、硝基、C1-C8烷基、卤代C1-C8烷基、-NR5R6或-NR7(CH2)mNR5R6；
R5、R6和R7各自独立选自氢、C1-C8烷基或C3-C8环烷基；
或R5、R6、R7两两间可独立地形成4-10元杂环基；
m为1，2，3或4。
本发明优选方案，所述的式(I)化合物，其中：R1选自C1-C4烷基，任选进一步被一个或多个选自卤素或羟基的取代基所取代；
R2选自氢、氘、卤素或甲基；
R3选自氢、氘、卤素、C1-C8烷基或C3-C8环烷基；
R4选自-NR5R6或-NR7(CH2)mNR5R6；
R5、R6和R7各自独立选自氢或C1-C4烷基；
m为1，2，3或4。
本发明优选方案，所述的式(I)化合物，其特征在于：
R1选自甲基、二氟甲基、三氟甲基、乙基、正丙基、异丙基或三氟乙基；
R2选自氢、氘、F、Cl、Br或甲基；
R3选自氢或氘；
R4为-NR7(CH2)mNR5R6；
R5、R6和R7各自独立选自氢、甲基或乙基；
m为1，2，3或4。
作为最优选的方案，具体优选的通式(I)化合物或其药学上可接受的盐，包括如下：
Figure BDA0002096183510000031
本发明另一方面提供式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐的制备方法，包括如下步骤：
Figure BDA0002096183510000041
式(II)化合物与式(III)化合物在金属催化剂存在下发生取代反应得到式(IV)化合物，经过还原反应得到通式(V)化合物，再发生缩合反应得到式(I)化合物，其中，R1、R2、R3、R4如式(I)化合物所定义。
本发明另一方面提供药物组合物，其包括治疗有效剂量的前述式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐及可药用的载体。
本发明另一方面提供了前述式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或前述药物组合物在制备用于治疗对EGFR突变体尤其是L858R EGFR突变体、T790M EGFR突变体和外显子19缺失激活突变体活性介导疾病的治疗药物中的应用。
本发明另一方面提供了前述式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或前述药物组合物在制备用于治疗单独或部分地由EGFR突变体活性介导疾病的治疗药物中的应用。
本发明另一方面提供了前述式(I)化合物、其立体异构体或其药学上可接受盐，或前述药物组合物在制备用于治疗癌症药物中的应用。
作为进一步优选的方案，所述癌症选自卵巢癌、***、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、胶质母细胞瘤、黑色素瘤、***癌、白血病、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胃癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠道间质瘤、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、急性髓细胞白血病、多发性骨髓瘤、黑色素瘤或间皮瘤。
除非有相反陈述，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义。
本发明中“C1-C8烷基”指包括1至8个碳原子的直链烷基和含支链烷基，烷基指饱和的脂族烃基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基或其各种支链异构体等。
本发明中“环烷基”指饱和单环烃取代基，“C3-C8环烷基”指包括3至8个碳原子的单环环烷基，例如：单环环烷基的非限制性实施例包含环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。
本发明中“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其中一个或多个环原子选自氮、氧或S(O)r(其中r是整数0、1、2)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。“4-10元杂环基”指包含4至10个环原子的环基。单环杂环基的非限制性实施例包含吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
本发明中“烯基”指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的如上述定义的烷基，“C2-C8烯基”指含有2-8个碳的直链或含支链烯基。例如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-，2-或3-丁烯基等。
本发明中“炔基”指至少两个碳原子和至少一个碳-碳三键组成的如上所定义的烷基，“C2-C8炔基”指含有2-8个碳的直链或含支链炔基。例如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-，2-或3-丁炔基等。
本发明中“烷氧基”指-O-(烷基)，其中烷基的定义如上所述。“C3-C8烷氧基”指含1-8个碳的烷基氧基，非限制性实施例包含甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基等。
本发明中“环烷氧基”指和-O-(未取代的环烷基)，其中环烷基的定义如上所述。“C3-C8环烷氧基”指含3-8个碳的环烷基氧基，非限制性实施例包含环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。
“卤素”或者“卤”指氟、氯、溴或碘。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本发明制备步骤中，所用试剂的缩写分别表示：
THF 四氢呋喃
EA 乙酸乙酯
PE 石油醚
DCM 二氯甲烷
MTBE 甲基叔丁基醚
TFAA 三氟乙酸酐
Pd2(dba)3 三(二亚苄基丙酮)二钯
Xantphos 4,5-双二苯基膦-9,9-二甲基氧杂蒽
附图说明
图1实施例1化合物的核磁共振氢谱。
图2实施例1化合物的质谱。
图3实施例2化合物的核磁共振氢谱。
图4实施例2化合物的质谱。
图5实施例3化合物的核磁共振氢谱。
图6实施例3化合物的质谱。
图7实施例4化合物的核磁共振氢谱。
图8实施例4化合物的质谱。
图9实施例5化合物的核磁共振氢谱。
图10实施例5化合物的质谱。
图11实施例6化合物的核磁共振氢谱。
图12实施例6化合物的质谱。
具体实施方式
以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-甲氧基吡啶吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000061
步骤1:6-溴-2-甲氧基-3-硝基吡啶的合成
Figure BDA0002096183510000071
室温下，向四口瓶中依次加入2,6-二溴-3-硝基吡啶(40.00g，141.90mmol)、THF(520ml)，降温0-5℃，加入甲醇钠(30％，28.11g，156.08mmol)，3h反应终止。将反应液倒入冰水(500ml)，加MTBE(500ml x3)萃取，合并有机相，加饱和食盐水(200ml)洗涤，有机相浓缩，粗品结晶，得淡黄固体19.89g，收率60％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.15(d,J＝8.2Hz,1H),7.22(d,J＝8.2Hz,1H),4.14(s,3H)。
步骤2:6-溴-2-甲氧基吡啶-3-胺的合成
Figure BDA0002096183510000072
室温下，向四口瓶中依次加入6-溴-2-甲氧基-3-硝基吡啶(9.50g，38.62mmol)、铁粉(11.50g，193.11mmol)、氯化铵(10.80g，193.11mmol)和乙醇(190ml)、水(95ml)，氮气保护，升温至80℃，1h反应终止。反应液加硅藻土过滤，滤液浓缩，加水(950ml)，EA(380mlx2)萃取，合并有机相，加饱和食盐水(200ml)洗涤，浓缩，得黑色油状液体8.28g，收率100％。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ6.86(d,J＝7.8Hz,1H),6.76(d,J＝7.8Hz,1H),3.98(s,3H)。
步骤3:N-(6-溴-2-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000073
室温下，向四口瓶中依次加入6-溴-2-甲氧基吡啶-3-胺(12.00g，59.10mmol)、乙酸酐(48.67g，466.90mmol)，20℃，1h反应终止。反应液加水(240ml)搅拌1h，析出褐色沉淀，抽滤，滤饼干燥，得褐色固体9.80g，收率68％。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.49(d,J＝8.2Hz,1H),7.06(d,J＝8.2Hz,1H),4.02(s,3H),2.21(s,3H)。
步骤4:N-(6-溴-2-甲氧基-5-硝基-吡啶-3-基)乙酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000074
室温下，向四口瓶中依次加入N-(6-溴-2-甲氧基吡啶-3-基)乙酰胺(6.80g，27.74mmol)、三氟乙酸酐(68ml)，降温至0℃以下，滴加发烟硝酸(2.00g，28.58mmol)，0.5h反应终止。反应液缓慢倒入冰水(500g)搅拌1h，析出灰白色沉淀，抽滤，滤饼干燥，得黄色固体7.60g，收率94％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)9.12(s,1H),4.06(s,3H),2.16(s,3H)。
步骤5:N-(6-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基-吡啶-3-基)乙酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000081
室温下，向四口瓶中依次加入N-(6-溴-2-甲氧基-5-硝基-吡啶-3-基)乙酰胺(5.60g，19.30mmol)、N,N,N’-三甲基乙二胺(2.96g，28.96mmol)，乙腈(168ml)，升温至80℃，1h反应终止。将反应液50℃减压蒸去溶剂，EA(70ml)打浆，抽滤，EA(20ml)洗涤，滤饼干燥，得黄色粉末5.40g，收率72％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)8.74(s,1H),4.03(s,3H),3.92(br,2H),3.41(t,J＝6.7Hz,2H),3.32(s,3H),2.84(d,J＝4.6Hz,6H),2.07(s,3H)。
步骤6:N2-(2-(二甲基氨基)乙基)-6-甲氧基-N2-甲基-3-硝基吡啶-2,5-二胺的合成
Figure BDA0002096183510000082
室温下，向四口瓶中依次加入N-(6-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基-吡啶-3-基)乙酰胺(3.60g，11.34mmol)、甲醇(90ml)、37％盐酸(2.22g，22.68mmol)，升温至60℃，3h反应终止。将反应液加5％NaHCO3中和至pH＝8～9，40℃减压蒸去溶剂，加水(30ml)，加DCM(100ml x3)萃取，合并有机相，浓缩，粗品柱层析，得棕黄色油状物0.70g，收率22％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.46(s,1H),4.73(br,2H),3.93(s,3H),3.59-3.54(m,2H),2.77(s,3H),2.52(s,2H),2.17(s,6H)。
步骤7：2-氯-5-氟-N-(萘-2-基)嘧啶-4-胺的合成
Figure BDA0002096183510000083
室温下，向四口瓶中依次加入2-氨基萘(2.00g，13.97mmol)、2,4-氯-5-氟嘧啶(4.70g，27.93mmol)、DMF(20ml)，氮气保护，降温至15-20℃，少量多次加入60％钠氢(1.70g，40.90mmol)，保温10℃，4h反应终止。将反应液缓慢倒入冰水(120ml)溶液中淬灭，加DCM(50ml)提取一次，有机层饱和食盐水洗涤，分出有机层，浓缩，粗品柱层析纯化(DCM)，得红棕色固体1.50g，收率39％。
步骤8：N2-(6-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基吡啶-3-基)-5-氟-N4-(萘-2-基)嘧啶-2,4-二胺)的合成
Figure BDA0002096183510000091
室温下，向四口瓶中依次加入N2-(2-(二甲基氨基)乙基)-6-甲氧基-N2-甲基-3-硝基吡啶-2,5-二胺(3.00g，11.14mmol)、2-氯-5-氟-N-(萘-2-基)嘧啶-4-胺(3.01g，11.14mmol)、Pd2(dba)3(0.80g，0.89mmol)、Xantphos(1.02g，1.78mmol)、K3PO4(5.84g，27.85mmol)和1,4-二氧六环(45ml)，氮气保护，升温至65℃，搅拌反应11h。将反应液冷却至室温，加入水(90ml)淬灭反应，加入DCM(100mL x3)萃取，合并有机相，加水(40ml)洗涤一次，有机相浓缩，粗品柱层析得红棕色油状物1.42g，收率25.49％。
步骤9：N2-(2-(二甲基氨基)乙基)-N5-(5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)-6-甲氧基-N2-甲基吡啶-2,3,5-三胺的合成
Figure BDA0002096183510000092
室温下，向四口瓶中依次加入N2-(6-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基吡啶-3-基)-5-氟-N4-(萘-2-基)嘧啶-2,4-二胺)(1.42g，28.03mmol)、铁粉(0.78g，140.16mmol)、氯化铵(0.75g，140.16mmol)和乙醇(28ml)、水(14ml)，氮气保护，升温至75℃，2h反应终止。反应液加硅藻土过滤，滤液浓缩，粗品柱层析得黄色固体0.65g，收率48.7％。
步骤10：N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-甲氧基吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000093
室温下，向四口瓶中依次加入N2-(2-(二甲基氨基)乙基)-N5-(5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)-6-甲氧基-N2-甲基吡啶-2,3,5-三胺(0.65g，1.36mmol)、TEA(0.41g，4.09mmol)、二氯甲烷(19.5mL)，氮气保护，降温至-30℃以下，滴加丙烯酰氯(0.13g，1.49mmol)的DCM溶液，1h反应终止。反应液加入5％NaHCO3(10ml)淬灭反应，加入DCM(20mlx2)萃取，合并有机相，浓缩，粗品柱层析得粉色固体0.053g，收率7.3％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.07(br,1H),9.45(br,1H),8.39(br,1H),8.23(s,1H),8.19(s,1H),8.06(d,J＝2.9Hz,1H),7.80(s,3H),7.71(d,J＝9.4Hz,1H),7.45(t,J＝8.2Hz,1H),7.36(m,1H),6.75(m,1H),6.18(m,1H),5.67(d,J＝10.6Hz,1H),3.84(s,3H),3.51(m,2H),2.83(s,3H),2.57(m,2H),2.34(s,6H)。MS(ESI)m/z:531.0[M+H]+。
实施例2
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000101
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.98(br,1H),9.45(br,1H),8.36(br,1H),8.32(s,1H),8.13(s,1H),8.06(s,1H),7.79(m,3H),7.59(d,J＝7.8Hz,1H),7.43(t,J＝7.3Hz,1H),7.39–7.34(m,1H),6.57(m,1H),6.21(d,J＝16.6Hz,1H),5.73(d,J＝11.1Hz,1H),4.87(q,J＝8.9Hz,2H),3.41(m,2H),2.86(s,3H),2.58(m,2H),2.35(s,6H)。MS(ESI)m/z:599.2[M+H]+。
实施例3
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-异丙基吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000102
N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-5-((5-氟-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-6-异丙基吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(br,1H),9.44(br,1H),8.39(br,1H),8.21(s,1H),8.08(d,J＝3.5Hz,1H),8.00(s,1H),7.77(m,3H),7.61(d,J＝7.8Hz,1H),7.39(m,2H),6.41(dd,J＝17.0,10.1Hz,1H),6.15(d,J＝17.0Hz,1H),5.69(d,J＝10.0Hz,1H),5.18(m,1H),3.17(m,2H),2.84(s,3H),2.47(m,2H),2.20(s,6H),1.21(d,J＝6.1Hz,6H)。MS(ESI)m/z:559.0[M+H]+。
实施例4
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-甲氧基吡啶吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000111
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-甲氧基吡啶吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.59(br,1H),10.20(br,1H),8.82(br,1H),8.42(s,1H),8.25(s,1H),8.12(d,J＝10.5Hz,1H),7.82(m,3H),7.72(d,J＝8.6Hz,1H),7.46(t,J＝7.2Hz,1H),7.37(t,J＝7.4Hz,1H),6.94(m,1H),6.18(d,J＝16.3Hz,1H),5.66(d,J＝9.9Hz,1H),3.83(s,3H),3.67(m,2H),2.78(s,3H),2.67(s,6H),2.49(m,2H)。MS(ESI)m/z:547.0[M+H]+。
实施例5
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000112
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-(2,2,2-三氟乙氧基)吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.82(br,1H),8.80(br,1H),8.49(br,1H),8.25(s,1H),8.09(s,1H),8.04(s,1H),7.75(m,3H),7.59(d,J＝7.3Hz,1H),7.40(m,2H),6.41(dd,J＝16.9,10.1Hz,1H),6.18(d,J＝16.7Hz,1H),5.72(d,J＝9.9Hz,1H),4.83(q,J＝8.9Hz,2H),3.22(m,2H),2.88(s,3H),2.47(m,2H),2.18(s,6H)。MS(ESI)m/z:615.0[M+H]+。
实施例6
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-异丙基吡啶-3-基)丙烯酰胺的合成
Figure BDA0002096183510000121
N-(5-((5-氯-4-(萘-2-基氨基)嘧啶-2-基)氨基)-2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-6-异丙基吡啶-3-基)丙烯酰胺的制备方法与实施例1类似。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.92(br,1H),8.86(br,1H),8.25(br,1H),8.13(m,3H),7.80(d,J＝13.6Hz,3H),7.66(d,J＝9.1Hz,1H),7.41(m,2H),6.64(m,1H),6.20(d,J＝16.8Hz,1H),5.71(d,J＝10.5Hz,1H),5.16(dt,J＝12.3,6.1Hz,1H),3.48(m,2H),2.78(s,3H),2.60(m,2H),2.30(m,6H),1.21(d,J＝6.0Hz,6H)。MS(ESI)m/z:575.0[M+H]+。
实施例7
化合物对激酶抑制活性测试
本试验采用γ-33p-ATP同位素测试法测试化合物对激酶EGFR(WT)、EGFR(T790M/L858R)、IGF1R的抑制作用，并得出化合物对该酶抑制活性的半数抑制浓度IC50，对照药AZD-9291参考专利WO2013014448A1中的方法制备。
1.基础反应缓冲液
20mM Hepes(pH 7.5),10mM MgCl2,1mM EGTA,0.02％Brij35,0.02mg/ml BSA,0.1mM Na3VO4,2mM DTT,1％DMSO。
2.化合物配制
化合物采用100％DMSO溶解至特定的浓度，之后采用自动加样装置梯度稀释成不同浓度的待测样品(DMSO溶解液)。
3.反应步骤
3.1使用基础反应缓冲液稀释反应底物；
3.2将激酶加入底物溶液中，轻柔混匀；
3.3采用自动加样***将100％DMSO稀释的不同浓度化合物加入激酶溶液中，室温下孵育20min；
3.4室温下加入33P-ATP(10μM,10μCi/μl)启动激酶反应，反应2h；
4.检测
反应液经离子交换过滤***除去未反应的ATP及反应产生的ADP等离子后检测底物中33P同位素放射量。
5.数据处理
依据放射量计算加入不同浓度抑制剂体系中的激酶活性从而得到不同浓度化合物对激酶活性的抑制作用，采用graphpad prism拟合得化合物抑制IC50。
本发明化合物的生物化学活性通过以上的试验进行测定，测得的酶活性IC50值参见表1：
表1激酶抑制活性测试结果
Figure BDA0002096183510000131
结论：本发明化合物与对照阳性药相比，有更好的EGFR(L858R/T790M)突变激酶抑制活性，部分化合物对比专利WO2016082713实施例41化合物(CCB120067)有显著的IGF1R激酶选择性优势，可防止脱靶产生血糖升高副作用。
实施例8
Hcc827细胞增殖抑制试验
本实验采用MTT的方法测试化合物对Hcc827的细胞活性作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC50。
1.Hcc827细胞株在RPMI-1640+10％FBS的条件下进行培养。在96孔细胞培养板中接种100μL的处于对数生长期的Hcc827细胞悬液，密度为5X 104/ml，将培养板于培养箱中培养24h令细胞贴壁(37℃，5％CO2)。
2.各化合物已事先溶解在DMSO中配制成10mM的储存液，采用DMSO梯度稀释为目标浓度的400倍，采用无血清培养基稀释到目的浓度的2倍，维持药液中DMSO浓度均为0.5％。在接种细胞的96孔板中依次加入不同浓度药液，100μL/孔。每个浓度设3个复孔，并设空白对照及阴性对照，继续在37℃、5％CO2中继续培养72h。
3.终止培养，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/ml)，继续在37℃、5％CO2中继续培养4h后弃除培养基，加入DMSO 150μL/孔，室温震荡10min，在490nM波长处测OD值，并经GraphpadPrism 6.0数据处理计算IC50值。
实施例9
NCI-H1975细胞增殖抑制试验
本实验采用MTT的方法测试化合物对NCI-H1975的细胞活性作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC50值。
1.NCI-H1975细胞株在RPMI-1640+10％FBS的条件下进行培养，在96孔细胞培养板中接种100μL的处于对数生长期的NCI-H1975细胞悬液，密度为5X 104/ml，将培养板于培养箱中培养24h令细胞贴壁(37℃，5％CO2)。
2.弃除96孔细胞培养板中含10％FBS的RPMI-1640培养基，换用含0.2％FBS的RPMI-1640培养基。各化合物已事先溶解在DMSO中配制成10mM的储存液，采用DMSO梯度稀释为目标浓度的400倍，采用无血清培养基将其稀释到目的浓度的2倍。在接种细胞的96孔板中依次加入不同浓度药液，100μL/孔。每个浓度设3个复孔，并设空白对照及阴性对照，继续在37℃、5％CO2中继续培养72h。
3.终止培养，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml)，继续在37℃、5％CO2中继续培养4h后弃除培养基，加入DMSO 150μL/孔，室温震荡10min，在490nM波长处测OD值，并经GraphpadPrism数据处理计算IC50值。
实施例10
A431细胞增殖抑制试验
本实验采用MTT的方法测试化合物对A431的细胞活性作用，并得出化合物抑制细胞增殖活性的半数抑制浓度IC50。
1.A431细胞株在DMEM+10％FBS的条件下进行培养。在96孔细胞培养板中接种100μL的处于对数生长期的A431细胞悬液，密度为5X104/ml，将培养板于培养箱中培养24h令细胞贴壁(37℃，5％CO2)。
2.各化合物已事先溶解在DMSO中配制成10mM的储存液，采用DMSO梯度稀释为目标浓度的400倍，采用无血清培养基稀释到目的浓度的2倍，维持药液中DMSO浓度均为0.5％。在接种细胞的96孔板中依次加入不同浓度药液，100μL/孔。每个浓度设3个复孔，并设空白对照及阴性对照，继续在37℃、5％CO2中继续培养72h。
3.终止培养，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml)，继续在37℃、5％CO2中继续培养4h后弃除培养基，加入DMSO 150μL/孔，室温震荡10min，在490nM波长处测OD值，并经GraphpadPrism 6.0数据处理计算IC50值。
本发明化合物生物化学活性通过以上的试验进行测定，测得的细胞抑制IC50值参见表2：
表2细胞抑制实验结果
Figure BDA0002096183510000151
结论：本发明化合物对照阳性药有更好的H1975(EGFR-T790M/L858R)细胞抑制活性，部分化合物对照阳性药有更好的相对突变株的选择性。

Claims (9)

1.式(I)所示的化合物，或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003663215240000011
其特征在于：
R1选自C1-C4烷基，任选进一步被一个或多个卤素所取代；
R2选自氢或卤素；
R3选自氢；
R4选自-NR7(CH2)mNR5R6；
R5、R6和R7各自独立选自氢或C1-C4烷基；
m为1，2，3或4。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于：
R1选自甲基、二氟甲基、三氟甲基、乙基、正丙基、异丙基或三氟乙基；
R2选自氢、F、Cl或Br；
R3选自氢；
R4为-NR7(CH2)mNR5R6；
R5、R6和R7各自独立选自氢、甲基或乙基；
m为2或3。
3.化合物，或其药学上可接受的盐，其特征在于，化合物选自如下结构：
Figure FDA0003663215240000012
Figure FDA0003663215240000021
4.一种药物组合物，其包含如权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐和可药用的载体。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物是胶囊剂、散剂、片剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、糖浆剂、口服液、吸入剂、软膏剂、栓剂或贴剂。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求4所述的药物组合物在制备用于预防或治疗单独或部分地由表皮生长因子受体EGFR激酶活性介导的疾病的治疗药物中的应用。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求4所述的药物组合物在制备用于预防或治疗癌症的药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌症选自卵巢癌、***、结肠直肠癌、乳腺癌、胰腺癌、胶质瘤、***癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、肝细胞癌、胃癌、胃肠道间质瘤、甲状腺癌、胆管癌、子宫内膜癌、肾癌、多发性骨髓瘤、黑色素瘤或间皮瘤。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述癌症选自胶质母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或急性髓细胞白血病。
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