CN108761091A

CN108761091A - 双抗夹心法快速检测hpv抗体的试纸条、试纸卡及其制备方法

Info

Publication number: CN108761091A
Application number: CN201810715149.6A
Authority: CN
Inventors: 秦湫红; 高湘; 肖志强; 李铮
Original assignee: Shaanxi Pharmaceutical Holding Medical Research Institute Co Ltd
Current assignee: Shaanxi Pharmaceutical Holding Medical Research Institute Co Ltd
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2018-11-06

Abstract

本发明公开了一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸条、试纸卡及其制备方法，试纸条(卡)包括沿着层析方向依次设置的样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，所述结合垫上设置有纳米颗粒标记物，分析膜上设置有检测带和质控线；所述纳米颗粒标记物选自胶体金或胶乳标记的抗人IgG的抗体，检测带包括HPV主要衣壳蛋白L1；或者，所述纳米颗粒标记物选自胶体金或胶乳标记的HPV主要衣壳蛋白L1，检测带包括抗人IgG的抗体。本发明中试纸条(卡)不仅使用方便、快捷，成本低廉，而且检测的准确性、安全性和灵敏性较高，对人体内的HPV16/18 L1 IgG抗体可以进行现场、快速检测，适合于医院、疾控、基层卫生单位检测及家庭自测，适于推广。

Description

双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸条、试纸卡及其制备方法

技术领域

本发明属于免疫分析检测领域，具体涉及一种基于胶体金免疫层析技术快速检测HPV抗体的方法以及检测试纸条(卡)。

背景技术

***是一种常见的妇科恶性肿瘤，在女性肿瘤的发病率位居第二，全世界每年的新发病例约为47万人，并导致30万人死亡，是仅次于乳腺癌的女性死亡重要原因。***的发病病因与多种因素有关，其中以人类***瘤状病毒(human papillomavirus,HPV)的感染为最重要的因素，据报道99.8％的***合并HPV感染，而HPV阴性者几乎不发生***。目前对HPV感染尚无有效的治疗措施，预防HPV感染及对已感染人群进行定期检测是目前***的主要治疗方式。

HPV属***状病毒科，是一种噬黏膜和皮肤的双链闭合环状DNA病毒。到目前为止，已报道发现的HPV有120多种，其中与人类生殖道感染有关的约40多种，根据其致癌性分为高危型(致癌型)HPV、可能致癌性和低危型HPV，高危型HPV中以HPV16、HPV18、HPV31、HPV33型与***的发病关系最为密切，尤其以HPV16、HPV18最为常见。据报道，在***中这两种类型的HPV的检出率达70％以上。HPV16型多见于宫颈鳞癌，而HPV18型多见于***，而低危型HPV多在湿疣等良性病变中发现。

高危型HPV感染通常是没有症状的，持续感染HPV的妇女，患***的风险更高。定期检测高危型HPV对于预防***至关重要，但因缺少高灵敏度和特异性的HPV诊断试剂，目前对HPV的检测多集中于在医院进行组织病理学或HPV病毒的DNA检测。

HPV基因组编码的10个开放读码框架分别为E1～E8及L1～L2，其中HPV L1为主要衣壳蛋白。HPV L1是HPV病毒入侵细胞前便暴露于机体免疫***的抗原，相比于其他病毒蛋白更容易被免疫***识别和清除，是目前研究开发HPV疫苗的主要靶向抗原。有研究报道了HPV6L1IgG抗体在***患者外周血中的检测，但其仅仅涉及酶联免疫吸附法。

目前还未有检测人体高危型HPV L1IgG抗体的报道，也未见到以免疫层析技术为基础的双抗夹心法检测高危型HPV L1IgG抗体的试纸条(卡)。试纸条(卡)在识别并捕获样本中检测目标(高危型HPV L1IgG抗体)后还需要检测带以及质控线上的特异性包被蛋白对检测结果给予显示和验证，从而实现快速、准确检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸条、试纸卡及其制备方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸，该试纸包括沿层析方向依次设置的样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，所述结合垫上设置有纳米颗粒标记物，分析膜上设置有检测带和质控线；所述纳米颗粒标记物选自胶体金或胶乳标记的抗人IgG的抗体，检测带包括HPV主要衣壳蛋白L1，质控线包括与抗人IgG抗体结合的抗体，HPV主要衣壳蛋白L1是将人***细胞株Hela的HPV16或HPV18主要衣壳蛋白L1基因经原核表达***表达而得到的；或者，所述纳米颗粒标记物选自胶体金或胶乳标记的HPV主要衣壳蛋白L1，检测带包括抗人IgG的抗体，质控线包括抗HPV主要衣壳蛋白L1的抗体，胶体金或胶乳标记的HPV主要衣壳蛋白L1是将人***细胞株Hela的HPV16或HPV18主要衣壳蛋白L1基因经原核表达***表达后进行胶体金或胶乳标记而得到的。

优选的，所述抗HPV主要衣壳蛋白L1的抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源HPV主要衣壳蛋白L1的多克隆抗体中的一种或多种。

优选的，所述抗人IgG的抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源抗人IgG的多克隆抗体中的一种或多种，可以进行胶体金或胶乳标记。

优选的，所述与抗人IgG抗体结合的抗体是指可以与抗人IgG的抗体形成免疫复合物的抗体，例如，若抗人IgG抗体选用的是鼠抗人IgG抗体，那么与该抗人IgG抗体结合的抗体是兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源抗鼠IgG抗体。

一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸条(卡)，包括上述试纸以及用于固定支撑该试纸的基底。

优选的，所述基底选自PVC板或卡壳，所述样品垫选自玻璃纤维膜或聚脂膜。

上述双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：结合垫的制备

1.1)胶体金或胶乳标记蛋白(纳米颗粒标记物)的制备

将胶体金溶液或胶乳的pH调节至5.5～7.0后与结合蛋白混合并反应10～30分钟，然后加入BSA，并依次经混匀、静置以及离心，得标记蛋白，所述结合蛋白选自抗人IgG的抗体或HPV主要衣壳蛋白L1，HPV主要衣壳蛋白L1是将人***细胞株Hela的HPV16或HPV18主要衣壳蛋白L1基因经原核表达***表达而得到的；

1.2)将步骤1.1)制备的标记蛋白分散稀释后涂敷在玻璃纤维膜或聚脂膜上，然后干燥，备用；

步骤2：分析膜的制备

2.1)检测带(T线)制备

根据所述结合垫上的标记蛋白，选择检测带的包被蛋白：若结合垫上的标记蛋白含有抗人IgG的抗体，则检测带的包被蛋白为HPV主要衣壳蛋白L1；若结合垫上的标记蛋白含有HPV主要衣壳蛋白L1，则检测带的包被蛋白为抗人IgG的抗体；将选择的包被蛋白固定在硝酸纤维素膜上；

2.2)质控线(C线)制备

根据所述结合垫上的标记蛋白，选择质控线的包被蛋白：若结合垫上的标记蛋白含有抗人IgG的抗体，则质控线的包被蛋白为对应的与抗人IgG抗体结合的抗体；若结合垫上的标记蛋白含有HPV主要衣壳蛋白L1，则质控线的包被蛋白为抗HPV主要衣壳蛋白L1的抗体；将选择的包被蛋白固定在所述硝酸纤维素膜上。

优选的，所述步骤1中，胶体金溶液的用量为10mL，抗人IgG的抗体或HPV主要衣壳蛋白L1的用量为50～100μg；涂敷控制在0.1～0.5mL/cm²，干燥的条件为：37～40℃下18～24小时。

优选的，所述步骤2中，将针对检测带和质控线选择的包被蛋白分别按照1～4mg/mL稀释后涂敷在硝酸纤维素膜，然后经固化处理，得到检测带和质控线。

上述双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸条(卡)的制备方法，包括以下步骤：

根据上述试纸沿层析方向依次设置样品垫、结合垫、分析膜和吸水垫，把样品垫、吸水垫以及上述步骤1～2所制得的结合垫和分析膜，依次安装在底板(PVC板)上，然后根据试纸条的规格分割，得试纸条；或者，先把样品垫、吸水垫以及步骤1～2所制得的结合垫和分析膜，根据试纸卡的规格切割成一定的长度和宽度，然后依次安装在卡壳里，得试纸卡。

本发明的有益效果体现在：

本发明将免疫层析和双抗原夹心法应用于HPV抗体的检测试纸，以抗人IgG的抗体和HPV主要衣壳蛋白L1(HPV L1)为双抗原，利用其中一个抗原(经过纳米颗粒标记)在结合垫处捕获样品中的HPV L1IgG抗体，利用另一个抗原于检测带处对捕获的HPV抗体进行固定(显色)，从而完成对高危型HPV L1IgG抗体的检测。同时，本发明不仅避免了使用同一结合位点的抗原抗体结合反应完成捕获和显色，而且通过对人***细胞株Hela的HPV L1基因利用原核表达***进行表达，表达的HVP L1具有较高的免疫原性，且解决了高危型(HPV16、18)HVP主要衣壳蛋白L1容易发生非特异性结合的问题，提高了检测灵敏度和准确性。另外，本发明所使用的HPV L1是HPV主要的种特异性蛋白，且不含有完整的病毒入侵及复制的组分，不具有致病性。因此，本发明提供的试纸条、试纸卡不仅使用方便、快捷，成本低廉，而且检测的准确性、安全性和灵敏性较高，对人体产生的HPV(HPV16、18)L1IgG抗体可以进行现场、快速检测，适合于医院、疾控、基层卫生单位检测及家庭自测，适于推广。

附图说明

图1为快速检测HPV抗体的试纸条(卡)的结构示意图；图中：1为PVC板，2为检测带，3为质控线，4为吸水垫，5为NC膜，6为金标垫，7为样品垫。

图2为扩增电泳图谱。

图3为重组蛋白电泳图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

(一)HPV L1蛋白及其抗体制备

(1)HPV L1蛋白制备：利用基因克隆技术分别构建HPV16L1全基因及HPV18L1全基因于表达载体中，并利用大肠杆菌进行表达

1.1、扩增引物

根据HPV16L1基因参考序列(Gene ID:1489082)及HPV18L1基因参考序列(GeneID:1489090)，设计HPV L1基因特异引物，用PCR方法扩增HPV16L1及HPV18L1基因(序列设计完成时间为2016年5月，含限制内切酶识别位点)：

HPV16L1正向引物-SphI：5`-CATGCATGC CAGGTGACTTTTATTTACATC-3`

HPV16L1反向引物-SacI：5`-CGAGCTC CAGCTTACGTTTTTTGCGTTT-3`

HPV18L1正向引物-SphI：5`-CATGCATGC GCTTTGTGGCGGCCTAGT-3`

HPV18L1反向引物-SacI：5`-CGAGCTC CTTTCTGGCACGTACACGC-3`

1.2、模板和扩增

以提取的人***细胞株Hela(2016年8月获取自中国典型培养物保藏中心)细胞总DNA为模板，使用上述特异引物进行HPV16L1及HPV18L1基因扩增。

PCR扩增体系为：10×Taq Buffer 5μL，Taq酶0.25μL，dNTP Mixture 4μL，DNA模板2.5ng，正向引物(25μm)1μL，反向引物(25μm)1μL，灭菌蒸馏水补至50μL。

反应条件为：95℃30s，57℃30s，72℃1min 40s，循环30次；72℃10min，循环1次。PCR扩增产物约为1500bp，如图2所示，与NCBI数据库HPV16L1基因、HPV18L1基因大小一致。

1.3、重组质粒构建

将PCR扩增基因以及pQE80L质粒(北京华越洋生物)分别进行SphI以及SacI双酶切，酶切条件如下：

PCR扩增产物300ng或pQE80L质粒100ng，10×K buffer 5μL，SphI 2μL，SacI 2μL，灭菌蒸馏水补至50μL，于37℃反应8小时。

将酶切产物回收后进行连接，连接体系和条件为：10×Ligase buffer 1μL，T4DNALigase 0.5μL(350U/μL)，酶切扩增产物7.5μL，酶切pQE80L质粒1μL，于16℃反应8小时。重组质粒大小为6.2kb。

1.4、HPV L1蛋白表达和分离纯化

1.4.1、将重组质粒在原核表达***BL21中表达

将重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21(北京华越洋生物)，转化过程为：于离心管中将连接产物与50μL BL21感受态菌株混合后，冰上放置30min，42℃水浴热激45s后迅速放置于冰上，2min后向离心管中加入700μL不含抗生素(氨苄青霉素)的无菌LB培养基，混匀后37℃培养60min，5000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上，筛选阳性克隆，鉴定。

将转化成功的大肠杆菌菌株BL21在LB液体培养基中，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导表达8h。

1.4.2、用亲和层析纯化HPV16L1蛋白、HPV18L1蛋白

将诱导表达HPV16L1或HPV18L1的BL21菌体经超声波裂解以及离心。将上清液上镍柱(QIAGEN Ni-NTA Spin Kit)，经试剂盒中的漂洗液漂洗后，用洗脱液洗脱，收集表达蛋白，经SDS-PAGE分析确定纯化蛋白的大小，最终以大肠杆菌表达***表达以及亲和层析纯化技术分别获取得到带有His标签的重组HPV16L1蛋白及重组HPV18L1蛋白，约为50KD，如图3所示，与NCBI数据库蛋白信息相符。

(2)HPV L1抗体制备

将浓度为0.5～2mg/mL的重组HPV16L1蛋白及重组HPV18L1蛋白分别与弗氏免疫佐剂按照体积比1:1混合并免疫BALB/c小鼠，每只小鼠免疫的重组HPV16L1蛋白或重组HPV18L1蛋白量为100μg，在初次免疫后的第14及28天以同样的计量加强免疫两次，在初次免疫后的第35天采集小鼠血清，利用ProteinG亲和纯化制备HPV16L1及HPV18L1蛋白的多克隆抗体。亲和纯化过程为：将血清用结合缓冲液(20mM磷酸纳，pH7.0)上柱于ProteinG柱(Invitrogen Protein G)中，结合缓冲液漂洗后，用洗脱液(100mM甘氨酸，pH2.7)洗脱，洗脱液立即用中和缓冲液(1M Tris-HCl，pH9.0)将收集到的多克隆抗体(HPV16L1或HPV18L1多克隆抗体)中和至中性。

(二)HPV L1抗体滴度检测

1)先用重组HPV16L1蛋白及重组HPV18L1蛋白分别以1μg的量包被酶联免疫96孔板，包被板在4℃孵育过夜。

2)用含0.05％的Tween-20的PBST洗涤缓冲液(PBS中添加Tween20)洗涤各孔6次，每孔加入封闭液(含5％脱脂奶粉的PBST溶液)100μL封闭2小时。

3)每孔加入100μL用PBST溶液稀释200倍的多克隆抗体样品，于37℃反应1小时，然后用PBST溶液洗涤各孔4次，每次5分钟。

4)每孔加入100μL辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠IgG抗体，37℃反应1小时，然后用PBST溶液洗涤各孔6次，以除去未结合的酶标抗体。

5)每孔加入100μL TMB显色液，室温进行显色反应半小时。

6)每孔加入50μL的反应终止液(2M硫酸溶液)终止显色反应，5分钟后用酶标仪测定450nm波长处的吸收值，并记录结果。

共测定了6只经过免疫的小鼠和一只未经免疫的阴性对照小鼠的血清抗体，其中3只被重组HPV16L1蛋白免疫小鼠的血清抗体在450nm波长处的吸收值分别为0.726、1.258及0.915，3只被重组HPV18L1蛋白免疫小鼠的血清抗体在450nm波长处的吸收值分别为0.612、0.834及0.793，而阴性对照小鼠血清抗体在450nm波长处的吸收值为0.049。由此判断，由重组HPV L1蛋白免疫小鼠能激活小鼠的免疫***，并产生相应的HPV16L1及HPV18L1蛋白的特异性抗体，具有较高的免疫原性和结合特异性。

(三)抗人IgG的抗体

例如，可购买羊抗人IgG抗体(中杉金桥)。

(四)快速检测HPV抗体试纸条(卡)的制备

1)胶体金制备：将氯金酸(HAuCl₄)配成质量分数1％的氯金酸溶液，取1mL氯金酸溶液加入99mL去离子水中，加热至沸腾后立即加入2mL质量分数1％的枸掾酸钠溶液，迅速搅拌均匀，继续加热沸腾10分钟，冷却至室温，补充去离子水至100mL，得胶体金溶液。

2)胶体金标记物的制备：取10mL制备好的胶体金溶液，用0.1M的碳酸钾溶液将pH值调节到5.5～7.0，加入抗人IgG抗体或HPV L1蛋白(重组HPV16L1蛋白或重组HPV18L1蛋白)50～100μg，混匀，室温反应10～30分钟，然后加入BSA至终浓度(质量分数)0.5～1％，混匀，静置5～10分钟，4℃、2000rpm离心20分钟，弃去沉淀。上清液于4℃、12000rpm离心60分钟，弃去上清，沉淀溶于1mL的PBS(内含质量分数0.2％BSA)中，得胶体金标记物。

3)金标垫(即铺有胶体金标记物的结合垫)的制备：取胶体金标记物以PBS(内含质量分数0.2％BSA)稀释1～2倍，利用喷涂仪均匀的喷涂在玻璃纤维膜上，喷涂量为0.1～0.5mL/cm²，30％的湿度以下，37～40℃干燥18～24小时，得到金标垫6。将金标垫6用锡箔袋密封，内装干燥剂，常温保存。打开和使用应在30％的湿度以下。

4)检测带与质控线的包被：

A1、将HPV L1蛋白(重组HPV16L1蛋白或重组HPV18L1蛋白)用PBS稀释至浓度为1～4mg/mL，在硝酸纤维素膜(NC膜5)上划线(或喷于NC膜5上)，作为检测带。在离检测带6毫米处，用1～4mg/mL的与抗人IgG抗体结合的抗体再划一条线(或喷于NC膜上)，作为质控线。使检测带2和质控线3固化在NC膜上。

A2、将抗人IgG抗体用PBS稀释至浓度为1～4mg/mL，在硝酸纤维素膜(NC膜5)上划线(或喷于NC膜5上)，作为检测带。在离检测带6毫米处，用1～4mg/mL的HPV L1蛋白多克隆抗体再划一条线(或喷于NC膜5上)作为质控线。使检测带2和质控线3固化在NC膜上。

B、固化：待NC膜干燥后，浸泡于含1％BSA的pH7.2的PBS中进行封闭(4℃，1小时)。然后取出NC膜用PBS洗涤3次，悬挂，于室温干燥3小时以上，再放于30℃通风干燥箱内通风干燥1小时。

5)试纸条(卡)的组装：

试纸条(卡)主要包括由样品垫7、经以上步骤得到的金标垫6、NC膜5(固化有检测带2和质控线3)及吸水垫4构成的试纸以及固定支撑试纸的基底。

其中，基底采用PVC板1(试纸条)或卡壳(试纸卡)；吸水垫4可采用吸水滤纸，吸收检测样品中多余液体；样品垫7可以采用玻璃纤维膜，接触待检测样品。

以试纸条为例，具体结构参见图1：

(1)A1类试纸条：在PVC板1上，沿着层析方向依次布置试纸的各个部分，其中，在下游端为吸水垫4，上游端为样品垫7，中段以固化有检测带2(含有重组HPV16L1蛋白或重组HPV18L1蛋白)和质控线3(含有与抗人IgG抗体结合的抗体)的NC膜5作为检测反应和分析区，在NC膜5与样品垫7之间放置吸附有胶体金标记的抗人IgG抗体的金标垫6。

(2)A2类试纸条：在PVC板1上，沿着层析方向依次布置试纸的各个部分，其中，在下游端为吸水垫4，上游端为样品垫7，中段以固化有检测带2(含有抗人IgG抗体)和质控线3(含有HPV16L1或HPV18L1多克隆抗体)的NC膜5作为检测反应和分析区，在NC膜5与样品垫7之间放置吸附有胶体金标记的重组HPV16L1蛋白或重组HPV18L1蛋白的金标垫6。

(3)试纸贴附于PVC板1上，裁切成4mm宽的条形带；其中，先将NC膜5贴附在PVC板1上，然后将吸水垫4和金标垫6贴附在PVC板1上，并且与NC膜5两端分别部分重叠，最后将样品垫7贴附在PVC板1上，并且与金标垫6部分重叠。试纸条密封干燥保存，备用。

(五)HPV L1IgG抗体检测

(1)利用上述试纸条对待检样品进行检测

1.1)样本处理：取血清、血浆或全血样本，用加样缓冲液稀释0～100倍，加样缓冲液为水、质量分数0.9％氯化钠溶液、0.05～0.3M磷酸盐缓冲液或0.05～0.2M硼酸盐缓冲液；

1.2)将经过上述处理的血清、血浆或全血样本50～100μL加到试纸条的样品垫7上，静置5～20分钟，观察检测带2和质控线3颜色；

1.3)结果判读：检测带2和质控线3均显色为阳性；检测带2不显色而质控线3显色，结果为阴性；检测带2和质控线3均不显色或其他现象，提示试纸条失效。

(2)检测原理

当把待检测样品加样到样品垫7上后，样品中的HPV L1IgG抗体与结合垫上的抗人IgG的抗体或HPV L1抗原形成免疫复合物，由于毛细管效应，该复合物向吸水垫4方向泳动，此复合物与包被在检测带2上的HPV L1抗原或抗人IgG的抗体发生免疫结合反应，形成金标抗人IgG抗体-HPV L1IgG抗体-HPV L1抗原或金标HPV L1抗原-HPV L1IgG抗体-抗人IgG抗体三联体复合物而被截留在检测带2上，逐渐富集形成较深的***条带；由于毛细作用继续向前泳动，胶体金标记抗人IgG抗体或胶体金标记HPV L1抗原与包被在质控线3上的与抗人IgG抗体结合的抗体或HPV L1多克隆抗体发生特异性的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线3上形成较深的***条带，多余的未结合的物质继续层析到吸水垫4上，因此在检测带2和质控线3都出现显色的条带被判断为阳性结果(样品中存在HPV L1IgG抗体)；若待检测样品中不含有HPV L1IgG抗体，胶体金标记的抗人IgG的抗体或HPV L1抗原不与检测带2上的HPV L1抗原或抗人IgG的抗体发生免疫结合反应，所以在检测带2上不会出现显色条带，而胶体金标记的抗人IgG的抗体或HPV L1抗原继续向前泳动，与包被在质控线3上的与抗人IgG抗体结合的抗体或HPV L1多克隆抗体发生特异性的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线3上，因此仅在质控线3上出现显色条带判断为阴性结果(样品中不存在HPV L1IgG抗体)。

(3)样品采集举例

3.1、血清样本：取全血1～5mL于血清采集管中，静置1～2小时，3000～5000rpm离心10～30分钟，取上清即得。

3.2、血浆样本：取全血1～5mL于枸橼酸钠或肝素钠抗凝管中，1000～3000rpm离心10～30分钟，取上清即得。

3.3、全血标本：取指尖或耳垂新鲜血约50～100μL，即得。

(4)实验发现，对于经过HPV DNA检测呈阳性的样品，均可以通过上述试纸条得到相应的HPV L1IgG抗体呈阳性的检测结果，可靠性和灵敏性较高。

总之，本发明提供了一种可现场快速检测HPV抗体的试纸条(卡)，使用方便、快捷、高效，准确，检测结果容易观察区别，可用于判断感染HPV病毒的情况，为***的筛查和治疗提供快速的辅助诊断，可用于HPV导致的***高危人群的自我诊断、预防，同时也可用于HPV感染者或疫苗接种者的及时、在线治疗效果评价、病情检测及预后判断，适合家庭自检及临床快速诊断和基层流行病学调查大规模应用。

序列表

<110> 陕西医药控股医药研究院有限公司

<120> 双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸条、试纸卡及其制备方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 1

catgcatgcc aggtgacttt tatttacatc 30

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 2

cgagctccag cttacgtttt ttgcgttt 28

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 3

catgcatgcg ctttgtggcg gcctagt 27

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成()

<400> 4

cgagctcctt tctggcacgt acacgc 26

Claims

1.一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸，其特征在于：该试纸包括沿层析方向依次设置的样品垫(7)、结合垫、分析膜和吸水垫(4)，所述结合垫上设置有纳米颗粒标记物，分析膜上设置有检测带(2)和质控线(3)；所述纳米颗粒标记物选自胶体金或胶乳标记的抗人IgG的抗体，检测带(2)包括HPV主要衣壳蛋白L1，质控线(3)包括与抗人IgG抗体结合的抗体，HPV主要衣壳蛋白L1是将人***细胞株Hela的HPV16或HPV18主要衣壳蛋白L1基因经原核表达***表达而得到的；或者，所述纳米颗粒标记物选自胶体金或胶乳标记的HPV主要衣壳蛋白L1，检测带(2)包括抗人IgG的抗体，质控线(3)包括抗HPV主要衣壳蛋白L1的抗体，胶体金或胶乳标记的HPV主要衣壳蛋白L1是将人***细胞株Hela的HPV16或HPV18主要衣壳蛋白L1基因经原核表达***表达后进行胶体金或胶乳标记而得到的。

2.根据权利要求1所述一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸，其特征在于：所述抗HPV主要衣壳蛋白L1的抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源HPV主要衣壳蛋白L1的多克隆抗体中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸，其特征在于：所述抗人IgG的抗体为鼠源、兔源、羊源、马源、骆驼源或豚鼠源抗人IgG的多克隆抗体中的一种或多种，所述胶体金或胶乳标记的抗人IgG的抗体是该抗人IgG的多克隆抗体进行胶体金或胶乳标记而得到的。

4.根据权利要求1所述一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸，其特征在于：所述与抗人IgG抗体结合的抗体是指可以与抗人IgG的抗体形成免疫复合物的抗体。

5.一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸条或试纸卡，其特征在于：包括试纸以及用于固定支撑该试纸的基底，所述试纸包括沿层析方向依次设置的样品垫(7)、结合垫、分析膜和吸水垫(4)，所述结合垫上设置有纳米颗粒标记物，分析膜上设置有检测带(2)和质控线(3)；所述纳米颗粒标记物选自胶体金或胶乳标记的抗人IgG的抗体，检测带(2)包括HPV主要衣壳蛋白L1，质控线(3)包括与抗人IgG抗体结合的抗体，HPV主要衣壳蛋白L1是将人***细胞株Hela的HPV16或HPV18主要衣壳蛋白L1基因经原核表达***表达而得到的；或者，所述纳米颗粒标记物选自胶体金或胶乳标记的HPV主要衣壳蛋白L1，检测带(2)包括抗人IgG的抗体，质控线(3)包括抗HPV主要衣壳蛋白L1的抗体，胶体金或胶乳标记的HPV主要衣壳蛋白L1是将人***细胞株Hela的HPV16或HPV18主要衣壳蛋白L1基因经原核表达***表达后进行胶体金或胶乳标记而得到的。

6.根据权利要求5所述一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸条或试纸卡，其特征在于：所述基底选自PVC板(1)或卡壳，所述样品垫(7)选自玻璃纤维膜或聚脂膜。

7.一种如权利要求1所述的双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：结合垫的制备

1.1)纳米颗粒标记物的制备

将胶体金溶液或胶乳的pH调节至5.5～7.0后与结合蛋白混合并反应10～30分钟，然后加入BSA，并依次经混匀、静置以及离心，得纳米颗粒标记物，所述结合蛋白选自抗人IgG的抗体或HPV主要衣壳蛋白L1，HPV主要衣壳蛋白L1是将人***细胞株Hela的HPV16或HPV18主要衣壳蛋白L1基因经原核表达***表达而得到的；

1.2)将步骤1.1)制备的纳米颗粒标记物分散稀释后涂敷在玻璃纤维膜或聚脂膜上，然后干燥；

步骤2：分析膜的制备

2.1)检测带制备

根据所述结合垫上的纳米颗粒标记物，选择检测带(2)的包被蛋白：若结合垫上的纳米颗粒标记物含有抗人IgG的抗体，则检测带(2)的包被蛋白为HPV主要衣壳蛋白L1；若结合垫上的纳米颗粒标记物含有HPV主要衣壳蛋白L1，则检测带(2)的包被蛋白为抗人IgG的抗体；将选择的包被蛋白固定在硝酸纤维素膜上；

2.2)质控线制备

根据所述结合垫上的纳米颗粒标记物，选择质控线(3)的包被蛋白：若结合垫上的纳米颗粒标记物含有抗人IgG的抗体，则质控线(3)的包被蛋白为对应的与抗人IgG抗体结合的抗体；若结合垫上的纳米颗粒标记物含有HPV主要衣壳蛋白L1，则质控线(3)的包被蛋白为抗HPV主要衣壳蛋白L1的抗体；将选择的包被蛋白固定在所述硝酸纤维素膜上。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1中，胶体金溶液的用量为10mL，抗人IgG的抗体或HPV主要衣壳蛋白L1的用量为50～100μg；涂敷控制在0.1～0.5mL/cm²，干燥的条件为：37～40℃、18～24小时。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述步骤2中，将针对检测带(2)和质控线(3)选择的包被蛋白分别按照1～4mg/mL稀释后涂敷在硝酸纤维素膜，然后经固化处理，得到检测带(2)和质控线(3)。

10.一种双抗夹心法快速检测HPV抗体的试纸条或试纸卡的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1：结合垫的制备

1.1)纳米颗粒标记物的制备

步骤2：分析膜的制备

2.1)检测带制备

2.2)质控线制备

根据所述结合垫上的纳米颗粒标记物，选择质控线(3)的包被蛋白：若结合垫上的纳米颗粒标记物含有抗人IgG的抗体，则质控线(3)的包被蛋白为对应的与抗人IgG抗体结合的抗体；若结合垫上的纳米颗粒标记物含有HPV主要衣壳蛋白L1，则质控线(3)的包被蛋白为抗HPV主要衣壳蛋白L1的抗体；将选择的包被蛋白固定在所述硝酸纤维素膜上；

步骤3：将样品垫(7)、上述步骤1～2所制得的结合垫和分析膜及吸水垫(4)，依次安装在底板上，然后根据试纸条的规格分割，得试纸条；或者，先将样品垫(7)、上述步骤1～2所制得的结合垫和分析膜及吸水垫(4)，根据试纸卡的规格切割成一定的长度和宽度，然后依次安装在卡壳里，得试纸卡。