CN111239410A - 检测肝癌、肝炎和/或肝硬化的试剂盒及在akr1b10和afp联合定量测定中应用 - Google Patents

检测肝癌、肝炎和/或肝硬化的试剂盒及在akr1b10和afp联合定量测定中应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，公开了一种用时间分辨荧光免疫分析法同时检测醛酮还原酶1B10和甲胎蛋白含量的测定试剂盒，可用于肝癌、肝炎、肝硬化等疾病的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。所述试剂盒包括：酶标板、校准品、铕标记AKR1B10检测抗体、铽标记AFP检测抗体和增强液。待测血清中AKR1B10和AFP分别与酶标板的AKR1B10和AFP包被抗体结合，再加入两种检测抗体，形成双抗体夹心复合物，加入增强液解离复合物上的铕离子和铽离子，分别在340nm和295nm波长发出高强度荧光。其荧光强度与样本中的AKR1B10和AFP浓度成正比。采用本试剂盒可以同时检测两种标志物的含量，极大的提升了检测的灵敏度和特异性。

Description

检测肝癌、肝炎和/或肝硬化的试剂盒及在AKR1B10和AFP联合 定量测定中应用
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，具体地说，涉及了一种用时间分辨荧光免疫分析法共同检测醛酮还原酶1B10（AKR1B10）和甲胎蛋白（AFP）含量的试剂盒，其可用于肝癌、肝炎、肝硬化和其他肝脏疾病的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
背景技术
甲胎蛋白（α-fetoprotein, αFP或AFP）是一种相对分子质量约68kDa的癌胚糖蛋白，由胎儿肝脏和卵黄囊合成。成人中，AFP由肝细胞产生，其血清中含量极微，但当肝细胞发生癌变时，却又恢复了产生AFP的功能，而且随着病情的恶化，AFP在血清中的含量会急剧增加。检测血清AFP水平对早期诊断原发性肝癌具有极高的临床价值，所以AFP长期升高被视为原发性肝癌的特异性指标。然而并非所有肝癌患者的肝细胞都分泌AFP，仍有30%~40%左右的患者AFP呈阴性或低浓度，具有明显的局限性。因而早期诊断还需要其他肝癌辅助诊断手段。
醛酮还原酶1B10（Aldo-keto Reductase 1B10，AKR1B10）基因定位在染色体7q33，编码一个由316个氨基酸组成的蛋白，即AKR1B10蛋白，分子量为36.02kDa。AKR1B10蛋白可由溶酶体介导的非经典分泌途径，从肿瘤细胞中分泌进入血液循环。其功能主要为保护细胞免于羧基毒性损伤；以及稳定乙酰辅酶A羧化酶α（ACCα）阻止ACCα降解，从而调节脂肪酸与脂质合成，促进肿瘤细胞的生长增殖和迁移。相关研究表明，AKR1B10在人类原发性肝癌组织中高表达，是一种新型的肝癌血清标志物。
近期发表于Hepatology（2019, 69(6):2489-2501. doi: 10.1002/hep.30519.Epub 2019 Apr 6）的文章报导，从三家医院入组1244名受试者，包括肝癌患者（HCC）、健康对照者（HC）和肝脏良性肿瘤患者（BLT）、慢性乙型肝炎患者（CHB）和肝硬化患者（LC），分成探索性发现队列（203名）、训练队列（519名）和验证队列（522名）。从三个队列比较分析了AKR1B10和AFP蛋白的检测情况，结果显示：AKR1B10的检测灵敏度为72.7%，AFP的灵敏度为65.1%，而当两种指标共同检测，其灵敏度可以达到87.5%。有522名参与者的验证队列证实了这一结果。因此，联合AKR1B10和AFP能提高对HCC的检出率和准确性，具有更加广阔的临床诊断价值。
发明内容
针对上述问题，本发明人开发了一种检测肿瘤特异性标志物醛酮还原酶1B10（AKR1B10）和甲胎蛋白（AFP）联合测定试剂盒（时间分辨免疫荧光分析法）。该试剂盒将铕离子（Eu3+）和铽离子（Tb3+）分别藕联于AKR1B10抗体和AFP抗体，通过利用两种离子的不同激发光波长，在同一反应中同时检测AKR1B10和AFP两种不同蛋白。本试剂盒可用于受试者血清、尿液、乳汁、肠液、大便或组织样本中的AKR1B10和AFP蛋白的检测，采用本试剂盒可以同时检测两种标志物含量，极大的提升了检测的灵敏度和特异性。
具体而言，本发明涉及如下内容：
本发明提供一种用于检测肝癌、肝炎和/或肝硬化的试剂盒，其特征在于，其包括铕标记的醛酮还原酶1B10检测抗体和铽标记的甲胎蛋白检测抗体。
进一步地，还包括增强液，其包含中β-NTA和TOPO，更优选地，所述增强液是25μmol/L β-NTA，50μmol/L TOPO，0.1% Triton X-100，0.5%无水醋酸，0.1%邻苯二甲酸氢钾，pH 3.0~4.0。
还进一步地，还包括醛酮还原酶1B10抗原、甲胎蛋白抗原的标准品，优选地，所述抗原以一定浓度溶解于样品缓冲液中配置而成，具体如醛酮还原酶抗原浓度分别为0、375、750、1500、3000、6000pg/mL，甲胎蛋白抗原浓度分别为0、5、10、50、200、650ng/mL，缓冲液为10mmol/L Tris•HCl（pH7.5±0.1），1% BSA，0.05%Tween 20，0.05% Proclin300。
再进一步地，还包括清洗液，例如Tris-HCl、氯化钠、Tween20和Proclin300或它们的混合溶液，在该试剂盒中以浓缩清洗液的形式存在，检测时适当稀释后使用。优选的清洗液的配制方法是：50mM Tris•HCl（PH7.5±0.1），21%氯化钠，2.5% Tween20，充分混匀后2~8℃保存，使用前稀释25倍。
优选地，所述铕标记的醛酮还原酶1B10检测抗体为多克隆抗体或单克隆抗体， 优选为鼠抗单克隆抗；所述铽标记的甲胎蛋白检测抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，优选为鼠抗单克隆抗体。
在一个实施方式中，所述兔抗醛酮还原酶1B10多克隆抗体和识别另一抗原位点的鼠抗甲胎蛋白单克隆抗体包被在微孔板中。
在一个优选方式中，所述醛酮还原酶1B10检测抗体是将鼠抗醛酮还原酶1B10单克隆抗体与铕离子藕联制备而成；所述甲胎蛋白检测抗体是将鼠抗甲胎蛋白单克隆抗体与铽离子藕联制备而成。
优选地，所述试剂盒还包括：样品稀释液：10mmol/L Tris•HCl（pH7.5±0.1），1%BSA，0.05%Tween 20，0.05% Proclin300。以及稀释25倍的下述浓缩清洗液：50mM Tris•HCl（pH7.5±0.1），21%氯化钠，2.5% Tween20；或者试剂盒中以包括上述浓缩清洗液，使用时再稀释25倍。
本发明试剂盒可用于检测的对象选自血清、尿液、乳汁、肠液、大便或组织样本。检测的用途选自肝癌、肝炎、和肝硬化的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
本发明还提供如上述的试剂盒在体外用于非诊断目的的定量检测醛酮还原酶1B10和甲胎蛋白中的应用，比如对于脱离活体的样品，检测结果不再适用于样品来源的主体的情况，如未知血液等。
本发明的试剂盒中未详细描述的试剂组分（如一些必要的缓冲液）、试剂盒的外包装以及各试剂组分的独立包装容器等均可按照所属领域的常规操作进行，符合相关行业规定即可。
本发明的方法中未详细描述的操作步骤也可以参照所属领域的常规操作进行。例如，在检测前可将各试剂组分放置室温（18~25℃）平衡，加样前充分混匀等；所用仪器设备，如时间分辨免疫荧光分析仪的使用按照说明书操作进行。
本发明提供的AKR1B10和AFP测定试剂盒具有如下优势：
a)本发明以AKR1B10抗体和AFP抗体共同包被酶标板，又以铕离子（Eu3+）标记AKR1B10检测抗体，铽离子（Tb3+）标记AFP检测抗体，同时与AKR1B10和AFP两种抗原产生特异性免疫结合；
b)本发明可同时测定AKR1B10和AFP两种蛋白的含量，极大的提高了临床诊断的灵敏度和特异性，还能大幅降低检测时间及成本，目前临床上暂无同类型产品；
c)本发明采用时间分辨免疫荧光分析法，通过时间延迟和波长分辨使本底值降到可以忽略的程度，具有较高的信噪比、荧光信号强、线性范围广、操作简便等特点；
d)本试剂盒稳定性良好，有效期可至一年以上。
附图说明
图1.本发明试剂盒的校准品曲线线性图（左图为AKR1B10抗原标准曲线；右图为AFP抗原）。
图2.本发明试剂盒检测正常人和肝癌患者血清中AKR1B10和AFP蛋白的含量（左图为AKR1B10；右图为AFP）。
图3.本发明试剂盒检测正常人和肝炎患者血清中AKR1B10和AFP蛋白的含量（左图为AKR1B10；右图为AFP）。
图4.本发明试剂盒检测正常人和肝硬化患者血清中AKR1B10和AFP蛋白的含量（左图为AKR1B10；右图为AFP）。
具体实施方法
本发明提供了一种醛酮还原酶1B10（AKR1B10）和甲胎蛋白（AFP）测定试剂盒（时间分辨免疫荧光分析法），具体实施例仅用于更清楚的说明本发明，参照下列实施例进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中所用到的部分试剂材料均可商购获得（AKR1B10检测抗体为本公司专利产品，专利号：ZL 20141057977.0，授权公告号：CN 104650234 B），所用各仪器设备也是所属领域的现有设备，未注明具体条件的实验方法均为所属领域熟知的常规方法和条件。
实施例1. AKR1B10和AFP测定试剂盒的制备。
一、包被酶标板的制备方法如下：
用10mmol/L Tris•HCl（pH7.5±0.1）的包被缓冲液配置5ug/mL兔抗AKR1B10多克隆抗体和10ug/mL鼠抗AFP单克隆抗体的混合溶液，以200uL每孔注入酶标板的微孔中，置于2~8℃条件下包被反应12~15小时，然后弃去包被混合溶液。用10mmol/L Tris•HCl（pH7.5±0.1），1% BSA的封闭缓冲液，以400uL每孔注入酶标板的微孔中，置于37℃封闭反应2小时，然后弃去封闭缓冲液，自然晾干。
二、校准品混合溶液的配制方法如下：
将AKR1B10抗原和AFP抗原以一定浓度溶解于样品缓冲液中配置而成。其中AKR1B10工作浓度分别为0、375、750、1500、3000、6000pg/mL，AFP工作浓度分别为0、5、10、50、200、650ng/mL，缓冲液为10mmol/L Tris•HCl（pH7.5±0.1），1% BSA，0.05%Tween 20，0.05%Proclin300。
三、AKR1B10检测抗体制备方法如下：
将鼠抗AKR1B10单克隆抗体与铕离子（Eu3+）藕联制备得到AKR1B10检测抗体。
（1）将待标记的鼠抗AKR1B10单克隆抗体用脱盐柱置换成缓冲液为10mmol/LTris•HCl（pH7.5±0.1）溶液中。
（2）将步骤（1）中的抗体与0.2mg铕离子（Eu3+）混合，在2~8℃条件下轻轻振荡反应12~15小时。
（3）再将标记后的抗体溶液用脱盐柱置换成缓冲液为10mmol/L Tris•HCl（pH7.5±0.1），1% BSA，0.05%Tween 20，0.05% Proclin300溶液中，去除游离的铕离子（Eu3+），-80℃保存，制备得到所需的AKR1B10检测抗体。
四、AFP检测抗体制备方法如下：
将鼠抗AFP单克隆抗体与铽离子（Tb3+）藕联制备得到AFP检测抗体。
（1）将待标记的鼠抗AFP单克隆抗体用脱盐柱置换成缓冲液为10mmol/L Tris•HCl（pH7.5±0.1）溶液中。
（2）将步骤（1）中的抗体与0.2mg铽离子（Tb3+）混合，在2~8℃条件下轻轻振荡反应12~15小时。
（3）再将标记后的抗体溶液用脱盐柱置换成缓冲液为10mmol/L Tris•HCl（pH7.5±0.1），1% BSA，0.05%Tween 20，0.05% Proclin300溶液中，去除游离的铽离子（Tb3+），-80℃保存，制备得到所需的AFP检测抗体。
五、增强液的制备方法如下：
增强液是将25μmol/L β-NTA，50μmol/L TOPO，0.1% Triton X-100，0.5%无水醋酸，0.1%邻苯二甲酸氢钾充分溶解于纯化水中，调整pH 3.0~4.0。
本发明的AKR1B10和AFP测定试剂盒还包含清洗液，该清洗液主要用于检测过程中各反应步骤后的洗涤，清洗液的具体组分可以参照所属领域的常规操作进行。通常是Tris-HCl、氯化钠、Tween20和Proclin300或它们的混合溶液，在该试剂盒中以浓缩清洗液的形式存在，检测时适当稀释后使用。优选的清洗液的配制方法是：50mM Tris•HCl（PH7.5±0.1），21%氯化钠，2.5% Tween20，充分混匀后2~8℃保存，使用前稀释25倍。
实施例2. 用AKR1B10和AFP测定试剂盒建立校准曲线
校准曲线的建立步骤如下：
（1）在酶标板微孔中分别加入100ul校准品，室温振荡孵育1小时，每孔中加入300ul清洗液，反复清洗3次；
（2）在酶标板微孔中同时加入100ul AKR1B10检测抗体和100ul AFP检测抗体，室温振荡孵育1小时，每孔中加入300ul清洗液，反复清洗3次；
（3）各孔中分别加入200ul增强液，室温振荡孵育5分钟；
（4）用时间分辨免疫荧光分析仪分别检测340nm波长中铕离子的荧光值和295nm波长中铽离子的荧光值；
（5）数据分析：
通过四参数线性拟合校准品的浓度值和发光值获得标准曲线（参见图1）。其中，横坐标代表校准品的浓度值，纵坐标代表校准品的发光值，AKR1B10校准品（R2=0.9966）；AFP校准品（R2=0.9983）。
实施例3. 用AKR1B10和AFP测定试剂盒检测正常人和肝癌患者血清样本中AKR1B10和AFP蛋白的含量
（1）在酶标板微孔中分别加入100ul待测血清样本，室温振荡孵育1小时，每孔中加入300ul清洗液，反复清洗3次；
（2）在酶标板微孔中同时加入100ul AKR1B10检测抗体和100ul AFP检测抗体，室温振荡孵育1小时，每孔中加入300ul清洗液，反复清洗3次；
（3）各孔中分别加入200ul增强液，室温振荡孵育5分钟；
（4）用时间分辨免疫荧光分析仪分别检测340nm波长中铕离子的荧光值和295nm波长中铽离子的荧光值；
（5）数据分析：
选取30例健康正常人、126例肝癌患者血清样本进行检测，通过四参数线性拟合校准品的浓度值和荧光值获得标准曲线，计算各受试者血清样本中AKR1B10和AFP蛋白的含量，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，两组人群中AKR1B10和AFP蛋白的平均水平均具有显著性统计学差异（p＜0.0001）（AKR1B10在健康正常人和肝癌患者中的表达水平分别为68.68±12.16pg/mL和1130±127.3pg/mL；AFP在健康正常人和肝癌患者中的表达水平分别为3.924±0.3208ng/mL和298±57.51ng/mL；参见图2）。
实施例4. 用AKR1B10和AFP测定试剂盒检测正常人和肝炎患者血清样本中AKR1B10和AFP蛋白的含量
采用与实施例3相同的方法检测血清样本，选取35例健康正常人、59例肝炎患者血清样本进行检测，通过四参数线性拟合校准品的浓度值和荧光值获得标准曲线，计算各受试者血清样本中AKR1B10和AFP蛋白的含量，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，两组人群中AKR1B10和AFP蛋白的平均水平均具有显著性统计学差异（p＜0.0001）（p＜0.0001）（AKR1B10在健康正常人和肝炎患者中的表达水平分别为46.98±7.403pg/mL和179.9±7.403pg/mL；AFP在健康正常人和肝炎患者中的表达水平分别为3.525±0.305ng/mL和41.67±5.169ng/mL；参见图3）。
实施例5. AKR1B10和AFP测定试剂盒检测正常人和肝硬化患者血清样本中AKR1B10和AFP蛋白的含量
采用与实施例3相同的方法检测血清样本，选取46例健康人、77例肝硬化患者血清样本进行检测，通过四参数线性拟合校准品的浓度值和荧光值获得标准曲线，计算各受试者血清样本中AKR1B10和AFP蛋白的含量，结果用Graphpad 4.0统计学软件进行分析。t检验结果显示，两组人群中AKR1B10和AFP蛋白的平均水平均具有显著性统计学差异（p＜0.0001）（AKR1B10在健康正常人和肝硬化患者中的表达水平分别为66.03±7.326pg/mL和263.1±25.34pg/mL；AFP在健康正常人和肝硬化患者中的表达水平分别为5.639±1.04ng/mL和72.46±7.59ng/mL；参见图4）。

Claims (10)

1.一种用于检测肝癌、肝炎和/或肝硬化的试剂盒，其特征在于，其包括铕标记的醛酮还原酶1B10检测抗体和铽标记的甲胎蛋白检测抗体。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括增强液，其中包含β-NTA和TOPO，更优选地，所述增强液是25μmol/L β-NTA，50μmol/L TOPO，0.1% Triton X-100，0.5%无水醋酸，0.1%邻苯二甲酸氢钾， pH 3.0~4.0；还包括样品稀释液，其成分为：pH7.5±0.1的10mmol/L Tris•HCl，1% BSA，0.05%Tween 20，0.05% Proclin300。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括醛酮还原酶1B10抗原、甲胎蛋白抗原的标准品，优选地，所述抗原以一定浓度溶解于样品缓冲液中配置而成，具体如醛酮还原酶1B10抗原浓度分别为0、375、750、1500、3000、6000pg/mL，甲胎蛋白抗原浓度分别为0、5、10、50、200、650ng/mL，缓冲液为10mmol/L Tris•HCl（pH7.5±0.1），1% BSA，0.05%Tween20，0.05% Proclin300。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括清洗液，例如Tris-HCl、氯化钠、Tween20和Proclin300或它们的混合溶液，在该试剂盒中以浓缩清洗液的形式存在，检测时适当稀释后使用；
优选的清洗液的配制方法是：50mM Tris•HCl（pH7.5±0.1），21%氯化钠，2.5%Tween20，充分混匀后2~8℃保存，使用前稀释25倍。
5.根据权利要求1中所述的试剂盒，其特征在于：所述铕标记的醛酮还原酶1B10检测抗体为多克隆抗体或单克隆抗体， 优选为鼠抗单克隆抗；所述铽标记的甲胎蛋白检测抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，优选为鼠抗单克隆抗体。
6.根据权利要求1中所述的试剂盒，其特征在于：所述兔抗醛酮还原酶1B10多克隆抗体和识别另一抗原位点的鼠抗甲胎蛋白单克隆抗体包被在微孔板中。
7.根据权利要求5中所述的试剂盒，其特征在于：所述醛酮还原酶1B10检测抗体是将鼠抗醛酮还原酶1B10单克隆抗体与铕离子藕联制备而成；所述甲胎蛋白检测抗体是将鼠抗甲胎蛋白单克隆抗体与铽离子藕联制备而成。
8.根据权利要求1至7任一项所述的试剂盒，其特征在于，检测的对象选自血清、尿液、乳汁、肠液、大便或组织样本。
9.根据权利要求1至7任一项所述的试剂盒，其特征在于，检测的用途选自肝癌、肝炎和肝硬化的筛查、诊断、疗效判断、预后评估或复发监测。
10.如权利要求1至8任一项所述的试剂盒在体外用于非诊断目的的定量检测醛酮还原酶1B10和甲胎蛋白的含量。
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