CN105420373A - 同时检测三种气单胞菌的多重pcr引物组及探针和检测方法 - Google Patents

同时检测三种气单胞菌的多重pcr引物组及探针和检测方法 Download PDF

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Abstract

同时检测三种气单胞菌的多重PCR引物组及探针和检测方法，公开了一种能同时快速检测嗜水气单胞菌(AH)、维氏气单胞菌(AV)和舒伯特气单胞菌(AS)的检测方法及其使用的引物组和探针。该检测方法的特征为使用三对特异性引物和三条核酸探针能够区分高同源性的上述三种气单胞菌，且能在同一管反应体系中同时检测和加以辨别。利用本发明的引物探针和检测方法能快速检测这三种人畜共患病病原菌，具有操作简便、灵敏度高、特异性好等优点；能够及时发现和确诊可疑病例，提高对该类病原的监测水平。

Description

同时检测三种气单胞菌的多重PCR引物组及探针和检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及同时检测三种气单胞菌的多重PCR引物组及探针和检测方法。
背景技术
我国是世界上的水产养殖大国，然而，病害损失严重制约着水产养殖业的健康可持续发展。嗜水气单胞菌(AeromonasHydrophila，简称AH)、维氏气单胞菌(AeromonasVeronii，简称AV)和舒伯特气单胞菌(AeromonasSchubertii，简称AS)是流行于我国的致病性气单胞菌，由这三种病原菌引发的疾病不仅给水产养殖业带来严重的经济损失，还可通过水产动物和水产品感染人畜，导致人畜腹泻和食物中毒。针对主要致病菌株建立准确可靠的检测技术对于传染病的防控工作具有重要意义。
气单胞菌的检测技术经历了从传统的分离鉴定法、免疫检测技术，到分子生物学方法的转变。李晨等(2010年)报道了针对鳗弧菌、嗜水气单胞菌以及迟缓爱德华氏菌多重PCR检测方法。刘春等人(2014年)报道了针对鳢源致病性舒伯特气单胞菌的双重PCR检测方法。由于气单胞菌属成员之间基因同源性高，普通PCR检测方法难以区别。余波等人(2014年)报道了一种检测大鲵致病性嗜水气单胞菌的SYBRGreenⅠ荧光定量PCR诊断试剂盒。探针法实时荧光定量PCR技术引入分子探针，以其高特异和高敏感的特性，对高同源性菌株的检测具有明显优势。目前已有报道应用多重荧光定量PCR技术检测气单胞菌，如孟双等人(2012年)报道了检测嗜水气单胞菌的三重TaqManPCR快速检测体系。在同一个反应管内，利用具有多个激光通道的荧光PCR检测仪，建立一种同时检测嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌的多重荧光定量PCR反应体系未见报道和相关文献公开。
发明内容
本发明的目的在于提出一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其可在水生动物和水产品中能快速和同时检测和辨别嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌，实现同气单胞菌属内不同菌种的快速检测，克服了气单胞菌属之间同源性对检测的影响。
本发明的另一个目的在于提出上述检测方法中使用的引物组及探针，具有灵敏度高、特异性好等优点，能够及时发现和确诊可疑病例，提高对该类病原的监测水平。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)从被检测动物的组织或者微生物培养液中提取DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板和三对特异性引物与三条TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测；
(3)根据检测后的特异性S扩增曲线和循环值进行结果判断，获得检测结果；
其中步骤(2)中的三对特异性引物与三条TaqMan探针如下：
嗜水气单胞菌上游引物AH-F：5’-GGCAGAGCCCGTCTATCCA-3’(SEQIDNO：1)，或者为该序列的核酸互补序列；
嗜水气单胞菌下游引物AH-R：5’-GCGATACTTGTCGCCACAGA-3’(SEQIDNO：2)，或者为该序列的核酸互补序列；
嗜水气单胞菌探针AHP：5’F-ACCAGCTTCGCTTGTTTTCATTGGGC-Q3’(SEQIDNO：3)，或者为该序列的核酸互补序列；
维氏气单胞菌上游引物AV-F：5’-TTTGGCGTCTTCATTGATGCT-3’(SEQIDNO：4)，或者为该序列的核酸互补序列；
维氏气单胞菌下游引物AV-R：5’-CCGCCCATTTGACCTGATC-3’(SEQIDNO：5)，或者为该序列的核酸互补序列；
维氏气单胞菌探针AVP：5’F-TGCAGGCGGCTGAACCTGTCTACC-Q3’(SEQIDNO：6)，或者为该序列的核酸互补序列；
舒伯特气单胞菌上游引物AS-F：5’-GGCGGTCATTTCGGTCAA-3’(SEQIDNO：7)，或者为该序列的核酸互补序列；
舒伯特气单胞菌下游引物AS-R：5’-AGCAGGAAGTCGGCCAGCTTG-3’(SEQIDNO：8)，或者为该序列的核酸互补序列；
舒伯特气单胞菌探针ASP：5’F-CCGGATCCCAAGTTCTCCTCCCA-Q3’(SEQIDNO：9)，或者为该序列的核酸互补序列；
上述探针中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。
更进一步的说明，所述的F为FAM、HEX和CY5中的任一种；所述的Q为BHQ系列。
更进一步的说明，所述步骤(2)中进行多重荧光定量PCR检测时，反应体系包括2×SGprobeMasterMix10μL,AH、AV、AS10μM上下游引物各取0.5μL，AH、AV、AS10μMTaqMan探针各取0.5μL，样品DNA模板取1μL，并用双蒸水补充体积至20μL。
更进一步的说明，所述步骤(2)中进行多重荧光定量PCR检测时，反应参数为95℃预变性10min；95℃变性20sec，60℃退火并延伸30sec，40-50个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
更进一步的说明，所述步骤(3)的判断方法为根据三重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断被检样品中是否有嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌。
更进一步的说明，其判断方法为：对于无S曲线产生且Ct值≥40者，判定结果为阴性，报告结果为未检出；Ct值≤35，判定该样品结果为阳性；Ct值在35-40之间，报告结果为建议样本重做；重做Ct值≥40者为阴性，反则为阳性。
更进一步的说明，所述步骤(1)中DNA的提取利用微生物DNA提取试剂盒从被检测动物的组织或者微生物培养液中提取获得。
更优的，上述同时检测三种气单胞菌的多重PCR引物组及探针，其核苷酸序列分别如下所示：
嗜水气单胞菌上游引物AH-F：5’-GGCAGAGCCCGTCTATCCA-3’(SEQIDNO：1)；
嗜水气单胞菌下游引物AH-R：5’-GCGATACTTGTCGCCACAGA-3’(SEQIDNO：2)；
嗜水气单胞菌探针AHP：5’F-ACCAGCTTCGCTTGTTTTCATTGGGC-Q3’(SEQIDNO：3)；
维氏气单胞菌上游引物AV-F：5’-TTTGGCGTCTTCATTGATGCT-3’(SEQIDNO：4)；
维氏气单胞菌下游引物AV-R：5’-CCGCCCATTTGACCTGATC-3’(SEQIDNO：5)；
维氏气单胞菌探针AVP：5’F-TGCAGGCGGCTGAACCTGTCTACC-Q3’(SEQIDNO：6)；
舒伯特气单胞菌上游引物AS-F：5’-GGCGGTCATTTCGGTCAA-3’(SEQIDNO：7)；
舒伯特气单胞菌下游引物AS-R：5’-AGCAGGAAGTCGGCCAGCTTG-3’(SEQIDNO：8)；
舒伯特气单胞菌探针ASP：5’F-CCGGATCCCAAGTTCTCCTCCCA-Q3’(SEQIDNO：9)；
上述探针中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。
本发明采用多重TaqMan荧光定量RT-PCR技术，针对致病性嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌的Aer基因和舒伯特气单胞菌的gyrB基因序列分别设计引物和TaqMan探针，分别使用FAM、HEX等基团作为探针的发光基团，设计并构建标准阳性质粒、计算出其拷贝数，建立阳性对照样品标准曲线，优化RT-PCR的反应体系，以对应于荧光定量PCR仪的不同波长段用于同时检测，构建出基于引物和荧光探针的三种气单胞菌多重荧光定量RT-PCR检测方法。本方法具有特异性强、灵敏度高和重复性好的优点，用于快速检测并区分感染动物体内的嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌，弥补了现有技术在这一领域的空白，实现同气单胞菌属内不同菌种的快速检测，克服了气单胞菌属之间同源性对检测的影响，具有实用性。
本发明的有益效果：1、实现一管多检的实际需要，为上述三种致病性气单胞菌的快速、灵敏、特异检出提供重大技术保障；2、TaqMan探针的使用，大大的提高特异性，即使是同源性较高的菌种也能准确区分鉴别；3、应用于水产养殖病害的检测，以便及时制定有效防治措施；4、应用于水产品的安全性检测，保证水产食品安全，提高食品卫生质量。
附图说明
图1是本发明的技术流程图；
图2是本发明的三对引物普通PCR结果电泳图；
图3是本发明的荧光定量PCR特异性检测结果；
图4是本发明中对嗜水气单胞菌进行检测的敏感性试验扩增曲线图；
图5是本发明中对维氏气单胞菌进行检测的敏感性试验扩增曲线图；
图6是本发明中对舒伯特气单胞菌进行检测的敏感性试验扩增曲线图；
图7是本发明中检测三种菌对应的标准曲线图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本发明公开了一种能同时快速检测嗜水气单胞菌(AH)、维氏气单胞菌(AV)和舒伯特气单胞菌(AS)的检测方法。该检测方法的特征为使用三对特异性引物和三条核酸探针能够区分高同源性的上述三种气单胞菌，且能在同一管反应体系中同时检测和加以辨别。利用本发明的引物探针和检测方法能快速检测这三种人畜共患病病原菌，具有操作简便、灵敏度高、特异性好等优点；能够及时发现和确诊可疑病例，提高对该类病原的监测水平。
一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)利用微生物DNA提取试剂盒从被检测动物肝、脾、肾和血等组织或者微生物培养液中快速提取DNA；
(2)应用PrimerPremier5.0软件，根据Genbank上公布的嗜水气单胞菌Aer基因(登录号：M16495)、维氏气单胞菌Aer基因序列(登录号：EF034117)以及舒伯特气单胞菌gyrB基因序列(登录号：JQ319030.1)分别设计3对引物和TaqMan探针。引物和探针DNA由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
(3)以步骤(1)中提取的DNA为模板和步骤(2)中合成的引物与TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测，技术流程如图1所示。
(4)根据检测后的特异性S扩增曲线和循环值进行结果判断。
其中步骤(2)中的特异性的引物与TaqMan探针如下(序列由发明人设计)：
探针的5’端要根据所采用的荧光定量PCR仪的多种荧光通道进行区别标记，本发明所用探针分别选择FAM、HEX和CY5荧光基团，探针的3’端淬灭基团选择BHQ系列。
步骤(3)中多重荧光定量PCR检测时的反应体系如下：
成分 体积(μl)
2×SG probe Master Mix 10
DNA模板 1
上游引物(10μM)×3 0.5×3
下游引物(10μM)×3 0.5×3
探针(10μM)×3 0.5×3
双蒸水 4.5
总共 20
步骤(3)中多重荧光定量PCR检测时的反应参数为95℃预变性10min；95℃变性20sec，60℃退火并延伸30sec，40-50个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
结果判断方法，优选采用如下方案：根据三重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断被检样品中是否有嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌。对于无S曲线产生且Ct值≥40者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值≤35，可判定该样品结果为阳性；Ct值在35-40之间，建议样本重做。重做Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。
实施例1：特异性引物及分子信标探针的设计与合成
对Genbank上公布的嗜水气单胞菌Aer基因(登录号：M16495)、维氏气单胞菌Aer基因序列(登录号：EF034117)以及舒伯特气单胞菌gyrB基因序列(登录号：JQ319030.1)进行同源性比较，确定每种菌株特异性引物和探针的选择范围，应用Primer5.0软件寻找所有可能的引物和探针序列组合，筛选符合条件的引物和探针序列，并运用BLAST软件分析特异性，获得3对特异性引物和对应的TaqMan探针靶序列。在嗜水气单胞菌探针的5’标记FAM荧光基团，维氏气单胞菌探针的5’标记HEX荧光基团，舒伯特气单胞菌探针的5’标记CY5荧光基团。
引物和探针如下：
嗜水气单胞菌上游引物：5’-GGCAGAGCCCGTCTATCCA-3’(SEQIDNO：1)
嗜水气单胞菌下游引物：5’-GCGATACTTGTCGCCACAGA-3’(SEQIDNO：2)
嗜水气单胞菌探针：5’FAM-ACCAGCTTCGCTTGTTTTCATTGGGC-BHQ13’(SEQIDNO：3)
维氏气单胞菌上游引物：5’-TTTGGCGTCTTCATTGATGCT-3’(SEQIDNO：4)
维氏气单胞菌下游引物：5’-CCGCCCATTTGACCTGATC-3’(SEQIDNO：5)
维氏气单胞菌探针：5’HEX-TGCAGGCGGCTGAACCTGTCTACC-BHQ23’(SEQIDNO：6)
舒伯特气单胞菌上游引物：5’-GGCGGTCATTTCGGTCAA-3’(SEQIDNO：7)
舒伯特气单胞菌下游引物：5’-AGCAGGAAGTCGGCCAGCTTG-3’(SEQIDNO：8)
舒伯特气单胞菌探针：5’CY5-CCGGATCCCAAGTTCTCCTCCCA-BHQ23’(SEQIDNO：9)
引物和探针DNA由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例2嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌多重PCR检测方法的灵敏度分析
1、实验方法
(1)样品的准备：标准质粒的构建方法：分别使用上述三种气单胞菌上下游引物(SEQIDNO：1-2；SEQIDNO：4-5；SEQIDNO：7-8)对各自对应的细菌DNA进行常规PCR法扩增，获得图2所示对应大小的核算片段，核酸序列如SEQIDNO：10-12所示。将扩增的片段分别纯化后，通过TA克隆至pMD19-T载体上，经测序鉴定，测序结果正确的重组载体转化入DH5α感受态细胞，扩增后提取质粒，获得三种菌对应的质粒DNA。再分别将三种菌的质粒稀释为1×108copies/μL-1×102copies/μL等浓度。
(2)反应液配制：根据下表配制反应液：
成分 体积(μl)
2×SG probe Master Mix 10
DNA模板 1
上游引物(10μM)×3 0.5×3
下游引物(10μM)×3 0.5×3
探针(10μM)×3 0.5×3
双蒸水 4.5
总共 20
其中DNA模板为对应浓度的三种质粒等体积混合，即每种质粒的终添加浓度为3.33×107copies/μL-3.33×101copies/μL。三对引物和探针均加入同一反应体系中。
(3)PCR扩增：
加样完成后的96孔板置于StratageneMx3000P荧光定量PCR仪，反应参数为95℃预变性10min；95℃变性20sec，60℃退火并延伸30sec，40-50个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
2、检测结果：
由图4-6可知：对于嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌的检测灵敏度均可达到3.33×101copies/μL。根据图7标准曲线图所示，该检测方法对三种菌不同浓度DNA反应的线性关系良好。
具体的，图7中标准曲线的解释为：
CY5检测通道，标准曲线Y＝-3.495*LOG(X)+44.50,扩增效率为99.3％，相关系数为0.996；
HEX检测通道，标准曲线Y＝-3.458*LOG(X)+40.30,扩增效率为99.6％，相关系数为0.998；
FAM检测通道，标准曲线Y＝-3.343*LOG(X)+38.74,扩增效率为100.4％，相关系数为0.996。
实施例3水生动物感染气单胞菌检测与特异性分析
1、实验方法
(1)样品的准备：分别对嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌感染阳性的病鱼取样，取鱼体的肝脏、脾脏和肾脏等器官的组织样少许混合，以温和气单胞菌、大肠杆菌、柱状黄杆菌和荧光假单胞菌阳性病鱼组织混合为对照。利用微生物DNA提取试剂盒提取以上组织DNA，得到DNA模板。
(2)反应液配制：
根据下表配制反应液：
成分 体积(μl)
2×SG probe Master Mix 10
DNA模板 1
上游引物(10μM)×3 0.5×3
下游引物(10μM)×3 0.5×3
探针(10μM)×3 0.5×3
双蒸水 4.5
总共 20
阳性组为嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌DNA混合，其它细菌DNA混合模板作为对照。
(3)PCR扩增：
加样完成后的96孔板置于StratageneMx3000P荧光定量PCR仪，反应参数为95℃预变性10min；95℃变性20sec，60℃退火并延伸30sec，40-50个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
2、结果判断：根据三重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断被检样品中是否有嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌。对于无S曲线产生且Ct值≥40者，判定结果为阴性，可直接报告未检出；Ct值≤35，可判定该样品结果为阳性；Ct值在35-40之间，样本重做。重做Ct值≥40者为阴性，否则为阳性。
3、检测结果：由图3可知该检测方法可准确鉴别和检测出嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌，使该三种致病菌DNA样品产生S型反应曲线，而对其它细菌DNA则无反应，不产生反应曲线。
以上结合具体实施例描述了本发明的技术原理。这些描述只是为了解释本发明的原理，而不能以任何方式解释为对本发明保护范围的限制。基于此处的解释，本领域的技术人员不需要付出创造性的劳动即可联想到本发明的其它具体实施方式，这些方式都将落入本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)从被检测动物的组织或者微生物培养液中提取DNA；
(2)以步骤(1)中提取的DNA为模板和三对特异性引物与三条TaqMan探针进行多重荧光定量PCR检测；
(3)根据检测后的特异性S扩增曲线和循环值进行结果判断，获得检测结果；
其中步骤(2)中的三对特异性引物与三条TaqMan探针如下：
嗜水气单胞菌上游引物AH-F：5’-GGCAGAGCCCGTCTATCCA-3’(SEQIDNO：1)，或者为该序列的核酸互补序列；
嗜水气单胞菌下游引物AH-R：5’-GCGATACTTGTCGCCACAGA-3’(SEQIDNO：2)，或者为该序列的核酸互补序列；
嗜水气单胞菌探针AHP：5’F-ACCAGCTTCGCTTGTTTTCATTGGGC-Q3’(SEQIDNO：3)，或者为该序列的核酸互补序列；
维氏气单胞菌上游引物AV-F：5’-TTTGGCGTCTTCATTGATGCT-3’(SEQIDNO：4)，或者为该序列的核酸互补序列；
维氏气单胞菌下游引物AV-R：5’-CCGCCCATTTGACCTGATC-3’(SEQIDNO：5)，或者为该序列的核酸互补序列；
维氏气单胞菌探针AVP：5’F-TGCAGGCGGCTGAACCTGTCTACC-Q3’(SEQIDNO：6)，或者为该序列的核酸互补序列；
舒伯特气单胞菌上游引物AS-F：5’-GGCGGTCATTTCGGTCAA-3’(SEQIDNO：7)，或者为该序列的核酸互补序列；
舒伯特气单胞菌下游引物AS-R：5’-AGCAGGAAGTCGGCCAGCTTG-3’(SEQIDNO：8)，或者为该序列的核酸互补序列；
舒伯特气单胞菌探针ASP：5’F-CCGGATCCCAAGTTCTCCTCCCA-Q3’(SEQIDNO：9)，或者为该序列的核酸互补序列；
上述探针中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述的F为FAM、HEX和CY5中的任一种；所述的Q为BHQ系列。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中进行多重荧光定量PCR检测时，反应体系包括2×SGprobeMasterMix10μL,AH、AV、AS10μM上下游引物各取0.5μL，AH、AV、AS10μMTaqMan探针各取0.5μL，样品DNA模板取1μL，并用双蒸水补充体积至20μL。
4.根据权利要求1所述的一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中进行多重荧光定量PCR检测时，反应参数为95℃预变性10min；95℃变性20sec，60℃退火并延伸30sec，40-50个循环，在每个循环的60℃退火并延伸阶段收集荧光信号。
5.根据权利要求1所述的一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(3)的判断方法为根据三重荧光定量PCR反应中的特异性S曲线与对应的阈值大小判断被检样品中是否有嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌和舒伯特气单胞菌。
6.根据权利要求5所述的一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于：其判断方法为：对于无S曲线产生且Ct值≥40者，判定结果为阴性，报告结果为未检出；Ct值≤35，判定该样品结果为阳性；Ct值在35-40之间，报告结果为建议样本重做；重做Ct值≥40者为阴性，反则为阳性。
7.根据权利要求1所述的一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中DNA的提取利用微生物DNA提取试剂盒从被检测动物的组织或者微生物培养液中提取获得。
8.一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR引物组及探针，其特征在于：其核苷酸序列分别如下所示：
嗜水气单胞菌上游引物AH-F：5’-GGCAGAGCCCGTCTATCCA-3’(SEQIDNO：1)；
嗜水气单胞菌下游引物AH-R：5’-GCGATACTTGTCGCCACAGA-3’(SEQIDNO：2)；
嗜水气单胞菌探针AHP：5’F-ACCAGCTTCGCTTGTTTTCATTGGGC-Q3’(SEQIDNO：3)；
维氏气单胞菌上游引物AV-F：5’-TTTGGCGTCTTCATTGATGCT-3’(SEQIDNO：4)；
维氏气单胞菌下游引物AV-R：5’-CCGCCCATTTGACCTGATC-3’(SEQIDNO：5)；
维氏气单胞菌探针AVP：5’F-TGCAGGCGGCTGAACCTGTCTACC-Q3’(SEQIDNO：6)；
舒伯特气单胞菌上游引物AS-F：5’-GGCGGTCATTTCGGTCAA-3’(SEQIDNO：7)；
舒伯特气单胞菌下游引物AS-R：5’-AGCAGGAAGTCGGCCAGCTTG-3’(SEQIDNO：8)；
舒伯特气单胞菌探针ASP：5’F-CCGGATCCCAAGTTCTCCTCCCA-Q3’(SEQIDNO：9)；
上述探针中F为报告荧光基团，Q为淬灭荧光基团。
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