CN112725483A - 同时检测三种气单胞菌的特异性引物、试剂盒、应用、多重pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同时检测三种气单胞菌的特异性引物、试剂盒、应用、多重PCR检测方法。所述检测气单胞菌的特异性引物包括上游引物Aehy_F和下游引物Aehy_R组成的第一特异性引物对，上游引物Aeca_F下游引物Aeca_R组成的第二特异性引物对，以及上游引物Aeve_F和下游引物Aeve_R组成的第三特异性引物对。本发明的特异性引物可用于气单胞菌的多重PCR扩增，从而可用于检测如水体、土壤等样品中的三种致病性气单胞菌，进而保证水体、土壤等环境的安全可靠性，方法简单，可为养殖业等提供保证。同时，本发明的特异性引物可制备成多重PCR检测试剂盒，使用方便。
Description
技术领域
本发明涉及细菌检测领域，特别是涉及同时检测三种气单胞菌的特异性引物、试剂盒、应用、多重PCR检测方法。
背景技术
随着人们生活水平的提高，养殖业具有不错的发展前景，但是在人工养殖过程中，气单胞菌引起的疾病的爆发，常常使得养殖户受到巨大的损失。研究表明，导致疾病发生的气单胞菌主要为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠气单胞菌(Aeromonascaviae)和维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)等菌种。因此，特异性地识别气单胞菌种对于水产养殖中疾病的治疗非常关键。为此，需要开展对气单胞菌种的特异性引物的研究，用于水体或水产动物感染气单胞菌的检测。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种同时检测三种气单胞菌的特异性引物、试剂盒、应用、多重PCR检测方法；所述特异性引物可用于同时检测或辅助检测三种气单胞菌，特异性强、灵敏度高。
一种同时检测三种气单胞菌的特异性引物，包括上游引物Aehy_F和下游引物Aehy_R组成的第一特异性引物对，上游引物Aeca_F和下游引物Aeca_R组成的第二特异性引物对，以及上游引物Aeve_F和下游引物Aeve_R组成的第三特异性引物对；其中，
所述上游引物Aehy_F为:5’CGAGCAACAGCTCGAAGTGG3’，
所述下游引物Aehy_R为:5’GCTGGGATTGAACGAAGCCG3’，
所述上游引物Aeca_F为:5’CCGGAACTCGGACTGAGAC3’，
所述下游引物Aeca_R为:5’GGAGCCTGCCAAGAACGATA3’，
所述上游引物Aeve_F为:5’GGCCCTTCCGACAAAGGATT3’，
所述下游引物Aeve_R为:5’CTCCTTCATCACCCCCATCAG3’。
在其中一个实施例中，所述第一特异性引物对、所述第二特异性引物对和所述第三特异性引物对的摩尔比为3:2:4。
一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测试剂盒，包括如上所述的第一特异性引物对、第二特异性引物对和第三特异性引物对。
在其中一个实施例中，所述第一特异性引物对、所述第二特异性引物对和所述第三特异性引物对的摩尔比为3:2:4。
在其中一个实施例中，所述多重PCR检测试剂盒还包括模板DNA，所述模板DNA包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌中的至少一种气单胞菌的基因组DNA。
在其中一个实施例中，所述多重PCR检测试剂盒还包括10×扩增缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶和双蒸水。
一种如上所述的气单胞菌的多重PCR检测试剂盒的应用，所述多重PCR检测试剂盒用于检测气单胞菌。
在其中一个实施例中，所述气单胞菌包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌中的至少一种。
一种应用如上所述的特异性引物的气单胞菌属的多重PCR检测方法，包括：
提取待测样品的气单胞菌的基因组DNA，作为模板DNA；
将所述模板DNA与特异性引物、10×扩增缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、双蒸水配制形成PCR反应体系，其中，所述特异性引物包括第一特异性引物对、第二特异性引物对和第三特异性引物对；
所述PCR反应体系进行反应，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行凝胶电泳，根据条带分析结果。
在其中一个实施例中，所述气单胞菌包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述第一特异性引物对、所述第二特异性引物对和所述第三特异性引物对在PCR反应体系中的摩尔比为3:2:4。
在其中一个实施例中，所述PCR反应体系的体积为10μL-50μL，其中，包括1.5mmol/L-3.0mmol/L的MgCl2，0.10mmol/L-0.40mmol/L的dNTP，0.1μmol/L-1.5μmol/L的特异性引物，0.5U-2.5U的Taq聚合酶，0.5μL-4μL的模板DNA，1μL-5μL的10×扩增缓冲液，余量为双蒸水。
在其中一个实施例中，所述反应的程序为：94℃-98℃预变性1min-3min；
94℃-98℃变性15s-30s，59℃-62℃退火20s-40s，70℃-74℃延伸30s-60s，共30个-37个循环；
最后72℃延伸5min-7min。
本发明的特异性引物可用于气单胞菌的多重PCR扩增，从而可用于检测如水体、土壤、水产品等样品中的气单胞菌，尤其是，当样品中含有嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌中的至少一种时，本发明的特异性引物即可检测出样品中具体含有哪种或哪几种气单胞菌，进而保证水体、土壤等环境的安全可靠性，方法简单，可为养殖业等提供保证。同时，本发明的特异性引物可制备成多重PCR检测试剂盒，使用方便。
附图说明
图1为本发明同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法的特异性检测结果图；
图2为本发明实施例1对养殖黑斑蛙肠道菌样本的检测图；
图3为本发明实施例2对养殖黑斑蛙皮肤菌样的检测图。
具体实施方式
以下将对本发明提供的同时检测三种气单胞菌的特异性引物、试剂盒、应用、多重PCR检测方法作进一步说明。
本发明分别以GenBank数据库中嗜水气单孢菌基因组序列(登录号CP0169899)、豚鼠气单胞菌基因组序列(登录号CP062787)及维氏气单胞菌基因组序列(登录号CP059396)作为各物种参考序列，经在NCBI中与其它相近物种进行序列的相似性比对后，分别在嗜水气单胞菌的65962-66275特异性序列区间、豚鼠气单胞菌的4050305-4050860特异性序列区间及维氏气单胞菌48355-49014特异性序列区间利用NCBI的在线引物设计软件设计出只能扩增嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌的特异性引物。
所以，本发明提供的同时检测三种气单胞菌的特异性引物，包括上游引物Aehy_F和下游引物Aehy_R组成的第一特异性引物对，上游引物Aeca_F下游引物Aeca_R组成的第二特异性引物对，以及上游引物Aeve_F和下游引物Aeve_R组成的第三特异性引物对；其中，
所述上游引物Aehy_F为:5’CGAGCAACAGCTCGAAGTGG3’，
所述下游引物Aehy_R为:5’GCTGGGATTGAACGAAGCCG3’，
所述上游引物Aeca_F为:5’CCGGAACTCGGACTGAGAC3’，
所述下游引物Aeca_R为:5’GGAGCCTGCCAAGAACGATA3’，
所述上游引物Aeve_F为:5’GGCCCTTCCGACAAAGGATT3’，
所述下游引物Aeve_R为:5’CTCCTTCATCACCCCCATCAG3’。
所述第一特异性引物对为嗜水气单胞菌特异引物，扩增产物长度为314bp；所述第二特异性引物对为豚鼠气单胞菌特异引物，扩增产物长度为556bp；所述第三特异性引物对为维氏气单胞菌特异引物，扩增产物长度为660bp。
其中，所述第一特异性引物对、所述第二特异性引物对和所述第三特异性引物对的摩尔比为3:2:4。
其中，根据嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌基因组中的基因片段设计特异性引物，所述特异性引物主要用于这三种气单胞菌的PCR扩增。
从而，当水体、土壤、水产品等样品中含有嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌中的至少一种时，使用本发明由第一特异性引物对、第二特异性引物对和第三特异性引物对组成的特异性引物即可检测出样品中含有哪种或哪几种气单胞菌。
本发明还提供一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测试剂盒，包括如上所述的第一特异性引物对、第二特异性引物对和第三特异性引物对。
其中，所述多重PCR检测试剂盒还包括模板DNA。考虑到所述特异性引物主要用于嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌的PCR扩增，所以，所述模板DNA主要包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌中的至少一种气单胞菌的基因组DNA。
由于嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌为常见的蛙类、鱼类等水产动物主要的三种致病菌，所以，可通过本发明的特异性引物对样品中嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌进行特异性识别，保证蛙类、鱼类等水产动物养殖业的健康发展。
在所述多重PCR检测试剂盒中，具体还可包括10×扩增缓冲液、dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)、MgCl2、Taq聚合酶和双蒸水。在使用时，根据需要配制形成相应浓度的PCR反应体系，其中，所述第一特异性引物对、所述第二特异性引物对和所述第三特异性引物对在PCR反应体系中的摩尔比为3:2:4。
本发明还提供一种如上所述的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测试剂盒的应用，所述多重PCR检测试剂盒用于检测气单胞菌。当然，也可以结合其它检测方式，用于辅助检测气单胞菌。
可以理解，所述多重PCR检测试剂盒主要用于检测嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌，当样品中含有这三种气单胞菌中的至少一种时，所述多重PCR检测试剂盒在检测过程中即可特异性识别样品中具体含有哪种或哪几种气单胞菌。
本发明同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法建立如下：
细菌基因组DNA模板提取：
用细菌基因组DNA抽提试剂盒分别提取嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌三种气单胞菌属物种的基因组DNA。
设置洛菲氏不动杆菌、大肠杆菌、浅黄假单胞菌、奇异变形杆菌、水稻白叶枯病菌、铜绿假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、迟钝爱德华菌、布氏柠檬酸杆菌、枯草芽孢杆菌等作为非目的致病性气单胞菌外源物种对照模板。同时，以无菌水作为阴性对照；以细菌16S rRNA通用引物(F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT)作为阳性对照。
PCR扩增：
PCR反应体系为10μL-50μL，其中，包括：10×扩增缓冲液1μL-5μL，1.5mmol/L-3.0mmol/L的MgCl2，0.10mmol/L-0.40mmol/L的dNTP，0.5U-2.5U的Taq聚合酶，DNA模板0.5μL-4μL，0.1μmol/L-1.5μmol/L的特异性引物，其中，所述第一特异性引物对、所述第二特异性引物对和所述第三特异性引物对在PCR反应体系中的摩尔比为3:2:4；双蒸水补足到10μL-50μL。
PCR反应条件为：94℃-98℃预变性1min-3min；
94℃-98℃变性15s-30s；59℃-62℃退火20s-40s；70℃-74℃延伸30s-60s，共30个-37个循环；
最后72℃延伸5min-7min。
电泳分析：
琼脂糖凝胶板制备，按照1.5％-2％的比例配制琼脂糖凝胶。用分析天平称取0.6g-0.8g琼脂糖，加入到40ml 0.5×TBE缓冲液中摇匀，微波炉加热120s使其完全溶解，将1μL-3μL核酸染料加入琼脂糖凝胶溶液后混匀，倒入中制胶板的胶槽中，***适当齿数梳子，室温冷却静置30min-60min，待凝固后，两边同时拔掉梳子，除去边缘多余凝胶，制备即完成。
电泳及鉴定检测：将制备好的琼脂糖凝胶放入电泳槽中，加入0.5×TBE缓冲液使其覆盖过凝胶。加入4μL-6μL DNAMarker DM2000，加入4μL-6μL待检样品扩增产物。120V-180V恒定电压下进行核酸电泳10min-30min。通过凝胶成像***，观察并记录各待测样品扩增条带，分析鉴定结果。
图1为本发明同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法的特异性检测结果。图中，M为分子量标准DNAMaker DM2000；图中，1：嗜水气单孢菌；2：豚鼠气单胞菌；3：维氏气单胞菌；4：嗜水气单孢菌+豚鼠气单胞菌；5：嗜水气单孢菌+维氏气单胞菌；6：豚鼠气单胞菌+维氏气单胞菌；7：嗜水气单孢菌+豚鼠气单胞菌+维氏气单胞菌；8：水稻白叶枯病菌；9：布氏柠檬酸杆菌；10：浅黄假单胞菌；11：铜绿假单胞菌；12：洛菲氏不动杆菌；13：奇异变形杆菌；14：弗氏柠檬酸杆菌；15：迟钝爱德华菌；16：大肠杆菌；17：枯草芽孢杆菌；18：无菌水。
根据图1所示的样品PCR扩增产物结果，做出诊断判定。当①第一特异性引物对Aehy_F/Aehy_R、第二特异性引物对Aeca_F/Aeca_R和第三特异性引物对Aeve_F/Aeve_R在以至少包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌中的一种气单胞菌的DNA为模板的多重PCR中扩增出的条带为314bp、556bp或660bp；而在奇异变形杆菌、浅黄假单胞菌、布氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、洛菲氏不动杆菌、迟钝爱德华菌、大肠杆菌、水稻白叶枯病菌、枯草芽孢杆菌等基因组DNA为模板的多重PCR扩增中无扩增条带；②通用引物F/R在三种致病性气单胞菌和奇异变形杆菌、浅黄假单胞菌、布氏柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、洛菲氏不动杆菌、迟钝爱德华菌、大肠杆菌、水稻白叶枯病菌、枯草芽孢杆菌为模板DNA的PCR中扩增出1500bp左右的条带；③第一特异性引物对Aehy_F/Aehy_R、第二特异性引物对Aeca_F/Aeca_R、第三特异性引物对Aeve_F/Aeve_R和通用引物F/R在以无菌水为模板的PCR扩增中无条带产生。上述三个条件同时满足时，判定结果为阳性，否则检测需要重做。
本发明还提供一种应用如上所述的特异性引物的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，包括：
S1，提取待测样品的气单胞菌的基因组DNA，作为模板DNA；
S2，将所述模板DNA与特异性引物、10×扩增缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、双蒸水配制形成PCR反应体系，其中，所述特异性引物包括第一特异性引物对、第二特异性引物对和第三特异性引物对；
S3，将所述PCR反应体系进行反应，得到扩增产物；
S4，将所述扩增产物进行凝胶电泳，根据条带分析结果。
步骤S1中，所述样品不限，可以为水体、土壤、水产品等，所述气单胞菌包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌中的至少一种。
步骤S2中，所述PCR反应体系的体积为10μL-50μL，其中，包括1.5mmol/L-3.0mmol/L的MgCl2，0.10mmol/L-0.40mmol/L的dNTP，0.1μmol/L-1.5μmol/L的特异性引物，0.5U-2.5U的Taq聚合酶，0.5μL-4μL的模板DNA，1μL-5μL的10×扩增缓冲液，余量为双蒸水；优选地，所述PCR反应体系的体积为10μL-20μL，其中，包括2.0mmol/L-2.5mmol/L的MgCl2，0.20mmol/L-0.30mmol/L的dNTP，0.3μmol/L-0.8μmol/L的特异性引物，1.0U-2.0U的Taq聚合酶，1.0μL-3.0μL的模板DNA，1μL-2μL的10×扩增缓冲液，余量为双蒸水。
步骤S2中，所述第一特异性引物对、所述第二特异性引物对和所述第三特异性引物对在PCR反应体系中的摩尔比为3:2:4。
步骤S3中，所述反应的程序为：94℃-98℃预变性1min-3min；94℃-98℃变性15s-30s，59℃-62℃退火20s-40s，70℃-74℃延伸30s-60s，共30个-37个循环；最后72℃延伸5min-7min；优选地，所述反应的程序为：94℃-95℃预变性2min-3min；94℃-95℃变性20s-30s，60℃-62℃退火20s-30s，72℃-74℃延伸30s-40s，共33个-36个循环；最后72℃延伸5min-7min。
步骤S4中，所述扩增产物用1.5％-2％的琼脂糖凝胶进行凝胶电泳。
本发明的检测方法快速、简便，灵敏度高、特异性强，可同时检测出嗜水气单孢菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌三种气单胞菌，快速特异性识别出具体为哪种或哪几种气单胞菌。
以下，将通过以下具体实施例对所述同时检测三种气单胞菌的特异性引物、试剂盒、应用、多重PCR检测方法做进一步的说明。
实施例1：养殖黑斑蛙肠道菌样的检测
1、样品中DNA的提取：样品为采自某养殖场中的6组黑斑蛙肠道内容物样本，用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取样品中的细菌基因组DNA。同时设置无菌水为阴性对照样本，设置通用引物F/R作为阳性对照。
2、PCR扩增：用第一特异性引物对Aehy_F/Aehy_R、第二特异性引物对Aeca_F/Aeca_R和第三特异性引物对Aeve_F/Aeve_R配制形成PCR反应体系，并分别进行PCR扩增得到扩增产物，具体如下：
所述PCR反应体系的体积为20μL，其中，包括2.0mmol/L的MgCl2，0.20mmol/L的dNTP，0.3μmol/L的特异性引物，1.0U的Taq聚合酶，2μL的模板DNA，2μL的10×扩增缓冲液，余量为双蒸水。
特异性引物中，第一特异性引物对Aehy_F/Aehy_R、第二特异性引物对Aeca_F/Aeca_R和第三特异性引物对Aeve_F/Aeve_R的摩尔比为3:2:4。
所述反应的程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸30s，共33个循环；最后72℃延伸7min。
3、电泳分析：将扩增产物进行凝胶电泳，分析PCR扩增结果，结果如图2所示，图2中，M为分子量标准DNAMaker DM2000；图中数字：1、3、5、7、9、11分别为6个肠道菌样本的多重PCR扩增结果；2、4、6、8、10、12为阳性对照；13，阴性对照。
从图2可知，其中两例肠道菌样本中扩增出314bp、556bp和660bp三条条带，一例肠道菌样本扩增出314bp和556bp两条条带，一例肠道菌样本扩增出314bp和660bp两条条带，一例肠道菌样本扩增出314bp一条条带，一例肠道菌样本无条带产生。此外，阳性对照显示所有6例样本均扩增出1500bp左右的条带，而以无菌水为模板DNA的阴性对照显示多重PCR扩增无条带产生。证明本实施例所建立的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法有效。
实施例2：养殖黑斑蛙皮肤菌样的检测
1、样品中DNA的提取：样品为采自某养殖场中的6组黑斑蛙皮肤样本，用细菌基因组DNA抽提试剂盒提取样品中的细菌基因组DNA。同时设置无菌水为阴性对照样本，设置通用引物F/R作为阳性对照。
2、PCR扩增：用第一特异性引物对Aehy_F/Aehy_R、第二特异性引物对Aeca_F/Aeca_R和第三特异性引物对Aeve_F/Aeve_R配制形成PCR反应体系，并分别进行PCR扩增得到扩增产物，具体如下：
所述PCR反应体系的体积为20μL，其中，包括2.5mmol/L的MgCl2，0.30mmol/L的dNTP，0.5μmol/L的特异性引物，2.0U的Taq聚合酶，3.0μL的模板DNA，2μL的10×扩增缓冲液，余量为双蒸水。
特异性引物中，第一特异性引物对Aehy_F/Aehy_R、第二特异性引物对Aeca_F/Aeca_R和第三特异性引物对Aeve_F/Aeve_R的摩尔比为3:2:4。
所述反应的程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共36个循环；最后72℃延伸7min。
3、电泳分析：将扩增产物进行凝胶电泳，分析PCR扩增结果，结果如图3所示，图3中，M为分子量标准DNAMaker DM2000；图中数字：1、3、5、7、9、11分别为6个肠道菌样本的多重PCR扩增结果；2、4、6、8、10、12分别为阳性对照；13，阴性对照。
从图3可知，所有6例样本均扩增出314bp、556bp和660bp三条条带，且以无菌水为模板DNA的阴性对照显示多重PCR扩增无条带产生，以细菌通用引物F/R为阳性对照的多重PCR扩增出现1500bp的条带。证明本实施例所建立的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法有效。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 浙江师范大学
<120> 同时检测三种气单胞菌的特异性引物、试剂盒、应用、多重PCR检测方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)
<400> 2
cgagcaacag ctcgaagtgg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)
<400> 2
gctgggattg aacgaagccg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)
<400> 3
gctgggattg aacgaagccg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)
<400> 4
ggagcctgcc aagaacgata 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)
<400> 5
ggcccttccg acaaaggatt 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)
<400> 6
ctccttcatc acccccatca g 21
Claims (10)
1.一种同时检测三种气单胞菌的特异性引物，其特征在于，包括上游引物Aehy_F和下游引物Aehy_R组成的第一特异性引物对，上游引物Aeca_F和下游引物Aeca_R组成的第二特异性引物对，以及上游引物Aeve_F和下游引物Aeve_R组成的第三特异性引物对；其中，
所述上游引物Aehy_F为:5’CGAGCAACAGCTCGAAGTGG3’，
所述下游引物Aehy_R为:5’GCTGGGATTGAACGAAGCCG3’，
所述上游引物Aeca_F为:5’CCGGAACTCGGACTGAGAC3’，
所述下游引物Aeca_R为:5’GGAGCCTGCCAAGAACGATA3’，
所述上游引物Aeve_F为:5’GGCCCTTCCGACAAAGGATT3’，
所述下游引物Aeve_R为:5’CTCCTTCATCACCCCCATCAG3’。
2.一种同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的第一特异性引物对、第二特异性引物对和第三特异性引物对。
3.根据权利要求2所述的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重PCR检测试剂盒还包括模板DNA，所述模板DNA包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌中的至少一种气单胞菌的基因组DNA。
4.根据权利要求2所述的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述多重PCR检测试剂盒还包括10×扩增缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶和双蒸水。
5.一种如权利要求2-4任一项所述的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测试剂盒的应用，其特征在于，所述多重PCR检测试剂盒用于检测气单胞菌。
6.根据权利要求5所述的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测试剂盒的应用，其特征在于，所述气单胞菌包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌中的至少一种。
7.一种应用权利要求1所述的特异性引物的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于，包括：
提取待测样品的气单胞菌的基因组DNA，作为模板DNA；
将所述模板DNA与特异性引物、10×扩增缓冲液、dNTP、MgCl2、Taq聚合酶、双蒸水配制形成PCR反应体系，其中，所述特异性引物包括第一特异性引物对、第二特异性引物对和第三特异性引物对；
所述PCR反应体系进行反应，得到扩增产物；
将所述扩增产物进行凝胶电泳，根据条带分析结果。
8.根据权利要求7所述的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于，所述气单胞菌包括嗜水气单胞菌、豚鼠气单胞菌、维氏气单胞菌中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于，所述PCR反应体系的体积为10μL-50μL，其中，包括1.5mmol/L-3.0mmol/L的MgCl2，0.10mmol/L-0.40mmol/L的dNTP，0.1μmol/L-1.5μmol/L的特异性引物，0.5U-2.5U的Taq聚合酶，0.5μL-4μL的模板DNA，1μL-5μL的10×扩增缓冲液，余量为双蒸水。
10.根据权利要求7所述的同时检测三种气单胞菌的多重PCR检测方法，其特征在于，所述反应的程序为：94℃-98℃预变性1min-3min；
94℃-98℃变性15s-30s，59℃-62℃退火20s-40s，70℃-74℃延伸30s-60s，共30个-37个循环；
最后72℃延伸5min-7min。
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