CN108642195A - 一种舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法 - Google Patents

一种舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于PCR技术领域，具体涉及一种舒伯特气单胞菌TaqMan‑MGB实时荧光定量PCR检测方法。对舒伯特气单胞菌的rpoD基因保守区域设计特异性引物和TaqMan—MGB探针，建立的TaqMan—MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线有较好的线性关系；建立的TaqMan‑MGB实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强，能较好的用于养殖水环境和鱼体组织中舒伯特气单胞菌的检测，对舒伯特气单胞菌病的早期诊断、流行病学研究和防控技术研究等具有重要意义。

Description

一种舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明属于PCR技术领域，具体涉及一种舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法。
背景技术
舒伯特气单胞菌(Aeromonas schubertii)属气单胞菌科(Aeromonadaceae)气单胞菌属(Aeromanas)，为革兰氏阴性杆菌，单极鞭毛，运动极为活泼。该菌广泛存在于淡水、海水、土壤、鱼类和脊椎动物肠道中，人类接触后可引起感染，是急性腹泻的重要致病菌。在食品、食物中毒的病样和腹泻患者中检出过该菌，也有在感染伤口上分离到该菌的报道。在水产养殖上，舒伯特气单胞菌可感染引起鳢科鱼类(Channidae)导致其内脏类结节病，该病常见于斑鳢、乌鳢和杂交鳢等主要养殖品种，是危害鳢科鱼类养殖最严重的病害之一。舒伯特气单胞菌病在鳢科鱼类养殖过程中频繁爆发，由于该病前期发病症状不明显，发病病程短、死亡率高，中后期典型症状为内脏类结节，这与诺卡氏菌、分枝杆菌和类立克次氏体等引起的鱼类结节病症状相似，在养殖过程中容易引起误诊，错误用药，给鳢科鱼类养殖业带来严重损失。
舒伯特气单胞菌感染引起的鳢科鱼类病害严重制约了养殖业的健康发展，目前尚未研制出针对该菌的商业化疫苗进行疾病的预防。病害的流行病学调查、早期诊断和环境中病原菌的监测对于疾病的防治具有十分重要的作用，而病原菌的检测方法的建立是以上研究的基础，常规的微生物生理生化鉴定方法操作过程繁琐、费时，且很难得到准确结果，常常延误病情诊断。
因此，如何快速准确地鉴定该病原菌从而有效地控制病情，在养殖生产实践上具有重要意义，而病原菌的定量监测是该病预警与防控技术研究的基础。传统细菌病诊断需进行病原菌分离、培养、生理生化鉴定以及普通PCR鉴定等，缺乏对病原菌进行快速、准确、定量分析的检测预警方法。荧光定量PCR检测技术具有快速、灵敏、特异性高、检测线性范围较宽、对扩增产物进行精确定量分析、不易出现假阳性等优点，正逐渐应用于水产病原微生物的检测与研究中。
发明内容
本发明的目的是提供一种舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法。对舒伯特气单胞菌的rpoD基因保守区域设计特异性引物和TaqMan—MGB探针，建立的TaqMan—MGB探针实时荧光定量PCR检测方法的标准曲线有较好的线性关系；最低可以检测到36个rpoD基因拷贝；30个平行样品重复性试验组内变异系数为0.44％；对其他10种水产养殖常见细菌均无扩增反应。应用该方法对池塘水和鱼体组织中的舒伯特气单胞菌含量检测结果与活菌计数结果有较好的一致性。因此，建立的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强，能较好的用于养殖水环境和鱼体组织中舒伯特气单胞菌的检测，对舒伯特气单胞菌病的早期诊断、流行病学研究和防控技术研究等具有重要意义。
本发明的技术方案为：
一种舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)根据GenBank中舒伯特气单胞菌的Rpod基因序列，应用Primer5软件设计特异性引物和探针，引物和探针序列为：
Rpod-1F:5'ATGGAGCAAACCCCGCAGTC 3'
Rpod-1R:5'CGAGAACTTGTAGCCACGACGG 3'
Rpod-2F：5'CGGCTCCGAACTGGGTG 3'
Rpod-2R：5'CGAGCCACTTCCGGATCC 3'
Rpod-probe:5'CGTCACCGTCGTCGTCGTTAC 3'
(2)标准品模板制备：用舒伯特气单胞菌分离株WL-2的DNA为模板，Rpod-1F、Rpod-1R为引物进行PCR扩增，扩增产物经胶回收纯化后与pMD-18T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，PCR检测阳性克隆并测序正确后，提取重组质粒经分光光度计测定重组质粒浓度，根据公式：分子拷贝数(copies·μL-1)＝6.02×1023(copies·mol-1)×质粒浓度(g·μL-1)/质粒分子量(g·mol-1)计算重组质粒的DNA拷贝数，用EASY Dilution对重组质粒进行10倍倍比稀释，使其浓度依次为3.6×108～3.6×101copies·μL-1的8组标准品；
(3)标准曲线建立：分别以步骤(2)中浓度依次为3.6×108～3.6×101copies·μL-1的8组标准品为模板，以Rpod-2F、Rpod-2R为引物，加入探针Rpod-probe、Premix(Takara)Ex TaqTM和ROXReference DyeⅡ(50×)进行TaqMan-MGB实时荧光定量PCR反应，得到标准品拷贝数与Ct值之间的标准曲线；
(4)样品检测：提取待测样品中细菌或组织基因组DNA，并以此DNA为模板，以Rpod-2F、Rpod-2R为引物，加入探针Rpod-probe、Premix(Takara)Ex TaqTM和ROX Reference DyeⅡ(50×)进行TaqMan-MGB实时荧光定量PCR反应，根据检测获得的待测样品Ct值，根据标准曲线计算出待测样品中细菌DNA分子拷贝。
优选地，步骤(2)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸8min。
优选地，步骤(2)中提取的重组质粒经分光光度计测定在260nm和280nm处吸光度比值转换得到重组质粒浓度。
优选地，步骤(3)和步骤(4)中TaqMan-MGB实时荧光定量PCR反应体系为：PremixEx TaqTM 10μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μL，PCR Forward Primer和PCR ReversePrimer各0.4μL(终浓度均为0.20μmol·L-1)，探针Rpod-probe 0.6μL(终浓度为0.30μmol·L-1)，DNA模板2μL，ddH2O 6.6μL，总体系为20μL。
优选地，步骤(3)和步骤(4)中TaqMan-MGB实时荧光定量PCR反应条件为：第一步，95℃30s；第二步，40个循环，95℃5s，60℃34s(收集FAM荧光信号)。
优选地，步骤(4)中待测样品为养殖池塘水，该待测样品中细菌基因组DNA提取方法为：取池塘水样品10000r/min离心5min，弃掉上清液，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取沉淀中基因组DNA。
优选地，步骤(4)中待测样品为鱼体组织，该待测样品中组织基因组DNA提取方法为：采集鱼体肝、脾或肾组织进行研磨，用组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
该舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法在检测池塘水和鱼体中舒伯特气单胞菌含量的应用。
本发明的有益效果如下：
本发明针对舒伯特气单胞菌的rpoD基因保守区域设计特异性引物和TaqMan—MGB探针，建立的TaqMan—MGB探针实时荧光定量PCR方法避免了常规PCR检测存在假阳性和PCR污染等弊端。TaqMan—MGB探针是在TaqMan探针基础上进行了改进，在探针的3'端增加了MGB(mi—nor groove binder)分子，探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团，从而大大降低实时荧光PCR反应本底信号。本研究建立的TaqMan—MGB荧光定量PCR方法，最低可检测到36个拷贝，比普通PCR方法灵敏2个数量级，易于在疾病发生的早期发现病原菌感染，及时做出预警预测，为该病的防控赢取时间。同时MGB的修饰将探针的退火温度提高10℃左右，提高了PCR反应过程中的特异性。由于气单胞菌属各细菌间差异较小，常用的16S Rna基因测序技术很难鉴定到种，rpoD基因是编码RNA多聚酶σ70因子的基因，其在细菌种内的保守性较高，广泛应用于病原菌的分子生物学分类、鉴定研究中，本发明根据舒伯特气单胞菌的rpoD基因序列建立的荧光定量PCR检测方法，对舒伯特气单胞菌标准株ATCC43700和WL-2菌株都具有典型的扩增曲线；与同属嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、温和气单胞菌和其他常见水产养殖病原菌无乳链球菌、诺卡氏菌、荧光假单胞菌、迟缓爱德华氏菌、鮰爱德华氏菌、柱状黄杆菌、类志贺邻单胞菌均无交叉反应，与阴性对照结果一致，表明所建立的方法具有较强的特异性。细菌病的发生多是因病原微生物在环境剧烈变化或不良环境时对宿主进行感染而引起的。因此研究养殖环境和宿主体内病原菌的动态变化能为鱼类养殖提供理论指导，同时为病害发生提供预警。本研究利用建立的舒伯特气单胞菌TaqMan—MGB荧光定量PCR方法检测出的模拟养殖池塘水样品和鱼体组织样品中舒伯特气单胞菌含量均与活菌计数结果一致性较高，表明建立的荧光定量PCR方法能较好的应用到养殖水环境和鱼体组织中舒伯特气单胞菌的监测中。
本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法，具有灵敏度高、重复性强、特异性好、应用广泛的特点，能够快速、准确地对病原定量，对于鳢科鱼类舒伯特气单胞菌病的早期诊断和流行病学研究以及防控技术研究等具有重要意义。
附图说明
附图1为实施例1中TaqMan-MGB实时荧光定量特异性引物Rpod-2F、Rpod-2R PCR扩增结果；
附图2为实施例1中舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测标准曲线；
附图3为实施例1中舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR灵敏度检测结果的扩增曲线图，其中，ΔRn的值表示PCR过程中,探针降解的量；
附图4为实施例1中舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR30次重复试验结果的扩增曲线图，其中，ΔRn的值表示PCR过程中,探针降解的量；
附图5为实施例1中舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR特异性检测结果的扩增曲线图，其中，ΔRn的值表示PCR过程中,探针降解的量。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
以下实施例中：人工感染用实验鱼为健康杂交鳢(80-120g)，购自广州景洋鱼苗场；基因组DNA提取试剂盒购自北京TIANGEN公司。
实施例1
一种舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
1，PCR扩增方法的建立
1.1 引物设计
根据GenBank中Aeromonas schubertii的Rpod基因序列(CP013067.1)，应用Primer5软件设计特异性引物和探针，第一对引物(Rpod-1F、Rpod-1R)扩增Rpod基因部分序列，扩增产物长度为1302bp，用于构建重组质粒，为制作标准曲线提供模板；第二对引物(Rpod-2F、Rpod-2R)和MGB探针(Rpod-probe)用于荧光定量PCR扩增，扩增产物长度为129bp。引物和探针由广州艾基生物技术有限公司合成。引物和探针序列为：
Rpod-1F:5'ATGGAGCAAACCCCGCAGTC 3'
Rpod-1R:5'CGAGAACTTGTAGCCACGACGG 3'
Rpod-2F：5'CGGCTCCGAACTGGGTG 3'
Rpod-2R：5'CGAGCCACTTCCGGATCC 3'
Rpod-probe:5'CGTCACCGTCGTCGTCGTTAC 3'
1.2标准品模板制备
用WL-2的DNA为模板，Rpod-1F、Rpod-1R为引物进行PCR扩增。反应参数为94℃预变性3min，94℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸8min。扩增产物经胶回收纯化后与pMD-18T载体(TaKaRa)连接，转化到大肠杆菌DH5α中，PCR检测阳性克隆后送艾基生物技术有限公司测序。测序正确的重组质粒经测定在260和280nm处的吸光度后，根据以下方法计算重组质粒的DNA拷贝数。分子拷贝数(copies·μL-1)＝6.02×1023(copies·mol-1)×质粒浓度(g·μL-1)/质粒分子量(g·mol-1)。用EASY Dilution(for Real Time PCR)对标准品进行10倍倍比稀释，用于构建标准曲线。
2，TaqMan-MGB荧光定量PCR的建立和条件优化
采用TaqMan-MGB探针技术，参照Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)说明书，将上下游引物Rpod-2F和Rpod-2R、探针Rpod-probe、Premix(Takara)Ex TaqTM和ROX Reference DyeⅡ(50×)加入到反应体系中，用QuantStudioTM 6Flex型荧光定量PCR仪(美国ABI公司)进行PCR扩增。对各组分浓度和反应程序进行优化，对引物和探针浓度进行筛选，以获得最低的Ct值和最高的荧光强度增加值标准。选用0.2、0.4、0.6、0.8μmol·L-1的引物浓度和0.2、0.4、0.6、0.8μmol·L-1的探针浓度，筛选引物和探针的最佳浓度。分别选取56℃、58℃、60℃、62℃为退火温度，筛选最佳退火温度。
3，标准曲线建立
将重组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为3.6×108～3.6×101copies·μL-1作为标准品模板，每个稀释度设3个平行。在优化的反应体系和条件下进行实时荧光定量PCR扩增，反应结束后绘制标准曲线。
4，TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的敏感性、重复性和特异性试验
4.1 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的敏感性测试
将重组质粒进行10倍梯度稀释，使其浓度依次为3.6×106～3.6×100copies·μL-1作为标准品模板，以ddH2O代替模板作为阴性对照，用优化的反应体系和条件进行荧光定量PCR反应，根据样品拷贝数与Ct值之间的线性关系和相关系数确定最小检测量。同时用引物Rpod-2F、Rpod-2R进行普通PCR反应，计算出2种方法所能检测出的最低模板浓度，比较两种方法的敏感性。
4.2 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的重复性测试
对同一样品在一次实验中重复30次进行实时荧光定量PCR检测，通过组内的Ct值变异系数来初步评估该方法的重复性。
4.3 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的特异性测试
分别提取菌株舒伯特气单胞菌标准株ATCC43700、维氏气单胞菌(A.veronii)JZ09、温和气单胞菌(A.sobria)SJ-1、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)1535、诺卡氏菌(Nocardia seriolae)WL-24、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)BD-1、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)HG-2、鮰爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)zbl141、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)CY-1、类志贺邻单胞菌(Plesiomonasshigelloides)HP-1、嗜水气单胞菌J-1株菌液基因组DNA，用建立的实时荧光定量PCR方法进行特异性扩增，同时设ddH2O为模版的阴性对照和WL-2为模板的阳性对照来评价该方法的特异性。
5，TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的应用
评价舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法的有效性，分别利用该方法检测模拟养殖池塘水和鱼体组织样品中的舒伯特气单胞菌含量，验证该方法的准确率。
5.1 池塘水中舒伯特气单胞菌含量的检测
用BHI培养基培养12h的WL-2菌液，先用无菌水把细菌浓度稀释到1×109CFU·mL-1后(麦氏比浊法测定，同时进行活菌计数确认)，再用10倍梯度稀释后加入池塘水中，使其浓度依次为1×108～1×103CFU·mL-1作为模拟养殖池塘水样品，不加WL-2菌的池塘水和ddH2O分别作为阴性和空白对照，所有样品提取基因组DNA作为模版，用荧光定量PCR方法进行检测，根据检测获得的样品Ct值，根据标准曲线计算出样品中细菌DNA分子拷贝，与实际加入的细菌量比较，验证荧光定量PCR方法的准确性。
5.2 鱼体组织中舒伯特气单胞菌含量的检测
利用1.5×106CFU·mL-1的WL-2菌液，腹腔注射感染健康杂交鳢(200μL/尾)，于攻毒后2d采集肝、脾和肾组织进行研磨，提取基因组DNA，按优化的方法进行TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测，计算出样品中细菌DNA分子拷贝。同时，将病样组织进行常规的细菌理化特性鉴定、16S rRNA基因序列比对和活菌计数，比较确定该方法的准确性。
6 结果与分析
6.1 RpoD基因的PCR扩增和克隆
舒伯特气单胞菌DNA采用引物Rpod-1F、Rpod-1R进行PCR扩增，获得1302bp左右的片段，该片段克隆到载体pMD18-T后，经测序证实与预期***片段相同。重组质粒提取后经分光光度计测定浓度为799μg·mL-1，A260/A280值为1.95。
6.2 TaqMan-MGB实时荧光定量PCR的建立和条件优化
重组质粒采用荧光定量PCR引物Rpod-2F、Rpod-2R进行普通PCR扩增后，产物经琼脂糖凝胶电泳分析，其扩增结果如附图1所示，其中，M.标准DNA DL2000；1-6.质粒浓度分别为3.6×106～3.6×101copies·μL-1。在150bp左右有一条特异性条带，与预期片段长度(129bp)基本一致，表明该引物可用于荧光定量PCR反应。经过荧光定量PCR反应条件的优化，最终确定反应体系为：Premix Ex TaqTM10μL，ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4μL，PCRForward Primer和PCR Reverse Primer各0.4μL(终浓度均为0.20μmol·L-1)，探针Rpod-probe 0.6μL(终浓度为0.30μmol·L-1)，DNA模板2μL，ddH2O 6.6μL，总体系为20μL。PCR扩增程序：第一步，95℃30s；第二步，40个循环，95℃5s，60℃34s(收集FAM荧光信号)。
6.3 标准曲线的建立
以10倍梯度稀释重组质粒后选取3.6×108～3.6×101copies·μL-1的8个稀释度进行荧光定量PCR扩增，获得扩增曲线，以重组质粒拷贝数为X轴、Ct值为Y轴作图，得到的舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测标准曲线如附图2所示，该标准曲线方程为y＝-3.25x+35.85，其相关系数R2＝0.9998，扩增效率为103％，说明实时荧光定量PCR在108～101copies·μL-1范围内有较好的线性关系。
6.4 TaqMan-MGB荧光定量PCR的灵敏度、重复性和特异性试验结果
6.4.1 对重组质粒标准品10倍梯度稀释后，得到浓度依次为3.6×106～3.6×100copies·μL-1标准品样品，对样品分别进行普通PCR和TaqMan-MGB荧光定量PCR扩增。得到的舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR灵敏度检测结果的扩增曲线图如附图3所示，结果显示，荧光定量PCR对重组质粒进行扩增，最低可检测36个细菌DNA分子拷贝数；而附图2中可以看出，普通PCR方法最低在3.6×103copies·μL-1处能检测到条带；因此，舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR比普通PCR方法灵敏100倍。
6.4.2 对同一阳性样品重复30次检测获得的Ct值进行统计分析，得到的舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR30次重复试验结果的扩增曲线图如附图4所示，结果表明，30个平行样的扩增曲线在阈值线附近基本上重合，Ct值读数范围为17.77～17.07，标准偏差为0.085，变异系数为0.44％。
6.4.3 以菌株ATCC43700、WL-2、JZ09、SJ-1、J-1、1535、WL-24、BD-1、HG-2、zbl141、CY-1、HP-1菌液基因组DNA为模板，进行实时荧光定量PCR特异性检测，得到的舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR特异性检测结果的扩增曲线图如附图5所示，结果表明，ATCC43700和WL-2有典型扩增曲线，荧光信号值高，检测结果为阳性，而其余细菌和阴性对照无扩增曲线，未发生扩增反应。
6.5 TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法的应用
6.5.1 模拟养殖池塘水中舒伯特气单胞菌含量的检测
麦氏比浊法测定浓度为1×109CFU·mL-1的WL-2菌液，通过稀释后活菌计数测得实际浓度为0.96×109CFU·mL-1。采用建立的荧光定量PCR方法检测模拟养殖池塘水样品结果见下表1，结果显示，荧光定量PCR方法检测后通过Ct值计算出的5个池塘水样品中舒伯特气单胞菌的含量与实际加入量基本一致，且最低可以检测到池塘水中13个细菌，没有加入WL-2菌的池塘水和dd H2O中均未检测到舒伯特气单胞菌。
表1用荧光定量PCR检测池塘水中舒伯特气单胞菌含量结果
6.52 鱼体组织中舒伯特气单胞菌含量的检测
用本实验建立的荧光定量PCR方法，对人工感染2d的杂交鳢肝、脾和肾组织分别进行检测，通过Ct值计算出的对应基因的拷贝数及活菌计数结果见下表2，常规细菌分离鉴定结果显示，所分离的细菌均为舒伯特气单胞菌。荧光定量PCR方法测出的三个组织的基因拷贝数与活菌计数结果一致。
表2用荧光定量PCR检测感染鱼体组织中舒伯特气单胞菌含量结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测的引物和探针，其特征在于，其序列为：
Rpod-1F:5'ATGGAGCAAACCCCGCAGTC 3'
Rpod-1R:5'CGAGAACTTGTAGCCACGACGG 3'
Rpod-2F：5'CGGCTCCGAACTGGGTG 3'
Rpod-2R：5'CGAGCCACTTCCGGATCC 3'
Rpod-probe:5'CGTCACCGTCGTCGTCGTTAC 3' 。
2.权利要求1所述的引物和探针在舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，舒伯特气单胞菌TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
(1)标准品模板制备：用舒伯特气单胞菌分离株WL-2的DNA为模板，Rpod-1F、Rpod-1R为引物进行PCR扩增，扩增产物经胶回收纯化后与pMD-18T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α中，PCR检测阳性克隆并测序正确后，提取重组质粒经分光光度计测定重组质粒浓度，根据公式：分子拷贝数＝6.02×1023×质粒浓度/质粒分子量计算重组质粒的DNA拷贝数，用EASYDilution对重组质粒进行10倍倍比稀释，使其浓度依次为3.6×108～3.6×101copies·μL-1的8组标准品；
(2)标准曲线建立：分别以步骤(2)中浓度依次为3.6×108～3.6×101copies·μL-1的8组标准品为模板，以Rpod-2F、Rpod-2R为引物，加入探针Rpod-probe、Premix Ex TaqTM和ROXReference DyeⅡ进行TaqMan-MGB实时荧光定量PCR反应，得到标准品拷贝数与Ct值之间的标准曲线；
(3)样品检测：提取待测样品中细菌或组织基因组DNA，并以此DNA为模板，以Rpod-2F、Rpod-2R为引物，加入探针Rpod-probe、Premix Ex TaqTM和ROX Reference DyeⅡ进行TaqMan-MGB实时荧光定量PCR反应，根据检测获得的待测样品Ct值，根据标准曲线计算出待测样品中细菌DNA分子拷贝。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中PCR扩增条件为：94℃预变性3min，94℃30s，55℃30s，72℃90s，共30个循环，最后72℃延伸8min。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中提取的重组质粒经分光光度计测定在260nm和280nm处吸光度比值转换得到重组质粒浓度。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中TaqMan-MGB实时荧光定量PCR反应体系为：Premix ExTaqTM 10μL，ROX Reference DyeⅡ0.4μL，PCR ForwardPrimer和PCR Reverse Primer各0.4μL，探针Rpod-probe 0.6μL，DNA模板2μL，ddH2O 6.6μL，总体系为20μL。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中TaqMan-MGB实时荧光定量PCR反应条件为：第一步，95℃30s；第二步，40个循环，95℃5s，60℃34s；收集FAM荧光信号。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)中待测样品为养殖池塘水，该待测样品中细菌基因组DNA提取方法为：取池塘水样品10000r/min离心5min，弃掉上清液，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取沉淀中基因组DNA。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(3)中待测样品为鱼体组织，该待测样品中组织基因组DNA提取方法为：采集鱼体肝、脾或肾组织进行研磨，用组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。
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