发明内容
本发明提供一种单管快速检测沙眼衣原体核酸的试剂盒,其特征在于试剂盒利用双波长荧光PCR技术同时扩增检测CT和内参照DNA,且人工构建的内参照DNA核苷酸序列为SEQ ID NO:1。试剂盒含有PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶和内参照、阴性对照和阳性对照、DNA提取液组分。本发明可以用于监控PCR扩增中可能的反应抑制物,通过改进的样本处理方法复检获得正确结果,从而避免检测结果出现假阴性的作用,确定样本是否存在CT感染,适合临床推广使用。
技术方案
1.实时荧光PCR引物探针的设计与合成
通过对GenBank中沙眼衣原体隐蔽性质粒基因序列查询,用Vector NTI、Oligo等软件对各种来源的基因序列进行比对后发现,其序列高度保守并具有很好的同源性,按照TaqMan荧光PCR设计的原则,设计了一对CT特异性引物扩增隐蔽性质粒上的序列保守区域,并用5’端FAM标记的特异性TaqMan水解探针法实时检测。引物和探针核苷酸序列如下:
上游引物为5’-CgTgA CCTTC ATTAT gTCgg Ag-3’,如SEQ ID No:2所示;
下游引物为5’-TCTCT CAAgC AggAC TACAA gCTg-3’,如SEQ ID No:3所示;
CT荧光探针为5’-ACAgC ggTTg CTCgAAgCAC gTg-3’(5’标记FAM,3’标记TAMRA或BHQ-1),如SEQ ID No:4所示。
本发明采用人工构建的内参照DNA,其序列为SEQ ID No:1,它含有CTPCR扩增的一条引物序列和另一条引物互补序列,并含有位于两者之间、不同于现有公布的已知生物序列的内参探针序列。更具体地,内参DNA和CT PCR扩增片段具有相同的核苷酸序列长度和相近的GC%含量,能保证两者在单管反应体系中具有相同的扩增效率。
内参探针核苷酸序列为5’-TTCAg CgAgC gTggg ACATC Agg-3’(5’标记JOE或HEX,3’标记TAMRA或BHQ-1),如SEQ ID No:4所示。
通过上述设计,获得的一对引物和探针序列为沙眼衣原体所特异,而内参照DNA人工模板序列不同于包括CT在内的现有已知生物序列,上述寡核苷酸序列由商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司等)合成,合成好的寡核苷酸干粉用无菌双蒸水溶解至浓度为25μmol/L,-20℃保存。
2.样本的处理和实时荧光PCR检测
含有上述引物探针和内参照DNA的CT荧光PCR快速检测试剂盒(32Test),其主要组分如下:
(1)CT PCR缓冲液672μl,主要成分有Tris-HCl(pH8.3)、KCl、明胶、dATP、dGTP、dCTP、dUTP、MgCl2、上下游引物(SEQ ID No:2和3)。
(2)荧光探针96μl,含CT荧光探针(SEQ ID No:4)和内参探针(SEQ ID No:5)。
(3)Taq酶64μl,含Taq DNA聚合酶40U和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)16U。
(4)内参照DNA 160μl,含105copy/ml内参DNA(SEQ ID NO:1)。
(5)阴性对照200μl,为大肠杆菌培养物,104个菌/ml。
(6)阳性对照200μl,为培养的CT包涵体稀释物,103个包涵体/ml。
(7)DNA提取液1.5ml,主要成分为50mmol/L NaOH、5mM EDTA、1%TritonX-100、1%NP-40。
由上述试剂盒组分CT PCR缓冲液21μl、荧光探针3μl、Taq酶2μl混合后加入模板4μl(含有由样本处理步骤引入的内参DNA)后组成的30μl反应体系,含有Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2-0.4mM、MgCl21.5-5mM、引物各0.2-0.5μM、CT荧光探针和内参探针各0.1-0.5μM、Taq DNA聚合酶1-5U、UNG酶0.1-1U,在多波长荧光PCR仪器上进行扩增反应。
更具体地,上述组分配制成的反应体系中含有Tris-HCl(pH8.3)10mM、KCl 50mM、明胶0.1mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.3mM、MgCl23.5mM、引物各0.35μM、CT荧光探针和内参探针各0.15μM、Taq DNA聚合酶1.25U、UNG酶0.5U,在多波长荧光PCR仪器上进行扩增反应。
上述组分组装成的试剂盒在-20℃保存和运输。
使用方法
本发明试剂盒在临床样本CT检测过程中的使用步骤之一为:
(1)样本处理
取临床采集的拭子样本,加入1ml无菌生理盐水,充分振荡摇匀漂洗,吸取液体转移到1.5ml离心管中。从中吸取样本漂洗液200μl,13,000rpm离心6min后吸弃上清,加入50μl试剂盒DNA提取液、5μl内参,漩涡振荡均匀后于100℃保温10min,最后13,000rpm离心2min、吸取离心上清液作模板用于试剂盒荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性对照和阳性对照处理按样本处理方法进行。
(2)扩增检测
按照待检测样品数n+2,取试剂盒CT PCR缓冲液21μl×(n+2)、荧光探针3μl×(n+2)、Taq酶2μl×(n+2)组分,混匀后每个扩增管分装26μl,分别加入按照样本处理方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照以及上述处理好的n个样本模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl,将上述扩增管放到双通道实时荧光PCR仪器上按照50℃2min、94℃2min后94℃5sec、60℃30sec循环40次的程序运行。运行结束后结果按照下表来判断。
注意:FAM通道荧光值和Ct值表征NDM-1基因检测信号;JOE通道荧光值和Ct值表征内参检测信号。
有益效果
本发明根据上述设计的引物探针和技术方案,通过优化反应体系和扩增条件研制成含有内参照DNA的沙眼衣原体核酸荧光PCR检测试剂盒,其主要特点如下:
(1)内参信号监控结果是否假阴性,可以避免由此造成的误诊;
(2)试剂盒使用了序列特异性且不同荧光标记的CT探针和内参探针,两种信号之间不会相互干扰,保证了检测特异性;
(3)试剂盒闭管检测,操作简便快速,可在2小时内报告检测结果;
(4)扩增体系中的dUTP-UNG酶***更进一步避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
试剂盒的上述特点,均为采用内参照DNA和荧光PCR技术组合应用而直接引起。从原理上说,本发明试剂盒在CT病原体临床样本检测中通过对实时荧光PCR扩增两个通道荧光信号的分析,判断CT核酸特异性片段的存在,以及反应体系中是否存在由于抑制物造成的假阴性。作为性病病原体核酸快速检测的手段,本发明的技术方案设计合理,可以广泛应用于性病高危人群中沙眼衣原体感染的快速鉴定。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明中所涉及的主要试剂说明:
Taq DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)、dNTPs(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)均为上海宏谊公司生产,引物探针以及其它化学试剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。QIAamp DNA mini kit购自德国QIAGEN公司。
实施例1:沙眼衣原体核酸快速检测试剂盒的配制
试剂盒中的组分为自行配制,32人份试剂盒各组分配制过程如下:
(1)CT PCR缓冲液672μl,含有Tris-HCl(pH8.3)14.2mM、KCl 71.4mM、明胶0.14mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.43mM、MgCl25mM、上下游引物(SEQ ID No:2和3)各5μM。
(2)荧光探针96μl,含CT荧光探针(SEQ ID No:4)和内参荧光探针(SEQID No:5)各1.5μM。
(3)Taq酶64μl,含Taq DNA聚合酶40U和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)16U。
(4)内参照DNA 160μl,含105copy/ml内参DNA(SEQ ID NO:1)。
(5)阴性对照200μl,含有104个菌/ml大肠杆菌培养物。
(6)阳性对照200μl,含有103个包涵体/ml CT包涵体稀释物。
(7)DNA提取液1.5ml,主要成分为50mmol/L NaOH、5mM EDTA、1%TritonX-100、1%NP-40。
上述组分组装成的试剂盒在-20℃保存和运输。
实施例2:试剂盒在男性尿道拭子样本沙眼衣原体鉴定中的应用
(1)样本处理
选择本试剂初次检测两个通道均为阴性的男性尿道拭子样本7例,将其按照发明内容中样本处理方法获得的提取物用DNA提取液稀释5倍,用于扩增检测。
(2)扩增检测
按照发明内容中的方法,取试剂盒组分CT PCR缓冲液21μl×9、荧光探针3μl×9、Taq酶2μl×9置于1.5ml离心管,混匀后短暂离心,每个扩增管分装26μl,分别加入按照相同方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照提取物以及上述稀释处理的7个样品模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl,将上述扩增管放到ROTORGENE实时荧光PCR仪器(澳大利亚Corbett Research公司)上按照50℃2min、94℃2min后94℃5sec、60℃30sec循环40次的程序运行。
(3)检测结果
仪器运行结束后,按照发明内容中的结果判断方法,7个首次检测两个通道信号均为阴性的男性尿道拭子提取物,经过稀释后复检,在JOE通道内参信号均为阳性,表明已经解除了首次扩增体系中存在的PCR抑制物;而在FAM通道,5个结果为阴性、2个结果为阳性,表明复检的这7个样本初次检测结果5个为真阴性、而2个为假阴性(首次漏检比例为28.6%)。
实施例3:试剂盒在女性宫颈拭子沙眼衣原体鉴定中的应用
(1)样本处理
选择本试剂初次检测两个通道均为阴性的女性宫颈拭子样本4例,重新取拭子清洗液各200μl,采用QIAGEN公司QIAamp DNA mini kit按照其说明书处理并进行PCR检测。
(2)扩增检测
按照发明内容中的方法,取试剂盒组分CT PCR缓冲液21μl×6、荧光探针3μl×6、Taq酶2μl×6置于1.5ml离心管,混匀后短暂离心,每个扩增管分装26μl,分别加入按照相同方法处理的试剂盒阴性对照、阳性对照提取物以及上述采用QIAGEN柱法提取试剂盒处理好的4个样品模板各4μl。每个反应扩增管体积为30μl,将上述扩增管放到ABI 7000实时荧光PCR仪器(美国应用生物***公司)上按照50℃2min、94℃2min后94℃10sec、60℃45sec循环40次的程序运行。
(4)检测结果
仪器运行结束后,按照发明内容中的结果判断方法,4个首次检测两个通道信号均为阴性的女性宫颈拭子,采用QIAGEN柱法提取试剂重新提取复检,在JOE通道(内参信号)均为阳性,表明已经解除了首次扩增体系中存在的PCR抑制物;而在FAM通道(CT信号),2个结果为阴性、2个结果为阳性,表明复检的这4个样本初次检测结果2个为真阴性、而2个为假阴性(首次漏检比例为50%)。
上述实施例实验结果表明,对于试剂盒首次检测为双阴性的泌尿生殖道样本,采用盒内DNA提取液稀释样本提取物(5倍)或采用离心柱法核酸提取试剂重新提取纯化样本(例如QIAGEN公司QIAamp DNA mini kit)的方法复检,可以有效减少或去除样本PCR抑制物,获得可靠检测结果,减少临床样本中CT的漏检。