CN106222256A - 一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重免疫荧光分析方法 - Google Patents

一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重免疫荧光分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法。本发明操作简单，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素‑藻红蛋白进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值，分辩不同类型的病原。本发明方法，能够同时检测鉴别鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体，而且具有特异性强，灵敏度高，重复性好等优点，可实现同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测。本发明灵活性好，可以根据需要在此基础上加减检测病原的种类。

Description

一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重免疫荧光分析 方法
技术领域
本发明属于养殖业的病原检测领域，具体涉及一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法。
背景技术
鸡支原体病是由支原体引起的传染病，以直接接触经呼吸道感染和经蛋感染为主要传播途径，最常见的为鸡毒支原体（MG）和滑液囊支原体（MS）。鸡毒支原体主要引起鸡慢性呼吸道症状、气囊炎、产蛋下降，是支原体中对养禽业造成最严重经济损失者；鸡滑液囊支原体主要引起鸡的关节病变和亚临床呼吸
道症状，气囊炎和关节病变导致肉仔鸡酮体的废弃率明显增加。临床上常出现两者同时混合感染的情况。鸡群被支原体感染后，其机体的免疫功能降低，导致对其他传染病因的易感性增加，致使死亡率增加，生产性能降低而造成严重的经济损失。近几年，随着集约化养鸡业的发展，鸡群中支原体感染已十分普遍，有的鸡群支原体感染率已高达56.9 %，严重阻碍了养鸡业的健康发展。
目前对 MG 和MS的常规诊断方法主要采取血清学和分离培养2种方法。血清学方法由于常出现非特异性的交叉反应而影响诊断的准确性；而分离培养，由于其对所需条件要求苛刻，费时费力，已不适应现代集约化养禽业发展的需要。
针对此情况分子生物学方法被广泛应用，最近国内外建立了PCR/多重PCR、荧光定量PCR等检测方法。虽然PCR技术具有特异性强、敏感度高的优点，但结果判定需要电泳，费时费力，且反应产物容易产生污染而导致假阳性。荧光定量PCR技术融合了PCR的多种优点，通过直接检测PCR反应过程中荧光信号的变化实现对目的分子的定量，不需要电泳检测，并且整个过程完全闭管式操作，污染机率降低，避免了常规PCR容易造成的假阳性问题。相对常规PCR，荧光定量PCR在敏感性、特异性与速度等方面具有优势，但在实际应用中，当样品量非常大时，单重荧光PCR在成本和时间方面就存在一定的劣势，而建立一个多重荧光PCR方法比单重的要复杂得多，其对试剂和引物的要求更高，同时需要
保证不同探针所标记的荧光基团间无相互干扰，使用的荧光定量PCR仪具有相应的多个检测通道，使实验难度加大。目前，还未见有应用多重免疫荧光分析方法对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行检测的报道。
发明内容
为了解决现有技术中所存在的不足，本发明的一个目的在于提供一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析引物组；
本发明的另一个目的在于提供一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析试剂盒；
本发明的另一个目的在于提供一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于检测鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）和鸡滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）的多重荧光免疫分析引物组，其包括：用于检测鸡毒支原体的引物对G1和G2、用于检测鸡滑液囊支原体的引物对S1和S2，其特征在于：所述用于检测鸡毒支原体的引物对是根据鸡毒支原体的PVPA基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡滑液囊支原体的引物对是根据鸡滑液囊支原体的vlhA基因的保守序列设计的。
作为优选的，所述用于检测鸡毒支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：
MG引物G1：5’-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3’（SEQ ID NO.1），
MG引物G2：5’-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3’（SEQ ID NO.2）；
用于检测鸡滑液囊支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：
MS引物S1：5’-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3’（SEQ ID NO.3），
MS引物S2：5’-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3’（SEQ ID NO.4）。
优选的，引物G1和S1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。
优选的，引物G1和S1的5’端的tag序列分别为：
引物G1的tag序列为：5’-CACTACACATTTATCATAACAAAT-3’（SEQ ID NO.5）；
引物S1的tag序列为：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3’（SEQ ID NO.6）。
优选的，引物G2和S2的5’端还添加有生物素标记。
一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：（1）以上所述的多重荧光免疫分析引物组；（2）2种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与多重荧光免疫分析引物组的上游引物上的tag序列互补配对；（3）链霉亲和素-藻红蛋白复合物。
一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：
1）从样品中提取DNA，以DNA为模板，加入以上任一项所述的引物组进行PCR扩增；
2）将扩增产物、包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定其支原体的类型；
优选的，步骤2）中的荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列，所述anti-tag序列能相应地与权利要求3中的tag序列互补配对。
优选的，步骤1）中PCR扩增的反应体系为：
2×Multiplex PCR Master Mix 10ul
上游引物混合液 1ul（0.2uM,final conc.)
下游引物混合液 1ul（0.2uM,final conc.)
模板 1ul（＜500ng）
ddH2O 7ul
Total 20ul
优选的，步骤1）中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。
优选的，步骤2）中扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交的体系为：
荧光编码微球 20µL
链霉亲和素-藻红蛋白 75µL
扩增产物 5µL
Total 100µL
37℃反应30min。
本发明的有益效果是 ：
本发明的上游引物5’端的特异性的tag序列，可以与包被有特异的anti-tag序列的2种荧光编码微球结合，而下游引物5’端的Biotin标记，可以与链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）进行杂交。本发明方法同时对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行检测时，通过PCR获得目标扩增片段，然后将扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白（SA-PE）进行杂交，然后通过检测仪读取MFI值时，分辩不同类型的支原体。
本发明的方法将多重荧光免疫分析（MFIA）和TAG技术结合起来，TAG技术使用Luminex专有的通用标签，通过标签序列与反标签序列的专一性互补配对，进行核酸实验优化，产品开发和分子诊断化验。TAG技术能保证相同的复性温度和杂交效率，且有效避免不同检测物标记的微球之间交叉杂交。
本发明方法，能够同时对鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体进行准确检测，而且特异性强，灵敏度高，重复性好。与传统检测方法相比，本发明方法实现了对同一样本中的多种不同目的分子同时进行检测，样本用量少，操作简单、快速，可大大降低检测成本。
附图说明
图1是鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体2种病原PCR的电泳图；
图2是鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体2种病原的多重荧光免疫分析方法检测实验结果图；
图3是鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体2种病原的多重荧光免疫分析方法检测特异性实验结果图；
图4是鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体2种病原的多重荧光免疫分析方法检测灵敏度实验结果图；
图5是鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体2种病原的多重荧光免疫分析方法临床检测实验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 引物设计
设计一组用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析引物其中，所述用于检测鸡毒支原体的引物对是根据鸡毒支原体的PVPA基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡滑液囊支原体的引物对是根据鸡滑液囊支原体的vlhA基因的保守序列设计的。经过反复试验与筛选后，得到以下引物序列：
用于检测鸡毒支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：
MG引物G1：5’-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3’（SEQ ID NO.1），
MG引物G2：5’-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3’（SEQ ID NO.2）；
用于检测鸡滑液囊支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：
MS引物S1：5’-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3’（SEQ ID NO.3），
MS引物S2：5’-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3’（SEQ ID NO.4）。
引物G1和S1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列，tag序列分别为：
引物G1的tag序列为：5’-CACTACACATTTATCATAACAAAT-3’（SEQ ID NO.5）；
引物S1的tag序列为：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3’（SEQ ID NO.6）。
实施例 2：用于检测MS、MG的多重荧光免疫分析试剂盒的建立
试剂盒包括以下组分：
（1）实施例1所设计的2重荧光免疫分析引物组；
（2）2种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与多重荧光免疫分析引物组上游引物上的tag序列互补配对；两种微球均购自luminex公司，具体的MS和MG分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A025和MTAG-042。
（3）链霉亲和素-藻红蛋白复合物；
（4）PCR扩增反应体系。
实施例3 MS、MG的多重荧光免疫分析方法检测方法的建立
1、质粒的构建
用天根的核酸自动抽取仪分别提取MG、MS病原的DNA，分别实施例1所设计的对应的引物，进行PCR扩增，将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化。用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的cDNA连接至pMD-19T载体中，将连接产物转化至DH5a感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送测序。
2、质粒PCR扩增
用特异性扩增MS、MG引物进行单重、两重PCR扩增。
上游引物混合液的制备：将G1和S1以1:1比例进行混合；下游引物混合液的制备：将G2和S2以1:1比例进行混合。利用两种病原的特异性模板，以及MS和MG两重模板，对上述两种病原的特应性区域进行扩增。其中两重模板的制备：将两两质粒以1:1的比例进行混合。
PCR扩增反应体系如下：
2×Multiplex PCR Master Mix 10ul
上游引物混合液 1ul（0.2uM,final conc.)
下游引物混合液 1ul（0.2uM,final conc.)
模板 1ul（＜500ng）
ddH2O 7ul
Total 20ul
扩增的反应程序为：
94℃预变性5min；
94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸20s；循环35次；
72℃终延伸10min。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，其电泳图如图1所示。1：100bp DNA marker，2：MG，3：MS，4：MS+MG，5：PCR blank。
从图1中可以看出，MG的扩增产物大小约为133bp，MS的扩增产物大小约为141bp，由于这两种病原的扩增产物大小相近，所以两重 PCR 扩增产物的电泳条带无法分辨。
3、PCR产物与荧光编码微球工作液、链霉亲和素藻红蛋白（SA-PE）工作液杂交，包括以下步骤：
分别包被有特异的anti-tag序列的2种微球，其中anti-tag序列能相应地与MS和MG两种病原引物上的tag序列互补配对。两种微球均购自luminex公司，具体的MS和MG分别对应的荧光编码微球号为MTAG-A025和MTAG-042。
荧光编码微球工作液的制备：将2500个/μl荧光编码微球用1.1×TmHybrdization Buffer稀释到1μl约含有125个/种荧光编码微球。
SA-PE工作液制备：将1mg/ml SA-PE用1×Tm Hybrdization Buffer稀释到10μg/μl。
充分重悬荧光编码微球工作液，每个样品孔和背景孔加入微球工作液20μl，样品孔中加入5μl PCR产物，背景孔中加入5μl PCR blank产物，再加入75μl的SA-PE工作液，充分混匀，于金属加热器中37℃孵育30min。
依照检测仪Luminex 200仪器的说明将杂交后的50μl上述反应液进行检测，结果如图3所示，虽然两重模板的扩增产物无法用电泳分辨，但用检测仪Luminex 200仪器读取MFI值时，明显分辩不同类型的病原。
结果判断标准（注：该判断标准仅供参考，亦可对结果判断标准进行调整）如下：
最低检测阈值（cutoff值）的确定：选取10头健康鸡组织样品（每个样品平行重复3次），分别读取MFI值并计算其平均值和标准差。以平均值加3倍标准差的MIF值设定其为cutoff值。本发明所获得cutoff值为278.5，因此将本发明的cutoff值定为300。只有检测样品的MFI值高于300时，该实验数据才能进行有效分析。
待测样本的分析判断：1）当待测样本的MFI值＞300时，判断为阳性样本；2）待测样本的MFI值≤300时，判断为阴性，需要进行重复实验或采取其他检测方法进一步验证。
实施例4 MS和MG的多重荧光免疫分析检测特异性实验
分别用鸡滑液囊支原体（MS）、鸡毒支原体（MG）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、禽传染性贫血病毒（CAV）、马立克病毒（MDV）作为模板进行多重荧光免疫分析检测。实验结果如图4所示，只有滑液囊支原体、鸡毒支原体、为阳性，其他的均为阴性，说明检测体系特异性良好。
实施例5：MS和MG的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验
将制备的质粒进行定量，采用10倍稀释法进行稀释，稀释至101copies/μl，用上述建立的多重荧光免疫分析方法进行检测。MS和MG的多重荧光免疫分析检测灵敏性实验结果如图5所示，实验结果表明，MG、MS的灵敏度检出限为102copies/ul。
从鸡场采集的肺、气管、肾、肝样品，用天根核酸自动抽取仪提取DNA，使用Qiagen的Multiplex PCR Plus kit进行扩增，以DNA作为模板，采用上述MS、MG的多重荧光免疫分析检测方法进行检测，扩增产物与荧光编码微球和SA-PE杂交，在Luminex 200检测仪上读数。具体步骤参照实施例3，实验结果如图5所示。
经普通PCR检测实验结果表明，样品1、2、4、5、6、7、8、11、12、14、15、16、18、19、20为阴性样本；3、10为滑液囊支原体样品；9、13、17为鸡毒支原体样品。通过测序分析，结果一致。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广东省实验动物监测所
<120> 一种检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重免疫荧光分析方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttacagatt acaggagcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagcatttca tttgttttac 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attagcagct agtgcagtgg 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttgaggatt atcagtattt g 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cactacacat ttatcataac aaat 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctttcttaat acattacaac atac 24

Claims (10)

1.一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析引物组，其包括：用于检测鸡毒支原体的引物对G1和G2、用于检测鸡滑液囊支原体的引物对S1和S2，其特征在于：所述用于检测鸡毒支原体的引物对是根据鸡毒支原体的PVPA基因的保守序列设计的；所述用于检测鸡滑液囊支原体的引物对是根据鸡滑液囊支原体的vlhA基因的保守序列设计的。
2.根据权利要求1所述的多重荧光免疫分析引物组，其特征在于，用于检测鸡毒支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：
MG引物G1：5’-CTTACAGATTACAGGAGCAG-3’（SEQ ID NO.1），
MG引物G2：5’-AAGCATTTCATTTGTTTTAC-3’（SEQ ID NO.2）；
用于检测鸡滑液囊支原体的引物对的核苷酸序列如下所示：
MS引物S1：5’-ATTAGCAGCTAGTGCAGTGG-3’（SEQ ID NO.3），
MS引物S2：5’-TTTGAGGATTATCAGTATTTG-3’（SEQ ID NO.4）。
3.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于：引物G1和S1的5’端还通过间隔臂序列添加有tag序列。
4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于：引物G1和S1的5’端的tag序列分别为：
引物G1的tag序列为：5’-CACTACACATTTATCATAACAAAT-3’（SEQ ID NO.5）；
引物S1的tag序列为：5’-CTTTCTTAATACATTACAACATAC-3’（SEQ ID NO.6）。
5.根据权利要求1或2所述的引物，其特征在于：引物G2和S2的5’端还添加有生物素标记。
6.一种用于检测检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：（1）权利要求1-5任一项所述的引物组；（2）2种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球，所述anti-tag序列能相应地与权利要求3或4中的tag序列互补配对；（3）链霉亲和素-藻红蛋白复合物。
7.一种用于检测鸡毒支原体和鸡滑液囊支原体的多重荧光免疫分析方法，包括如下步骤：
从样品中提取DNA，以DNA为模板，加入权利要求1-5任一项所述的引物组进行PCR扩增；
将扩增产物、2种编码不同荧光色的包含有anti-tag序列的荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交；杂交结束后，利用仪器进行分析，确定其病原的类型。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2）中的荧光编码微球上包被有特异的anti-tag序列，所述anti-tag序列能相应地与权利要求3中的tag序列互补配对。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤1）中PCR扩增的反应体系为：
2×Multiplex PCR Master Mix 10ul
上游引物混合液 1ul
下游引物混合液 1ul
模板 1ul
ddH2O 7ul
Total 20ul
PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火90s，72℃延伸20s；循环35次；72℃终延伸10min。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤2）中扩增产物、荧光编码微球和链霉亲和素-藻红蛋白杂交的体系为：
荧光编码微球 20µL
链霉亲和素-藻红蛋白 75µL
扩增产物 5µL
Total 100µL
37℃反应30min。
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