CN105384800A - 金黄色葡萄球菌taf融合蛋白制备方法及其应用 - Google Patents

金黄色葡萄球菌taf融合蛋白制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段，并且提供了该免疫优势片段的编码基因。本发明还涉及了一种含有金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段的融合蛋白，是由金黄色葡萄球菌的TRAP蛋白、α-溶血素免疫优势片段和金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段融合而成，并且提供了该融合蛋白的编码基因、制备方法以及用途。利用本发明的TAF融合蛋白对小鼠免疫攻毒试验，表明TAF融合蛋白具有较好的免疫保护性效果，是金黄色葡萄球菌的理想疫苗抗原，在新型疫苗的开发应用方面具有重要的价值。

Description

金黄色葡萄球菌TAF融合蛋白制备方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种金黄色葡萄球菌TAF融合蛋白制备方法及其应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)可引起人类多种感染，也是奶牛***炎的一种重要致病菌。随着耐药菌株的大量出现和抗生素疗效渐失，疫苗免疫接种成为预防S.aureus感染的最佳选择。金黄色葡萄球菌产生大量的致病因子，可以通过粘附、免疫逃避以及产生侵袭性毒素和酶等因子致病，因此，有效的S.aureus疫苗应该是针对同时阻断以上环节的多抗原疫苗。
金黄色葡萄球菌FnBPA是重要的粘附分子，并具有良好的抗原性。Trap具有抗氧化应激作用，并能诱导良好的免疫保护性作用。α-溶血素是S.aureus重要的外毒素，也是引起肺炎的主要致病因子，具有良好的免疫原性。到目前为止，有关FnBPA、Trap和Hla融合蛋白的免疫原性和免疫保护作用未见报道。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段及编码该优势片段的基因。
本发明的第二目的是提供含有上述金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段的融合蛋白以及编码该融合蛋白的基因。
本发明的第三目的是提供上述融合蛋白的制备方法。
本发明的第四目的是提供上述融合蛋白的用途。
本发明通过以下技术方案来实现：
一、一种金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段，包括FnBPA蛋白N区域中301-430位氨基酸和FnBPA蛋白r1-11区域中FnBPAr10-11的801-874位氨基酸两个片段，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
进一步的，编码上述的免疫优势片段的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
进一步的，上述的金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。
二、一种金黄色葡萄球菌TAF融合蛋白，是由金黄色葡萄球菌的TRAP蛋白、α-溶血素免疫优势片段和金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段融合而成，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。
进一步的，编码上述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
三、上述的融合蛋白的制备方法，包括用上述的基因克隆至原核细胞中进行异源表达，并纯化该融合蛋白。
四、上述的融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。
本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。
首先以金黄色葡萄球菌基因组为模板，通过PCR方法扩增获得FnBPA蛋白N区域中301-430位氨基酸(FnBPA301-430aa)的基因片段和FnBPA蛋白r1-11区域中FnBPAr10-11的801-874位氨基酸(FnBPA801-874aa)基因片段，然后用人工肽linker将FnBPA301-430aa和FnBPA801-874aa融合，命名为FL，并通过免疫保护作用研究，选择和确定了FnBPA免疫优势区(FL)。在此基础上，设计引物，通过重叠延伸PCR方法扩增获得Trap、HlaD和FL的融合基因，并将该基因***到表达载体pET-32a，转化大肠杆菌，经IPTG诱导后可获得高水平表达的可溶性融合蛋白TAF。
利用该融合蛋白N末端含有的6个连续His残基能与Ni2+柱结合的特性，选用MagneHisTM蛋白纯化***进行纯化，并将纯化后的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备疫苗免疫小鼠，然后进行免疫原性和免疫保护作用研究。
采用上述技术方案的积极效果：本发明的TAF融合蛋白制得的疫苗免疫小鼠后，检测体液和细胞免疫应答水平，并进行攻毒，结果证实该融合蛋白疫苗具有较好的免疫保护性效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原，即本发明的融合蛋白具有更好的免疫原性及免疫保护作用；另外，本发明的TAF融合蛋白不但进一步提高了抗金黄色葡萄球菌感染的保护作用，而且简化了制备过程，在新型疫苗的开发应用方面具有重要的价值。
附图说明
图1为FnBPA301-430aa，FnBPA801-874aa、fl的PCR产物电泳分析结果。其中，A为FnBPA301-430aa的PCR产物，390bp；B为FnBPA801-874aa的PCR产物结果，222bp；C为fl的PCR产物结果，657bp；其中每个图中，M为DNAMarkerDL5000；1为阴性对照；2为PCR产物结果；
图2为重组质粒FnBPA301-430aa-pET32a、FnBPA801-874aa-pET32a和fl-pET32a表达载体重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定结果。A图为FnBPA301-430aa-pET32a酶切鉴定和PCR鉴定；B图为FnBPA801-874aa-pET32a酶切鉴定和PCR鉴定；C图为fl-pET32a酶切鉴定和PCR鉴定。其中，每个图中的M为DNAMarkerDL5000；1为重组质粒的鉴定结果；2为重组质粒的酶切鉴定结果；
图3为重组FnPBA301-430aa、FnBPA801-874aa和FL蛋白表达及纯化结果。图A为FnBPA301-430aa；图B为FnBPA801-874aa；图C为FL。其中，每个图中的1为未诱导的重组菌；2-6为IPTG分别诱导1-5h的重组菌；7为蛋白纯化结果；M为蛋白质Marker；
图4为重组蛋白FnBPA301-430aa、FnBPA801-874aa和FL免疫小鼠后攻毒结果(n＝10)。其中，图A为实验动物S.aureusNewman株攻毒后存活数；图B为实验动物S.aureusWood46株攻毒后存活数；图C为实验动物S.aureusHLJ23-1株攻毒后存活数；
图5为HlaD、Trap和fl的PCR产物电泳分析结果。其中A为HlaD的PCR产物，459bp；B为Trap的PCR产物结果，498bp；C为fl的PCR产物结果，657bp；M为DNAMarkerDL5000；
图6为TAF基因PCR扩增过程结果。其中，A为Trap+linker基因PCR扩增产物；B为Linker+HlaD+linker基因PCR扩增产物；C为Trap+linker+HlaD+linker基因PCR扩增产物；D为Linker+fl基因PCR扩增产物；E为Trap+Linker+HlaD+Linker+fl(TAF)基因扩增产物；
图7为重组质粒Trap-pET32a、HlaD-pET32a、TAF-pET32a双酶切鉴定结果；
图8为重组蛋白Trap、HlaD、FL、TAF的SDS-PAGE分析结果。其中，1泳道为蛋白分子量Marker；2、6、10、14泳道为pET32a空载体对照；3-5泳道分别为重组蛋白FL诱导前、诱导后及纯化后蛋白；49.1KD；7-9泳道分别为重组蛋白HlaD诱导前、诱导后及纯化后蛋白；36.8KD；11-13泳道分别为Trap蛋白诱导前、诱导后及纯化后蛋白；38.2KD；15-17泳道分别为重组蛋白TAF诱导前、诱导后及纯化后蛋白；82.4KD；
图9为肺部攻毒组免疫小鼠肺部细菌含量(Newman)；
图10为Trap-HlaD-FL(TAF)融合蛋白扩增方法。
具体实施方式
本发明中生物材料的来源：
1、金黄色葡萄球菌：金黄色葡萄球菌Newman株、Wood46株和HLJ23-1，金黄色葡萄球菌凝集因子A的免疫原性，冯昊、刘乐峰、迟佳琦、王宁、李闰婷、佟春玉、马金柱、朱战波、崔玉东，生物工程学报，2009,25(8)：1180-1186；另外，该生物专利还公开在专利“金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白的制备及应用”中，专利号：201110231144.4，申请日2011.08.12，公开日2011.12.14和专利“金黄色葡萄球菌ITC融合蛋白及制备方法和应用”中，专利号：201310480520.2，申请日2013.10.15，公开日2014.02.12中；
2、重组质粒FnBPA-pET32a：金黄色葡萄球菌Trap、FnBPA和α-溶血素融合蛋白免疫原性研究，刘道龙，硕士论文，授予单位：黑龙江八一农垦大学，导师：崔玉东教授，公开日期：2014年；
3、重组质粒Trap-pET32a：金黄色葡萄球菌IsdB3与TRAP融合蛋白免疫保护作用研究，王宁，硕士论文，授予单位：黑龙江八一农垦大学，导师：崔玉东教授，公开日期：2009年；另外，该生物专利还公开在专利“金黄色葡萄球菌IsdBid-TRAP融合蛋白的制备及应用”中，专利号：201110231144.4，申请日2011.08.12，公开日2011.12.14中；
4、重组质粒HlaD-pET28a：预防葡萄球菌α-溶血素肺炎的新型疫苗，代健，硕士论文，授予单位：黑龙江八一农垦大学，导师：崔玉东教授，公开日期：2013年；
5、所有引物为自行设计并委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
下面结合实施例和试验例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制：
实施例1
本实施例说明金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段(FL)选择和确定。
1、参照已发表的FnBPA基因序列，研究获得的数据及在线软件的表位分析将该基因序列分为两段，取FnBPA蛋白N区域中301-430位氨基酸命名为FnBPA301-430aa，设计上下游引物为F1，R1；取FnBPAr1-11区域中FnBPAr10-11(801-874aa)命名为FnBPA801-874aa，设计上下游引物为F2，R2；设计人工肽段刚性Linker(LAEAAAKEAAAKAAA)将FnBPA801-874aa和FnBPA301-430aa融合，命名为FL，采用overlapPCR方法设计连接F3，F10上下游引物分别为P2，P3；具体Primersofcoding、Primerlocation、Primersequence及扩增片段长度见表1；下划线代表引入的酶切位点，上游引入BamHⅠ，下游引入HindⅢ。
表1PCR引物及Linker设计
2、FnBPA-pET32a重组菌培养及质粒提取
取-70℃保存的含有FnBPA-pET32a重组质粒的重组菌，在含有氨苄抗性(Amp+)LB固体琼脂平板中划线，37℃培养过夜，次日无菌操作挑取单菌落加入含有Amp+抗性LB培养基中，180rpm/min37℃培养16h左右，无菌操作取2ml菌液加入到2.0tube管中，12000rpm/min离心1min，弃净上清液。质粒提取实验试剂盒(GTPlasmidminipreppurificationkit)提取，按说明书进行。将提取的质粒取2-5μl至1％琼脂凝胶电泳中进行验证。
3、目的基因扩增
PCR反应按照以下方案进行。将微量反应管置于冰上，按照说明书依次加入，(无菌ddH2O14.8μl，10×PCR缓冲液2μl，寡核苷酸1μl，上游及下游引物(20μM)1μl，TemplateDNA(200ng/μl)1μl，DNApolyase(5U/μl)0.2μl用于PCR扩增。
(1)FnBPA301-430aa、FnBPA801-874aa基因片段的扩增
以FnBPA-pET32a质粒作为模板DNA，以F1、R1为引物扩增FnBPA301-430aa基因，反应条件如下：94℃预变性10min后，95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，进行30个循环，最后72℃延伸l0min，PCR产物验证后4℃保存。
(2)fl基因片段的扩增
以FnBPA301-430aa纯化后的PCR产物为模板，以F1、P2为引物扩增上游片段FL1，反应条件中退火温度为60℃其余同FnBPA301-430aa基因扩增方法；以FnBPA801-874aa纯化后PCR产物为模板，分别以P3，R2为引物扩增下游FL2片段，反应条件中退火温度为59℃其余同FnBPA301-430aa基因扩增方法；以纯化后FL1，FL2的PCR产物为模板(根据DNA浓度以1：1比例加入模板)，以F1，R2为上下游引物扩增目的片段FL，反应条件中梯度探索退火温度为54℃其余同f3基因扩增方法，PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳进行验证后回收FL目的片段，以回收后的目的片段FL基因模板，以F1，R2为上下游引物进行再次扩增纯化，PCR产物1％琼脂糖凝胶电泳验证后4℃保存。
PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行验证，电泳结果在390bp，222bp和657bp处分别出现电泳带，与预期扩增产物目的片段大小一致，如图1所示。
4、PCR产物回收与纯化
将PCR扩增产物在琼脂糖凝胶中电泳后，于紫外灯下切取含有目的DNA片段的凝胶，用DNA凝胶回收试剂盒(DNAGelExtractionKit)回收和纯化DNA，具体过程按照说明书进行。
5、PCR产物与pMD18-T载体的连接转化
在PCR微量反应管中，依照pMD18-TVectorkit试剂盒说明书，依次加入pMD18-TVector0.5μl，已纯化的PCR产物4.5μl，SolutionI5.0μl混匀后，16℃水浴连接过夜。然后，将连接产物全量加入到感受态细胞中，混匀，冰上放置30min，然后42℃热休克90s，注意不要摇动，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2min，立即加入事先预热到37℃无抗生素的800μLLB培养基，37℃空气摇床温和振荡培养1h，培养物瞬时离心，取200μL上清液，均匀涂布于含50μg/mLAmp+的LB平板上,待液体被吸收后倒置平板，37℃温箱中过夜培养。
6、重组质粒的鉴定
FnBPA301-430aa-pMD18T、FnBPA801-874aa-pMD18T和fl-pMD18T重组质粒按下列体系进行双酶切鉴定(重组质粒30μl，10×Buffer5μl，BamHI2.5μl，HindIII2.5μl，ddH2O总体系50μl)。混匀后37℃水浴3h，取5μl上样，于1％琼脂糖凝胶电泳验证。将鉴定正确的阳性菌株送北京金伟智公司进行基因测序，将测序结果用BLSAT方法与GenBank中已发表的标准序列进行比较。
7、重组蛋白原核表达载体构建
将pET-32a质粒用限制性核酸内切酶BamHI和HindⅢ进行双酶切，用DNA纯化/回收试剂盒进行回收。同时将重组克隆质粒FnBPA301-430aa-pMD18，FnBPA801-874aa-pMD18，fl-pMD18分别用限制性核酸内切酶BamHI和HindⅢ进行双酶切，用DNA纯化/回收试剂盒回收目的基因FnBPA301-430aa，FnBPA801-874aa和fl片段。在3个灭菌的PCR反应管中，分别将目的基因FnBPA301-430aa，FnBPA801-874aa和fl基因片段与载体pET-32a双酶切片段，在T4Ligase作用下连接过夜，然后按前述方法进行转化，酶切后通过1％琼脂凝胶电泳分析后发现，均在预期位置出现目的基因条带及载体片段条带；将鉴定正确的质粒作为模板，通过设计的引物进行PCR验证，1％琼脂凝胶电泳结果出现目的条带且与双酶切后目的基因大小一致，如图2所示。将鉴定正确的质粒转入Rosetta(DE3)感受态细胞中，送上海生工生物工程公司测序。所获序列用Blast程序与GenBank中己发表的标准序列进行比较，同源性达到100％。将鉴定为阳性菌株的重组克隆命名为FnBPA301-430aa-pET32a、FnBPA801-874aa-pET32a、fl-pET32a。
8、重组蛋白的诱导表达
将含有FnBPA301-430aa-pET32a、FnBPA801-874aa-pET32a、fl-pET32a的重组质粒Rosetta(DE3)表达菌株接种于含Amp+的50mLLB液体培养基中，37℃培养至OD600值为0.6时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续剧烈振荡培养，分别在1h、2h、3h、4h取2mL菌液，12000r/min离心1min，倒掉上清，在沉淀中加入90μL1×上样缓冲液和10μL1MDTT，吹打混匀，煮沸5min，取10μL在10％的SDS-PAGE进行电泳分离。电泳后取出凝胶，置于考马斯亮蓝R-250染色液中，在脱色摇床上染色1h，弃去染色液，用蒸馏水淋洗凝胶后，加入脱色液，在摇床上脱色1h，待蓝色背景消失、目的条带清晰时，用清水冲洗，照相保存。
通过与蛋白质分子量Marker和诱导0h相比对，诱导后的目的蛋白大小分别为39.3KD(FnBPA301-430aa)、33.1KD(FnBPA801-874aa)和49.1KD(FL)，与纯化后的目的蛋白大小一致，如图3所示。
9、重组蛋白的纯化
重组细菌培养物生长至A600值为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度1mM/L，继续振荡培养4-5h测定诱导菌的A600值。然后，用Promega公司的MagneHisTM蛋白纯化试剂盒进行纯化，纯化后蛋白通过SDS-PAGE来进行纯度验证。
10、动物免疫和攻毒实验
将纯化蛋白和等体积的弗氏佐剂进行乳化，制备免疫原。取150只健康雌性、6周龄、体重16～18g的SPF级ICR小鼠随机分成5组，每组30只(FnBPA组，FnBPA301-430aa免疫组、FnBPA801-874aa免疫组、FL实验组、Mock组)。其中每组再分为3小组，每组10只，分别为S.aureusNewman，Wood46，HLJ23-1攻毒组；另取25只健康雌性、6周龄、体重16～18g的SPF级blab/c小鼠随机分为5组(FnBPA组，FnBPA301-430aa免疫组、FnBPA801-874aa免疫组、FL组，Mock组)。每只小鼠采用肌肉注射100μg重组蛋白抗原，对照组注射等体积的佐剂与PBS混合物，首次免疫后21d进行第二次免疫，二次免疫后14d进行腹腔攻毒，每日观察小鼠的死亡情况，记录时间为10d。
各实验免疫组，在加强免疫14d后用金黄色葡萄球菌Newman，Wood46，HLJ23-1菌株以绝对致死量进行攻毒，攻毒后观察实验小鼠死亡情况并记录数据。结果显示，FL实验组对攻毒菌株的免疫保护率分别为60％(Newman株)、60％(Wood46株)和80％(HLJ23-1株)，FnBPA301-430aa实验组对攻毒菌株的免疫保护率为分别为40％(Newman株)、30％(Wood46株)和40％(HLJ23-1株)，FnBPA801-874aa实验组对攻毒菌株的免疫保护率分别为50％(Newman株)、50％(Wood46株)和50％(HLJ23-1株)，FnBPA实验组对攻毒菌株的免疫保护率分别为80％(Newman株)、70％(Wood46株)和80％(HLJ23-1株)，如图4所示。
以上说明，FL具有与FnBPA相近的免疫原性和免疫保护作用，为免疫优势片段。
实施例2
本实施例说明金黄色葡萄球菌TAF融合蛋白的制备。
1、根据本实验获得的FL及前期本实验室获得的蛋白HlaD以及Trap，在基因序列正确的前提下，根据已发表的基因序列，采用Primer5软件设计引物及人工肽段Linker。具体见表2以及扩增方法示意图(图10)所示。表中下划线为酶切位点，引物斜体为Linker。引物PT、RT扩增目的蛋白Trap，引物PH、RH扩增目的蛋白HlaD，引物PF、RF扩增目的蛋白FL。
表2引物和linker的设计方案
2、Trap、HlaD和FL目的基因的扩增
PCR扩增方法：将微量反应管放于低温下，根据说明书加入所用试剂，(无菌ddH2O12.5μl，10×PCR缓冲液2μl，寡核苷酸1μl，上游及下游引物各(30μM)1.5μl，TemplateDNA(200ng/μl)1μl，DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl进行PCR扩增。Trap基因的扩增：以Trap-pET32a为模板，PT1和RT2为上下游引物；反应条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。HlaD基因的扩增：以实验室保存的HlaD-pET28a为模板，PH1和RH2为上下游引物；反应条件同Trap基因PCR扩增条件。fl基因的扩增：略，见前述。PCR扩增结果产物1％琼脂糖凝胶电泳进行验证。电泳结果在459bp，498bp和657bp处分别出现电泳带，与预期扩增产物目的片段大小一致，如图5所示。
3、TAF基因设计方案
采用重叠引物PCR方法。具体为：
(1)以纯化后的Trap基因为模板，以PT1和P4为上下游引物。反应条件如下：94℃预变性5min；94变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s及30循环，72℃全部延伸10min。产物通过1％琼脂糖凝胶进行电泳验证，得到大小543bp目的片段A。
(2)以纯化后的HlaD基因为模板，以P5和P6为上下游引物。反应条件如下：94℃预变性5min；94变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s及30循环，72℃全部延伸10min。产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证，此得到大小549bp的目的片段B。
(3)以回收纯化的A、B基因片段为模板，PT1和P6为上下游引物。反应条件如下：94℃预变性5min；94变性30s，66℃退火30s，72℃延伸60s及25循环，72℃全部延伸10min。产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证。以回收产物为模板，PT1和P6为上下游引物进行再次PCR。反应条件如下：94℃预变性5min；94变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s及30循环，72℃全部延伸10min。产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证，得到大小1047bp的目的片段C。
(4)以回收纯化后的FL基因片段为模板，以P7和RF2为上下游引物。94℃预变性5min；反应条件如下：94变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s及30循环，72℃全部延伸10min。产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证，得到大小702bp的目的片段D。
(5)以回收纯化的C、D基因片段为模板，PT1和RF2为上下游引物。反应条件如下：94℃预变性5min；94变性30s，68℃退火30s，72℃延伸60s及25循环，72℃全部延伸10min。产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证。以回收产物为模板，PT1和RF2为上下游引物进行再次PCR。反应条件如下：94℃预变性5min；94变性30s，54℃退火30s，72℃延伸60s及30循环，72℃全部延伸10min。产物通过1％琼脂糖凝胶电泳验证，得到预期大小1704bp的目的片段E，为本实验TAF目的基因片段。
结果如图6所示。
4、融合基因TAF原核表达载体的构建、鉴定和表达
具体方法见实施例一。
将测序正确的双酶切目的片段进行基因回收，回收产物同BanmHⅠ和HindⅢ双酶切的表达载体pET32a进行连接转化培养，提取单菌落，扩增培养提取质粒，质粒用BanmHⅠ和HindⅢ酶切验证，在1％凝胶电泳分析，出现预期大小的目的条带，载体大小为5900bp，如图7所示。
取鉴定正确的质粒转化到表达菌Rosetta(DE3)，在Amp+抗性LB培养基中培养至OD6000.4～0.6后，加入IPTG至终浓度1mM，取诱导前及诱导后5h菌液，处理后进行SDS-PAGE验证。通过镍柱纯化方法纯化目的蛋白，SDS-PAGE进行分析，结果显示在49.1KD(FL)、36.8KD(HlaD)、38.2KD(Trap)、82.4KD(TAF)出现条带与预期大小相同，如图8所示。蛋白分子量Marker红色条带大小为72KD。
实施例3
本实施例说明TAF、Trap、HlaD和FL蛋白免疫效果对比。
1、动物免疫和攻毒试验
取健康、雌性、相同周龄的SPF级ICR小鼠180只，分为腹腔组和肺部组。其中腹腔组分为Trap实验组、FL实验组、TAF实验组、混合蛋白组(Mixture组)和Mock组，每组20只；肺部组分为HlaD实验组、TAF实验组、混合蛋白组(Mixture组)和Mock组，每组20只。纯化各实验组蛋白1mg/ml，以1：1的比例与弗式完全佐剂进行乳化，每只200μl小鼠腿部肌肉注射免疫；首次免疫后21d，将蛋白与不完全弗氏佐剂以1：1比例进行乳化，腿部肌肉注射加强免疫。
本实验取人源S.aureusNewman和牛源S.aureusHLJ23-1标准菌株进行攻毒。取稀释好的菌液对二免后14d的小鼠腹腔攻毒及肺部灌肺攻毒，并每天记录小鼠状态以及死亡数目，持续一周，无菌状态下解剖死亡小鼠并分离病菌，分析是否为实验攻毒菌导致小鼠死亡。
试验时使用SPF级ICR小鼠为模型具体分组见表3。
表3腹腔组小鼠模型分组
在加强免疫后14d用金黄色葡萄球菌Newman，HLJ23-1菌株以绝对致死量(金黄色葡萄球菌Newman株以1.5×1010CFU/mouse和金黄色葡萄球菌HLJ23-1分离株以1.0×1010CFU/mouse的剂量)进行小鼠腹腔攻毒，攻毒后观察实验小鼠死亡情况并记录数据，见表4。攻毒Newman株TAF免疫保护率为90％，攻毒HLJ23-1株TAF免疫保护率为80％。
表4腔组小鼠模型攻毒结果
小鼠肺部攻毒组采用金黄色葡萄球菌Newman株以5×108CFU/mouse和HLJ23-1地方分离株以4×108CFU/mouse的剂量进行，攻毒后观察实验小鼠死亡情况并记录数据，见表5。攻毒Newman株TAF免疫保护率为100％，攻毒HLJ23-1株TAF免疫保护率为90％。
表5肺部组小鼠模型攻毒结果
2、抗体水平
用间接ELISA检测分离的血清样本中IgG含量。大量纯化实验组蛋白TAF，HlaD，FL，Trap备用。
包被抗原均以10μg/mL浓度，每孔100μL包被96孔酶标板，37℃两小时，然后用PBST洗涤。每孔加100μL5％脱脂乳的PBST封闭液，37℃封闭1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的待检免疫血清，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入PBS稀释的Goatanti-MouseIgG-Peroxidase二抗，37℃孵育1h，洗涤；每孔加入100μLTMB显色液，室温显色10min后每孔加入50μL2M的硫酸终止反应，测OD450nm吸光值。分析结果。当样品OD450值≥(阴性血清的OD450值+3倍标准方差)时即为阳性。
结果表明重组蛋白TAF抗体效价最高，高于Trap、HlaD及FL实验组。
表6各实验组血清中抗体IgG效价比
3、细胞因子检测
用Elispot方法检测IL-4、INF-γ含量。用ELISA方法检测IL-2、IL-17含量。按细胞因子检测试剂盒的操作步骤进行。
应用ELISPOT方法测定各实验免疫组和对照组小鼠的淋巴细胞IL-4、IFN-γ分泌水平(表7)。重组蛋白TAF实验组中IL-4、INF-γ含量高于其他各实验组差异显著(P＜0.05)，同对照组比较差异较显著(p<0.01)。
表7各实验组细胞因子IL-4、INF-γ含量
应用ELISA方法测定各实验重组蛋白免疫组和对照免疫组小鼠脾脏细胞上清液中IL-2、IL-17分泌水平(表8)。所得结果经t-检验表明重组蛋白免疫组小鼠脾淋巴细胞上清液中IL-2、IL-17分泌量同其他各实验组比较差异显著(P＜0.05)，与对照组比较差异较显著(p<0.01)。
表8IL-2、IL-17含量分析
4、小鼠肺部细菌承载量实验
检测小鼠肺炎症状与病原菌之间的病理关系，在实验小鼠攻毒一段时间后(24h)，断颈处死，在无菌环境中取其肺部，称其重量，以1mg比例加入2ml无菌PBS，充分研磨后加入7ml无菌PBS缓冲液至10ml，200μl上清液进行连续的倍比稀释，稀释后在TSA培养基中涂板计数，记录各个实验组和对照组中菌落数目，并分析数据结果。
结果：重组蛋白TAF实验组肺部承载量最低，HlaD免疫组其次，对照组最低，如图9所示。
以上结果表明，本发明TAF融合蛋白疫苗的免疫效果优于各蛋白单独或混合在一起免疫的免疫效果，是制备金黄色葡萄球菌疫苗理想的候选抗原，即本发明的融合蛋白具有更好的免疫原性及免疫保护作用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段，其特征在于：包括FnBPA蛋白N区域中301-430位氨基酸和FnBPA蛋白r1-11区域中FnBPAr10-11的801-874位氨基酸两个片段，其氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。
2.编码权利要求1所述的免疫优势片段的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。
3.权利要求1所述的金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。
4.一种金黄色葡萄球菌TAF融合蛋白，其特征在于：是由金黄色葡萄球菌的TRAP蛋白、α-溶血素免疫优势片段和金黄色葡萄球菌FnBPA免疫优势片段融合而成，其氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。
5.编码权利要求4所述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。
6.权利要求4所述的融合蛋白的制备方法，包括用权利要求5所述的基因克隆至原核细胞中进行异源表达，并纯化该融合蛋白。
7.权利要求4所述的融合蛋白在制备金黄色葡萄球菌疫苗中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544352A (zh) * 2016-10-30 2017-03-29 吉林农业大学 一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0397633B1 (en) * 1989-05-11 1995-08-02 Alfa-Laval Agri International Ab Fibronectin binding protein as well as its preparation
CN1953991A (zh) * 2004-05-21 2007-04-25 惠氏公司 变异的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白
CN102304185A (zh) * 2011-09-02 2012-01-04 黑龙江八一农垦大学 预防奶牛***炎的融合蛋白sip-trap及制备方法和应用
CN103570835A (zh) * 2013-10-15 2014-02-12 黑龙江八一农垦大学 金黄色葡萄球菌itc融合蛋白及制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0397633B1 (en) * 1989-05-11 1995-08-02 Alfa-Laval Agri International Ab Fibronectin binding protein as well as its preparation
CN1953991A (zh) * 2004-05-21 2007-04-25 惠氏公司 变异的金黄色葡萄球菌纤连蛋白结合蛋白
CN102304185A (zh) * 2011-09-02 2012-01-04 黑龙江八一农垦大学 预防奶牛***炎的融合蛋白sip-trap及制备方法和应用
CN103570835A (zh) * 2013-10-15 2014-02-12 黑龙江八一农垦大学 金黄色葡萄球菌itc融合蛋白及制备方法和应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARAI RYOICHI 等: "Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein", 《PROTEIN ENGINEERING》 *
INFORMATICS，PATHOGEN.: "alphahemolysin [Staphylococcus aureus]", 《GENBANK DATABASE》 *
MEENAN 等: "The Tandem β-Zipper Model Defines High Affinity Fibronectin-binding Repeats within Staphylococcus aureus FnBPA", 《JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
SIGNAS 等: "Nucleotide sequence of the gene for a fibronectin-binding protein from Staphylococcus aureus- use of this peptide sequence in the synthesis of biologically active peptides", 《PROC. NATL. ACAD. SCI.》 *
刘道龙 等: "《中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第十次学术研讨会 论文集》", 22 December 2014 *
陈龙欣: "金黄色葡萄球菌IsdB、TRAP和ClfA融合蛋白的免疫保护作用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106544352A (zh) * 2016-10-30 2017-03-29 吉林农业大学 一种基于FnBPA蛋白的侵入型乳酸菌

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