CN103830722A - 一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程苗及其应用；是利用β毒素特异性引物,复活C型产气荚膜梭菌菌种，PCR扩增获得β毒素基因片段（930bp）连接到PET-28a（+）质粒上，然后将重组质粒导入受体菌株，成功构建重组菌株BL21(DE3)-β；重组的菌株BL21(DE3)以包涵体的形式高效表达β毒素；将β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1:1的比例进行乳化，加入0.01%的硫柳汞制得疫苗。该疫苗用于免疫妊娠后期的母畜，新生仔畜通过初乳获得被动免疫，能有效预防幼畜出血性坏死性肠炎(羔羊痢疾、犊牛肠毒血症、仔猪红痢等)；通过进行免疫保护效力实验证明该疫苗对兔的保护力达到了100%。

Description

一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用

（一）技术领域

本发明涉及一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用。

（二）发明背景

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种革兰氏阳性、产生芽胞、严格厌氧及形成特殊荚膜的梭状杆菌。根据其产生四种致死性毒素(α、β、ε、ι毒素)的能力,将其分为五种类型,即A、B、C、D、E五种类型。产气荚膜梭菌β毒素是由产气荚膜梭菌B型和C型菌株产生的坏死、致死性毒素，可以产生溶血性的坏死，其毒性作用表现在小肠绒毛上，可引起人和动物的坏死性肠炎。

我国是畜牧业大国,猪、牛、羊是主要经济家畜,幼畜腹泻是影响畜牧业发展的重要疫病。由产气荚膜梭菌β毒素引起的幼畜出血性坏死性肠炎(羔羊痢疾、犊牛肠毒血症、仔猪红痢等),在我国广大牧区流行十分严重,有较高的发病率和死亡率,给畜牧业造成了巨大的经济损失。幼畜腹泻的药物治疗不但价格昂贵、费力费工,而且效果不好，更因致病菌抗药菌株日趋增多,用药往往无效,因而免疫预防是控制这类疫病的最佳选择。临床上产气荚膜梭菌类毒素疫苗存在致病的隐患，而基因工程疫苗安全性高而且产量高、纯度高。

（三）发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗及其应用，具备免疫力强、针对性好、无毒副作用、安全性好等优点。

一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，是将β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞制得；所述的β毒素蛋白的制备方法包括以下步骤：

1）菌种复活及模板制备

用接种环挑取C型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板。

2）β毒素基因的克隆

根据GenBank中β毒素的基因序列设计引物进行PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;（SEQ.ID.N03所示）

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT（SEQ.ID.N04所示）

3）构建原核表达载体pET28a-β

将目的基因PCR产物和表达载体pET28a均使用Eco RI和Xho I酶切；将酶切后分别回收的目的基因PCR产物和表达载体pET28a进行纯化。将纯化的目的基因PCR产物和载体pET28a进行连接，得到重组质粒pET28a-β。将pET28a-β与BL21(DE3)感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-β。

4）β毒素基因的原核表达、蛋白纯化

用0.6mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到β毒素蛋白。

本发明还涉及一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1）菌种复活及模板制备

用接种环挑取C型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板。

2）β毒素基因的克隆

根据GenBank中β毒素的基因序列设计引物进行PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;（SEQ.ID.N03所示）

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT（SEQ.ID.N04所示）

3）构建原核表达载体pET28a-β

将目的基因PCR产物和表达载体pET28a均使用Eco RI和Xho I酶切；将酶切后分别回收的目的基因PCR产物和表达载体pET28a进行纯化。将纯化的目的基因PCR产物和载体pET28a进行连接，得到重组质粒pET28a-β。将pET28a-β与BL21(DE3)感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-β。

4）β毒素基因的原核表达、蛋白纯化

用0.6mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到β毒素蛋白。

5）β毒素基因工程苗制备

将上述步骤中制备好的β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。

本发明还涉及一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗在预防因产气荚膜梭菌β毒素引起的仔猪红痢中的应用：

于怀孕母猪产前30日和15日各肌肉注射一次本发明制备的产气荚膜梭菌β毒素基因工程苗，每次6ml/只，用于免疫妊娠后期母猪，新生仔猪通过吮食初乳而获得被动免疫，预防仔猪红痢。

有益效果

本研究开发制备了安全性高、免疫力强、治疗效果好，无毒副作用的产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，用于免疫妊娠后期的母畜，新生仔畜通过初乳获得被动免疫，能有效预防幼畜出血性坏死性肠炎(羔羊痢疾、犊牛肠毒血症、仔猪红痢等)。

（四）附图说明

图1是表达出的目的蛋白β毒素SDS-PAGE电泳图。

从图上可以看出表达出的目的蛋白大小为38KD与β毒素大小一致，说明成功表达出了目的蛋白。

图2是该基因工程苗的制备工艺流程

（五）具体实施方式

1、菌种复活及模板制备

用接种环挑取C型产气荚膜梭菌菌种(National Collection of Type Cultμres英国微生物菌种保藏中心保藏，NCTC3180)接种于一个血平板培养基（100毫升蒸馏水、1克葡萄糖和3.8克豆琼脂粉灭菌后，加入5毫升绵羊血分装到六个血平板上）上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h。取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）（培养基成分通用）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒（大连宝生物公司）说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板。

2、β毒素基因的克隆及表达载体的构建

（1）引物的设计

根据GenBank中β毒素的基因序列（登录号L13198，其核苷酸序列如SEQ.ID.N01所示）设计的引物如下：

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT

（2）β毒素基因的克隆及回收

以第一步提取的DNA为模板，扩增产物为930bp的目的基因（反应体系如下：上游引物2μl，下游引物2μl，cDNA2μl，dNTP1μl，10X pfμBμffer5μl，Pfμ高温聚合酶0.4μl，ddH2O补齐至50μl）。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，用DNA凝胶回收试剂盒（大连宝生物公司）回收目的条带。

（3）酶切目的基因PCR产物及表达载体pET28a

将目的基因PCR产物使用EcoR I和Xho I酶切（反应体系为：PCR产物20μl，EcoR I1μl，Xho I1μl，10X Buffer Tango5μl，ddH₂O23μl）在37℃恒温水浴锅中反应4h；将表达载体pET28a用EcoR I和Xho I酶切（体系为：pET28a1μg，EcoR I1μl，Xho I1μl，10X Buffer Tango5μl，ddH₂O补足至50μl）在37℃恒温水浴锅中反应4h。

（4）回收目的基因PCR产物及载体并进行纯化

酶切结束后通过1%琼脂糖凝胶电泳分别回收目的基因PCR产物及载体并进行纯化。胶回收及纯化目的基因PCR产物及载体的过程如下：

a.从琼脂糖凝胶中分别割下含有目的基因PCR产物及载体的胶块并称重。

b.加入胶块重量3倍的BμfferB2，50℃水浴5min。

c.将溶胶液移入吸附柱中，8000g离心30s，倒掉收集管中的液体。

d.加入500μlWash Solution，9000g离心30s，倒掉收集管中的液体，重复该过程一次。

e.将另一空吸附柱于9000g离心1min，再放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入40μl Elution Buffur，室温静置1min，然后保存管中的胶回收及纯化的目的基因PCR产物。

（5）重组质粒的制备

将回收纯化的目的基因PCR产物与载体pET28a进行连接，反应体系为：PCR产物5μl，表达载体pET28a5μl，10X T4DNA ligase Buffer2μl，T4DNA ligase1μl，ddH₂O7μl，在16℃恒温水浴锅中反应2h进行连接反应得到重组质粒。

（6）重组菌株的制备及阳性重组质粒的鉴定

将重组质粒转入BL21（DE3）的感受态细胞（购自北京神州红叶科技有限公司）中：重组质粒与BL21（DE3）感受态细胞按1:5体积比加入离心管中，在冰浴条件下静置20min。再置于42℃恒温水浴锅中热激90s，然后在冰浴条件下静置5min，在离心管中加入800μl LB培养基再恒温摇床37℃，200r/m培养30min；至此已将重组质粒转入了重组菌株BL21（DE3）。吸取200μl已转化了的感受态细胞加到含有浓度为34μg/mL的硫酸卡那霉素的LB琼脂培养基上，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃培养至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。无菌操作挑取单菌落接种于含有浓度为34μg/mL的硫酸卡那霉素的LB液体培养基增菌，37℃振荡培养12-14h，按照质粒提取试剂盒（泰安博傲生物技术公司）说明提取质粒。

提取得到的质粒DNA用Nci I/BamHⅠ和BamHⅠ/NotⅠ限制性内切酶37℃酶切3h，酶切体系10ul：限制性内切酶各0.5ul，重组质粒6ul，10×buffer1ul，ddH₂O2ul。

酶切产物于1%琼脂糖凝胶观察酶切片断，确定阳性重组质粒，送金斯特工程有限公司进行核苷酸序列测定。Blast在线比对所测β毒素全基因序列与GenBank已发表相应序列的同源性在98%以上。

3、β毒素基因的原核表达、蛋白纯化及特异性检测

挑取重组菌株BL21（DE3）的单菌落于5mL lysogeny broth培养基的试管中（lysogenybroth培养基组分：Tryptone2g,Yeast extract1g,Nacl2g溶于200mL去离子水每1mLlysogeny broth培养基中加入34μg的硫酸卡那霉素）37℃，220rpm/min过夜培养。将培养的菌液按1:100的体积比例接种于200ml lysogeny broth培养基（每1mL lysogeny broth培养基中加入34μg的硫酸卡那霉素）中，37℃，180rpm/min扩大培养。当OD值达到0.6左右时，添加终浓度为0.6mM的IPTG，37℃，120rpm/min诱导12h。表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中，收集菌体并用PBS缓冲液（组分：NaCl8g,KCl0.2g,Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，KH₂PO₄0.27g溶于1000mL去离子水中）悬浮。超声破碎菌体以得到表达的蛋白：冰浴中超声破碎菌体，功率200W，99次循环（超声3S，暂停5S为一个循环）。超声完毕，8000rpm/min，4℃，离心15min，收集上清和沉淀。目的蛋白β毒素存在于上清中，取上清准备纯化。通过Ni-Agarose His标签蛋白纯化柱（南京金斯瑞生物科技有限公司）纯化，得到了较纯净的β毒素。纯化后样品进行SDS-PAGE电泳，并通过Western blot检测表达蛋白的特异性。

4、β毒素基因工程苗制备

将制取好的β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞，即得产气荚膜梭菌β毒素基因工程苗。

5、β毒素基因工程苗安全检验

用体重1.5-2千克的家兔4只，各肌肉注射疫苗5毫升，观察10日，均健活，注射部位没有发生坏死。

6、β毒素基因工程苗无菌检验

参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001年版）附录301页进行，无菌生长。

7、β毒素基因工程苗硫柳汞含量测定

参照《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》（2001年版）附录313页进行，符合《制品检验的有关规定》（硫柳汞含量不超过0.01%）。

8、β毒素基因工程苗免疫保护效力试验

取1.5-2kg健康兔10只，分为对照组和实验组，每组各5只,实验组每只肌肉注射2ml的β毒素基因工程苗，对照组每只各肌肉注射等量的无菌生理盐水，21日后，10只兔分别注射2ml产气荚膜梭菌β毒素，观察3-5日，对照组5只兔全部死亡，免疫组5只兔均未死,说明该疫苗对兔的保护力达到了100%。

9、应用

在某仔猪红痢病发生较严重的猪厂，将怀孕母猪分为两组分别为免疫组和非免疫组，每组各20只；免疫组的怀孕母猪于产前30日和15日各肌肉注射一次产气荚膜梭菌β毒素基因工程苗，每次6ml作为免疫组；非免疫组不注射疫苗，同时把免疫组的母猪与非免疫组的母猪分开饲养。结果表明，免疫组的母猪所产的仔猪无仔猪红痢现象发生，而非免疫组每只母猪所产的仔猪中都有仔猪红痢现象发生。

Claims (3)

1.一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗，其特征在于是将β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞制得；所述的β毒素蛋白的制备方法包括以下步骤：

1）菌种复活及模板制备

用接种环挑取C型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板；

2）β毒素基因的克隆

根据GenBank中β毒素的基因序列设计引物进行PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT

3）构建原核表达载体pET28a-β

将目的基因PCR产物和表达载体pET28a均使用Eco RI和Xho I酶切；将酶切后分别回收的目的基因PCR产物和表达载体pET28a进行纯化；将纯化的目的基因PCR产物和载体pET28a进行连接，得到重组质粒pET28a-β；将pET28a-β与BL21(DE3)感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-β；

4）β毒素基因的原核表达、蛋白纯化

用0.6mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到β毒素蛋白。

2.一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）菌种复活及模板制备

用接种环挑取B型产气荚膜梭菌菌种接种于一个血平板培养基上，40℃厌氧（88％N₂、7％H₂、5％CO₂）培养36h；取单个菌落接种于一个含7-8毫升硫乙醇酸盐流体培养基（FT）的试管内，37℃厌氧培养12h，取1～5ml的培养液按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，作为扩增目的基因的模板；

2）β毒素基因的克隆

根据GenBank中β毒素的基因序列设计引物进行PCR扩增目的基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收扩增产物；

Primer1:GGAATTCAATGATATAGGTAAAACTAC;（SEQ.ID.N02所示）

Primer2:CCTCGAGTTAAATAGCTGTTACTTTGTGAGT（SEQ.ID.N03所示）

3）构建原核表达载体pET28a-β

将目的基因PCR产物和表达载体pET28a均使用Eco RI和Xho I酶切；将酶切后分别回收的目的基因PCR产物和表达载体pET28a进行纯化；将纯化的目的基因PCR产物和载体pET28a进行连接，得到重组质粒pET28a-β；将pET28a-β与BL21(DE3)感受态细胞混合后进行转化，得到重组菌株BL21(DE3)-β；

4）β毒素基因的原核表达、蛋白纯化

用0.6mM的IPTG，37℃，对重组菌诱导表达12h，经纯化得到β毒素蛋白；

5）β毒素基因工程苗制备

将上述步骤中制备好的β毒素蛋白与白油佐剂以体积比为1：1的比例进行乳化，每100ml乳化液中加入0.01克硫柳汞得到。

3.如权利要求1所述的一种产气荚膜梭菌β毒素基因工程疫苗在预防因产气荚膜梭菌β毒素引起的仔猪红痢中的应用。

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