CN101294144A - 2型猪链球菌sa1KR基因敲除突变株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种2型猪链球菌salKR基因敲除突变株及其制备方法和应用。所述突变株05ZYH33ΔsalKR，保藏号为CGMCC No.2259。其制备方法为：利用同源重组技术将S.suis 2野生株05ZYH33染色体上PAI_89K毒力岛中的二元信号转导***SalK/R进行基因敲除，经PCR鉴定和Southern杂交证实，确定所获得的菌株为基因敲除突变株，命名为05ZYH33ΔsalKR。用本发明所述突变株进行动物实验，其结果对实验动物无任何危害，所述突变株与野生株全基因组序列相似性很大，适合用于疫苗研究与生产。

Description

2型猪链球菌sa1KR基因敲除突变株及其制备方法和应用

技术领域

本发明属细菌类，具体说是一株2型猪链球菌(Streptococcus suisserotype 2)salKR基因敲除突变株的制备方法，以及在猪链球菌病疫苗研制中的应用。

背景技术

2型猪链球菌(简称S.suis2)是一种重要的***共患病的病原体。猪群对S.suis 2普遍易感，感染后可致急性败血症、肺炎、脑膜炎、关节炎、心内膜炎及急性死亡等，如不及时治疗病死率达40％；病后存活的猪生长缓慢，存栏时间大为延长。近年我国南方省份的猪群中S.suis 2流行日趋严重，时有较大规模暴发，每年造成的经济损失达数十亿元。该病原体感染人类可导致脑膜炎、败血症等严重疾患。1998和2005年分别在我国江苏和四川资阳人群中发生大规模暴发流行，病人中出现高比例的、国内外罕见的中毒性休克综合征，病情凶险，病死率高(60％～80％)，引发严重的公共卫生事件。目前，国内外尚无理想的适合动物和人群使用的疫苗，相关基础和应用研究对于该病的预防和控制具有十分重要的意义。

传统的疫苗包括灭活疫苗和减毒活疫苗。灭活疫苗是经灭活的全菌体死疫苗，其最大的优点是制备与生产容易，且稳定、易保存；但缺点是需多次接种、接种剂量大、接种后局部或全身毒、副反应明显，且有的疫苗保护作用欠佳。减毒活疫苗的优点是只需接种一次，接种剂量小，免疫效果较好，且免疫力教持久；缺点是不稳定、难保存，且可能出现毒力的回复突变。以上两种疫苗都是以全菌体为基础的疫苗，它们的共同缺点是：注入体内的抗原组分多而复杂，有许多组分其实是非保护性抗原。这些非保护性抗原组分的存在，一是干扰了机体对保护性抗原的应答(有时对非保护性抗原的应答成为主要应答，而保护性抗原是非主要应答甚至无应答)；二是非保护性抗原的存在可能带来严重的免疫毒副反应，如发烧、免疫性疾病等。

发明内容

本发明的目的，是针对上述不足之处提供一株无毒2型猪链球菌及其制备方法，以及在猪链球菌病疫苗研制中的应用。

对一株分离自2005年四川资阳2型猪链球菌疫情爆发现场的强毒株05ZYH33(Genbank登录号：NC_009442)进行基因工程技术改造，将位于其染色体上PAI_89K毒力岛中的二元信号转导***SalK/SalR编码基因salKR(序列表SEQID NO：1和2)进行基因敲除，取而代之的是壮观霉素抗性基因盒(Spectinomycinresistance cassette，Spc^R，序列表SEQ ID NO：3)，通过动物实验证实该突变株为对宿主动物无致病力的无毒株。

然后基于***生物学和反向遗传学方法，拟对S.suis 2突变株与野生株进行比较蛋白质组学研究，通过蛋白质二维电泳分离并找出二者蛋白表达谱上的差异点，进而采用MALDI-TOF MS时间飞行质谱鉴定对这些差异点进行逐一分析，确定每一个蛋白的编码基因，按常规方法进行克隆、表达与纯化，制备出蛋白性抗原的候选分子。然后用这些候选分子作为抗原免疫动物，再用野生株进行攻击，观察动物存活情况，筛选出可能的保护性抗原组分，为该菌疫苗走向应用奠定基础。

因此，制备该无毒2型猪链球菌菌株的方法，主要包括以下步骤：

(1)根据S.suis 2野生株05ZYH33基因组salKR编码基因的上下游DNA序列，设计PCR引物，

(2)以05ZYH33基因组DNA为模板，扩增salKR编码基因，构建基因敲除载体；

(3)建立在Spc^R因两侧具有同源序列的salKR基因敲除载体pUC::salKR；

(4)基因敲除载体pUC::salKR电转化制备好的S.suis 2野生株05ZYH33感受态细胞；

(5)筛选具有壮观霉素抗性的猪链球菌菌落，PCR和Southern杂交证实salKR编码基因被Spc^R基因替换，即得到2型猪链球菌salKR基因敲除突变株。

动物实验检测本突变株是否有对动物有危害。

目前该2型猪链球菌菌种的保藏号是CGMCC No.2259；保藏单位是：中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所；菌种的拉丁学名是：Streptococcus suis Serotype 2；参据的微生物(株)：05ZYH33ΔsalKR；保藏日期为2007年11月23日。

本发明的细菌具有以下特征：该菌属于球菌科、链球菌属，为革兰氏阳性菌，兼性厌氧，呈卵圆形，以短链形式存在，在5％绵羊血THB琼脂培养基上37℃培养24-48小时，可长出细小菌落，直径1～2mm，呈浅灰色或半透明，稍带粘液样，在菌落周围能产生α溶血环。

本发明的突出优点：

1.用该菌进行动物实验，结果对实验动物无任何危害。

2.该无毒株与野生株全基因组序列相似性很大，适合用于疫苗研究与生产。

附图说明

图1为基因敲除载体pUC::salKR的构建过程示意图；

图2为salKR基因敲出前后染色体基因组织分布图；

图3为无毒2型猪链球菌突变株05ZYH33ΔsalKR的鉴定结果(B、C、D中1号泳道为野生株05ZYH33，2号泳道为基因敲除突变株05ZYH33ΔsalKR，3号泳道为单交换对照突变株)。

具体实施方式

材料：

1.Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司产品，中国大连)

2.T4DNA连接酶(TaKaRa公司产品，中国大连)

3.EcoR I、BamH I、Pst I、Hind III等限制性内切酶(TaKaRa公司产品，中国大连)

4.质粒载体pUC18(Promega公司产品，美国)

5.质粒DNA抽提试剂盒(Promega公司产品，美国)

6.DNA胶回收试剂盒(Promega公司产品，美国)

7.大肠杆菌DH5α(本室保存)

8.2型猪链球菌强毒株05ZYH33(分离自四川资阳中毒性休克综合征病人)

9.酵母提取物、胰蛋白胨和Todd-Hewitt Broth(THB)培养基(Oxoid公司产品，英国)

10.LB液体培养基：称取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，溶于1000ml去离子水中，高压蒸气灭菌。

11.LB固体培养基：每1000ml液体LB培养基中加入15g琼脂粉，高压蒸气灭菌。

12.THB液体培养基：称取THB粉3g，溶于100ml去离子水中，高压蒸气灭菌。

13.THB固体培养基：每100ml液体THB培养基中加入1.5g琼脂粉，高压蒸气灭菌。

14.壮观霉素、氨苄青霉素(Sigma公司产品，美国)

15.North2South DNA随机引物生物素标记和化学发光检测试剂盒(Pierce公司产品，美国)

16.Gene Pulser Xcell^TM型电穿孔仪(BIO-RAD公司产品，美国)

实施例1：基因敲除载体的构建

(1)引物设计：根据S.suis2野生株05ZYH33基因组salKR编码基因的上下游DNA序列(序列表SEQ ID NO：4和5)，设计PCR引物，碱基序列如下：

LA1：5’GTGGATCCTAGCTTATTTTTACTGTTATC 3’

(下划线处为引入的EcoR I酶切位点)

LA2：5’AGCTGCAGATGGAGGAAATGCGGAATC 3’

(下划线处为引入的BamH I酶切位点)

RA1：5’ATGGTACCAATTACCCTTTTTACTCAT 3’

(下划线处为引入的Pst I酶切位点)

RA2：5’AAGGGCCCCACCGACACTTCCACTACCTA 3’

(下划线处为引入的Hind III酶切位点)

引物LA1和LA2用于扩增salKR编码基因的上游DNA片段，引物RA1和RA2用于扩增下游DNA片段。为了克隆的需要，在LA1和LA2引物中分别引入EcoR I和BamH I的酶切位点，在引物RA1和RA2中分别引入Pst I和Hind III的酶切位点。

(2)PCR扩增：以05ZYH33基因组DNA为模板，用引物LA1和LA2进行PCR，扩增salKR编码基因上游片段LA；用引物RA1和RA2进行PCR，扩增salKR编码基因下游片段RA。

PCR的反应体系为：

模板(05ZYH33 genomic DNA)    2μl

Primer1(LA1或RA1)            4μl

Primer2(LA2或RA2)            4μl

dNTP(10mM each)              2μl

10×PCR buffer               10μl

MgCl₂(25mM)                  6μl

Ex Taq DNA聚合酶             1μl

ddH₂O                        71μl

                                              

Total                        100μl

PCR的反应条件为：第一阶段94℃预变性5分钟；第二阶段94℃变性40秒，55℃退火40秒，72℃延伸1分钟，循环25次；第三阶段72℃延伸10分钟。所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测分别可见约1200bp(LA)和1100bp(RA)大小的电泳条带，将PCR产物回收、纯化，分别用EcoR I/BamH I和Pst I/Hind III进行双酶切，将双酶切产物回收、纯化，冻存备用。

(3)LA的克隆：将EcoR I/BamH I双酶切后的LA片段与用同样内切酶双酶切处理过的pUC18载体进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用EcoR I和BamH I进行双酶切鉴定，将有1200bp左右大小DNA片段出现的重组质粒命名为pUC18-LA。

(4)RA的克隆：将Pst I/Hind III双酶切后的RA片段与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18-LA进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经氨苄青霉素筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用Pst I和Hind III进行双酶切鉴定，将有1100bp左右大小DNA片段出现的重组质粒命名为pUC18-LR。

(4)壮观霉素抗性基因Spc^R的克隆：根据pSET2质粒DNA序列并以其为模板，设计引物PCR扩增壮观霉素抗性基因Spc^R，引物序列为

Spc1：AGGGATCCGTTCGTGAATACATGTTATA(下划线为引入的BamH I酶切位点)，

Spc2：ATCTGCAGGTTTTCTAAAATCTGAT(下划线为引入的Pst I酶切位点)，

PCR的反应体系和条件同前，所得PCR产物经1％琼脂糖电泳检测可见约1100bp(Spc^R)大小的电泳条带，将PCR产物回收、纯化，用BamH I/Pst I进行双酶切，将双酶切产物回收、纯化，与用同样内切酶双酶切处理过的重组质粒pUC18-LR进行连接，16℃过夜后将连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，经壮观霉素和氨苄青霉素双重筛选后，挑取LB平板上的克隆培养于LB液体培养基中37℃振荡过夜。次日提取质粒DNA，用BamH I和PstI进行双酶切鉴定，将有1100bp左右大小DNA片段出现的重组质粒命名为pUC::salKR。

(5)基因敲除载体pUC::salKR的确认：将基因敲除载体pUC::salKR进行测序，测序结果表明在Spc^R基因两侧具有同源序列的salKR基因敲除载体pUC::salKR的构建完全正确。

实施例2：无毒2型猪链球菌突变株的筛选与鉴定

(1)电转化：将构建好的基因敲除载体pUC::salKR电转化S.suis 2野生株05ZYH33感受态细胞，将菌液涂布于含有壮观霉素的THB平板上，37℃培养24-48小时。

(2)筛选：从壮观霉素THB平板上挑选猪链球菌菌落，分别培养于2ml液体THB培养基，各取2μl菌液作为模板，用引物check1和check2(位于salKR基因内部，引物序列为

check1：GGGGGACTATTACTTTTGAG，

check2：TTTCTTTTTCGCGTTCTGTC

进行PCR初步筛选。如果salKR基因被敲除，PCR扩增将会得到阴性结果，如果仍能扩增出预期大小(514bp)的产物，说明salKR基因未被敲除。通过这种方法，初步筛选获得salKR基因敲除突变株，将其命名为05ZYH33ΔsalKR。

(3)鉴定：采用Southern杂交进一步证实基因敲除突变株05ZYH33ΔsalKR的正确性，杂交所用探针为Spc^R基因、salKR编码基因和pUC18质粒DNA，探针的标记和杂交信号的检测严格按照North2South DNA随机引物生物素标记和化学发光检测试剂盒说明书进行。

实施例3：动物实验

为检测该2型猪链球菌突变株对宿主动物的致病性，在平板上分别挑取S.suis2野生株05ZYH33和突变株05ZYH33ΔsalKR的单个菌落，于THB培养基中37℃振荡培养至对数生长中期(OD₆₀₀≈0.6)，取0.5ml菌液(约10⁸CFU剂量)离心收集菌体，用同等体积的无菌PBS缓冲液重悬细菌。通过耳缘静脉注射的方法，用野毒株和突变株分别攻击健康长白仔猪(6头猪/每个菌株)，密切观察感染动物的体征，比较两组动物的发病情况及存活时间有无明显变化。结果发现，注射突变株后的实验猪无明显病理反应，而用同等剂量注射后的长白猪均则出现典型的S.suis2感染症状，如关节炎、心内膜炎、呼吸衰竭等，继而先后死亡，最快可在24小时内猝死。动物实验结果表明，salKR基因敲除后的突变株为无毒株。

实施例4：应用前景

基于***生物学和反向遗传学方法，拟对S.suis 2突变株与野生株进行比较蛋白质组学研究，通过蛋白质二维电泳分离并找出二者蛋白表达谱上的差异点，进而采用MALDI-TOF MS时间飞行质谱鉴定对这些差异点进行逐一分析，确定每一个蛋白的编码基因，按常规方法进行克隆、表达与纯化，制备出蛋白性抗原的候选分子。然后用这些候选分子作为抗原免疫动物，再用野生株进行攻击，观察动物存活情况，筛选出可能的保护性抗原组分，为该菌疫苗走向应用奠定基础。

序列表

<110>中国人民解放军第三军医大学

<120>2型猪链球菌salKR基因敲除突变株的制备方法及其应用

<130>

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1188

<212>DNA

<213>猪链球菌05ZYH33(Streptococcus suis 05ZYH33)

<220>

<221>CDS

<223>编码二元信号转导***组氨酸激酶SalK的DNA序列

<400>1

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<210>2

<211>597

<212>DNA

<213>猪链球菌05ZYH33(Streptococcus suis 05ZYH33)

<220>

<221>CDS

<223>编码二元信号转导***反应调节因子SalR的DNA序列

<400>2

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<210>3

<211>1130

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>编码壮观霉素抗性基因盒(Spectinomycin resistance cassette)的DNA序列

<400>3

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<210>4

<211>1203

<212>DNA

<213>猪链球菌05ZYH33(Streptococcus suis 05ZYH33)

<220>

<223>二元信号转导***SalK/SalR编码基因salKR的上游DNA序列，为基因敲除的同源

左臂

<400>4

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<210>5

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<212>DNA

<213>猪链球菌05ZYH33(Streptococcus suis 05ZYH33)

<220>

<223>二元信号转导***SalK/SalR编码基因salKR的下游DNA序列，为基因敲除的同源

右臂

<400>5

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tgagtgatct ttatgcagat gggttgtgag atttagtgtt ttttgatgag agacacttca     840

gtgactgtca tctgtttaca ggatttacac tgaagaagac atctttggtt tttaacatag     900

ttggcatccc tttgatattc agaatagata ctgtagattt atgttggtaa taacatctga     960

ctaaggtagt ttggagctgg gtaatcaagc tcacgctgaa tagtgatatg cgtgttgact    1020

tgaaaaaatg gtctcgattt gatgttctta ttttctaatt cgaagagtac tgtggtattc    1080

taaaattgtt ccataagcac ttcctaatga tgattaggga ggtcttatgg               1130

Claims (4)

1.一种2型猪链球菌salKR基因敲除突变株，其保藏号为CGMCC No.2259。

2.制备如权利要求1所述的2型猪链球菌salKR基因敲除突变株的方法，其特征在于有以下步骤：

(1)根据S.suis 2野生株05ZYH33基因组salKR编码基因的上下游DNA序列，设计PCR引物，

(2)以05ZYH33基因组DNA为模板，扩增salKR编码基因，构建基因敲除载体；

(3)建立在Spc^R基因两侧具有同源序列的salKR基因敲除载体pUC::salKR；

(4)基因敲除载体pUC::salKR电转化制备好的S.suis 2野生株05ZYH33感受态细胞；

(5)筛选具有壮观霉素抗性的猪链球菌菌落，PCR和Southern杂交证实salKR编码基因被Spc^R基因替换，即得到2型猪链球菌salKR基因敲除突变株。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：PCR引物的序列为：

LA1：5’GTGGATCCTAGCTTATTTTTACTGTTATC 3’(下划线处为引入的EcoR I酶切位点)

LA2：5’AGCTGCAGATGGAGGAAATGCGGAATC 3’(下划线处为引入的BamH I酶切位点)

RA1：5’ATGGTACCAATTACCCTTTTTACTCAT 3’(下划线处为引入的Pst I酶切位点)

RA2：5’AAGGGCCCCACCGACACTTCCACTACCTA 3’(下划线处为引入的Hind III酶切位点)

4.如权利要求1所述的2型猪链球菌salKR基因敲除突变株在猪链球菌病疫苗中的应用。

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