CN116589539B - 九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗 - Google Patents

九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗。本发明首先提供了一种由非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、C129R蛋白、P72蛋白、X蛋白和Y蛋白组成的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合能够诱导机体产生较强的免疫反应；其次本发明制备了包含上述非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合的九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗，所述九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗对亲本非洲猪瘟强毒株的攻毒具有良好的免疫保护率，无生物安全风险，突破了国内外现有非洲猪瘟亚单位疫苗无法为猪体提供有效免疫保护的难题，证明了非洲猪瘟亚单位疫苗研究方案的可行性。

Description

九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是危害世界养猪业的“头号杀手”，流行已逾百年。2018年8月，非洲猪瘟传入我国，重创我国养猪业，造成前所未有的损失。迄今没有ASF商品化疫苗问世，成为养猪业的痛点和难题，更是国家重大需求。国内外科学研究表明，ASF灭活疫苗、亚单位疫苗和活载体疫苗仍然没有解决免疫效力问题，虽然基因缺失疫苗解决了免疫效力问题，但存在毒力残留和生物安全风险。非洲猪瘟病毒(African swinefever virus，ASFV)基因组庞大、编码超过150种病毒蛋白，多数功能不清，诱导和激发免疫***的抗原知之甚少，成为创制免疫效力理想的非洲猪瘟亚单位疫苗的关键问题。
针对亚单位疫苗，中国专利CN115814071A公开了一种由非洲猪瘟病毒p34、p14、C129R、DP96R、A104R、p54、p17、p22、P72、p30蛋白组成的亚单位疫苗；中国专利CN115702928A公开了一种由非洲猪瘟病毒p34、p14、C129R、DP96R、A104R、p54、p22、P72、p30蛋白组成的亚单位疫苗；中国专利CN112472801A公开了一种非洲猪瘟p30、p54、p72和B602L的亚单位疫苗；中国专利CN111658768A公开了一种包括非洲猪瘟病毒表面囊膜蛋白CD2V和至少选自非洲猪瘟病毒P72蛋白、非洲猪瘟病毒P30蛋白、非洲猪瘟病毒P54膜结构蛋白中一种蛋白的亚单位疫苗。虽然上述研究已经公开了不同抗原组成的亚单位疫苗，但均未***评价疫苗的免疫保护效力。申请人团队的进一步研究还发现，上述亚单位疫苗涉及的抗原组分，某些具有ADE效应，可能会严重影响亚单位疫苗对非洲猪瘟强毒株的保护效力，所述ADE效应是指病毒特异性抗体与病毒结合后，结合了病毒的抗体可通过Fc段与某些表面表达FcR的细胞结合从而导致病毒进入这些细胞，从而增强了病毒的感染性过程。
基于上述问题，申请人提供了一种九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗，所述亚单位疫苗对非洲猪瘟亲本强毒株攻毒具有理想的保护效力。
发明内容
针对上述技术问题，本申请经过大量实验筛选及评价研究，意外的发现了一种九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗，所述亚单位疫苗不仅能够诱导机体产生更好的免疫反应，无生物安全风险，而且在亲本非洲猪瘟强毒株攻毒时能够提供理想的保护效力，具体包括以下内容：
第一方面，本发明提供了一种非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合由非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白组成；所述X蛋白为DP96R蛋白或DP96R蛋白与P12蛋白的融合蛋白；所述Y蛋白为P22蛋白，或P17蛋白，或P22蛋白与P17蛋白的组合，或P22蛋白与P17蛋白的融合蛋白，或P22蛋白片段与P17蛋白片段的融合蛋白。
优选地，所述非洲猪瘟病毒为II型非洲猪瘟病毒。
优选地，所述II型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS 2018。
优选地，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述非洲猪瘟病毒P54蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示；所述非洲猪瘟病毒A104R蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.9所示；所述非洲猪瘟病毒E165R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述DP96R蛋白与P12蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述非洲猪瘟病毒C129R蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.17所示；所述非洲猪瘟病毒P72蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示；所述非洲猪瘟病毒P17蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述非洲猪瘟病毒P22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；非洲猪瘟病毒P17蛋白片段与P22蛋白片段的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示；所述非洲猪瘟病毒P17蛋白与P22蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示。
优选地，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1-6：1-6：1-6：1-6：1：1-6：1-6：1：1-6。
优选地，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1-6：1：1-6：1：1：1-6：1：1：1。
优选地，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1-2：1：1-2：1：1：1-2：1：1：1。
优选地，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1-6：1：1：1：1：1-6：1：1：1。
优选地，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1：1：1-2：1：1：1-2：1：1：1。
优选地，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1：1：2：1：1：2：1：1：1。
优选地，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1：1：2：1：1：1：1：1：1。
优选地，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1：1：1：1：1：2：1：1：1。
优选地，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度均大于等于50μg/ml。
优选地，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度均大于等于90μg/ml。
优选地，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度均大于等于150μg/ml。
优选地，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度均为150-2400μg/ml。
优选地，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度分别为200μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml。
优选地，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度分别为200μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml。
优选地，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度分别为200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml。
优选地，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度分别为400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml。
优选地，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白通过大肠杆菌***表达获得；所述P72蛋白通过昆虫***表达获得；所述Y蛋白通过CHO表达***表达获得。
第二方面，本发明提供了上述第一方面所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒感染药物中的应用。
第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合在制备预防非洲猪瘟病毒感染的生物制品中的应用。
第四方面，本发明提供了一种九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗，所述九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗由上述第一方面所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合以及药学上可接受的佐剂组成。
优选地，所述佐剂包括化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。
本发明的有益效果是：(1)本发明提供了一种由非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白组成的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其中所述X蛋白为DP96R蛋白或DP96R蛋白与P12蛋白的融合蛋白；所述Y蛋白为P22蛋白，或P17蛋白，或P22蛋白与P17蛋白的组合，或P22蛋白与P17蛋白的融合蛋白，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合能够产生良好的免疫反应；(2)在本发明所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合上加入疫苗佐剂制备的九组分亚单位疫苗，在亲本非洲猪瘟强毒株攻毒时能够提供良好的保护效率；(3)本申请所述的九组分亚单位疫苗具有良好的安全性；(4)本申请所述的九组分亚单位疫苗制备工艺简单，适合于大规模工业化生产，具有极大的社会价值和经济价值。
附图说明
图1质粒pET-A-1#基因鉴定结果，其中M：DL2000 DNA marker；1：不同质粒；
图2质粒pET-A-2#基因鉴定结果，其中M：DL2000 DNA marker；1：不同质粒；
图3质粒pET-A-3#基因鉴定结果，其中M：DL2000 DNA marker；1：不同质粒；
图4质粒pET-A-4#基因鉴定结果，其中M：DL2000 DNA marker；1：不同质粒；
图5质粒pET-A-5#基因鉴定结果，其中M：DL2000 DNA marker；1：不同质粒；
图6质粒pET-A-6#基因鉴定结果，其中M：DL2000 DNA marker；1：不同质粒；
图7质粒pET-A-7#基因鉴定结果，其中M：DL2000 DNA marker；1：不同质粒；
图8P34蛋白表达结果，其中M：蛋白质分子质量标准；1：诱导前破菌上清；2：诱导前破菌沉淀；3：诱导后破菌上清；4：诱导后破菌沉淀；
图9P30蛋白表达结果，其中M：蛋白质分子质量标准；1：诱导前破菌上清；2：诱导前破菌沉淀；3：诱导后破菌上清；4：诱导后破菌沉淀；
图10P54蛋白表达结果，其中M：蛋白质分子质量标准；1：诱导前破菌上清；2：诱导前破菌沉淀；3：诱导后破菌上清；4：诱导后破菌沉淀；
图11A104R蛋白表达结果，其中M：蛋白质分子质量标准；1：诱导前破菌上清；2：诱导前破菌沉淀；3：诱导后破菌上清；4：诱导后破菌沉淀；
图12E165R蛋白表达结果，其中M：蛋白质分子质量标准；1：诱导前破菌上清；2：诱导前破菌沉淀；3：诱导后破菌上清；4：诱导后破菌沉淀；
图13X蛋白表达结果，其中M：蛋白质分子质量标准；1：诱导前破菌上清；2：诱导前破菌沉淀；3：诱导后破菌上清；4：诱导后破菌沉淀；
图14C129R蛋白表达结果，其中M：蛋白质分子质量标准；1：诱导前破菌上清；2：诱导前破菌沉淀；3：诱导后破菌上清；4：诱导后破菌沉淀；
图15抗原的Western blot分析结果，从左至右分别为P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白；其中M：蛋白质分子质量标准；1：不同抗原与ASFV阳性血清发生特异性反应结果；
图16非洲猪瘟病毒P72蛋白的表达结果，从左至右分别为重组质粒的目的基因鉴定结果(其中M：DL2000 DNA marker；1：pFB-8#)，重组杆粒目的基因鉴定结果(M：DL2000DNA marker；1：重组杆粒；2：野生型杆粒)，重组杆状病毒的基因鉴定结果(M：DL2000 DNAmarker；1：重组杆状病毒ASFV 8株2：野生型杆状病毒)，蛋白纯化结果(M：蛋白质分子质量标准；1：诱导后破细胞沉淀；2：诱导后破细胞上清；3：纯化流穿；4：50mM咪唑洗脱；5：400mM咪唑洗脱)，抗原的Western blot分析结果(M：蛋白质分子质量标准；1：蛋白与ASFV阳性血清发生特异性反应结果)；
图17非洲猪瘟病毒Y蛋白的表达结果，从左至右分别为pCHO-A-9#的基因鉴定结果(M：DL10000DNA marker；1：pCHO-A-9#株目的基因表达)，蛋白纯化结果(M：蛋白质分子质量标准；1：诱导后CHO上清；2：50mM咪唑；3：400mM咪唑洗脱)，抗原的Western blot分析结果(M：蛋白质分子质量标准；1：蛋白与ASFV阳性血清发生特异性反应结果)；
图18重组蛋白免疫家兔效价检测。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：
BL21(DE3)感受态细胞、pET28a表达载体购自上海索莱宝生物科技有限公司。Sf9昆虫细胞、pFastBacTM载体、DH10BacTM感受态细胞均购自Thermo Fisher公司；p3xflag-cmv-7.1载体、pcDNA3.1载体、悬浮培养的CHO细胞均由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。
非洲猪瘟病毒蛋白表达质粒均通过经典分子基因克隆方法，以非洲猪瘟病毒cDNA为模板，PCR扩增不同病毒蛋白编码区连接至pCMV-C-Flag载体。原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)由本实验室制备(猪肺冲洗分离制备)。
LB液体培养基(干粉)、LB固体培养基(干粉)购自北京索莱宝科技有限公司；卡那霉素、IPTG、X-Gal购自上海索莱宝科技有限公司；Gel Extraction Kit(100)、PlasmidMini Kit I(100)购自美国OMEGA公司；常规分子、化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。PureLinK HiPure Plasmid Maxiprep质粒抽提试剂盒、ExpiSfTMProtein ProductionKit试剂盒、ExpiFectamineTMCHO Transfection Kit均购自Invitrogen公司；DNA Marker购自TaKaRa公司。
II型非洲猪瘟病毒株ASFV CN/GS 2018来自国家非洲猪瘟区域实验室(兰州)，属于基因Ⅱ型，病毒效价为1×105HAD50/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，于2020年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：V202096；保藏地址：中国武汉，武汉大学；联系电话：027-68752319。
根据ASFV CN/GS/2018分离株编码的病毒蛋白基因序列，设计合成不同病毒蛋白编码区片段，构建真核表达载体。通过密码子优化(包括消除稀有密码子、调整GC含量等)设计各基因表达序列，将优化设计的基因序列送公司进行合成，构建原核表达载体。
实验兔：2.0kg左右健康新西兰公兔，购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物中心。
猪：健康猪，全部购自无ASFV流行的猪场，PCV2抗原检测阴性，ASFV、PRRSV抗原和抗体检测均为阴性。
定义：
术语“分子伴侣”是指一类在序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，它们在细胞内帮助其他含多肽的结构完成正确的组装，而且在组装完毕后与之分离，不构成这些蛋白质结构执行功能时的组份。
术语“截短蛋白”是指对去掉蛋白跨膜区的蛋白，或胞外区蛋白。
术语“抗原”是指能诱导机体发生免疫应答的物质，即能被T/B淋巴细胞表面的抗原受体(TCR/BCR)特异性识别与结合，活化T/B细胞，使之增殖分化，产生免疫应答产物(致敏淋巴细胞或抗体)，并能与相应产物在体内外发生特异性结合的物质。
术语“疫苗”、“疫苗组合物”、“亚单位疫苗”是指含有非洲猪瘟病毒蛋白抗原的药物组合物，该药物组合物可诱发、刺激或增强猪只针对非洲猪瘟的免疫反应，能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。
进一步地，所述“疫苗”、“疫苗组合物”、“亚单位疫苗”包含一种或多种佐剂、赋形剂、载体和稀释剂。
进一步地，所述佐剂包括化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。
进一步地，所述化学类免疫佐剂包括氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；所述微生物类免疫佐剂包括分枝杆菌、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；所述植物类免疫佐剂包括从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等；所述生化类免疫佐剂包括胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。
进一步地，所述“疫苗”、“疫苗组合物”、“亚单位疫苗”也可被用于制备联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合；
进一步地，所述“疫苗”、“疫苗组合物”、“亚单位疫苗”的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射、鼻内、口服、皮下、透皮和***等途径。所述“疫苗”、“疫苗组合物”、“亚单位疫苗”可以在初免-加强方案后施用；例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7、14、21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免使用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。
术语“预防”在涉及非洲猪瘟病毒感染时是指抑制非洲猪瘟病毒的复制、抑制非洲猪瘟病毒的传播或防止非洲猪瘟病毒在其宿主体内定居，以及减轻非洲猪瘟病毒感染的疾病或病症的症状。
本实验首先***评价了II型非洲猪瘟病毒的164个蛋白的免疫效力，从机体免疫应答和抑制病毒复制两个层面入手，筛选ASFV有效免疫抗原。(1)天然免疫应答方面：构建164个含有不同ASFV基因组开放阅读框的真核表达质粒，利用天然免疫通路不同双荧光素酶报告***，筛选出促进天然免疫应答的蛋白17个；(2)淋巴细胞免疫应答方面：制备120种ASFV抗原蛋白，从中筛选出能够促进ASFV特异性淋巴细胞增殖的蛋白23个；(3)抑制病毒复制方面：选取上述筛选的促进天然免疫应答最强的5个病毒蛋白和促进淋巴细胞增殖能力显著的23个病毒蛋白，共28个。对上述三种策略筛选获得的蛋白进行随机和定向组合，获得了一系列多组分亚单位疫苗，进行三次免疫实验兔(新西兰公兔)制备免疫血清，通过病毒红细胞吸附和复制抑制试验，最终筛选出9种病毒蛋白抗体可以显著抑制病毒增殖。所述九组分亚单位疫苗的制备过程及免疫效力评价实验如下。
实施例1九组分抗原蛋白的表达
1.非洲猪瘟病毒P34、P30、P54、A104R、E165R、X、C129R蛋白的表达
根据ASFV CN/GS/2018分离毒株P34、P30、P54、A104R、E165R、X(为DP96R蛋白或DP96R蛋白与P12蛋白的融合蛋白)、C129R基因，优化序列设计构建重组蛋白表达工程菌，将经过密码子优化(包括消除稀有密码子、调整GC含量等)后的P34、P30、P54、A104R、E165R、C129R基因分别克隆于大肠杆菌表达载体pET28a，X基因克隆于大肠杆菌表达载体pET32a，获得的阳性质粒，分别命名为pET-A-1#、pET-A-2#、pET-A-3#、pET-A-4#、pET-A-5#、pET-A-7#、pET-A-6#；将所述该阳性质粒分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得能够表达P34、P30、P54、A104R、E165R、C129R、X蛋白的重组工程菌，命名为E/pET-A-1#、E/pET-A-2#、E/pET-A-3#、E/pET-A-4#、E/pET-A-5#、E/pET-A-7#、E/pET-A-6#；其中所述P34蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述P30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码基因序列如SEQ ID NO.4所示；P54蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，编码基因序列如SEQ ID NO.8所示(本申请为了便于纯化表达采用了P54蛋白的截短蛋白(去掉跨膜区)，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码基因序列如SEQ ID NO.6所示)；A104R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码基因序列如SEQ ID NO.10所示；E165R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码基因序列如SEQ ID NO.12所示；X蛋白为DP96R蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，编码基因序列如SEQ ID NO.14所示(在本申请中，在DP96R蛋白表达时融合了P12蛋白(DP96R/P12)，氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码基因序列如SEQ ID NO.16所示)；C129R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，编码基因序列如SEQ ID NO.18所示。
提取重组工程菌种的质粒进行PCR鉴定，pET-A-1#质粒扩增到1150bp左右条带，与预期片段大小一致(如图1所示)；pET-A-2#质粒扩增到1200bp左右条带，与预期片段大小一致(如图2所示)；pET-A-3#质粒扩增到700bp左右条带，与预期片段大小一致(如图3所示)；pET-A-4#质粒扩增到840bp左右条带，与预期片段大小一致(如图4所示)；pET-A-5#质粒扩增到1160bp左右条带，与预期片段大小一致(如图5所示)；pET-A-6#质粒扩增到1100bp左右条带，与预期片段大小一致(如图6所示)；pET-A-7#质粒扩增到900bp左右条带，与预期片段大小一致(如图7所示)。
该重组工程菌株经IPTG诱导可表达可溶性的P34蛋白(如图8所示)、P30蛋白(如图9所示)、P54蛋白(如图10所示)、A104R蛋白(如11所示)、E165R蛋白(如图12所示)、DP96R蛋白(如图13所示)、C129R蛋白(如图14所示)，大小分别约为37kDa、45kDa、24kDa、31kDa、36kDa、35kDa和34kDa，经Western blot分析，所述蛋白均能与非洲猪瘟病毒阳性血清反应(结果如图15所示)。
2.非洲猪瘟病毒P72蛋白的表达
根据分离毒株ASFV CN/GS/2018P72基因(SEQ ID NO.20所示，氨基酸序列如SEQID NO.19所示)，经过优化后克隆于pFastBacTM质粒上，获得阳性克隆命名为pFB-8，将获得的重组质粒PCR鉴定，扩增到约1980bp条带(如图16所示)，与预期片段大小一致；
将鉴定正确的供体质粒转化DHlOBac感受态细胞，挑取白色毒落摇毒过夜后，抽提重组杆粒，以抽提的杆粒DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物大小约1980bp(如图16所示)；
将重组杆粒-8转染Sf9细胞后成功得到能够表达P1蛋白的重组杆状病毒，命名为重组杆状病毒pFB-A-8#株。提取P1代重组病毒基因组，进行PCR检测，重组杆状病毒pFB-A-8#株的扩增产物大小约1980bp(图16所示)，与预期大小相符。该毒株可致Sf9细胞产生明显的细胞病变，并且表达出大小约66KDa的目的蛋白(图16所示)，经SDS-PAGE、Western blot等分析，P72重组蛋白具有良好的反应性(图16所示)。
3.非洲猪瘟病毒Y蛋白的表达
所述Y蛋白为P22蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示，基因序列如SEQ IDNO.24所示)，或P17蛋白(SEQ ID NO.21所示，基因序列如SEQ ID NO.22所示)，或P22蛋白与P17蛋白的组合，或P22蛋白片段与P17蛋白片段的融合蛋白(P22蛋白胞外区与P17蛋白胞外区的融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示，基因序列如SEQ ID NO.26所示)，或P22蛋白与P17蛋白的融合蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，基因序列如SEQ ID NO.28所示)；本实施例以P22蛋白胞外区与P17蛋白胞外区的融合蛋白为例表达Y蛋白，具体如下：
根据ASFV CN/GS/2018分离毒株P22蛋白和P17蛋白基因，优化序列设计构建CHO稳定细胞株。将经过密码子优化后的P17-P22(P22蛋白胞外区与P17蛋白胞外区的融合蛋白)基因(SEQ ID NO.26)克隆于真核表达载体pCHO1.0，获得重组表达质粒，命名为pC1.0-A-9#，将该质粒转染至CHO细胞，经过嘌呤霉素和氨甲蝶呤筛选，获得能够稳定表达Y蛋白的重组CHO细胞株，命名为pCHO-A-9#。
结果如图17所示，提pCHO-A-9#基因组进行PCR鉴定，扩增到1400bp左右条带，与预期片段大小一致；重组CHO细胞株可在培养上清中分泌表达Y蛋白，大小约为38kDa；经Western blot分析，能与非洲猪瘟病毒阳性血清反应。本领域技术人员同样可采用上述方法表达P22蛋白，或P17蛋白，或P22蛋白片段与P17蛋白片段的融合蛋白。
本申请虽然限定了九组分蛋白的具体表达方法，但是并不局限于上述蛋白表达方法，本领域技术人员可通过常规的表达***对本申请所述的九组分抗原蛋白进行表达纯化；所述表达宿主并不局限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等原核表达***，也不局限于昆虫细胞、哺乳动物细胞、酵母细胞等真核表达***；所述表达载体并不局限于上述所述的pET28a、pFastBac、pCHO1.0，本领域技术人员也可以根据选定的表达***，进行常规质粒的选择，包括本领域公知的原核表达质粒：pET系列、pET-GST、pGEX系列、pMAL系列、pBAD系列、pQE系列、pCold系列等；真核表达质粒：flashBAC系列、pEGFP、pCDM8、pCNVp-NEO-BAN、pEGFT-Actin、pSV2、CMV4等。
本申请在对上述九组分蛋白进行表达时也可对上述所述的抗原蛋白的序列进行优化，包括截短、突变、引入融合标签、引入分子伴侣等手段，以提高可溶形式目的蛋白的表达和纯化效率；
所述截短策略为去除目的蛋白的跨膜区、去除定位信号、去除特殊结构域等；
所述分子伴侣可选在以下任一种或几种组合：DnaK蛋白、DnaJ蛋白、groEL蛋白、groES蛋白、GrpE蛋白、HSP蛋白、Trigger factor蛋白等；
所述融合标签选自以下任一种或几种组合：SUMO蛋白、GST蛋白、Trx蛋白、NusA蛋白、DsbA蛋白、DsbC蛋白、MBP蛋白等。
实施例2九组分抗原蛋白免疫原性试验
1.兔免疫实验
将上述表达纯化获得的9个抗原蛋白组分(1#-9#，分别表示P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白)分别与等量的弗氏完全佐剂充分混匀乳化。选取2.0kg左右健康公兔27只，待其适应环境两天后，每种乳化后的抗原背部皮下多点注射免疫3只，免疫剂量为300μg/只。分别在首次免疫后第15、30天用弗氏不完全佐剂乳化等量蛋白加强免疫两次，免疫部位及方法同首次免疫。三免后14天经耳静脉少量采血，分离血清，采用间接ELISA方法测定抗体效价。以S/N值≥2.1时抗体的最大稀释度作为抗体效价，若血清效不低于1:64000，即按常规方法采血、分离血清，置-20℃以下保存。若免疫血清效价偏低，可加强免疫一次，14日后再检测抗体效价，若血清效价达到要求，可按前述方法制备血清。否则弃之重新制备。
将9组分抗原分别用包被缓冲液稀释至1μg/ml，再以100μL/孔的量分别加入酶标板中，置2～8℃包被16小时，用洗涤工作液洗板2次并甩掉孔中液体，拍干，加封闭液150μL/孔，37℃封闭2小时，甩掉孔中液体，拍干并置干燥通风的环境中晾干酶标板。用铝箔袋加入干燥剂真空包装，4℃保存备用。
为测定各蛋白免疫兔多抗血清的抗体效价，用PBS将制备的兔抗血清分别进行1:1000，1:2000，1:4000，1:8000，1:16000，1:32000，1:64000，1:128000稀释，用间接ELISA方法检测兔抗效价。同时用未免疫兔抗血清作为阴性对照，具体判定标准为:S/N≥2.1(S代表样品OD450nm值，N代表阴性对照OD450nm值)时的兔抗最大稀释倍数为兔抗效价。
第三次免疫14天后，兔耳静脉采血，分离血清，进行ELISA效价检测，结果如图18所示，显示9组分抗原的抗体效价均大于1:64000。
2.小鼠免疫实验
将上述表达纯化获得的9个抗原蛋白组分(1#-9#，分别表示P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白)分别用灭菌PBS稀释到300μg/ml，分别取1.5ml重组蛋白与等量的弗氏完全佐剂充分混匀乳化。选取健康的六周龄雌性小鼠3只，待其适应环境两天后，在背部皮下分点注射200μL乳化后的重组蛋白。
分别在首次免疫后第15、30天用弗氏不完全佐剂乳化等量蛋白加强免疫两次，免疫部位及方法同首次免疫。三免后15天尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA方法测定每只小鼠的抗体水平。取1:16000稀释后OD450nm值仍大于1.0的小鼠脾细胞进行融合，待融合的小鼠融合前三天再次加强免疫一次，加强免疫时腹腔注射0.5ml不加佐剂的重组蛋白(300μg/ml)。
第三次免疫15天后，小鼠尾静脉采血，分离血清，进行ELISA检测，记录OD450nm。结果发现当血清稀释到1:16000时，9组分重组蛋白免疫小鼠血清OD450nm值均大于1.0，详细结果见表1。
表1九组分重组蛋白三免后15天小鼠血清ELISA检测结果
上述结果表明，本发明提供的由非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白组成的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合能够产生良好的免疫反应。
实施例3九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗的免疫保护试验
1.九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗的配置
首先参照表2获得不同配比的九组分抗原蛋白组合，然后将不同配比的九组分抗原蛋白组合与等量的ISA 201佐剂(法国赛比克公司)充分混匀乳化，制备非洲猪瘟病毒九组分亚单位疫苗1-13。
表2九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗的配制
2.免疫实验
检测试剂盒：非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，非洲猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，猪圆环病毒II型直接扩增荧光定量PCR抗原检测试剂盒，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供；RealPCR PRRSV-2RNA检测预混液，猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体X3检测试剂盒，购自IDEXX公司。
检验用毒ASFV CN/GS/2018株，编号：ASFV CN/GS/2018/1901、ASFV CN/GS/2018/2001，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供。
试验动物：60～75日龄试验猪，全部购自无ASFV、PRRSV、PCV-2流行的猪场，ASFV、PRRSV抗原和抗体检测均为阴性，PCV-2抗原检测为阴性。
2.1动物免疫
将上述制备的九组分亚单位疫苗1-13，分别免疫60～75日龄试验猪，每种疫苗免疫5～10头，耳根后肌肉注射，2～3ml/头(抗原组成及含量不同)，一免后21日在另一侧耳后肌肉注射，2～3ml/头(抗原组成及含量不同)，进行加强免疫，同时设5头不免疫对照。
2.2攻毒评价
加强免疫后14日，用ASFV CN/GS/2018毒株攻毒评价，攻毒剂量1.25HAD50/3ml/头(相当于5MLD)。攻毒后连续观察21日，每日测定直肠体温，记录临床症状。对照猪全部发病，试验周期内5/5死亡，攻毒模型构建成功；免疫猪直肠体温应不超过40.5℃；若直肠体温≥40.5℃，稽留应不超过2日；未出现由非洲猪瘟病毒感染引起的典型临床症状(如：精神沉郁、食欲减退或废绝、呕吐、两耳或全身皮肤发绀、天然孔出血)；在试验周期内，未出现由非洲猪瘟病毒感染导致的死亡。符合以上3条，则判定为保护。根据免疫猪保护数量，计算疫苗保护率。
2.3样品采集
攻毒后5日、10日、15日、21日，每头猪采集血液5ml(其中4ml分离血清，1ml制备抗凝血(EDTA-K2))，同时采集肛拭子样品，-70℃及以下保存。
3.结果
3.1九组分亚单位疫苗1-13的免疫效力
九组分亚单位疫苗1-13的免疫效力结果如表3所示，表明本申请所述的9组分疫苗对亲本强毒株攻毒具有良好的保护效率。
表3不同疫苗的攻毒保护比例
疫苗编号 攻毒保护比例
疫苗1 8/10
疫苗2 8/10
疫苗3 7/10
疫苗4 5/5
疫苗5 3/5
疫苗6 7/10
疫苗7 4/5
疫苗8 5/5
疫苗9 5/5
疫苗10 5/5
疫苗11 4/5
疫苗12 4/5
疫苗13 5/5
3.2试验猪攻毒后体温监测及临床症状观察
免疫保护的试验猪，在试验周期内体温正常或体温≥40.5℃持续不超过2日，健康生长，没有表现出由非洲猪瘟病毒感染引起的典型临床症状(精神沉郁、食欲减退或废绝、呕吐、两耳或全身皮肤发绀、天然孔出血)；免疫未保护猪从攻毒后第3日开始发热，体温可达41℃以上，并出现非洲猪瘟典型临床症状，于攻毒后第7至16日内全部死亡。对照组猪从攻毒后第3日开始发热，体温可达41℃以上，于攻毒后第8至15日内全部死亡。
3.2试验猪攻毒后核酸检测结果
免疫保护的试验猪，在试验周期内体内均未检出ASFV CN/GS/2018。
需要说明的是，本申请所述的九组分亚单位疫苗中各组分在浓度大于等于50μg/ml时，均具有理想的保护效率。
上述结果表明：(1)本发明提供了一种由非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白组成的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其中所述X蛋白为DP96R蛋白或DP96R蛋白与P12蛋白的融合蛋白；所述Y蛋白为P22蛋白，或P17蛋白，或P22蛋白与P17蛋白的组合，或P22蛋白与P17蛋白的融合蛋白，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合能够产生良好的免疫反应；(2)在本发明所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合上加入疫苗佐剂制备的九组分亚单位疫苗，在亲本非洲猪瘟强毒株攻毒时能够提供良好的保护效率；(3)本申请所述的九组分亚单位疫苗具有良好的安全性；(4)本申请所述的九组分亚单位疫苗制备工艺简单，适合于大规模工业化生产。

Claims (15)

1.一种非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合由非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白组成；所述X蛋白为DP96R蛋白与P12蛋白的融合蛋白；所述Y蛋白P22蛋白胞外区与P17蛋白胞外区的融合蛋白；所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1-6：1-6：1-6：1-6：1：1-6：1-6：1：1-6；所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度均大于等于90μg/ml；所述非洲猪瘟病毒P34蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述非洲猪瘟病毒P54蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.7所示；所述非洲猪瘟病毒A104R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；所述非洲猪瘟病毒E165R蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.11所示；所述非洲猪瘟病毒DP96R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，所述DP96R蛋白与P12蛋白的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；所述非洲猪瘟病毒C129R蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示；所述非洲猪瘟病毒P72蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.19所示；所述非洲猪瘟病毒P17蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述非洲猪瘟病毒P22蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.23所示；非洲猪瘟病毒P17蛋白片段与P22蛋白片段的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.25所示；所述非洲猪瘟病毒P22蛋白胞外区与P17蛋白胞外区的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒为II型非洲猪瘟病毒。
3.如权利要求2所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述II型非洲猪瘟病毒为ASFV CN/GS2018。
4.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1-2：1：1-2：1：1：1-2：1：1：1。
5.如权利要求4所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的组成比例为1：1：1-2：1：1：1-2：1：1：1。
6.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度均大于等于150μg/ml。
7.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度均为150-2400μg/ml。
8.如权利要求7所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度分别为200μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml。
9.如权利要求7所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度分别为200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml。
10.如权利要求7所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白、P72蛋白和Y蛋白的浓度分别为400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、400μg/ml、200μg/ml、200μg/ml、200μg/ml。
11.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合，其特征在于，所述P34蛋白、P30蛋白、P54蛋白、A104R蛋白、E165R蛋白、X蛋白、C129R蛋白通过大肠杆菌***表达获得；所述P72蛋白通过昆虫***表达获得；所述Y蛋白通过CHO表达***表达获得。
12.如权利要求1-11任一所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合在制备预防或治疗非洲猪瘟病毒感染药物中的应用。
13.如权利要求1-11任一所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合在制备预防非洲猪瘟病毒感染的生物制品中的应用。
14.一种九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗，其特征在于，所述九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗由权利要求1-11任一所述的非洲猪瘟病毒抗原蛋白组合以及药学上可接受的佐剂组成。
15.如权利要求14所述的九组分抗原非洲猪瘟亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂包括：化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。
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