CN105349546A - 仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种仿刺参凝集素基因，核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1？所示，仿刺参凝集素基因的重组融合蛋白，氨基酸序列如SEQ？ID？NO：2所示。仿刺参凝集素基因的制备方法是：提取仿刺参体壁总RNA；cDNA第一条链的合成；以cDNA为模板，分别获得5’RACE和3’RACE产物；再用RT-PCR引物扩增出完整的凝集素基因片段，通过测序和拼接得到完整凝集素序列。将凝集素基因连接到PMD19-T载体上，所得阳性克隆表达、纯化，即得到仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL。制备方法简单、纯化率高，所获得的仿刺参凝集素重组融合蛋白成本低、凝集活性高、表达量多、实验重复差异小、结果稳定、可控性强。

Description

仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法

技术领域

本发明属于海洋生物基因工程领域，尤其涉及一种仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法。

背景技术

海参属棘皮动物们海参纲，约有1200多种，分布在我国海域的有140多种，其中品质最佳、药用价值最高的是产于中国辽宁、山东、河北等地的北太平洋沿海仿刺参（Apostichopusjaponicus）。近些年来，海参已经成为东亚和东南亚地区重要的生态经济物种，在中国北部沿海地区海参养殖业也迅速发展起来。然而，由于海洋中含有高浓度病原菌导致海参养殖严重的病害问题，制约了海参养殖业的健康发展。通过提高海参天然免疫力来抵抗外来病原体的侵害是海参健康养殖最科学有效的途径。

海参的免疫***中存在多种免疫因子，包括凝集素、抗菌肽、溶菌酶、模式识别受体和补体C3等，目前对于凝集素（Lectin）的研究最为广泛、透彻。凝集素是一类非免疫起源、非酶的、可促使细胞凝集的蛋白质或多价糖结合蛋白，其分子中含有一个或多个可与单糖或寡糖特异可逆结合的非催化的结构域，具有对糖、糖脂、糖蛋白高度亲和并专一结合的特性。凝集素具有识别细胞表面特异性糖结构的功能，并参与细胞凋亡、细胞粘附、促有丝***、跨膜信号转导和识别肿瘤细胞等生命活动。孙永欣等报道，海参体液中的凝集素具有修复伤口的作用；通过与外源细胞上的特异性糖结构相结合发挥凝集和调理杀伤作用。Cheung等研究表明，海洋物种中分离出来的凝集素具有高效的抗细菌、抗真菌、抗病毒、消炎、抗寄生物和抗癌变等多种活性，可见凝集素在海洋无脊椎动物的先天免疫中具有重要作用。然而，分离提取天然海参凝集素过程复杂、成本高，迄今为止还没有关于重组仿刺参凝集素基因、编码蛋白及制备方法的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种仿刺参凝集素基因，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

一种如权利要求1上述仿刺参凝集素基因的重组融合蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

一种上述仿刺参凝集素基因的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a.提取仿刺参总RNA；

b.将仿刺参总RNA反转录合成3’-RACE-ReadycDNA和5’-RACE-ReadycDNA；

c.以3’-RACE-ReadycDNA为模板，用特异性引物Ajmbcl-3和UPM进行PCR反应，得到3’-FirstroundPCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-3序列如下：

Ajmbcl-3：5'GGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTA3'；

d.以3’-FirstroundPCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl-n3和NUP进行PCR反应，得到3’-NET-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n3序列如下：

Ajmbcl-n3：5'ACAGTCGCGGGGCCATAGCATCGGG3'；

e.以5’-RACE-ReadycDNA为模板，用特异性引物Ajmbcl-5和UPM进行PCR反应，得到5’-FirstroundPCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-5序列如下：

Ajmbcl-5：5'GATGTACACCTGTGGATCCCAACCG3'；

f.以5’-FirstroundPCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl-n5和NUP进行PCR反应，得到5’-NET-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n5序列如下：

Ajmbcl-n5：5'ATGACCACTGGCAAGAACATTACCT3'；

g.将3’-NET-PCR产物和5’-NET-PCR产物拼接得到完整凝集素基因片断。

本发明以所得到的完整凝集素基因片断为模板，用RT-PCR引物扩增出完整的凝集素基因片段，并将其连接到PMD19-T载体上，所得阳性克隆表达、纯化，即得到仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL。制备方法简单、纯化率高，所获得的仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL成本低、凝集活性高、表达量多、实验重复差异小、结果稳定、可控性强，可用于海参免疫增强剂的工业化开发，可以有效抑制海参病害问题，减少污染，建立健康的养殖环境。

附图说明

图1本发明实施例仿刺参凝集素目的基因的琼脂糖凝胶电泳检测图。

图2本发明实施例重组表达质粒的双酶切电泳鉴定图。

图3本发明实施例重组表达体系（pET32a-AjMBCL）表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳及Westernblot鉴定结果示意图。

图4本发明实施例仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL凝血活性分析结果示意图。

具体实施方式

a.提取仿刺参总RNA：

取仿刺参体壁100mg，用液氮研磨，加入1mlTRNzol–A⁺提取试剂（TIANGEN），其余具体操作根据TIANGEN公司的TRNzol-A⁺总RNA提取试剂说明书进。

b.将仿刺参总RNA反转录合成3’-RACE-ReadycDNA和5’-RACE-ReadycDNA。

c.以3’-RACE-ReadycDNA为模板，用特异性引物Ajmbcl-3和UPM进行PCR反应，得到3’-FirstroundPCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-3序列如下：

Ajmbcl-3：5'GGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTA3'。

d.以3’-FirstroundPCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl-n3和NUP进行PCR反应，得到3’-NET-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n3序列如下：

Ajmbcl-n3：5'ACAGTCGCGGGGCCATAGCATCGGG3'；

3’端核苷酸序列的获得：将3’-NET-PCR扩增产物用EasyPureQuickGel

ExtractionKit纯化后与pMD19-T载体连接，送生物生工测序，获得仿刺参凝集素Aj-MBCL基因的3’端序列。

e.以5’-RACE-ReadycDNA为模板，用特异性引物Ajmbcl-5和UPM进行PCR

反应，得到5’-FirstroundPCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-5序列如下：

Ajmbcl-5：5'GATGTACACCTGTGGATCCCAACCG3'；

f.以5’-FirstroundPCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl-n5和NUP进行PCR反应，得到5’-NET-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n5序列如下：

Ajmbcl-n5：5'ATGACCACTGGCAAGAACATTACCT3'；

5’端核苷酸序列的获得：将5’-NET-PCR扩增产物用EasyPureQuickGelExtractionKit纯化后与pMD19-T载体连接，送生物生工测序，获得仿刺参凝集素Aj-MBCL基因的5’端序列。

g.将3’-NET-PCR产物和5’-NET-PCR产物拼接得到完整凝集素基因片断：

将3’-RACE获得的刺参凝集素Aj-MBCL基因的3’端序列及5’-RACE获得的仿刺参凝集素Aj-MBCL基因的5’端序列用Seqman软件进行拼接，得到完整的仿刺参凝集素Aj-MBCL基因核苷酸序列。经测序，核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，含有的完整ORF，长为537bp。

一．基因扩增、克隆与重组质粒的构建：

1．以完整的凝集素基因片段为模板，用RT-PCR引物进行选择性扩增，所述RT-PCR引物如下：

mAjmbcF:5'CCGGAATTCTGTACTTTGACGGCTTGTC3'EcoRI

mAjmbcR:5'CCCAAGCTTATTAAATTGATACACGGTG3'HindIII；

将RT-PCR产物经过凝胶电泳检测后用EasyPureQuickGelExtractionKit进行回收、纯化。琼脂糖凝胶电泳分析图如图1所示：图1中M:Marker（由上至下依次为2000,1000,750,500,250,100bp）；1:Aj-MBCL基因PCR扩增片段，477bp。

2．再用EcoRⅠ和HindⅢ对纯化的RT-PCR产物及表达载体pET-32a（+）进行双酶切，电泳回收目的条带，用T4ligase（TaKaRa）连接，转化BL21（DE3）感受态细胞，涂布LB（AMP⁺）琼脂平板，PCR鉴定阳性克隆。PCR鉴定正确者即为基因工程表达菌株，酶切电泳鉴定如图2所示。

图2中M：Marker（由上至下依次为8000,5000,3000,1500,1000,500bp）；

1：重组表达质粒（pET32a-Aj-MBCL）；2：重组表达质粒（pET32a-Aj-MBCL）经双酶切。

以上PCR反应用buffer、dNTP和酶由TaKaRaLAPCR?KitVer.2.1试剂盒提供并按说明书操作。

二．制备仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL

1．仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL的表达：

将鉴定为阳性克隆的菌接种于LB（AMP⁺）液体培养基中，37℃，200转/分，活化6个小时，然后按1：100的比例接种于LB（AMP⁺）液体培养基，37℃200转/分摇菌2.5小时，至OD₆₀₀为0.4时加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5mM，28℃，80转/分过夜培养，收集菌体；7000r/min，离心10min收集菌体，弃上清，并使残液尽量流出，以每100ml的培养液加40ml冰冷的BingdingBuffer（10mM咪唑；0.5M氯化钠；20mMTris-HCl，PH7.9）的比重重悬细胞；置于冰上超声波破碎裂解细胞，强度50%，10min，pulseon10s，pulseoff5s，5000r/min，收集沉淀。此蛋白表达为包涵体，蛋白表达产物的SDS-PAGE凝胶电泳及Westernblot分析结果如图3所示。

图3中的A图为SDS-PAGE凝胶电泳分析图，M为蛋白Marker（由上至下依次为200,116,97.2,66.4,44.3,29.0,20.1,14.3,6.5KD）1:pET32a/BL21表达产物未诱导；2:pET32a/BL21表达产物经诱导；3:pET32a-Aj-MBCL/BL21融合表达产物未诱导；4:pET32a-Aj-MBCL/BL21融合表达产物经诱导；5:pET32a-Aj-MBCL融合蛋白经亲和层析纯化后的产物。

B图为Westernblot分析图，1:为BSA对照；2:融合蛋白稀释20倍；3：融合蛋白稀释10倍。

2．仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL的分离：

采用镍柱亲和层析的方法纯化重组融合蛋白。

将所得到的包涵体经变性、复性后的溶液用0.45μm的一次性除菌器过滤；将凝胶灌柱（ProteinIso^TMNi-NTAResin，transgen），依次使用3倍体积的去离子水和8倍体积的BingdingBuffer（10mM咪唑；0.5M氯化钠；20mMTris-HCl，PH7.9）平衡，流速为2ml/min；将细胞裂解液上柱，流速为2ml/min；使用15倍体积的BingdingBuffer冲洗柱子，再用5倍体积的WashingBuffer（60mM咪唑；0.5M氯化钠；20mMTris-HCl，PH7.9）冲洗柱子，最后用3倍体积的ElutionBuffer（0.5M咪唑；0.5M氯化钠；20mMTris-HCl，PH7.9）洗脱，得到较纯的仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL。

包涵体的变性与复性具体步骤如下：

将包涵体按1:10（W/V）重悬于洗涤液（20mMTris-HCl，PH7.9；1.5mM尿素；1mMEDTA）中吹散，1000rpm离心30min；，将洗涤好的包涵体按照1:15的比例加入变性缓冲液（20mMTris-HCl，PH7.9；8M尿素；1mMEDTA）中，室温放置1-2小时；将溶液12000rpm离心30min，取上清；将变性好的蛋白放入透析袋中，浸泡在复性缓冲液（20mMTris-HCl，PH7.9）中搅拌过夜，得到有活性的蛋白。

用BCA法测定纯化的仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL浓度，操作按照BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天）说明书进行。

对所得到的仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL进行测序，其氨基酸序列是如SEQIDNO：2所示178个氨基酸的多肽，该多肽理论蛋白质分子量为17.59KD。

三．仿刺参凝集素重组融合蛋白rAj-MBCL对人红细胞凝集活性检测：

1．红细胞的处理

取人血液5ml，用3.8%（M/M）枸橼酸钠溶液抗凝，将抗凝血经2000rmp离心10min，除去血浆。加入10倍体积的TBS溶液，充分洗涤，1000rmp离心5min去除上清，重复4次。以TBS-Ca²⁺溶液配成2%（V/V）的红细胞悬液，同时以TBS溶液配成2%（V/V）的红细胞悬液；另以TBS-EGTA配成2%（V/V）红细胞悬液。

2．实验设计：

在每个孔中加入相对应的缓冲液（各80μl），A组为TBSBuffer;B、D组为TBSBuffer+Ca²⁺；C组为TBSBuffer+Ca²⁺+EDTA。A、B、C组第一个孔都加入80μlAjMBCL蛋白（0.24mg/ml）；D组加入相同浓度的BSA做对照。混匀后取80μl混合液加入第二个孔，混匀后取80μl加入第三个孔，以此类推做倍比稀释，1:2（0.12），1:4（0.06），1:8（0.03），1:16（0.015），1:32（0.0075），1:64（0.0038），1:128（0.0019），1:236（0.00095）。在每个空中加入5%红细胞20μl，混匀后室温静置5min，扫描仪鉴定结果如图4所示。

图4中：

A行为仿刺参凝集素重组融合蛋白rA-jMBCL与TBSbuffer混合样；

B行为仿刺参凝集素重组融合蛋白rA-jMBCL与TBSbuffer（含有20mMCaCl₂）混合样；

C行为仿刺参凝集素重组融合蛋白rA-jMBCL与TBSbuffer（含有20mMEDTA和20mMCaCl₂）混合样；

D行为牛血清白蛋白BSA与TBSbuffer（含有20mMCaCl₂）混合样；

1-8列为待测融合蛋白和BSA按倍比稀释的浓度，依次为0.24,0.12,0.06,0.03,0.015,0.0075,0.0038,和0.0019mg/ml。

3．结果：

结果显示，A，C，D组的红细胞均匀分散；而B组有明显的凝集现象，从1到8凝集活性逐渐降低，1，2，3号凝集活性较明显，4、5号有微弱的凝集活性，6号之后几乎不表现凝集素活性。从结果得出结论，本发明的仿刺参凝集素重组融合蛋白rA-jMBCL为Ca²⁺依赖型，EDTA等金属离子螯合剂对其有抑制作浓度大于0.03mg/ml时有明显的凝集现象。

序列表

<110>大连海洋大学

<120>仿刺参凝集素基因、重组融合蛋白及制备方法

<160>8

<210>1

<211>537

<212>DNA

<213>仿刺参凝集素基因

<400>1

1ATGTATCGCACCGTTTTTCTGCTCGTTGTCACTTGCATGTTGTTTGTGCATTCCAGCGGC

61TGTACTTTGACGGCTTGTCCATCAAAATGGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTACAGATTG

121TTTGCTGCTGGACACAAACAATTTGATGCCGCGGAGAGAGCCTGTCAAAGTGCAAAACTC

181GTTGACTGCCAAGGTAATGTTCTTGCCAGTGGTCATCTGGCATCTGTTCACAGTCAAGAA

241GAACAAAACTTTCTCTTAGAAATGGTTCGGTCGACTTTACAATATACAAGCGGTTGGGAT

301CCACAGGTGTACATCGGAATGAAAGTTGGATACCACAACAACCAGCAAAGTTGGACCGAT

361GGATCATCCGTTGATTACACCAGCTGGTTCTCTGGAGAGCCGAACAATGGGCCTAACAGT

421CGCGGGGCCATAGCATCGGGCTTGCATTCGCGTGGTAAATGGGCCGATGTATACAGCAAC

481AGCAACTTCCCCTATATTTGTCAGCTACCTTGCACCGATTATCAATTTAATTGGTAG537

<210>2

<211>179

<212>PRT

<213>仿刺参凝集素基因的重组融合蛋白

<400>2

1MYRTVFLLVVTCMLFVHSSG

21CTLTACPSKWTGFNGKCYRL

41FAAGHKQFDAAERACQSAKL

61VDCQGNVLASGHLASVHSQE

81EQNFLLEMVRSTLQYTSGWD

101PQVYIGMKVGYHNNQQSWTD

121GSSVDYTSWFSGEPNNGPNS

141RGAIASGLHSRGKWADVYSN

161SNFPYICQLPCTDYQFNW*178

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

GGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTA25

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

ACAGTCGCGGGGCCATAGCATCGGG25

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

GATGTACACCTGTGGATCCCAACCG25

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

ATGACCACTGGCAAGAACATTACCT25

<210>7

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

CCGGAATTCTGTACTTTGACGGCTTGTC28

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

CCCAAGCTTATTAAATTGATACACGGTG28

Claims (3)

1.一种仿刺参凝集素基因，其特征在于核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.一种如权利要求1所述仿刺参凝集素基因的重组融合蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。

3.一种如权利要求1所述仿刺参凝集素基因的制备方法，其特征在于依次按如下步骤进行：

a.提取仿刺参总RNA；

b.将仿刺参总RNA反转录合成3’-RACE-ReadycDNA和5’-RACE-ReadycDNA；

c.以3’-RACE-ReadycDNA为模板，用特异性引物Ajmbcl-3和UPM进行PCR反应，得到3’-FirstroundPCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-3序列如下：

Ajmbcl-3：5'GGACTGGCTTCAATGGAAAGTGTTA3'；

d.以3’-FirstroundPCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl-n3和NUP进行PCR反应，得到3’-NET-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n3序列如下：

Ajmbcl-n3：5'ACAGTCGCGGGGCCATAGCATCGGG3'；

e.以5’-RACE-ReadycDNA为模板，用特异性引物Ajmbcl-5和UPM进行PCR反应，得到5’-FirstroundPCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-5序列如下：

Ajmbcl-5：5'GATGTACACCTGTGGATCCCAACCG3'；

f.以5’-FirstroundPCR产物为模板，用特异性引物Ajmbcl-n5和NUP进行PCR反应，得到3’-NET-PCR产物，所述特异性引物Ajmbcl-n5序列如下：

Ajmbcl-n5：5'ATGACCACTGGCAAGAACATTACCT3'；

g.将3’-NET-PCR产物和5’-NET-PCR产物拼接得到完整凝集素基因片断。