CN105274134A

CN105274134A - 拟穴青蟹抗菌肽scy2的制备方法与应用

Info

Publication number: CN105274134A
Application number: CN201510831229.4A
Authority: CN
Inventors: 王克坚; 刘杰; 彭会
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2016-01-27

Abstract

拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法与应用，涉及拟穴青蟹。制备方法：拟穴青蟹抗菌肽SCY2表达载体的构建：设计上游引物，设计时在5′端EcoRⅠ酶切位点前加入Kex2酶切位点氨基酸序列所对应的碱基序列，PCR扩增SCY2基因，将SCY2基因***pPIC9K载体中，即得pPIC9K-SCY2重组表达载体；将所得到的重组表达载体转化入宿主细胞，对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；分离纯化所得的表达产物，再进行N端测序，确定所获得的表达产物为具有与天然蛋白有相同N端的SCY2。拟穴青蟹抗菌肽SCY2可在制备细菌生长抑制剂中应用，SCY2还可在制备动物饲料添加剂以及抗病原微生物药物中应用。

Description

拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及拟穴青蟹，尤其是涉及拟穴青蟹抗菌肽SCY2的表达载体构建和毕赤酵母表达产物的制备方法。

背景技术

拟穴青蟹是我国东南沿海的重要海产养殖品种，其具有个体大、肉质好、营养丰富等特点，深受人们喜爱。近年来，随着养殖规模不断扩大、环境污染加重、致病菌大量增生等问题的出现，拟穴青蟹发生了大规模的死亡，使我国海产养殖业遭到了巨大的经济损失。

抗菌肽是甲壳类动物先天性免疫中的重要免疫活性因子，已报道的甲壳动物抗菌肽主要包括：penaeidin^[1,2]，Crustin^[3-5]，抗脂多糖因子(ALF)^[6-8]，以及青蟹性腺特异高表达的抗菌肽Scygonadin^[9]。抗菌肽在海水养殖鱼类、甲壳类等的疾病防治中作为抗耐药性细菌的药物和饲料添加剂具有广阔的应用前景。研究、开发和应用抗菌肽，对解决在海水养殖中由于抗生素的滥用导致的耐药性细菌的产生和水产品药物残留超标等问题具有重要的科学意义和应用价值。

本申请人在拟穴青蟹中克隆获得了一个新抗菌肽SCY2，运用ProtParam工具分析结果显示，SCY2成熟肽含有100个氨基酸残基，平均分子量为10925.4Da，PI为4.84，为阴离子抗菌肽。同时本申请人研究发现，拟穴青蟹抗菌肽SCY2可能在青蟹的生殖免疫中起着重要作用^[10]。

参考文献：

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发明内容

本发明的第一目的在于提供拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法。

本发明的第二目的在于提供拟穴青蟹抗菌肽SCY2在制备细菌生长抑制剂中的应用。

所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法，包括以下步骤：

1)拟穴青蟹抗菌肽SCY2表达载体的构建：设计上游引物，设计时在5′端EcoRⅠ酶切位点前加入Kex2酶切位点氨基酸序列所对应的碱基序列，PCR扩增拟穴青蟹抗菌肽SCY2基因，将所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2基因***pPIC9K载体中，即得pPIC9K-SCY2重组表达载体；

2)将步骤1)所得到的重组表达载体转化入宿主细胞，对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；

3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，再进行N端测序，确定所获得的表达产物为具有与天然蛋白有相同N端的拟穴青蟹抗菌肽SCY2。

在步骤1)中，所述引物序列如下：

gggGAATTCGAGAAAAGAGGCCTGGCACTCAACAGACTTATG；

所述PCR扩增拟穴青蟹抗菌肽SCY2基因的Genbank登录号为EF555444。

所述表达载体用于表达序列为SEQIDNo.1的拟穴青蟹抗菌肽SCY2序列。

所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的氨基酸片段序列为SEQIDNo.2。

在步骤3)中，所述分离纯化的方法为将步骤2)所得的表达产物进行离心，收集发酵上清液，对发酵上清液进行透析后，亲和层析后即获得纯化的拟穴青蟹抗菌肽SCY2。

抗菌实验结果显示，拟穴青蟹抗菌肽SCY2对革兰氏阳性菌，如溶壁微球菌具有较强的抗菌活性(MIC＝12.5～25μM)，对藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌具有一定的抗菌活性(MIC＝25～50μM)，对革兰氏阴性菌无抗菌活性(MIC>50μM)。可见真核表达的SCY2具有一定的抗菌活性，且对革兰氏阳性菌的抗菌活性强于对革兰氏阴性菌的抗菌活性。

所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2可在制备细菌生长抑制剂中应用。所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2还可在制备动物饲料添加剂以及抗病原微生物药物中应用。

所述细菌主要为革兰氏阳性菌，如藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)和溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)。

所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的基因序列为：

所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的氨基酸序列为：

本发明旨在获得与天然蛋白具有相同N末端的拟穴青蟹抗菌肽SCY2的真核表达产品，并对其抗菌活性进行鉴定，以期开发抗病原微生物的新药物。本发明根据拟穴青蟹抗菌肽SCY2基因序列特征，通过基因工程表达技术，成功获得具有生物活性的拟穴青蟹抗菌肽SCY2，其具有与天然蛋白相同的N端，验证拟穴青蟹抗菌肽SCY2具有一定抗菌活性，为其作为抗病原微生物新药的开发奠定基础。

附图说明

图1为SCY2PCR电泳图谱。M为DNAMarkerDL2000，1为SCY2PCR片段。

图2为pPIC9K表达载体酶切前后电泳图。1为pPIC9K载体酶切前片段，M为DNAMarkerDL2000，2为pPIC9K载体酶切后片段。

图3为pPIC9K-SCY2真核表达载体构件图。

图4为SDS-PAGE分析SCY2的表达和纯化情况。M:预染蛋白Maker(BioBasic公司)；1：毕赤酵母表达的SCY2蛋白；2：流出组分；3，4：纯化的抗菌肽SCY2。

图5为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D01lcd测序结果。

图6为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D02lcd测序结果。

图7为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D03lcd测序结果。

图8为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D04lcd测序结果。

图9为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D05lcd测序结果。

图10为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D06lcd测序结果。

图11为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D07lcd测序结果。

图12为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D08lcd测序结果。

图13为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D09lcd测序结果。

图14为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D10lcd测序结果。

图15为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D11lcd测序结果。

图16为对表达所获得的抗菌肽SCY2的N端氨基酸残基序列D11lcd测序结果。

具体实施方式

以下通过实施例结合附图详细说明本发明的技术方案。

实施例1重组表达载体pPIC9K-SCY2的构建

1)扩增拟穴青蟹SCY2成熟肽序列

根据pPIC9K载体多克隆位点和拟穴青蟹SCY2基因序列(Genbank登录号：JX228177)，设计扩增SCY2基因的上、下游引物。上游引物5′端加入Kex2酶切位点和EcoRⅠ，下游引物3′端加上NotⅠ酶切位点，终止密码子和6×His组氨酸标签。SCY2基因的引物设计如下：

上游引物F：gggGAATTCGGCCTGGCACTCAACAGACTTATG

EcoRⅠKex2识别位点

下游引物R：catGCGGCCGC ATGGTGATGGTGATGATGGTAGGAAGCAAGCCAGTCC

NotⅠ终止密码子6×His-Tag

TCGAGGTC

以青蟹***管组织提取的总RNA反转录成的cDNA为扩增模板，分别以SCY2-F和SCY2-R为上、下游引物，以FastPfu聚合酶扩增目的片段，反应体系为

混合均匀，PCR反应程序如下：

PCR产物长度为300bp(参见附图1)。

2)SCY2目的基因片段的双酶切：

取2μg上述回收的两种N端SCY2的目的基因片段，分别加入EcoRⅠ和NotⅠ限制性酶，37℃孵育5h，酶切体系如下：

反应结束后，用1.5％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检测酶切效率；用东盛凝胶回收试剂盒回收酶切后的SCY2目的基因片段。处理后的SCY2目的基因片段具有EcoRⅠ和NotⅠ的粘性末端(参见附图2)。

5)pPIC9K质粒的提取和双酶切

将带有pPIC9K的保种菌株DH5α划线于含50μg/mL的氨苄霉素的LB平板上，37℃培养过夜。次日挑取平板上的单克隆菌落，接种于5mL含50μg/mL的氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃，180r/min培养8h至对数生长期，离心收集菌体，小量提取pPIC9K，具体操作方法见东盛质粒提取试剂盒说明书。

取2μg上述纯化的pPIC9K载体，分别加入EcoRⅠ和NotⅠ限制性酶，37℃孵育5h，酶切体系如下：

反应结束后，用1％(W/V)琼脂糖凝胶-TAE电泳检测酶切效率；若载体酶切完全，用东盛凝胶回收试剂盒回收酶切后的载体。处理后的pPIC9K载体具有EcoRⅠ和NotⅠ的粘性末端。

6)pPIC9K-SCY2载体的构建、转化和鉴定

将经过一系列处理后具有EcoRⅠ和NotⅠ的粘性末端的pPIC9K载体与具有相同粘性末端SCY2的基因片段进行连接，反应体系如下：

将混合体系置于16℃孵育过夜；次日取10μL连接反应液转化至80μLE.coliDH5α感受态细胞中，涂布在含有氨苄霉素(50μg/mL)的LB琼脂平板上，37℃培养过夜。次日挑取单克隆菌落，将由菌液PCR法鉴定得到的阳性克隆菌交由Invitrogen公司进行DNA核苷酸序列测定。

结果显示，连接正确，核苷酸的开放阅读框(ORF)连续编码，最终成功构建pPIC9K-SCY2融合表达载体(附图3)。该真核重组表达载体的特点是采用AOX1启动子，酵母信号肽α-factor因子引导抗菌肽SCY2的分泌表达；设计引物时在EcoRI酶切位点前加上Kex2酶切位点，通过在酵母表达的外源蛋白前体中加入Kex2的识别位点，可实现对外源蛋白前体进行加工的目的，从而获得与天然蛋白具有相同N端的抗菌肽SCY2；C端添加6×His-Tag便于亲和层析纯化目的蛋白。

实施例2pPIC9K-SCY2重组质粒在毕赤酵母GS115中的诱导表达

1)pPIC9K-SCY2的线性化

将测序正确的含表达载体的菌株划线培养，挑取单克隆摇菌培养，提取质粒，对10μg质粒用SacⅠ线性化,反应体系如下：

用东盛凝胶回收试剂盒回收线性化后的pPIC9K-SCY2。采用电击法转化将线性化后的质粒转化至毕赤酵母GS115感受态细胞中，涂布于MD平板，28℃培养48h。

2)抗菌肽pPIC9K-SCY2的诱导表达

从MD平板上挑取单克隆菌落，接种于10ml生长培养基(BMGY)中，28℃230rpm/min培养至对数生长期，离心倒掉培养基收集菌体，加入10ml表达培养基(BMGY)，用0.5％甲醇诱导表达0、24和48h，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测融合蛋白的表达情况。

结果显示：pPIC9K-SCY2重组质粒转化的毕赤酵母GS115甲醇诱导24h与诱导前相比，在约10kDa位置具有明显的表达蛋白带(附图4)。

实施例3亲和层析法纯化抗菌肽SCY2

1)上柱前样品的制备

按照实施例2描述，重组菌株诱导24h后12,000rpm低温离心30min，收集发酵上清液。4℃，用预冷的PBS透析液(50mM磷酸缓冲液+50mMNaCl，pH8.0)透析毕赤酵母诱导表达上清液2～3次，随后12,000rpm低温离心30min，再次收集发酵上清液，经0.45μm滤膜过滤，待上柱纯化。

2)亲和层析法纯化抗菌肽SCY2

用镍离子螯合亲和层析柱亲和纯化，层析试剂为：

溶液A：20mM磷酸缓冲液+50mMNaCl+10mM咪唑，pH8.0；

溶液B：20mM磷酸缓冲液+500mMNaCl+1M咪唑，pH8.0；

用5～10个柱体积MilliQ水清洗预装柱(HisTrap^TMFFCrude5mL)，接着5～10个柱体积溶液C平衡HisTrap层析柱，将过滤后的上清液以2mL/min全部上柱，同时收集流穿样品；然后用5～10个柱体积的溶液C过柱，洗去未结合的蛋白；用30％溶液D过柱，洗脱抗菌肽收集洗脱峰，取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定。

SDS-PAGE电泳结果显示(参见附图4)，SCY2融合蛋白表达产物能够特异性的与镍离子螯合亲和层析柱结合，在较高浓度的咪唑溶液竞争洗涤后，融合表达产物被洗脱，纯度较高。将蛋白在磷酸盐缓冲液中透析，最后透析入MilliQ水中。

实施例4抗菌肽SCY2的N端测序

N端测序委托生工生物工程公司完成，本实验用Edman降解方法测定了两种SCY2的N端12个氨基酸残基序列。抗菌肽SCY2的N端测序结果(D01lcd～D12lcd)参见图5～16。

由N端测序结果可知，所测序样品N端序列为：YVEFGLALNRLM，即NH2-Tyr-Val-Glu-Phe-Gly-Leu-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Met。将该序列与美国国家生物技术信息中心数据库(NCBI)中已知的蛋白质序列进行比对。结果显示，该蛋白N端后8个氨基酸残基序列Gly-Leu-Ala-Leu-Asn-Arg-Leu-Met与数据库中拟穴青蟹SCY2成熟肽N端前8个氨基酸残基序列相同，可知由毕赤酵母GS115体外真核表达所得的多肽即为拟穴青蟹抗菌肽SCY2。

实施例5抗菌肽SCY2的抗菌活性鉴定

蛋白样品过滤除菌后，以BSA为标准品应用Bradford法绘制蛋白浓度标准曲线，根据公式可计算出抗菌肽SCY2的浓度。将蛋白溶液倍比稀释至1.6～50μM。MIC(MinimumInhibitoryConcentration，最小抑菌浓度)的测定在96孔细胞培养板上进行。

(1)菌悬液的准备：取被测细菌，在营养肉汤平板上划线，培养12～16h；挑取2～3个克隆接种于MH斜面，继续培养12～16h；10mM磷酸钠盐缓冲液(pH7.2)冲洗新鲜制备的MH细菌斜面培养物，调整OD₆₀₀为0.003。倒置培养2～5天。

(2)每种被测菌按照以下操作设置空白对照组、阴性对照组和待测样品实验组，每组设置2个平行样，每种菌重复3次：

i.阳性对照组：加50μL磷酸钠盐缓冲液和50μL菌悬液；

ii.空白对照组：加50μL待测蛋白样品和50μL磷酸钠盐缓冲液；

iii.样品实验组：加50μL待测蛋白样品和50μL菌悬液；

(3)细菌最适培养24～48h后，观察MIC结果。

抗菌实验结果显示，SCY2对革兰氏阳性菌，如溶壁微球菌具有较强的抗菌活性(MIC＝12.5～25μM)，对藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌具有一定的抗菌活性(MIC＝25～50μM)，对革兰氏阴性菌无抗菌活性(MIC>50μM)。可见真核表达的SCY2具有一定的抗菌活性，且对革兰氏阳性菌的抗菌活性强于对革兰氏阴性菌的抗菌活性。

本发明提供了含有拟穴青蟹抗菌肽SCY2的表达载体的构建、表达产物及其制备方法。本发明所述表达载体中***了用于重组表达序列为SEQIDNo.1的SCY2序列，在宿主毕赤酵母中进行诱导表达，获得表达产物。由于设计引物时在EcoRI酶切位点前加上Kex2酶切位点，通过在酵母表达的外源蛋白前体中加入Kex2的识别位点，实现对外源蛋白前体进行加工的目的，从而获得与天然蛋白具有相同N端的抗菌肽SCY2。该抗菌肽具有一定的抗菌活性，对溶壁微球菌，藤黄微球菌、谷氨酸棒杆菌等均有显著的抑杀菌作用，在水产养殖业、医药业等将具有重要的应用价值。

Claims

1.拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述引物序列如下：

gggGAATTCGAGAAAAGAGGCCTGGCACTCAACAGACTTATG。

3.如权利要求1所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述表达载体用于表达序列为SEQIDNo.1的拟穴青蟹抗菌肽SCY2序列。

4.如权利要求1所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法，其特征在于在步骤1)中，所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的氨基酸片段序列为SEQIDNo.2。

5.如权利要求1所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的制备方法，其特征在于在步骤3)中，所述分离纯化的方法为将步骤2)所得的表达产物进行离心，收集发酵上清液，对发酵上清液进行透析后，亲和层析后即获得纯化的拟穴青蟹抗菌肽SCY2。

6.如权利要求1所制备的拟穴青蟹抗菌肽SCY2在制备细菌生长抑制剂中应用。

7.如权利要求1所制备的拟穴青蟹抗菌肽SCY2在制备动物饲料添加剂中应用。

8.如权利要求1所制备的拟穴青蟹抗菌肽SCY2在制备抗病原微生物药物中应用。

9.如权利要求6所述应用，其特征在于所述细菌为革兰氏阳性菌；所述革兰氏阳性菌包括但不限于藤黄微球菌(Micrococcusluteus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)。

10.如权利要求1所制备的拟穴青蟹抗菌肽SCY2的基因序列为：

所述拟穴青蟹抗菌肽SCY2的氨基酸序列为：