CN106666064A - 一种类海参蛋白质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种类海参蛋白质的制备方法。其解决现有海参产品价格昂贵的问题。其是选取海参壁组织通过氯仿抽提方法，获得海参壁细胞RNA；再采用RT‑PCR的方法，得到海参壁细胞的cDNA，然后利用随机引物进行PCR，得到各种随机的基因片段，然后将得到的基因片段克隆入原核表达载体，进行诱导表达，得到随机基因编码的随机蛋白，凝胶过滤层析，收集得到类海参壁蛋白质溶液。本发明采用的原核表达方法技术成熟，生产成本低，价格便宜；所得随机蛋白都是来源于海参壁细胞的RNA，其氨基酸组成与海参壁细胞的氨基酸组成基本类似，营养价值高；其制备方法工艺合理，操作可行，易实现规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是一种类海参蛋白质的制备方法。
背景技术
我们知道，海参属棘皮动物门，海参纲，是生长在海洋底层岩石上或海藻间的一种棘皮动物。海参为海珍之首，富含人体所需的多种微量元素和多种氨基酸，其肉质软嫩，营养丰富，是典型的高蛋白、低脂肪、无胆固醇食物，自古以来被视为佐膳佳肴及珍贵滋补品。研究表明，海参中所含的人体必需氨基酸含量可达到20%，鲜味氨基酸和药效氨基酸均可达到36%，因此，海参不仅有滋补、保健作用，而且对于治疗高血压、高血糖、神经衰弱等均有明显功效。
海参虽好，但价格昂贵，对于普通的工薪阶层长期食用，还是难以承受的。因此，研发一种既具有海参营养价值，又能不给食用者造成经济压力的替代产品就显得很有必要。
发明内容
为了克服现有技术中海参产品价格昂贵的不足，本发明提供一种工艺合理、易于操作、价格便宜、营养价值高的类海参蛋白质的制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：一种类海参蛋白质的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
（1）、海参壁细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取100～200mg海参壁组织在液氮中磨碎，加入1～2ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温条件下静置3～5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于2～8℃条件下，10000g离心8～10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积10%～20%的氯仿，剧烈振荡15～20s，室温静置2～3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于2～8℃条件下，10000g离心10～15min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1～2的比例加入异丙醇，室温静置8～10min，于2～8℃条件下，10000g离心8～10min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1～1.5ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于2～8℃条件下，6000～7500g离心3～5min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥5～10min，然后加入25～200μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于55～60℃条件下静置8～10min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得海参壁细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的海参壁细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积10%～15%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8～12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h；将500ml菌液接种至50～80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4～0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.3～0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30～60s，用发酵液体积10%～20%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心30～60s，取上清液，即为海参壁RNA随机原核表达粗产物；
（5）、凝胶过滤
将步骤（4）中的海参壁RNA随机原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白质溶液，获得随机原核表达产物，即为类海参壁蛋白质溶液。
所述的匀浆后的混合物静置时的室温控制为15～30℃。
本发明先是选取海参壁组织通过氯仿抽提方法，获得海参壁细胞RNA；再采用RT-PCR的方法，得到海参壁细胞的cDNA，然后利用随机引物进行PCR，得到各种随机的基因片段，然后将得到的基因片段克隆入原核表达载体，进行诱导表达，得到随机基因编码的随机蛋白，这些随机蛋白都是来源于海参壁细胞的RNA，即均为海参壁细胞中所含有蛋白或蛋白片段，其氨基酸组成与海参壁细胞的氨基酸组成基本类似，其营养价值高，所得到的蛋白可用于后期产品加工使用，可达到提供与海参营养类似的目的。本发明采用的原核表达方法，因为原核表达技术成熟，价格低廉，生产成本低。其制备方法工艺合理，操作可行，易实现规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种类海参蛋白质的制备方法，其经过下列工艺步骤：
（1）、海参壁细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取150mg海参壁组织在液氮中磨碎，加入1.5ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温控制为20℃条件下静置4min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于5℃条件下，10000g离心9min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积16%的氯仿，剧烈振荡18s，室温静置3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于5℃条件下，10000g离心12min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1.6的比例加入异丙醇，室温静置9min，于5℃条件下，10000g离心9min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.2ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于5℃条件下，7000g离心4min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥8min，然后加入100μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于58℃条件下静置9min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得海参壁细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的海参壁细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积12%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养10h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养10h；将500ml菌液接种至65L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.5，向其中加入IPTG至终浓度为0.35mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心45s，用发酵液体积15%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心45s，取上清液，即为海参壁RNA随机原核表达粗产物；
（5）、凝胶过滤
将步骤（4）中的海参壁RNA随机原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白质溶液，获得随机原核表达产物，即为类海参壁蛋白质溶液。
本实施例得到随机基因编码的随机蛋白的氨基酸组成与海参壁细胞的氨基酸组成基本类似，其原料成本低，价格便宜，所得到的类海参壁蛋白质营养价值高。其采用的原核表达方法技术成熟，易于操作。其制备方法工艺合理，易实现规模化生产。
实施例2
一种类海参蛋白质的制备方法，其经过下列工艺步骤：
（1）、海参壁细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取200mg海参壁组织在液氮中磨碎，加入2ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温控制为30℃条件下静置3min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于8℃条件下，10000g离心8min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积20%的氯仿，剧烈振荡20s，室温静置3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于8℃条件下，10000g离心15min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1: 2的比例加入异丙醇，室温静置10min，于8℃条件下，10000g离心10min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1.5ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于8℃条件下，7500g离心3min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥10min，然后加入200μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于60℃条件下静置8min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得海参壁细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的海参壁细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积15%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养12h；将500ml菌液接种至80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心60s，用发酵液体积120%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心60s，取上清液，即为海参壁RNA随机原核表达粗产物；
（5）、凝胶过滤
将步骤（4）中的海参壁RNA随机原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白质溶液，获得随机原核表达产物，即为类海参壁蛋白质溶液。
本实施例得到随机基因编码的随机蛋白的氨基酸组成与海参壁细胞的氨基酸组成基本类似，其原料成本低，价格便宜。其制备方法工艺合理，操作可行，易实现规模化生产。
实施例3
一种类海参蛋白质的制备方法，其经过下列工艺步骤：
（1）、海参壁细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取100mg海参壁组织在液氮中磨碎，加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温控制为15℃条件下静置5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于2℃条件下，10000g离心10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积10%的氯仿，剧烈振荡15s，室温静置2min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于2℃条件下，10000g离心10min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1的比例加入异丙醇，室温静置8min，于2℃条件下，10000g离心8min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于2℃条件下，6000g离心5min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥5min，然后加入25μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于55℃条件下静置10min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得海参壁细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的海参壁细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积10%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8h；将500ml菌液接种至50L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4，向其中加入IPTG至终浓度为0.3mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30s，用发酵液体积10%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心30s，取上清液，即为海参壁RNA随机原核表达粗产物；
（5）、凝胶过滤
将步骤（4）中的海参壁RNA随机原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白质溶液，获得随机原核表达产物，即为类海参壁蛋白质溶液。
本实施例得到随机基因编码的随机蛋白的氨基酸组成与海参壁细胞的氨基酸组成基本类似，营养价值高，原料成本低，价格便宜。其采用的原核表达方法技术成熟，易于操作。其制备方法工艺合理，易实现规模化生产。
Claims (2)
1. 一种类海参蛋白质的制备方法，其特征在于：其经过下列工艺步骤：
（1）、海参壁细胞RNA的提取
（1.1）、匀浆处理
称取100～200mg海参壁组织在液氮中磨碎，加入1～2ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理；
（1.2）、静置
将步骤（1.1）中得到的匀浆后的混合物在室温条件下静置3～5min，使核酸蛋白复合物完全分离；
（1.3）、离心去杂质
将步骤（1.2）中得到的静置后的混合物于2～8℃条件下，10000g离心8～10min，收取上清液；
（1.4）、抽提
将步骤（1.3）中得到的上清液中加入其体积10%～20%的氯仿，剧烈振荡15～20s，室温静置2～3min；
（1.5）、离心
将步骤（1.4）中得到的室温静置后的混合物于2～8℃条件下，10000g离心10～15min；样品分为三层：有机相、水相和中间层；
（1.6）、沉淀
将步骤（1.5）中的水相层转移到新试管中，按体积比1:1～2的比例加入异丙醇，室温静置8～10min，于2～8℃条件下，10000g离心8～10min，管侧和管底出现胶状沉淀，移去上清液，即得RNA沉淀；
（1.7）、洗涤
向步骤（1.6）中得到的RNA沉淀中加入1～1.5ml、浓度为75%的乙醇溶液进行洗涤，再于2～8℃条件下，6000～7500g离心3～5min，弃上清液，得洗涤后的RNA沉淀；
（1.8）、干燥
将步骤（1.7）中得到的洗涤后的RNA沉淀室温放置干燥5～10min，然后加入25～200μl无RNase的水，用枪头吸打混匀，于55～60℃条件下静置8～10min，使RNA溶解，-70℃保存，备用；
（2）、反转录
将步骤（1.8）中得到的保存的RNA采用RT-PCR的方法，利用反转录酶SuperScriptTMII和随机引物进行反转录，获得海参壁细胞的cDNA；
（3）、构建表达载体
将步骤（2）中得到的海参壁细胞的cDNA以反转录产物为模板，利用大量随机引物：引物L-随机和R-随机 PCR扩增25个循环后回收，酶切后，回收产物与pET32(a)载体连接，转化大肠杆菌DH5α，得到含有表达载体pET32(a)-随机的大肠杆菌，挑取菌落，接种入LB液体培养基，待菌液浓度为OD值接近1.0时，向其中加入菌液体积10%～15%的甘油，-70℃保存，得到转化入表达载体的菌株；
（4）、蛋白表达
挑取步骤（3）中保存的菌株，接种体积为10ml LB液体培养基，37℃振荡培养8～12h；将10ml菌液加入到500ml LB液体培养基中，37℃振荡培养8～12h；将500ml菌液接种至50～80L发酵罐中，跟踪菌体生长指标，待OD600≈0.4～0.6，向其中加入IPTG至终浓度为0.3～0.4mM，继续振荡培养6h；开罐取菌液，12000g离心30～60s，用发酵液体积10%～20%的、浓度为1%的SDS溶液进行重悬，混匀，冰上超声破碎；12000g离心30～60s，取上清液，即为海参壁RNA随机原核表达粗产物；
（5）、凝胶过滤
将步骤（4）中的海参壁RNA随机原核表达粗产物进行凝胶过滤层析，收集蛋白质溶液，获得随机原核表达产物，即为类海参壁蛋白质溶液。
2.根据权利要求1所述的一种类海参蛋白质的制备方法，其特征在于：所述的匀浆后的混合物静置时的室温控制为15～30℃。
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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