CN104774899A

CN104774899A - 金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备方法

Info

Publication number: CN104774899A
Application number: CN201510198264.7A
Authority: CN
Inventors: 迟长凤; 王斌; 赵玉勤; 孙坤来
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: BEIJING SIMEITOL BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2015-04-24
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2035-04-24
Also published as: CN104774899B

Abstract

本发明公开了一种金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备方法，制备时以金枪鱼暗色肉作为原料，经过脱脂、碱性蛋白酶酶解、超滤、凝胶过滤层析、细胞膜色谱纯化和反相高效液相纯化，得抗***多肽Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp。该多肽对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用，IC₅₀为0.16 mg/mL，可用于制备防治***的药物。

Description

金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种鱼类功能性多肽的制备方法，尤其涉及金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备方法。

背景技术

金枪鱼为大洋性鱼类，是世界远洋渔业发展的重点目标鱼种，也是国际营养学会推荐为世界三大营养鱼类之一。据***粮农组织统计，目前世界大洋性渔业总产量为850万吨，其中金枪鱼产量超过600万吨，占公海渔业总产量70%以上。在金枪鱼加工过程中产生大量暗色肉，约占原料的11%。现有研究表明，金枪鱼暗色肉必需氨基酸含量丰富、全面，切易消化吸收，是制备活性肽的优质原料。但目前并未得到有效利用。

申请人研究发现，以金枪鱼暗色肉为原料，利用酶解技术制备抗***多肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性抗***多肽更是未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状提供一种对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用的金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备方法，该工艺科学、先进。

本发明为解决上述技术问题所采取的技术方案为：一种金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备方法，其包括以下步骤：

1 ）金枪鱼暗色肉的预处理：金枪鱼暗色肉匀浆，加热至95～100℃后保温10～15min，然后降至室温，按照料液比1g:4～5mL加入异丙醇，室温下脱脂22～24 h，然后于4℃、10000 rpm离心15～20 min除去异丙醇，收集脱脂金枪鱼暗色肉固形物，即为脱脂金枪鱼暗色肉蛋白；

2 ）脱脂金枪鱼暗色肉蛋白的酶解：以脱脂金枪鱼暗色肉蛋白作为原料，按固液比1 g : 20～25 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9～10），得混合液；将混合液温度升至45～55 ℃预热5～10 min，按照脱脂金枪鱼暗色肉质量的1.5～2.5%加入蛋白酶，酶解温度为45～55 ℃，酶解4～5 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15 min后，10000g离心20～25 min，取上清液，即为酶解产物；

3 ）金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备：将制备的酶解产物采用3 kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于3 kDa部分，得超滤酶解液，再将酶解液依次经凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化，得到抗***多肽。

作为优选，所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼（Katsuwonus pelamis）。

作为优选，所述步骤2）中的蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥2.0×10⁵ U/g。

作为改进，所述步骤3）中的凝胶过滤层析、细胞膜色谱和RP-HPLC纯化的具体过程为：

凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液配成15～25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析（2.6 × 80 cm）分离，用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用的组分为凝胶层析酶解物。

细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用三蒸水配成40～50 μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用的组分为细胞膜色谱纯化酶解物。

RP-HPLC 纯化：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用三蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对人***细胞株HeLa细胞的增值抑制作用得1个高活性抗***多肽Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp（QYDEYW），ESI-MS检测分子量为902.88 Da。

优选，所述细胞膜色谱条件为：进样量5～10 μL；细胞膜色谱柱（150 mm × 4.6mm，5 μm）；柱温为37 ℃；流动相：磷酸盐缓冲液（25 mmol/L，pH 7.4）；紫外检测波长220 nm；流速：0.2 mL/min。

优选，所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Zorbax C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为35 %乙腈；紫外检测波长为220 nm。

再优选，所述细胞膜色谱柱中采用细胞膜为中国白兔红细胞膜，所用固定细胞膜的载体为硅胶（5μm，200Å）。

本发明所制备的金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp（QYDEYW）对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用，IC₅₀为0.16 mg/mL；Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp（QYDEYW）具有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备防治***的药物。

附图说明

图1是本发明的超滤酶解液（≤3 kDa组分）的葡聚糖凝胶G-25柱层析色谱图。

图2 是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物（Fr.A3）的细胞膜色谱图。

图3是本发明的细胞膜色谱纯化酶解物（Fr.A3-1）的RP-HPLC色谱图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备方法，制备工艺流程如下：金枪鱼暗色肉→脱脂→酶解→超滤→凝胶过滤层析→细胞膜色谱纯化→高效液相色谱纯化→抗***多肽。

实施例：

1 ）金枪鱼暗色肉的预处理：金枪鱼暗色肉匀浆，加热至95℃后保温10 min，然后降至室温，按照料液比1g: 5mL加入异丙醇，室温下脱脂24 h，然后于4℃、10000 rpm离心20 min除去异丙醇，收集脱脂金枪鱼暗色肉固形物，即为脱脂金枪鱼暗色肉蛋白；

2 ）脱脂金枪鱼暗色肉蛋白的酶解：以脱脂金枪鱼暗色肉蛋白作为原料，按固液比1 g : 25 mL加入Gly-NaOH缓冲液（0.05 mol/L，pH 9.5），得混合液；将混合液温度升至50 ℃预热10 min，按照脱脂金枪鱼暗色肉质量的2%加入蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解4 h后，将溶液升温至95℃，并于此温度保持10 min后，10000g离心25 min，取上清液，即为酶解产物；

①凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 7.0磷酸盐缓冲液配成20 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析（2.6 × 80 cm）分离，用pH 7.0磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用的组分为凝胶层析酶解物Fr.A3（见图1）。

②细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物Fr.A3用三蒸水配成50 μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化（进样量5 μL；中国白兔红细胞膜色谱柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱温为37 ℃；流动相：磷酸盐缓冲液（25 mmol/L，pH 7.4）；紫外检测波长220 nm；流速：0.2 mL/min），根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用的组分为细胞膜色谱纯化酶解物Fr.A3-1（见图2）。

③RP-HPLC纯化：将上述凝胶层析酶解物Fr.A3-1用超纯水配成100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化（进样量15 μL；色谱柱为Zorbax C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相为35 %乙腈；紫外检测波长为220 nm），根据对人***细胞株HeLa细胞的增值抑制作用得1个高活性抗***多肽（见图3）。

④结构检测：收集对人***细胞株HeLa细胞的增值抑制作用最强的多肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp（QYDEYW），ESI-MS检测分子量为902.88 Da。

将上述制得的金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp（QYDEYW）进行细胞增殖抑制实验。实验结果表明：Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp（QYDEYW）对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用，IC₅₀为0.16 mg/mL。

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江海洋学院

<120> 金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备方法

<130> zjou-wb-20150411

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Gln Tyr Asp Glu Tyr Trp

1 5

Claims

1.金枪鱼暗色肉蛋白抗***多肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2 ）脱脂金枪鱼暗色肉蛋白的酶解：以脱脂金枪鱼暗色肉蛋白作为原料，按固液比1 g : 20～25 mL加入Gly-NaOH缓冲液，得混合液；将所述的混合液温度升至45～55 ℃预热5～10 min，按照脱脂金枪鱼暗色肉质量的1.5～2.5%加入蛋白酶，酶解温度为45～55 ℃，酶解4～5 h后，将溶液升温至90～95℃，并于此温度保持10～15 min后，10000g离心20～25 min，取上清液，即为酶解产物；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）中的金枪鱼为鲣鱼。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的蛋白酶为碱性蛋白酶，酶活力≥2.0×10⁵ U/g。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的凝胶过滤层析、细胞膜色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化的具体过程为：

凝胶过滤层析：将上述超滤酶解液用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液配成15～25 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用pH 6.5～7.5磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用的组分为凝胶层析酶解物；

细胞膜色谱纯化：将上述凝胶层析酶解物用三蒸水配成40～50 μg/mL的溶液，加入到细胞膜色谱柱进行纯化，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，对人***细胞株HeLa细胞的增值具有显著抑制作用的组分为细胞膜色谱纯化酶解物；

RP-HPLC 纯化：将上述细胞膜色谱纯化酶解物用三蒸水配成80～100 μg/mL的溶液，利用RP-HPLC进行纯化，根据对人***细胞株HeLa细胞的增值抑制作用得1个高活性抗***多肽Gln-Tyr-Asp-Glu-Tyr-Trp，ESI-MS检测分子量为902.88 Da。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述细胞膜色谱条件为：进样量5～10 μL；柱温为37 ℃；流动相为磷酸盐缓冲液；紫外检测波长220 nm；流速：0.2 mL/min。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述RP-HPLC条件为：进样量15~20 μL；色谱柱为Zorbax C18；流动相为35 %乙腈；紫外检测波长为220 nm。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述细胞膜色谱柱中采用的细胞膜为中国白兔红细胞膜；所用固定细胞膜的载体是规格为5μm、200Å的硅胶。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的细胞膜色谱柱规格为150 mm × 4.6 mm，5 μm。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲液为25 mmol/L、pH 7.4；所述的Zorbax C18色谱柱规格为250 mm × 4.6 mm，5 μm。