CN101948519A - 厚壳贻贝足丝黏附蛋白及其编码序列和制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种厚壳贻贝足丝黏附蛋白及其编码的多核苷酸，进一步本发明还公开了一种厚壳贻贝足丝黏附蛋白的制备方法。与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明能快速获得厚壳贻贝重组足丝黏附蛋白，即防水生物粘合剂，获得粘附蛋白功能片段的重组质粒之后可以源源不断的由酿酒酵母S78表达足丝黏附蛋白功能肽段并经修饰后具有较好的黏附性能。该多肽产物的修饰方法简单，仅需要少量的酪氨酸酶即可，操作简单。

Description

厚壳贻贝足丝黏附蛋白及其编码序列和制备方法

技术领域

本发明涉及一种厚壳贻贝足丝黏附蛋白，本发明还涉及该厚壳贻贝足丝黏附蛋白的编码序列和制备方法。

背景技术

海洋附着生物能在水环境下永久或暂时性地黏附于各种固体表面，如礁石，船体及其他生物表面等。目前已知的海洋附着生物种类约5000种左右，从海洋附着生物分泌的黏附物质中开发新型，高效，可在水环境中使用的生物粘合剂是目前在生物材料学的研究热点之一。其中，贻贝足丝蛋白是该研究领域的重点关注对象。贻贝属软体动物门瓣鳃纲，是一种常见的海洋双壳贝类，可通过其足腺细胞分泌的足丝与礁石、船体等固体表面形成牢固连接，并可经受海浪的反复冲刷而不脱落。贻贝足丝的主要成分足丝黏附蛋白可在水下与固体表面形成交联，其粘合力及防水性能是现有任何人造粘合剂均无法比拟的，广泛适用于医药、造船、涂料等许多行业。由于天然贻贝粘附蛋白的分泌量极少，目前市场上基于其开发的生物粘附剂产品十分稀少，且价格极其昂贵，很难满足行业需要。目前已从各类贻贝的足丝中鉴定到至少6种贻贝足丝蛋白(mytilus foot proteins，mfp)，分别命名为mfp-1～mfp-6。其中mfp-3是黏附性能最强的足丝蛋白，但mfp-3在贻贝足丝中含量极低，因此，采用基因工程手段大量生产贻贝足丝蛋白mfp-3是解决黏附蛋白来源的唯一方案。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种厚壳贻贝足丝黏附蛋白。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种编码厚壳贻贝足丝黏附蛋白的多核苷酸。

本发明所要解决的又一个技术问题是提供一种厚壳贻贝足丝黏附蛋白的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种厚壳贻贝(Mytilus coruscus)足丝黏附蛋白，即厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3，其特征在于，它含有如下氨基酸序列：

10    20    30    40

GGYYGPNYNY PGRYGGKYNG YKGYPRGYGW NKGWKKGWNR GRWGRKYY

一种编码权利要求1所述抗菌肽的多核苷酸。

厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的cDNA基因，其特征在于，所说的厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的cDNA基因总长度为302个碱基，其中含有5’端非编码区(5’UTR)长18个碱基，1个开放阅读框长219个碱基，3’非编码区(3’UTR)长65个碱基，全长cDNA序列如下：

        10         20         30         40         50

CGGTTTGAAT ATAAAACA

AATAATCTC AGTATTGCAG TTTTGGTGGC

        60         70         80         90        100

GTTGGTCCTT ATTGGATCGT TTGCCGTTCA AAGTGATGCA GGTGGTTATT

       110        120        130        140        150

ATGGCCCAAA CTATAATTAT CCAGGGCGAT ACGGAGGTAA ATATAACGGA

       160        170        180        190        200

TACAAAGGAT ATCCCAGAGG TTATGGATGG AATAAGGGCT GGAAAAAAGG

       210        220        230        240        250

CTGGAATAGA GGTCGATGGG GACGAAAATA TTAT

AAC AAAGCTACAG

       260        270        280        290        300

AGCTATTCTT AGAACAATTA GTACAGGAAG AAGTAAACGG TCAATATTGA

       310TA。

厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的cDNA基因，其特征在于，所说的厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的cDNA推导编码氨基酸序列如下：

        10         20         30          40          50

MNNLSIAVLV ALVLIGSFAV QSDAGGYYGP  NYNYPGRYGG  KYNGYKGYPR

        60         70

GYGWNKGWKK GWNRGRWGRK YY M*

一种厚壳贻贝黏附蛋白的制备方法，其特征在于：

(1)厚壳贻贝足丝盘蛋白的收集

厚壳贻贝饲养24hr后，用干净的刀片收集黏附于玻璃板上的足丝盘，并以去离子水漂洗。将足丝盘样品以5％醋酸(含8M尿素及0.1mM TCEP)充分抽提后离心(4℃，20000×g，30min)，收集上清于-20℃冰箱保存备用；

(2)厚壳贻贝黏附蛋白的分离纯化

所有高效液相色谱分离步骤均在Waters 600E型高效液相色谱仪上完成，检测器为Waters 2487型紫外检测器，检测波长为280nm。反相色谱柱为218TP54C18(4.6×250mm，Vydac公司)，最大上样量不超过1mg。流动相分别为含0.1％TFA的水(A)和乙腈(B)，柱温为40℃；线性梯度洗脱，50min内，B液从20％上升到50％，流速为1mL/min，收集各洗脱峰并冻干。

(3)厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的鉴定

利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)质谱(Voyager-DE^TMSTRBiospectromitry^TM workstation，Applied Biosystems公司)测定分子量。采用线性阳离子模式；N2光源337nm；离子加速电压为20000V。基质为α-氰基-4-羟基-肉桂酸(CCA)，通过以下方式制备样品：取1μL样品液加入到9μL CCA(含0.1％TFA)的50％乙腈饱和溶液，混匀后取1μL点样，室温干燥后测定，并采用内标法校正。厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的氨基酸序列测定采用N-端Edman降解法在PPSQ-31A/33A气相测序仪上(日本岛津公司)完成。采用仪器配备的标准程序测序，在线反相高效液相色谱检测并结合氨基酸标准图谱判断氨基酸种类，最终准确读出所测样品的氨基酸序列。

(4)厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的基因克隆

以测序所得厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的N端及C端氨基酸序列设计简并引物，以实验室现有厚壳贻贝足腺细胞cDNA文库为模板进行PCR扩增，扩增片段通过胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit，OMEGA)纯化后，与pMD19-T载体连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，利用蓝白斑筛选阳性克隆，所获得的克隆利用原PCR扩增引物进行菌落PCR鉴定后，送上海英骏生物公司测序，测序结果经分析整理得到厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3完整cDNA序列。

(5)重组厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的制备

根据上述所得的厚壳贻贝Mytilus coruscus的mfp-3基因序列中的开放阅读框的成熟肽序列设计PCR引物，P3F为正向引物，在5’端分别加入两个保护碱基CG和XbaI酶切位点；其后加一个T是防止ORF移位，接着加密码子AAGAGA，其编码K R两个氨基酸，以便酿酒酵母本身分泌的前体加工酶Kex2能把后面的成熟肽切割，分泌至培养基中；P3R是反向引物，在5’端分别加入三个保护碱基CCG和HindIII酶切位点。引物序列如下：

正向引物P3F：5′-CGT CTA GAT AAG AGA GGT GGT TAT TAT GGC CC-3’

反向引物P3R：5′-CCGAAG CTTTCAATAATATTTTCGTCC C-3’

1)以步骤1)提取的cDNA为模板，用引物P3F和P3R进行PCR扩增，获得厚壳贻贝M.coruscus的mfp-3基因中编码其成熟肽的DNA片段产物；其DNA片段(147bp)序列如下：

GGTGGTTATTATGGCCCAAACTATAATTATCCAGGGCGATACGGAGGTAAATATA

ACGGATACAAAGGATATCCCAGAGGTTATGGATGGAATAAGGGCTGGAAAAAA

GGCTGGAATAGAGGTCGATGGGGACGAAAATATTATTGA

编码的氨基酸序列(48个氨基酸残基)为：

GGYYGPNYNYPGRYGGKYNGYKGYPRGYGWNKGWKKGWNRGRWGRKYY

2)将PCR获得的DNA片段经克隆载体pMD19-T克隆，再切出连接到真核表达载体pVT102U/α中构建重组质粒；

3)将构建的重组质粒转化到酿酒酵母S78中，通过真核表达体系产出mfp-3成熟蛋白；

4)通过阳离子交换及反相高效液相色谱分离纯化该黏附蛋白产物；

5)用酪氨酸酶对纯化的多肽进行修饰，即得到厚壳贻贝粘附蛋白防水生物粘合剂，命名mfp-3-1。

所述的步骤1)具体如下：

①厚壳贻贝足丝盘蛋白的收集，用干净的刀片收集黏附于玻璃板上的足丝盘，经过漂洗，抽提，离心，收集上清于-20℃冰箱保存备用；

②厚壳贻贝足丝黏附蛋白的分离纯化，在液相色谱仪上完成，紫外检测器，检测波长为280nm，流动相流动相分别为A液：含0.1％三氟乙酸的去离子水，B液：含0.1％三氟乙酸的乙腈；采用50分钟内20％到50％的B液浓度进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min，以280nm波长的紫外光进行检测，收集洗脱峰，冻干后备用。

③厚壳贻贝足丝黏附蛋白的鉴定，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，质谱测定分子量，采用线性阳离子模式；N2光源337nm；离子加速电压为20000V，基质为α-氰基-4-羟基-肉桂酸，通过以下方式制备样品：取1μL样品液加入到9μL α-氰基-4-羟基-肉桂酸(CCA)的50％乙腈饱和溶液，混匀后取1μL点样，室温干燥后测定，其中，CCA中含有重量百分比0.1％TFA，并采用内标法校正，厚壳贻贝足丝黏附蛋白的氨基酸序列测定采用N-端Edman降解法在气相测序仪上完成；

④厚壳贻贝足丝黏附蛋白的基因克隆，以测序所得厚壳贻贝足丝黏附蛋白的N端及C端氨基酸序列设计简并引物，以实验室现有厚壳贻贝足腺细胞cDNA文库为模板进行PCR扩增，扩增片段通过DNA凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)，纯化后，与质粒载体(pMD19-T)连接，转化至大肠杆菌(E.coli DH5α)感受态细胞，利用蓝白斑筛选阳性克隆，所获得的克隆利用原PCR扩增引物进行菌落PCR鉴定后，进行测序，测序结果经分析整理得到厚壳贻贝足丝黏附蛋白完整cDNA序列。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明能快速获得厚壳贻贝重组足丝黏附蛋白，即防水生物粘合剂，获得粘附蛋白功能片段的重组质粒之后可以源源不断的由酿酒酵母S78表达足丝黏附蛋白功能肽段并经修饰后具有较好的黏附性能。该多肽产物的修饰方法简单，仅需要少量的酪氨酸酶即可，操作简单。所制备的足丝黏附蛋白防水生物粘合剂能够在潮湿的环境下牢固粘附于金属表面，本发明既避免了为获取足丝蛋白而滥捕海洋贻贝造成的资源浪费，又可以作为医用材料及生物粘合剂在生产和临床中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为厚壳贻贝足丝黏附蛋白cDNA基因克隆图谱。

图2为厚壳贻贝足丝黏附蛋白进行重组酵母表达后表达产物的mRNA电泳检测图谱。

图3为表达产物经阳离子交换色谱分离后的分离图谱。

图4为图3中的目的峰收集后经C8反相分离柱进一步分离后的图谱。

图5为图4收集的目的峰经tricin胶电泳分离后的图谱。

图6为重组表达产物的质谱检测图。

图7为重组表达的mfp-3经酪氨酸酶修饰后与天然mfp-3进行石英晶体微天平分析的吸附图谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

参考图1至图7所示，其中图3中*号标注为目的峰，图4中*号标注为表达产物所在的目的峰，图5中箭头所指为表达产物的条带，其分子量约为6kD，图6中表明表达产物的精确分子量为5768.69，与预期的分子量相符，图7以牛血清白蛋白做为阴性对照。

实施例：真核表达载体的构建。

从鲜活的厚壳贻贝M.coruscus上切去足部，去外层色素上皮和部分肌肉层，选取足腺组织提取总RNA，逆转录为cDNA并作为模板。根据厚壳贻贝Mytilus coruscus的mcofp-3基因序列中的开放阅读框(ORF)成熟肽序列设计PCR引物(由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)，P3F为正向引物，在5’端分别加入两个保护碱基CG和XbaI酶切位点；其后加一个T是防止ORF移位，接着加密码子AAGAGA，其编码KR两个氨基酸，以便酵母本身分泌的前体加工酶Kex2能把后面的成熟肽切割，分泌至培养基中；P3R是反向引物，在5’端分别加入三个保护碱基CCG和HindIII酶切位点。引物序列如下：

正向引物P3F：5′-CGT CTA GAT AAG AGA GGT GGT TAT TAT GGC CC-3’

反向引物P3R：5′-CCGAAG CTTTCAATAATATTTTCGTCC C-3’

以上述cDNA为模板，进行PCR扩增反应，体系如下(50μL)：

模板cDNA               5μL

引物P3F                1μL

引物P3R                1μL

dNTP                   1μL

10×Easy Taq Buffer    5μL

Taq酶                  0.5μL

去离子水               36.5μL

PCR反应循环：94℃预变性3m，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，35cycles。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收之后连接到pMD19-T载体，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素100μL/mL的LB平板培养基，并在37℃恒温培养箱中培养16h。通过蓝白斑筛选，挑取阳性单克隆进行菌落PCR鉴定后送上海生工测序。

提取含有正确***片段的质粒作为模板，用P3F和P3R引物进行PCR扩增，体系和循环参数同前。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后用PCR产物纯化试剂盒纯化，然后用XbaI和HindIII双酶切37℃过夜(约14h)，酶切体系如下：

10×酶切缓冲液        2.0μL

XbaI                  1.0μL

HindIII               2.0μL

上述PCR片段           7.5μL

去离子水              7.5μL

表达载体pVT102U/α也用XbaI和HindIII双酶切37℃过夜，酶切产物通过质粒提取试剂盒纯化。

酶切后的表达载体与酶切后的PCR片段于16℃连接10-24h，连接体系如下：

表达载体              1.5μL

PCR片段               3.5μL

10×连接缓冲液        1μL

ATP                   0.25μL

T4DNA连接酶    0.25μL

去离子水       3.5μL

连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素100μL/mL的LB平板培养基，并在37℃恒温培养箱中培养16h。通过蓝白斑筛选，挑取阳性单克隆进行菌落PCR鉴定后送上海生工测序。测序鉴定表明目的序列***正确。

实施例二：厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3的真核表达。

1)将表达质粒转入酿酒酵母S78感受态细胞，涂布于YSD平板培养基，30℃恒温培养4～6天；

2)挑取单克隆菌株至YSD液体培养基中扩大培养12h后以1∶25的比例用YSD液体培养基稀释，30℃恒温250rpm培养12h，最后以1∶25的比例转入YPD液体培养基30℃恒温，250rpm发酵3～4天；

3)将发酵液12000rpm离心15min，收集上清冻干后于去离子水中复溶，进行分离纯化

实施例三：厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3表达产物的纯化、修饰和鉴定。

将表达上清用抽滤瓶抽滤，过0.45μM滤膜，收集所得到的滤过液。表达滤过液与事先准备好的1M NaAc(pH 4.2)混合，使NaAc的终浓度为0.1M。然后直接上CM-sepharose阳离子交换柱(5cm×50cm)，接着分别用含0.1M、0.3M和0.5M NaCl的0.1M NaAc缓冲液进行洗脱，收集各洗脱峰。将各洗脱峰所收集的溶液上Waters公司的制备型C18反相柱(4.6×250mm)进行脱盐，将反相得到的洗脱峰进行SDS-PAGE电泳鉴定后冻干保存。

采取不连续SDS-PAGE垂直平板电泳对表达产物进行鉴定，分离胶浓度为11.5％、浓缩胶浓度为4.8％。取样品蛋白(以SDS裂解液溶解)及标准分子量蛋白质，然后加入相等体积的样品溶解液，使之充分混匀后置沸水浴中加热5min，取出冷却，离心(8000×g，10min)，用微量注射器吸取上清液点样。电泳仪先设置恒流为15mA，待溴酚蓝线迁移至分离胶与浓缩胶界面时，设置恒流为30mA进行电泳。待溴酚蓝前沿距离胶板底0.5-1.0cm处，终止电泳。电泳完毕后，取下凝胶，以常规考马氏亮蓝R250染色。

重组厚壳贻贝足丝黏附蛋白mfp-3经纯化后，溶解于磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH为7.0，该缓冲液中事先加入抗坏血酸(浓度为25mM)，之后加入酪氨酸酶(浓度为50微克/毫升)，于25℃反应一小时，待其充分反应后，反应液进行冷冻干燥，之后复溶于5％醋酸溶液中备用。

实施例四：厚壳贻贝足丝黏附蛋白表达产物的粘附性测试。

采用石英晶体微天平为RQCM(Maxtek Inc.，USA)对表达产物进行黏附性能分析，实验用直径12.5mm的AT切9MHz压电石英晶体(JA5B型，北京707厂)，露在空气中的电极直径6.0mm，该电极接入HP16092A阻抗测试架非地端；晶体另一面喷金电极直径6.5mm，接入HP16092A地端为工作电极，参比电极为饱和甘汞电极，对照电极为1.4cm ²铂片。裸金电极在含0.4mg/mL的待测溶液(溶液中含0.5M NaCl、0.02MNaH₂PO₄和0.08M Na₂HPO₄，pH＝7.3)浸泡30min后检测其频率变化。实验中每1.5s获取一组BVD等效电路参数(动态电阻R₁，动态电感L₁，动态电容C₁，静态电容C₀及谐振频率f₀＝1/[2∏(L₁C₁)^1/2]，电化学阻抗在EG&GM 283+1025电化学综合测试***上进行。

Claims (6)

1.一种厚壳贻贝足丝黏附蛋白，其特征在于它含有如下氨基酸序列：

10                  20        30         40

GGYYGPNYNY PGRYGGKYNG YKGYPRGYGW NKGWKKGWNR GRWGRKYY。

2.一种编码权利要求1所述厚壳贻贝足丝黏附蛋白的多核苷酸。

3.根据权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于所述的厚壳贻贝足丝黏附蛋白的cDNA基因总长度为302nt，其中含有5’端非编码区(5’UTR)长18nt，1个开放阅读框长219nt，3’非编码区(3’UTR)长65nt，全长cDNA序列如下：

        10          20        30         40        50

CGGTTTGAAT ATAAAACA

AATAATCTC AGTATTGCAG  TTTTGGTGGC

        60         70         80         90        100

GTTGGTCCTT ATTGGATCGT TTGCCGTTCA AAGTGATGCA GGTGGTTATT

       110        120        130        140        150

ATGGCCCAAA CTATAATTAT CCAGGGCGAT ACGGAGGTAA ATATAACGGA

       160        170        180        190        200

TACAAAGGAT ATCCCAGAGG TTATGGATGG AATAAGGGCT GGAAAAAAGG

       210        220        230        240        250

CTGGAATAGA GGTCGATGGG GACGAAAATA TTAT

AAC AAAGCTACAG

       260        270        280        290        300

AGCTATTCTT AGAACAATTA GTACAGGAAG AAGTAAACGG TCAATATTGA

       310

TA。

4.根据权利要求3所述厚壳贻贝足丝黏附蛋白的多核苷酸，其特征在于所述厚壳贻贝黏附蛋白mfp-3的cDNA推导编码氨基酸序列如下：

        10         20         30         40         50

MNNLSIAVLV ALVLIGSFAV QSDAGGYYGP NYNYPGRYGG KYNGYKGYPR

        60         70

GYGWNKGWKK GWNRGRWGRK YY M*。

5.一种厚壳贻贝足丝黏附蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

1)从新鲜采集的活体厚壳贻贝足腺组织提取总RNA，逆转录为cDNA；

2)根据厚壳贻贝Mytilus coruscus的mcofp-3基因序列中的开放阅读框(ORF)成熟肽序列设计PCR引物，P3F为正向引物，在5’端分别加入两个保护碱基CG和XbaI酶切位点；其后加一个T是防止ORF移位，接着加密码子AAGAGA，其编码K R两个氨基酸，以便酵母本身分泌的前体加工酶Kex2能把后面的成熟肽切割，分泌至培养基中；P3R是反向引物，在5’端分别加入三个保护碱基CCG和HindIII酶切位点；引物序列如下：

正向引物P3F：5′-CGT CTA GATAAG AGA GGT GGT TAT TAT GGC CC-3’

反向引物P3R：5′-CCGAAG CTT TCAATAATATTT TCG TCC C-3’

3)以步骤1)提取的cDNA为模板，用引物P3F和P3R进行PCR扩增，获得厚壳贻贝M.coruscus的mcofp-3基因中编码其成熟肽的DNA片段产物；其DNA片段(147bp)序列如下：

GGTGGTTATTATGGCCCAAACTATAATTATCCAGGGCGATACGGAGGTAAATATA

ACGGATACAAAGGATATCCCAGAGGTTATGGATGGAATAAGGGCTGGAAAAAA

GGCTGGAATAGAGGTCGATGGGGACGAAAATATTATTGA

编码的氨基酸(48aa)序列为：

GGYYGPNYNYPGRYGGKYNGYKGYPRGYGWNKGWKKGWNRGRWGRKYY；

4)将PCR获得的DNA片段经克隆载体pMD19-T克隆，再切出连接到真核表达载体pVT102U/α中构建重组质粒；

5)将构建的重组质粒转化到酿酒酵母S78中，通过真核表达产出mcofp-3成熟肽序列；

6)通过阳离子交换及反相高效液相色谱分离纯化该黏附蛋白产物；用酪氨酸酶对纯化的多肽进行修饰，即得到厚壳贻贝足丝黏附蛋白。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)具体如下：

①厚壳贻贝足丝盘蛋白的收集，用干净的刀片收集黏附于玻璃板上的足丝盘，经过漂洗，抽提，离心，收集上清于-20℃冰箱保存备用；

②厚壳贻贝足丝黏附蛋白的分离纯化，在液相色谱仪上完成，紫外检测器，检测波长为280nm，流动相流动相分别为A液：含0.1％三氟乙酸的去离子水，B液：含0.1％三氟乙酸的乙腈；采用50分钟内20％到50％的B液浓度进行线性梯度洗脱，流速为1mL/min，以280nm波长的紫外光进行检测，收集洗脱峰，冻干后备用；

③厚壳贻贝足丝黏附蛋白的鉴定，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，质谱测定分子量，采用线性阳离子模式；N2光源337nm；离子加速电压为20000V，基质为α-氰基-4-羟基-肉桂酸，通过以下方式制备样品：取1μL样品液加入到9μLα-氰基-4-羟基-肉桂酸的50％乙腈饱和溶液，混匀后取1μL点样，室温干燥后测定，其中，CCA中含有重量百分比0.1％TFA，并采用内标法校正，厚壳贻贝足丝黏附蛋白的氨基酸序列测定采用N-端Edman降解法在气相测序仪上完成；

④厚壳贻贝足丝黏附蛋白的基因克隆，以测序所得厚壳贻贝足丝黏附蛋白的N端及C端氨基酸序列设计简并引物，以实验室现有厚壳贻贝足腺细胞cDNA文库为模板进行PCR扩增，扩增片段通过DNA凝胶回收试剂盒，纯化后，与质粒载体(pMD19-T)连接，转化至大肠杆菌感受态细胞，利用蓝白斑筛选阳性克隆，所获得的克隆利用原PCR扩增引物进行菌落PCR鉴定后，进行测序，测序结果经分析整理得到厚壳贻贝足丝黏附蛋白完整cDNA序列。

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