CN102676568A - 一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法，它涉及生物学技术构建粉尘螨变应基因技术领域。它通过提取粉尘螨总RNA，用PCR扩增获得其编码基因，切胶回收产物并命名为Der fm，克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达。它耗时短，过程简单，成本较低，可以彻底去除溶剂等成份，从根本上提高变应原的纯度，避免免疫治疗中副反应的发生，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。
Description
技术领域：
本发明涉及生物学技术构建粉尘螨变应基因技术领域，尤其涉及一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法。
背景技术：
尘螨种类繁多，广泛存在于人类生活和工作环境中，其***物、代谢物及螨体均具较强的变应原性，据估计，全球约10％的人口对尘螨过敏，约80％的外源性哮喘由尘螨引起，我国学者用粉尘螨粗提浸液对***反应性疾病患者进行皮肤挑刺试验，47～92.11％的成人哮喘患者、51.64～78.85％哮喘患儿、80％左右的鼻炎患者、70％左右慢性荨麻疹患者呈阳性反应，1998年，美国由哮喘造成的直接和间接经济损失高达12.7亿美元，近年来，建筑技术的发展和人民物质生活的丰富，室内居住环境发生了很大变化，但居室温、湿度相对稳定，空调环境使空气不能直接对外流通，环境为尘螨孳生提供了适宜条件，人们在室内逗留时间延长增加了尘螨过敏原接触，尘螨相关疾病的发生率随之增加，因此，开展尘螨源***反应性疾病的预防、诊断、治疗及其发生机理等研究不仅具有重要的社会效益。
过敏性哮喘是由免疫***内淋巴细胞亚群Th1/Th2比例的失衡和其它一些因素综合引起的，特异性免疫治疗被认为是目前唯一哮喘病因治疗方法，可以改变哮喘病程，能阻滞症状的恶化和防治对新的变应原产生过敏，其通过小剂量皮下注射尘螨变应原，并逐渐增加变应原剂量，提高患者对特异性变应原的免疫耐受力，调节患者细胞免疫功能，增强Th1反应、抑制Th2反应，并产生高水平的IgG抗体阻断变应原结合到IgE，目前，临床采用尘螨变应原粗提浸液免疫治疗 I型***反应性疾病患者，由于变应原浸液包含成分较复杂如存在变应原、非过敏性或毒性蛋白及其它成分，在治疗过程中长期使用易导致红晕、肿胀、硬结、坏死等局部反应和休克、喉头水肿、支气管痉挛、荨麻疹、血管性水肿、全身性红斑等全身反应，此外，采用粗提浸液进行诊断，无法明确患者对变应原各组分的反应程度，易致误诊。
因此，变应原的质量对***反应疾病的诊断和治疗至关重要，用于免疫诊治的变应原应该是纯品而不宜为粗制浸液，但是，尘螨变应原主要存在于***物和皮壳中，采用生物化学方法提纯尘螨变应原，耗时长，过程繁琐，成本较高，且无法彻底去除溶剂等成份，不能从根本上提高变应原的纯度、避免免疫治疗中副反应的发生，随着分子生物学技术的发展和成熟，研制基因工程技术生产重组变应原成为***反应学研究的主流，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。
尘螨变应原组成复杂，约有30余种，其中第1组分和第2组分约占螨粗提浸液的90％；在螨过敏患者的血清中，80％以上患者的IgE结合这两类抗原，并呈现强反应性，因此诱导Th2型应答的主要是第1和2组分(Wayne R.Thomas，Wendy-Anne Smith，et al.The allergenic specificities of the house dust mite[J].Chang Gung Med J.2004；27(8)：563～569)，因此，重组粉尘螨变应原第1、2组分及二者的融合蛋白，可为临床诊治尘螨源***反应性疾病提供制品。
发明内容：
本发明的目的是提供一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法，它耗时短，过程简单，成本较低，可以彻底去除溶剂等成份，从根本上提高变应原的纯度，避免免疫治疗中副 反应的发生，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明是采用以下技术方案：它通过提取粉尘螨总RNA，根据GenBank公布的粉尘螨变应原第1组份(Der f1)和粉尘螨变应原第2组份(Der f2)核酸序列设计引物，用PCR扩增获得其编码基因，依次克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，以PMD 19-T-Der f1、PMD 19-T-Der f2为模板，PCR扩增后切胶、回收产物Der f1和Der f2，PCR搭链构建嵌合基因片段，切胶回收产物并命名为Der fm，克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达，所有表达产物经琼脂糖凝胶FF亲和柱层析纯化后，用SDS-PAGE和Western-blotting验证产物。
所述的粉尘螨变应原第1组分Der f1RT-PCR扩增结果是从RNAiso Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，经两次PCR扩增获得的产物经琼脂糖凝胶电泳，见一条约966bp的条带，与理论值相符合，然后将PCR产物回收，与pMD19-T simple连接后，转化至E.coli Competent Cells JM109中，过夜培养，蓝白斑筛选并提取质粒，用BamH I和XhoI酶切鉴定获得与预期相符的结果，1.0％琼脂糖凝胶电泳结果，将pET28a(+)-Der f 1质粒转化宿主菌E.coliBL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，在临近34kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致，用RNA isolation Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，RT-PCR扩增获得目的基因，经琼脂糖凝胶电泳，见一条约441bp的条带，与理论值相符合，用BamH I/Xho I双酶切测序正确的pMD19-T-Der f 2质粒，回收后获得目的基因，将其***pET28a(+)载体，质粒提取后行琼脂糖凝胶电泳，挑选目的质粒用 BamH I/Xho I进行酶切鉴定，有两质粒经1％琼脂糖凝胶电泳显示出两个条带，与预期相符，说明亚克隆获得成功，将pET28a(+)-Der f2质粒转化宿主菌E.coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a(+)-Der f 2全细胞和沉淀物在临近14kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致，说明pET28a(+)-Der f 2基因正常表达，但表达为包涵体。
所述的粉尘螨变应原第1和2组分嵌合基因片段的扩增结果分别以pMD19-T-Der f 1和为pMD19-T-Der f 2模板进行PCR扩增，回收产物Der f1和Der f2后搭链PCR合成得粉尘螨变应原第1、2组分的嵌合基因片段Der fm，使用Sal I/Xho I对测序正确的pMD19-T-Der fm质粒进行酶切，电泳后回收小片段即为Der fm；使用Sal I/Xho I对pET28a(+)质粒进行酶切，对回收产物进行精制、去磷酸化；通过连接酶将二者连接，热转化至E.coli Competent CellsJM109中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒即为pET28a(+)-Der fm，该质粒经Sal I/Xho I双酶切鉴定，将构建成功的原核表达质粒pET28a(+)-Der fm质粒转化宿主菌E.coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a(+)-Der fm全细胞和沉淀物在约52kD处出现特异性条带，与预期分子量大小相似，说明pET28a-Der fm基因正常表达，但表达为包涵体，从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体，经洗涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体，经洗涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物，冷冻干燥后共获得约415mg重组蛋白纯品，发酵液产率为207.5mg/L，经粉尘螨变应原粗提浸液皮肤挑刺试验阳性的哮喘患儿 血清为一抗，另取5份母亲无遗传过敏史脐血清混合物为阴性血清，二者分装后-80℃保存，生物素标记的抗人IgE抗体为二抗，Western-blotting分析表明该重组蛋白可与哮喘患儿血清IgE发生结合，有一特异性的反应条带。
本发明耗时短，过程简单，成本较低，可以彻底去除溶剂等成份，从根本上提高变应原的纯度，避免免疫治疗中副反应的发生，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。
具体实施方式：
本具体实施方式采用以下技术方案：它通过提取粉尘螨总RNA，根据GenBank公布的粉尘螨变应原第1组份(Der f1)和粉尘螨变应原第2组份(Der f2)核酸序列设计引物，用PCR扩增获得其编码基因，依次克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，以PMD19-T-Der f1、PMD 19-T-Derf2为模板，PCR扩增后切胶、回收产物Der f1和Der f2，PCR搭链构建嵌合基因片段，切胶回收产物并命名为Der fm，克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达，所有表达产物经琼脂糖凝胶FF亲和柱层析纯化后，用SDS-PAGE和Western-blotting验证产物。
所述的粉尘螨变应原第1组分Der f1 RT-PCR扩增结果是从RNAiso Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，经两次PCR扩增获得的产物经琼脂糖凝胶电泳，见一条约966bp的条带，与理论值相符合，然后将PCR产物回收，与pMD19-T simple连接后，转化至E.coli Competent Cells JM109中，过夜培养，蓝白斑筛选并提取质粒，用BamH I和Xho I酶切鉴定获得与预期相符的结果，1.0％琼脂糖凝胶电泳结果，将pET28a(+)-Der f1质粒转化宿主菌E.coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，在临近34kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致，用RNA isolation Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，RT-PCR扩增获得目的基因，经琼脂糖凝胶电泳，见一条约441bp的条带，与理论值相符合，用BamH I/Xho I双酶切测序正确的pMD19-T-Der f2质粒，回收后获得目的基因，将其***pET28a(+)载体，质粒提取后行琼脂糖凝胶电泳，挑选目的质粒用BamH I/Xho I进行酶切鉴定，有两质粒经1％琼脂糖凝胶电泳显示出两个条带，与预期相符，说明亚克隆获得成功，将pET28a(+)-Der f2质粒转化宿主菌E.coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a(+)-Der f2全细胞和沉淀物在临近14kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致，说明pET28a(+)-Der f2基因正常表达，但表达为包涵体。
所述的粉尘螨变应原第1和2组分嵌合基因片段的扩增结果分别以pMD19-T-Der f1和为pMD19-T-Der f2模板进行PCR扩增，回收产物Der f1和Der f2后搭链PCR合成得粉尘螨变应原第1、2组分的嵌合基因片段Der fm，使用Sal I/Xho I对测序正确的pMD19-T-Der fm质粒进行酶切，电泳后回收小片段即为Der fm；使用Sal I/Xho I对pET28a(+)质粒进行酶切，对回收产物进行精制、去磷酸化；通过连接酶将二者连接，热转化至E.coli Competent CellsJM109中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒即为pET28a(+)-Der fm，该质粒经Sal I/Xho I双酶切鉴定，将构建成功的原核表达质粒pET28a(+)-Der fm质粒转化宿主菌E.coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a(+)-Der fm全细胞和沉淀物在约52kD处出现特异性条带，与预期分子量大小相似，说明pET28a-Der fm基因正常表达，但表达为包涵体，从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体，经洗 涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体，经洗涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物，冷冻干燥后共获得约415mg重组蛋白纯品，发酵液产率为207.5mg/L，经粉尘螨变应原粗提浸液皮肤挑刺试验阳性的哮喘患儿血清为一抗，另取5份母亲无遗传过敏史脐血清混合物为阴性血清，二者分装后-80℃保存，生物素标记的抗人IgE抗体为二抗，Western-blotting分析表明该重组蛋白可与哮喘患儿血清IgE发生结合，有一特异性的反应条带。
本发明耗时短，过程简单，成本较低，可以彻底去除溶剂等成份，从根本上提高变应原的纯度，避免免疫治疗中副反应的发生，其纯度高，分类明确，可提高诊断的准确度，并有望为新型免疫治疗提供标准化制品。
实施例：
粉尘螨变应原第1组分全长基因克隆与表达所采用的质粒、菌株、试剂和仪器分别为BamH I酶、Xho I酶、RNAiso Reagent(Code No.D312)、One Step RNA PCR Kit(Code No.DRR024A)、PrimeSTARTM HS DNA Polymerase(Code No.DR010A)、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805)、DNA A-Tailing Kit(Code No.D404)、DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV807)、DNA Ligation Kit(Code No.D6023)、pMD19-T simple (Code No.D104)、E.coli Competent Cells JM109(Code No.D9052)均购自TaKaRa公司；pET28a(+)(Kit Lot No.N72770)、TP3000PCR仪(TaKaRa BIO INC.)，Mupid电泳仪(ADVANCE-BIO Co.，Ltd)， 
VDS电泳成像装置(Pharmacia Biotech)；
尘螨主要变应原Der f 1克隆和测序：a、引物的设计与合成：根据GenBank AB034946公布的序列设计引物，并在加入BamH I/XhoI酶切位点b、总RNA提取：在解剖镜下挑取粉尘螨约600只，匀浆后用RNAiso Reagent试剂盒提取Total RNA；c、cDNA合成及PCR扩增：以Total RNA为模板、F/R0为引物，使用One Step RNA PCRKit，进行RT-PCR合成cDNA，反应体系为：Total RNA 4μl、2×OneStep RNA PCR Buffer 25μl、各2.5mM dNTP Mixture 2μl、40u/μlRNase Inhibitor 1μl、5U/μl M-MLV Reverse Transcriptase XL 0.5μl、5u/μl Ex Taq 1μl、20pmol/μl上游引物F 1μl、20pmol/μl下游引物R01μl，DEPC H2O 14.5μl，反应条件：50℃30min反转录，94℃变性2min后，98℃15sec、57℃30sec、72℃1min条件下进行30个循环，72℃5min延伸，取5μl产物在含溴化乙锭的1.0％琼脂糖凝胶电泳，用 
VDS电泳成像装置观察结果并拍照，以上述RT-PCR产物1μl为模板，以F/R为引物，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase进行PCR扩增，反应体系：2×PrimerSTARTM Buffer 25μl、各2.5mM dNTP Mixture 4μl、2.5U/μl PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 0.5μl、RT-PCR产物1μl、上游引物F 0.5μl、下游R 0.5μl dH2O 18.5μl。反应条件为：94℃变性5min后，98℃10sec、57℃10sec、72℃1min条件下进行30个循环，72℃5min延伸，取5μl PCR产物上样电泳，观察目的条带；d、克隆载体构建、阳性克隆筛选及鉴定：回收上述PCR产物，加“A”尾、DNA精制后，将目的基因片段与pMD19-T simple连接后，取连接产物转化感受态E.coli JM109，涂布于含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上，37℃培养过夜，从含氨苄青霉素的LB平板上随机挑取16个白色菌落，利用载体上的引物进行PCR扩增后行琼脂糖凝胶电泳，含有目的条带的菌落为阳性克隆菌，取阳性克隆 后第23bp由C突变为T，同源性99.99％，联网到NCBI的ORF finder服务器对此序列进行可读框架分析，结果发现含-个完整的开放读码框，从起始密码子ATG到终止密码子TGA共966bp；亚克隆及酶切鉴定用BamH I/Xho I双酶切pMD19-T-Der f 1质粒，将纯化后的目的基因与pET28a(+)载体连接，质粒提取后行琼脂糖凝胶电泳，挑选目的质粒用BamH I/Xho I进行酶切鉴定，有两质粒经1％琼脂糖凝胶电泳显示出两个条带，与预期相符，说明亚克隆获得成功；将pET28a(+)-Der f 1质粒转化宿主菌E.coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，在临近34kD处出现特异性条带，与预期分子量大小一致。
粉尘螨变应原第2组分全长基因克隆与表达所采用的质粒、菌株、试剂和仪器分别为BamH I/Xho I、RNAiso Reagent(Code No.D312)、High Fidelity PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Code No.DR027A)、PrimeSTAR-HS DNA Polymerase(Code No.DR010A)、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805)、DNA A-Tailing Kit (Code No.D404)、DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV807)、DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞(Code No.D6023)、pMD19-TSimple Vector(Code No.D104)、E.coli Competent Cells JM109(Code No.D9052)、TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805)、TaKaRa DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞(Code No.D6023)、protein marker、E.coli BL21(DE3)Stratagene公司生产，pET28a(+)(Kit Lot No.N72770)及Perfect protein marker，Precision Plus Protein Standards，True bluePEROXIDASE Substrate，Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)(Code No.D9030A)、CBB-R250染色液、TP3000PCR仪(TaKaRa BIO INC.)，超纯水仪(MILLIPORE型)，制冰机，琼脂糖凝胶水平电泳槽及电泳仪，-20℃冰箱，-80℃冰箱，高速冷冻离心机；双稳定 菌置于含氨苄青霉素的TB培养液中，37℃振摇培养过夜，取重组阳性克隆，提取质粒DNA，用BamH I和XhoI双酶切鉴定pMD19T-Derf1重组子，用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段的大小，以重组质粒DNA为模板；
尘螨变应原Der f1原核表达及鉴定：a、表达质粒pET28a(+)-Derf 1的构建及鉴定：用BamHI和XhoI分别对阳性质粒及pET28a(+)载体进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，用TaKaRa DNA Ligation Kit将目的基因片段和pET28a(+)连接后，热转化至E.coli Competent Cells JM109，37℃培养过夜，挑取单个菌落，提取质粒后行琼脂糖凝胶电泳，对目的质粒行BamH I/XhoI双酶切鉴定；b、重组蛋白的诱导表达：取pET28a(+)-Der f1阳性克隆0.5μl转入Competent cell BL21(DE3)100μl，涂布于LB平板(LB/抗生素Kana为50μl/450μl)上，37℃摇菌过夜，次日挑取单菌落至2mlLB/抗生素培养液中，37℃摇菌至OD600nm值约为0.6～0.8，添加IPTG50μl(final 1mmol/L IPTG)，37℃诱导2hr后进行蛋白质抽提，取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)20μl，加入20μl2×SDS samplebuffer，95℃加热10min，10μl(约0.1OD)上样进行SDS-PAGE电泳，剩余样品-80℃保存。
RNAiso Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，经两次PCR扩增获得的产物，经琼脂糖凝胶电泳，见一条约966bp的条带，与理论值相符合，回收的PCR产物与pMD19-T simple连接后，转化至E.coli Competent Cells JM109中，过夜培养，蓝白斑筛选并提取质粒，用BamH I和Xho I酶切鉴定获得与预期相符的结果，将初筛的2个阳性重组菌通过摇菌、质粒提取并纯化，使用引物BcaBESTPrimer M13-47、BcaBEST Primer RV-M对阳性重组质粒测序，去除原始测序结果5’和3’端的酶切位点后，与参考序列相比，其在ATG 时电泳仪(DYY-8B)；核酸电泳槽(HE-120)；蛋白质电泳槽(DYCZ-24D)： 
VDS电泳成像装置(Pharmacia Biotech)。
粉尘螨变应原第2组分全长基因克隆的方法：a、根据GenBank(AB195580)公布的Der f 2CDS序列设计引物，并加入BamH I/Xho I酶切位点，如下：上游引物F：5’GGATCCATGATTTCCAAAATCTTGTGCC3’；下游引物R：5’CTCGAGTTAAT CACGGATTTTACCATGG 3’，解剖镜下挑取粉尘螨(Dermatophagoides farinae)约600只，匀浆后用Takara RNAiso Reagent试剂盒提取Total RNA，操作按说明书进行；b、RT-PCR合成Der f2全长基因使用High Fidelity PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Code No.DR027A)进行反转录实验，反应体系：TotalRNA 2μL、20μM下游引物R 1μL、各10mM dNTP Mixture 1μL、20μMRandom 6mers 1μL、RNase Free H2O 5μL，反应条件：65℃5min后，立即冰上放置2min，然后加入下列组分：5×PrimeScript RTBuffer 4μL、40U/μL RNase Inhibitor 0.5μL、PrimeScript RTase(for 2Step)0.5μL、RNase Free dH2O 5μL，共20μL，置30℃10min、42℃30min、95℃5min，用 
HS DNA Polymerase(Code No.DR010A)进行PCR扩增，总反应体系50μL，组成如下：上述转录反应液2μL、5×PrimeSTAR PCR Buffer 10μL、dNTP Mixture(2.5mMeach)4μL、CTB069F Primer(20μM)1μL、CTB069R Primer(20μM)1μL、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL、dH2O31.5μL，反应条件：94℃预变性3min，98℃10sec、55℃15sec、72℃30sec条件下进行30个循环，72℃10min延伸，取5μL进行琼 脂糖凝胶电泳；c、粉尘螨变应原第2组分基因克隆及测序：上述RT-PCR获得的产物全量上样电泳，切胶回收上述PCR产物、上A、精制后，与pMD19-T Simple Vector连接后，热转化至E._coli CompetentCells JM109中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒pMD19-T-Der f 2，用BamH I和Xho I双酶切鉴定，并用琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段的大小；d、重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE：取原核表达质粒pET28a(+)-Der f 20.5μL转化CompetentCell BL21(DE3)100μL中，取50μL转化液涂布LB/抗生素Kana(50μg/mL)平板，37℃过夜培养后，挑取单菌落至2mL LB/抗生素培养基中进行种培养，37℃过夜培养，在glass tube中添加5mL LB/抗生素培养基，添加种培养菌液100μL，37℃主培养至OD600nm值约为0.5-0.7时，添加100mM IPTG 50μL(final 1mM IPTG)，37℃诱导3hr，将主培养后培养液置4℃3500×g离心10min，收集菌体，取菌体添加PBS Buffer(200μL/tube)至5OD/mL，悬浊，超声波破碎直至液体透明，取50μL为全蛋白样品；残余部分置4℃20000×g离心10min，取上清为可溶性蛋白样品；在沉淀中添加PBS Buffer 150μL悬浊即得不溶性蛋白样品，取全蛋白、可溶性蛋白、不溶性蛋白样品各10μL，加入5×SDS sample buffer 2.5μL，95℃加热10min，12.5μL上样进行SDS-PAGE电泳，20mA/枚，约90min，使用胶为12.5％polyacrylamide gel(12well)，使用Marker为TaKaRa protein marker(Broad)5μL/well，电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色；
粉尘螨变应原第2组分全长基因克隆的结果：a、目的基因的扩 增：用RNA isolation Reagent试剂盒提取粉尘螨Total RNA后，RT-PCR扩增获得目的基因，经琼脂糖凝胶电泳，见一条约441bp的条带，与理论值相符合；b、克隆载体pMD19-T-Der f 2构建及测序：回收PCR产物与pMD19-T simple连接后，转化至E.coli Competent Cells JM109中，过夜培养，蓝白斑筛选并提取质粒pMD19-T-Der f 2，用BamH I和Xho I酶切鉴定，将初筛的2个阳性重组菌通过摇菌、质粒提取并纯化，使用引物BcaBEST Primer M13-47、BcaBEST PrimerRV-M对阳性重组质粒测序，去除原始测序结果5’和3’端的酶切位点后，与参考序列相比，其在328bp处发生“G→A”有义突变引起“天冬氨酸→天冬酰胺”氨基酸突变，382bp处发生“G→A”突变和384bp处发生“T→C”突变引起“缬氨酸→异亮氨酸”，同源性99.3％，联网到NCBI的ORF finder服务器对此序列进行可读框架分析，结果发现含一个完整的开放读码框，从起始密码子ATG到终止密码子TAA共441bp；c、原核表达质粒pET28a(+)-Der f 2的构建及鉴定：用BamH I/Xho I双酶切测序正确的pMD19-T-Der f 2质粒，回收后获得目的基因，将其***pET28a(+)载体，质粒提取后行琼脂糖凝胶电泳，挑选目的质粒用BamH I/Xho I进行酶切鉴定，有两质粒经1％琼脂糖凝胶电泳显示出两个条带，与预期相符，说明亚克隆获得成功。
粉尘螨变应原第1、2组分嵌合基因的克隆和原核表达所采用的质粒、菌株、试剂、血清和仪器分别为：pMD19-T Simple Vector(Code No.D104)，pET28a(+)(Kit Lot No.N72770)，E.coli Competent Cells JM109(Code No.D9052)，E.coli BL21(DE3)。Sal I/Xho I、PrimeSTAR-HS DNA Polymerase(Code No.DR010A)、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV805)、DNA A-Tailing Kit(Code No.D404)、DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0(Code No.DV807)、DNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞(Code No.D6023)、Dephospharylation Kit(Code No.D403)、prote in marker(Broad)。Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)(Code No.D9030A)、PVDF膜、Western-blotting膜封闭液、CBB-R250染色液，马抗人IgE抗体，HRP-马抗人IgE结合物，亲和色谱填料镍琼脂糖凝胶FF，TP3000PCR仪(TaKaRa BIO INC.)，超纯水仪(MILLIPORE型)，制冰机，琼脂糖凝胶水平电泳槽及电泳仪，-20℃冰箱，-80℃冰箱，高速冷冻离心机；双稳定时电泳仪(DYY-8B)；核酸电泳槽(HE-120)；蛋白质电泳槽(DYCZ-24D)； VDS电泳成像装置(Pharmacia Biotech)。
临床诊断为过敏性哮喘、并经经粉尘螨变应原粗提浸液皮肤挑刺试验阳性患儿5例，分别采集静脉血各5mL，5000g离心5min收集血清，并以其混合物为阳性血清，另取5名母亲无遗传过敏史脐血清混合物为阴性血清，二者分装后-80℃保存。
粉尘螨变应原第1、2组分嵌合基因的克隆和原核表达所采用的方法：a、粉尘螨变应原第1和2组分基因克隆：根据GenBank(Accession No.AB034946)公布的粉尘螨变应原第1组分核酸序列，去除终止密码子设计引物F1：5′-GTCGACAAGGCGGTATGAAATTCGTTTTGGCCATTG-3′(下划线为Sal I酶切位点)和下游引物R1：5′-AGAGCCACCACCGCCCATGATTAC AACATATGGATATT-3′。以作者保存的pMD 19-T-Der f 1质粒为模板进行PCR扩增，反应体系为：pMD19-T-Der f 1质粒(1000倍稀释液)1μL、5×PrimeSTAR PCR Buffer10μL、dNTP Mixture(2.5mM each)4μL、上游引物F1(20μM)1μL、下游引物R1(20μM)1μL、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL) 0.5μL、dH2O 32.5μL。反应条件为：94℃变性3min后，98℃10sec、55℃15sec、72℃1min条件下进行30个循环，72℃10min延伸，取5μL PCR产物上样电泳，切胶回收产物得Der f 1。同理，以GenBank(Accession No.AB195580)公布的Der f 2CDS序列为参考，设计并合成上游引物5′-GGCGGTGGTG GCTCTATGATTTCCAAAATCTTGTGCC-3′(柔性接头)和下游引物R2：5′CTCGAGTTAATCACGGATTTTACCATGG 3′(划线为Xho I酶切位点)，以作者保存的PMD 19-T-Der f 2质粒为模板，用 
HS DNA Polymerase进行PCR扩增，反应体系及反应条件同上，取5μL PCR产物上样电泳，切胶回收产物得Der f2；b、PCR合成粉尘螨变应原第1和2组分嵌合基因片段：取上述回收产物Der f 1和Der f 2，PCR搭链构建嵌合基因片段，反应体系如下：Der f 1(10倍稀释液)1μL，Der f 2(10倍稀释液)1μL，5×PrimeSTAR PCR Buffer 10μL、dNTP Mixture(2.5mM each)4μL、引物F1(20μM)1μL、引物R2(20μM)1μL、PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL和dH2O 31.5μL。反应条件为：94℃变性3min后，98℃10sec、55℃15sec、72℃1.5min条件下进行30个循环，72℃10min延伸，取5μL PCR产物上样电泳，切胶回收产物并命名为Der fm；c、嵌合基因Der fm的克隆及测序：切胶回收上述PCR产物得Der fm、上“A”精制后，与pMD19-T Simple Vector连接，热转化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒pMD19-T-Der f m，委托宝生物工程(大连)有限公司用BcaBEST Primer M13-47、BcaBEST Primer RV-M通用引物以及本文设计并合成的R1进行测序；d、嵌合基因Der fm原核表达质粒的构建及鉴定用Sal I/Xho I分别对pMD19-T-Der f m和pET28a(+)质粒进行双酶切，反应体系为：质粒pMD19-T-Der f m或pET28a(+)10μL、Sal I(10U/μL)5μL、Xho I(10U/μL)5μL、10×H Buffer 10μL、dH2O 70μL，37℃水浴4h，pET28a(+)质粒经双酶切后，上样电泳并回收目的片段，用DNA Fragment Purification KitVer.2.0进行精制、用Dephospharylation Kit将5’末端去磷酸化，全量电泳后切胶回收目的片段，质粒pMD19-T-Der fm双酶切后，电泳并回收小分子片段命名为Insert，用DNA Ligation Kit＜MightyMix＞中的连接酶，将Insert与pET28a(+)Vector连接后，热转化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒并命名为pET28a(+)-Der fm，使用Sal I/Xho I对其双酶切鉴定；e、重组蛋白的诱导表达及SDS-PAGE取原核表达质粒pET28a(+)-Der fm 0.5μL转化Competent CellBL21(DE3)100μL中，取50μL转化液涂布LB/抗生素Kana(50μg/mL)平板，37℃过夜培养后，挑取单菌落至2mL LB/抗生素培养基中进行种培养，37℃过夜培养，在glass tube中添加5mL LB/抗生素培养基，添加种培养菌液100μL，37℃主培养至OD600nm值约为0.5-0.7时，添加100mM IPTG 50μL(final 1mM IPTG)，37℃诱导3hr，将主培养后培养液置4℃3500×g离心10min，收集菌体，取菌体添加PBSBuffer(200μL/tube)至5OD/mL，悬浊，超声波破碎直至液体透明，取50μL为全蛋白样品；残余部分置4℃20000×g离心10min，取上清为可溶性蛋白样品；在沉淀中添加PBS Buffer 150μL悬浊即得不溶性蛋白样品，取全蛋白、可溶性蛋白、不溶性蛋白样品各10μL，加入5×SDS sample buffer 2.5μL，95℃加热10min，10μL上样进行SDS-PAGE电泳，20mA/枚，约90min，使用胶为12.5％polyacrylamide gel(12well)，使用Marker为TaKaRa protein marker(Broad)5μL/well，电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色，pET28a(+)vector为负对照进行同样操作；f、重组蛋白的分离纯化取工程菌的穿刺管，在含有Amp(100μg/μL)的LB琼脂平板上进 行划线，37℃恒温过夜培养活化；次日从平板上挑单个菌落接种于50mL含Amp(100μg/μL)的LB培养基中，37℃，250r/min振荡培养过夜，以此作为发酵的种子液；将50mL种子液接种到2000mL含Amp(100μg/μL)的LB培养基置30℃，250r/min振荡培养发酵，当菌液的OD600达到0.8-1.0时，加入100mM IPTG至终浓度为1mmol/L，然后30℃继续培养4h。收集诱导后的菌体，按10ml/g菌体的量重悬于50mmol/L PBS(pH7.4)中，在冰浴条件下超声波破碎至液体透明。将细胞破碎液以7000rpm/min，4℃离心15min，收集沉淀即为粗制的包涵体；将粗制包涵体用含2mol/L尿素的PBS缓冲液中(pH8.0)洗涤5次，得比较纯净的包涵体；将较纯净的包涵体悬于含8mol/L尿素、5mmol/L DTT的PBS缓冲液(pH 8.0)中，4℃轻微搅拌过夜；1000r/min离心10min，上清液经0.22μm滤膜超滤，将此蛋白抽提产物以4.0ml/min流速上镍琼脂糖凝胶FF亲和柱，用PBS缓冲液以6ml/min流速洗涤2-5个柱床体积，直到洗脱曲线到达基线为止，分别用含25、50、75、100、125、150mmol/l咪唑洗脱液进行阶段洗脱，收集洗脱液，用SDS-PAGE检测其分子量大小和纯度，冷冻干燥后制备成蛋白冻干粉，用梯度透析法进行复性，先用含2mol/L尿素的复性液(50mmol/L Tris-HCL 150mmol/L NaCl、1mmol/LGSH、0.2mmol/L GSSG)透析，再用含0.2mol/L尿素的复性液透析，最后用含0.2mol/L EDTA的PBS透析；g、Western blotting鉴定重组蛋白的变应原性按上述方法进行SDS-PAGE电泳，按阳极、滤纸A、滤纸B、PVDF膜、PAGE Gel、滤纸C、阴极顺序进行转印，将蛋白质转移到PVDF膜，再将PVDF膜置于10mL Blocking buffer(1.5％BSA、20mM Tri s-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、0.1％Tween)中，4℃平放过夜封闭，用Blocking Buffer按1∶1000稀释一抗哮喘患儿血清混合物(阳性血清)，取5mL抗体溶液置PVDF膜上静置1h，然后用 洗涤Buffer(含20mM Tris-HCl和150mM NaCl)+0.1％Tween洗涤2次，再用洗涤Buffer冲洗2次去除多余的抗体，取Blocking Buffer1∶1000稀释后的二抗马抗人IgE抗体5mL置膜上，静置1h，同前法洗涤去除多余的抗体，用1mL TrueBlue Peroxidase Substrate显色1min，将PVDF膜置于水中终止反应。
粉尘螨变应原第1、2组分嵌合基因的克隆和原核表达的结果：a、目的基因扩增：分别以pMD19-T-Der f1和为pMD19-T-Der f2模板进行PCR扩增，回收产物Der f1和Der f2后搭链PCR合成得粉尘螨变应原第1、2组分的嵌合基因片段Der fm；b、粉尘螨变应原嵌合基因片段Der fm克隆及测序：将回收获得的Der fm基因片段上“A”、精制后，***pMD19-T simple Vector，构建重组质粒pMD19-T-Der fm，提取质粒测序，全长为1419bp，其中第1-963bp编码粉尘螨变应原第1组分，第978-1419bp编码粉尘螨变应原第2组分，964-977为本文作者添加的柔性接头；c、原核表达质粒pET28a(+)-Der fm的构建及鉴定：使用Sal I/Xho I对测序正确的pMD19-T-Der fm质粒进行酶切，电泳后回收小片段即为Der fm；使用Sal I/Xho I对pET28a(+)质粒进行酶切，对回收产物进行精制、去磷酸化；通过连接酶将二者连接，热转化至E.coli Competent Cells JM109中，涂布平板，37℃过夜培养，挑选阳性菌落植菌，提取质粒即为pET28a(+)-Der fm，该质粒经Sal I/Xho I双酶切鉴定；d、重组变应原的诱导表达及纯化：将构建成功的原核表达质粒pET28a(+)-Der fm质粒转化宿主菌E.coli BL21诱导表达，SDS-PAGE电泳显示，pET28a(+)-Der fm全细胞和沉淀物在约52kD处出现特异性条带，与预期分子量大小相似(图10)，说明pET28a-Der fm基因正常表达，但表达为包涵体。从2000mL发酵液收集到菌体，超声波破碎后，离心收集沉淀即为粗制的包涵体，经洗涤、溶解、过滤后，上清液经过镍琼脂糖凝胶FF亲 和柱，并用不同浓度咪唑溶液洗脱并收集产物，冷冻干燥后共获得约415mg重组蛋白纯品，发酵液产率为207.5mg/L；f、Western-blotting鉴定重组蛋白变应原性：经粉尘螨变应原粗提浸液皮肤挑刺试验阳性的哮喘患儿血清为一抗，另取5份母亲无遗传过敏史脐血清混合物为阴性血清。二者分装后-80℃保存。生物素标记的抗人IgE抗体为二抗。Western-blotting分析表明该重组蛋白可与哮喘患儿血清IgE发生结合，有一特异性的反应条带。
Claims (1)
1.一种生产重组粉尘螨变应原Der f1和Der f2融合蛋白的方法，其特征在于它通过提取粉尘螨总RNA，根据GenBank公布的粉尘螨变应原第1组份(Der f1)和粉尘螨变应原第2组份(Der f2)核酸序列设计引物，用PCR扩增获得其编码基因，依次克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，以PMD19-T-Der f1、PMD19-T-Der f2为模板，PCR扩增后切胶、回收产物Der f1和Der f2，PCR搭链构建嵌合基因片段，切胶回收产物并命名为Der fm，克隆至pMD19-T载体、亚克隆至表达载体pET-28a(+)并转化至大肠杆菌并用IPTG诱导表达。所有表达产物经琼脂糖凝胶FF亲和柱层析纯化后，用SDS-PAGE和Western-blotting验证产物。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018121640A1 (zh) * | 2016-12-31 | 2018-07-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用 |
| CN108265058A (zh) * | 2016-12-31 | 2018-07-10 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组粉尘螨1类变应原蛋白及其制备方法和应用 |
| CN109852652A (zh) * | 2017-11-30 | 2019-06-07 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组尘螨Ⅰ型变应原Der p1和Der f1蛋白的制备与应用 |
| CN109852653A (zh) * | 2017-11-30 | 2019-06-07 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组尘螨II型变应原Der p2和Der f2蛋白的制备与应用 |
| CN117362453A (zh) * | 2023-12-08 | 2024-01-09 | 山东硕景生物科技有限公司 | 一种Derf1重组抗原、其制备方法及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1908777A1 (en) * | 2006-10-06 | 2008-04-09 | Stallergenes Sa | Mite fusion proteins |
| CN101821286A (zh) * | 2007-10-08 | 2010-09-01 | 阿尔克-阿贝洛有限公司 | 生产成熟的重组螨i类变应原的方法 |
| CN101977929A (zh) * | 2008-03-25 | 2011-02-16 | 拜尔工业制药有限公司 | 用于治疗***反应的主要1类和2类螨变应原的低变应原性杂合蛋白 |
-
2012
- 2012-05-08 CN CN2012101392400A patent/CN102676568A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1908777A1 (en) * | 2006-10-06 | 2008-04-09 | Stallergenes Sa | Mite fusion proteins |
| CN101821286A (zh) * | 2007-10-08 | 2010-09-01 | 阿尔克-阿贝洛有限公司 | 生产成熟的重组螨i类变应原的方法 |
| CN101977929A (zh) * | 2008-03-25 | 2011-02-16 | 拜尔工业制药有限公司 | 用于治疗***反应的主要1类和2类螨变应原的低变应原性杂合蛋白 |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018121640A1 (zh) * | 2016-12-31 | 2018-07-05 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组粉尘螨2类变应原蛋白及其制备方法与应用 |
| CN108265058A (zh) * | 2016-12-31 | 2018-07-10 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组粉尘螨1类变应原蛋白及其制备方法和应用 |
| CN108265058B (zh) * | 2016-12-31 | 2020-12-22 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组粉尘螨1类变应原蛋白及其制备方法和应用 |
| US11236137B2 (en) | 2016-12-31 | 2022-02-01 | Zonhon Biopharma Institute, Inc. | Recombinant Dermatophagoides farinae type 2 allergen protein and its preparation method and application |
| CN109852652A (zh) * | 2017-11-30 | 2019-06-07 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组尘螨Ⅰ型变应原Der p1和Der f1蛋白的制备与应用 |
| CN109852653A (zh) * | 2017-11-30 | 2019-06-07 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组尘螨II型变应原Der p2和Der f2蛋白的制备与应用 |
| CN109852653B (zh) * | 2017-11-30 | 2023-04-28 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组尘螨II型变应原Der p2和Der f2蛋白的制备与应用 |
| CN109852652B (zh) * | 2017-11-30 | 2023-05-02 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 重组尘螨Ⅰ型变应原Der p1和Der f1蛋白的制备与应用 |
| CN117362453A (zh) * | 2023-12-08 | 2024-01-09 | 山东硕景生物科技有限公司 | 一种Derf1重组抗原、其制备方法及应用 |
| CN117362453B (zh) * | 2023-12-08 | 2024-02-27 | 山东硕景生物科技有限公司 | 一种Derf1重组抗原、其制备方法及应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20120919 |