CN105331558A - 一种荧蒽降解菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种荧蒽降解菌及其在荧蒽降解中的应用，其中，所述降解菌为假单胞菌(Pseudomonas？sp.)，所述降解菌的保藏号为CCTCC？M2015612。本发明的荧蒽降解菌能够高效降解含荧蒽溶液中的荧蒽，本发明的荧蒽降解菌对浓度较高的荧蒽溶液耐受力较强，可耐受大于150mg/L的荧蒽浓度，尤其适用于含荧蒽废水的生物处理。

Description

一种荧蒽降解菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种荧蒽降解菌及其在荧蒽降解中的应用。

背景技术

多环芳烃(PolycyclicAromaticHydrocarbons，简称PAHs)是一类高分子量有机化合物的统称。这类化合物含有两个或两个以上苯环，极难溶于水，在环境中很难被分解。PAHs主要存在于石油、燃料油和煤中，通过地表径流、污水排放以及染料不完全燃烧后的废气随大气颗粒的沉降而进入水体环境。由于其具有潜在的致癌、致畸、致突变作用，目前越来越引起人们重视，美国EPA已将16种PAHs列入优先控制有机污染物黑名单中。

荧蒽为一种四环的杂环芳烃，在由燃烧产生的PAHs污染物中含量最高，因而常被作为环境遭受PAHs污染物的指示化合物，其生物降解具有典型意义。

去除环境中的PAHs的方法有化学方法、物理方法和生物降解法。物理方法和化学方法虽然处理十分快速，但容易造成二次污染；生物降解方法既经济、安全、残留又少，逐渐得到人们的认可。其中微生物由于生长迅速、变异率高，很容易产生土著的多环芳烃高效降解菌株。

目前已报道的多环芳烃降解菌，包括假单胞菌(Pseudomonas)、红球菌(Rhodococcus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、气单胞菌(Aeromonas)、拜叶林克氏菌(Beijerinckia)、拟诺卡氏菌(Nocardioides)、解环菌(Cycloclasticus)、伯克氏菌(Burkholderia)、丛毛单胞菌(Polaromonas)以及一些嗜热厌氧的菌属如嗜油菌(Neptunomonas)、两面神菌(Janibacter)、诺卡氏菌(Nocardia)、变性菌(Deltaproteobacteria)和产碱菌(Alcaligenes)等。其中具有降解荧蒽能力的细菌包括鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)等。

目前，已报道的通过筛选获得的降解荧蒽菌株对荧蒽的耐受浓度通常低于100mg/L，荧蒽的降解率通常低于90％，并且降解周期通常超过10天。少数菌株可以耐受浓度高达500mg/L的荧蒽，但降解周期超过两周。在对含多环芳烃的废水生物处理过程中，若想实现高降解率的处理效果需要较长的周期，在处理实际废水时经济性低。因此，通过筛选获得高荧蒽耐受力且降解周期短的降解菌在处理实际含多环芳烃尤其是荧蒽废水应用中具有重要的意义。

鉴于此，克服以上现有技术中的缺陷，提供一种高效处理多环芳烃废水的技术手段成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的上述缺陷，提供一种荧蒽降解菌及其在荧蒽降解中的应用。

本发明的目的可通过以下的技术措施来实现：

一种荧蒽降解菌，与现有技术相比，其不同之处在于，所述降解菌为假单胞菌(Pseudomonassp.)，所述降解菌的保藏号为CCTCC【M2015612】。

优选地，所述降解菌的16SrRNA基因序列为SEQIDNo.1。

本发明还提供了一种细菌制备物，与现有技术相比，其不同之处在于，所述细菌制备物为权利要求1所述的保藏号为CCTCC【M2015612】的荧蒽降解菌的纯培养物或培养物浓缩物或细菌悬液或发酵液。

优选地，所述细菌制备物为保藏号为CCTCC【M2015612】的荧蒽降解菌在发酵培养液中经过发酵培养形成的发酵液，其中，发酵培养液的组成如下：50-200mg荧蒽、0.5-1.5gKH₂PO₄、4.0-7.0gNa₂HPO₄·12H₂O、0.2-0.7g(NH₄)₂SO₄、0.2gMgSO₄·7H₂O及1mL微量元素溶液，补蒸馏水至1000mL。所述微量元素溶液为：1gFeSO₄·7H₂O、1gMnSO₄·H₂O、0.25gNa₂MoO₄·2H₂O、0.1gH₃BO₄、0.25gCuCl₂·2H₂O、0.25gZnCl₂、0.1gNH₄·VO₃、0.25gCo(NO₃)₂·6H₂O、和0.1gNiSO₄·6H₂O溶于900mL蒸馏水中，再加入5mL浓H₂SO₄，最后补蒸馏水至1000mL。

本发明另外提供了一种降解荧蒽的方法，包括使荧蒽与上述的荧蒽降解菌、或上述的细菌制备物接触的步骤。

优选地，荧蒽的浓度为50mg/L-200mg/L。

优选地，降解温度为25-35℃。

优选地，降解条件为pH6.5-9.5。

本发明还提供了上述的荧蒽降解菌、或上述的细菌制备物在去除或降解荧蒽中的用途。

本发明还提供了上述的荧蒽降解菌、或上述的细菌制备物在处理含有荧蒽的工业废水或在荧蒽污染的土壤/水体的生物修复中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于，本发明的荧蒽降解菌能够高效降解含荧蒽溶液中的荧蒽，本发明的荧蒽降解菌对浓度较高的荧蒽溶液耐受力较强，可耐受大于150mg/L的荧蒽浓度，尤其适用于含荧蒽废水的生物处理。

附图说明

图1是本发明实施例2中不同荧蒽浓度条件下SY-YE-1菌株对荧蒽的降解率及菌株浓度变化图。

图2是本发明实施例3中SY-YE-1菌株的荧蒽降解曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

术语“发酵培养液”是指液体培养基；术语“发酵液”是指菌株在液体培养基中发酵培养一段时间后所形成的液体(包括了培养液)；术语“细菌悬液”是发酵液经过离心处理后收集沉淀(菌株培养物或菌体)，将沉淀溶于水或缓冲液中，经过震荡或吹打使得沉淀状的菌株培养物悬浮起来所形成的均一的悬浊液。

本实施例提供了一种荧蒽降解菌，所述降解菌为假单胞菌(Pseudomonassp.)SY-YE-1菌株，所述降解菌的保藏号为CCTCC【M2015612】，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山），保藏日期：2015年10月19日。

进一步地，所述菌株鉴定特征如下：菌体细胞呈杆状，属于革兰氏阴性菌类，菌落呈淡黄色，圆形，边缘齐整，菌株在生长过程中能耐受浓度高于150mg/L的荧蒽，最适生长条件为：pH7.2，温度28℃。

进一步地，所述菌株的16SrRNA基因序列为SEQIDNo.1。将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的16SrRNA基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明SY-YE-1菌株与假单胞菌属(Pseudomonas)的16SrRNA基因序列的同源性在99％以上，因此将分离菌株鉴定为假单胞菌(Pseudomonassp.)。

本发明提供的细菌制备物为上述SY-YE-1菌株的纯培养物或培养物浓缩物或发酵液，可以是上述菌株在固体培养基表面形成纯培养物，例如：平板固体培养基或斜面固体培养基上形成的菌落，也可以是上述菌株在液体培养基(发酵培养液)中发酵培养后经过离心分离所得的细菌悬液，还可以是上述菌株在液体培养基(发酵培养液)中生长发酵形成的发酵液。

本发明所提供的保藏号为CCTCC【M2015612】的荧蒽降解菌SY-YE-1菌株的培养方法包括：保藏号为CCTCC【M2015612】的荧蒽降解菌在发酵培养液中经过发酵培养形成的发酵液，其中，发酵培养液的组成如下：50-200mg荧蒽、0.5-1.5gKH₂PO₄、4.0-7.0gNa₂HPO₄·12H₂O、0.2-0.7g(NH₄)₂SO₄、0.2gMgSO₄·7H₂O及1mL微量元素溶液，补蒸馏水至1000mL。而微量元素溶液为：1gFeSO₄·7H₂O、1gMnSO₄·H₂O、0.25gNa₂MoO₄·2H₂O、0.1gH₃BO₄、0.25gCuCl₂·2H₂O、0.25gZnCl₂、0.1gNH₄·VO₃、0.25gCo(NO₃)₂·6H₂O、和0.1gNiSO₄·6H₂O溶于900mL蒸馏水中，再加入5mL浓H₂SO₄，最后补蒸馏水至1000mL。具体地，在250mL三角瓶中装入100mL荧蒽无机盐培养基混合体系，其中包括培养基溶液、无机盐微量元素溶液和荧蒽，其中，每1L培养基加入1mL微量元素溶液；在高压灭菌后的三角瓶中添加荧蒽的丙酮溶液，待丙酮挥发后，再将高压灭菌后的无机盐培养基加入体系。

实施例1：

假单胞菌SY-YE-1菌株的分离和鉴定

(一)由于多环芳烃主要存在于石油、煤中，因此焦化废水中含有较多的多环芳烃，本发明中的假单胞菌SY-YE-1菌株采用富集培养法从辽宁鞍钢集团公司焦化废水处理***的生化好氧池活性污泥中分离得到，具体步骤如下：

(1)配制培养基：在250mL三角瓶中装入100mL荧蒽无机盐培养基混合体系，其中包括培养基溶液、无机盐微量元素溶液和荧蒽。每1L培养基加入1mL微量元素溶液；在高压灭菌后的三角瓶中添加荧蒽的丙酮溶液，待丙酮挥发后，再将高压灭菌后的无机盐培养基加入体系。

培养基溶液为(g/L)：0.5-1.5KH₂PO₄、4.0-7.0Na₂HPO₄·12H₂O、0.2-0.7(NH₄)₂SO₄、0.2MgSO₄·7H₂O及1mL微量元素溶液；微量元素溶液为(g/L)：1gFeSO₄·7H₂O、1gMnSO₄·H₂O、0.25gNa₂MoO₄·2H₂O、0.1gH₃BO₄、0.25gCuCl₂·2H₂O、0.25gZnCl₂、0.1gNH₄·VO₃、0.25gCo(NO₃)₂·6H₂O、0.1gNiSO₄·6H₂O，溶于900mL蒸馏水，加入5mL浓H₂SO₄，补蒸馏水至1000mL。

(2)驯化培养：向培养基中接入5mL从辽宁省鞍钢集团公司采集的生化好氧池活性污泥，于28-32℃在转速120-150r/min的摇床中振荡培养5-7天，取5mL菌液接种到100mL新培养基中，重复转接7次。新培养基中荧蒽的浓度依次递增。起始浓度为50mg/L，以后每次转接荧蒽浓度增加50mg/L，直到第7次转接的400mg/L。

(3)分离纯化：驯化培养好的菌液按10^-3、10^-4、10^-5、10^-6和10^-7稀释，取0.1mL10^-4稀释液涂在含有100mg/L荧蒽的无机盐培养基平板上，30℃倒置培养5-7天，挑取单菌落，进行3次划线分离纯化，得到纯化的菌株SY-YE-1。

(二)采用16SrRNA基因测序法对假单胞菌SY-YE-1菌株进行分类鉴定，具体步骤如下：

(1)细菌总DNA的制备：用天根公司基因组提取试剂盒提取SY-YE-1菌株的基因组DNA，作为PCR反应的模板。

(2)16SrRNA基因的PCR扩增：

使用如下扩增引物：

第一引物27F：5’-AgAgTTTgATCMTggCTCAg-3’[M＝C,A](SEQIDNo.2或SEQIDNo.3)；

第二引物1492R：5’-CggYTACCTTgTTACgACTT-3’[Y＝T,C](SEQIDNo.4或SEQIDNo.5)。

PCR反应体系如表1所示。

表1PCR反应体系

PCR反应条件为：(94℃3分钟)-(94℃1分钟-55℃30秒-72℃1分钟)×30个循环-(72℃1分钟)。

(3)PCR产物的纯化、克隆、测序和分析：

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后与pMD18-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α，然后提取重组质粒，测定16SrRNA基因序列。将基因序列登录美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，进行核苷酸序列Blast比对，得到与相关菌株的16SrRNA基因序列同源的若干核苷酸序列，结果表明SY-YE-1菌株与假单胞菌属(Pseudomonas)的16SrRNA基因序列的同源性在99％以上，因此将分离菌株鉴定为假单胞菌(Pseudomonassp.)。

(三)假单胞菌SY-YE-1菌株的形态鉴定特征如下：

菌体细胞呈杆状，属于革兰氏阴性菌类，菌落呈淡黄色，圆形，边缘齐整，菌株在生长过程中能耐受150mg/L的荧蒽，最适生长条件为：pH7.2，温度28℃。

实施例2：

假单胞菌SY-YE-1对不同浓度的荧蒽的降解率及菌体浓度(OD600值)

在pH7.2，温度28℃，荧蒽初始浓度分别为50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L、300mg/L、350mg/L、400mg/L，将SY-YE-1菌株的培养物接种于100mL上述以荧蒽为唯一碳源的无机盐培养基中，150r/min振荡培养5天后取样。

将所得培养液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，取上层有机相旋转蒸发，用甲醇定容后采用HPLC定量测量样品中残留荧蒽含量，计算降解率。以荧蒽初始浓度为横坐标，以荧蒽降解率及OD600值(菌体浓度)为纵坐标，绘制降解及菌体浓度曲线，结果示于图1。

从图1可见，假单胞菌SY-YE-1菌株在荧蒽浓度低于100mg/L时，对荧蒽有很好的降解效果，降解率可达到99％以上；在荧蒽浓度为100mg/L时，菌体生长最好，即菌体浓度达到最高值；即使在荧蒽浓度为150mg/L时，降解率仍可以达到95％以上；而当荧蒽初始浓度高于200mg/L时，假单胞菌SY-YE-1对荧蒽的降解率逐渐降低，但仍有一定的降解能力。

现有技术已知的荧蒽降解菌对荧蒽耐受浓度通常低于100mg/L，并且荧蒽降解率通常低于90％。例如CN103243059A公开了一株可降解荧蒽的蜡状芽孢杆菌，荧蒽初始浓度为50mg/L，培养7天后降解率仅为21.29％；又如CN103834588A公开的一株具有多环芳烃降解能力的蜡状芽孢杆菌，荧蒽初始浓度为50mg/L，培养7天后降解率为57.63％。因此本发明的假单胞菌SY-YE-1菌株具有较好的荧蒽降解能力。

实施例3：

假单胞菌SY-YE-1菌株对荧蒽的降解曲线

将假单胞菌SY-YE-1菌株的培养物接种于100mL的上述以荧蒽为碳源的无机盐培养基中，培养基pH为7.2，荧蒽初始浓度为100mg/L，于28℃、150r/min振荡培养，每隔12h取样。

将所得培养液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，取上层有机相旋转蒸发，用甲醇定容后采用HPLC定量测量样品中残留荧蒽含量，计算降解率。以时间为横坐标，荧蒽残留浓度为纵坐标，绘制降解曲线，结果示于图2。从图2可见，培养基初始荧蒽浓度为100mg/L时，本发明的假单胞菌SY-YE-1菌株可在5天内，将培养基中荧蒽降解99％以上，最终培养液中荧蒽浓度低于1mg/L。

现有技术中的荧蒽降解菌对荧蒽的高效降解所需要的降解时间通常超过两周，例如周惠娟等筛选到的一株木糖氧化产碱菌对500mg/L的荧蒽降解率可达到92.8％，但降解时间却达到了14天。又如CN104004686A公开的一株多环芳烃降解菌降解荧蒽的周期长达20天，降解率仅为39.44％。因此可见本发明的假单胞菌SY-YE-1菌株具有较好的荧蒽降解速率。

实施例4：

假单胞菌SY-YE-1菌株在含荧蒽工业废水处理中的应用

将假单胞菌SY-YE-1菌株在以荧蒽为碳源(100mg/L)、(NH₄)₂SO₄为氮源(400mg/L)的无机盐培养液体培养基中28℃振荡培养5天，然后按5％的接种量将菌液接种到荧蒽含量为80mg/L的辽宁某石化厂废水中，28℃振荡培养5天后，荧蒽残留量为0.9mg/L，荧蒽去除率达到98.8％。而不添加假单胞菌SY-YE-1菌株的对照组荧蒽残留量为71.4mg/L，荧蒽去除率仅为10.8％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧蒽降解菌，其特征在于，所述降解菌为假单胞菌(Pseudomonassp.)，所述降解菌的保藏号为CCTCC【M2015612】。

2.根据权利要求1所述的荧蒽降解菌，其特征在于，所述降解菌的16SrRNA基因序列为SEQIDNo.1。

3.一种细菌制备物，其特征在于，所述细菌制备物为权利要求1所述的保藏号为CCTCC【M2015612】的荧蒽降解菌的纯培养物或培养物浓缩物或细菌悬液或发酵液。

4.根据权利要求3所述的细菌制备物，其特征在于，所述细菌制备物为保藏号为CCTCC【M2015612】的荧蒽降解菌在发酵培养液中经过发酵培养形成的发酵液，其中，发酵培养液的组成如下：50-200mg荧蒽、0.5-1.5gKH₂PO₄、4.0-7.0gNa₂HPO₄·12H₂O、0.2-0.7g(NH₄)₂SO₄、0.2gMgSO₄·7H₂O及1mL微量元素溶液，补蒸馏水至1000mL。所述微量元素溶液为：1gFeSO₄·7H₂O、1gMnSO₄·H₂O、0.25gNa₂MoO₄·2H₂O、0.1gH₃BO₄、0.25gCuCl₂·2H₂O、0.25gZnCl₂、0.1gNH₄·VO₃、0.25gCo(NO₃)₂·6H₂O、和0.1gNiSO₄·6H₂O溶于900mL蒸馏水中，再加入5mL浓H₂SO₄，最后补蒸馏水至1000mL。

5.一种降解荧蒽的方法，其特征在于，包括使荧蒽与权利要求1或2所述的荧蒽降解菌、或权利要求3或4所述的细菌制备物接触的步骤。

6.根据权利要求5所述的降解荧蒽的方法，其特征在于，荧蒽的浓度为50mg/L-200mg/L。

7.根据权利要求5所述的降解荧蒽的方法，其特征在于，降解温度为25-35℃。

8.根据权利要求5所述的降解荧蒽的方法，其特征在于，降解条件为pH6.5-9.5。

9.权利要求1或2所述的荧蒽降解菌、或权利要求3或4所述的细菌制备物在去除或降解荧蒽中的用途。

10.权利要求1或2所述的荧蒽降解菌、或权利要求3或4所述的细菌制备物在处理含有荧蒽的工业废水或在荧蒽污染的土壤/水体的生物修复中的用途。