CN117645957B - 降解磺胺类抗生素的斯氏假单胞菌菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种降解磺胺类抗生素的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY‑21，所述斯氏假单胞菌菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63596。本发明还提供降解磺胺类抗生素的斯氏假单胞菌菌株的应用，该菌株对畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥)中的磺胺类抗生素具有很强的降解能力，能够同时对畜禽粪便或其堆肥中的多种磺胺类抗生素具有很强的降解能力，而且与畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥)中的原生微生物菌群兼容性好，适应性强。

Description

降解磺胺类抗生素的斯氏假单胞菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别是涉及具有降解磺胺类抗生素功能的斯氏假单胞菌菌株及其应用。
背景技术
磺胺类抗生素作为兽用药被广泛用于预防和治疗动物疾病，然而由于生物利用率有限，其在使用过程中不能被完全利用，约60-90％的抗生素以药物原形或代谢物的形态通过***物排入环境中。磺胺类抗生素在环境中降解缓慢，残留时间长，是环境中检出频率最高的抗生素之一，在我国黄河、长江、珠江等重点流域中均存在不同程度的检出，对人类身体健康和整个生态***构成一个长期潜在的风险，已引起社会各界广泛关注。如何有效去除畜禽废弃物中抗生素残留已成为当下亟待解决的重要问题。
目前国内外研究学者对磺胺类抗生素的降解技术进行了一定的研究，包括化学氧化法、吸附法、生物法等处理技术，其中生物法具有成本低、反应条件温和降解无二次污染等特点，具有巨大潜力，是现今磺胺类抗生素降解技术研究的热点。目前，国内外一些研究者已从污泥、生物膜反应器中筛选出具有磺胺类抗生素降解效能的菌株，但降解能力各异，出现频率较高的属包括杆菌属(Bacillus)、假单胞菌属(Pseudomonas)和无色杆菌属(Achromobacter)等三个属。但在畜禽废弃物好氧堆肥处理中筛选出高效降解磺胺类抗生素菌株研究还处于摸索阶段，相关报道少之又少。
另一方面，随着我国畜禽养殖业朝规模化、集约化发展，畜禽粪污产生量与日俱增。据统计，我国每年畜禽粪污产生量约38亿吨。在目前国家倡导化肥减量、畜禽废弃物资源化利用的形势下，好氧堆肥处理作为一种环境友好、经济有效的畜禽废弃物的处理术，应用前景广泛。但传统的好氧堆肥技术重点关注堆肥处理后的营养指标、病原体含量、含水率等指标的变化情况，而对抗生素等新型污染物关注较少。
因此，筛选驯化高效降解畜禽粪便中磺胺类抗生素的土著菌株，尤其是好氧堆肥处理畜禽粪便中磺胺类抗生素的土著菌株，研究其降解特性，扩大抗生素降解微生物菌种库，将有效从源头削减磺胺类抗生素对环境的潜在风险，具有重要的生态学意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供一种降解磺胺类抗生素的斯氏假单胞菌菌株及其应用，该斯氏假单胞菌菌株对畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥样品)中的磺胺类抗生素具有很强的降解能力，能够同时对畜禽粪便或其堆肥中的多种磺胺类抗生素具有很强的降解能力，而且与畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥)中的原生微生物菌群兼容性好，适应性强。
为实现上述发明目的，经研究，本发明提供如下技术方案：
本发明的第一方面提供了一种降解磺胺类抗生素的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21，所述斯氏假单胞菌菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63596。
优选地，所述菌株的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述菌株降解的磺胺类抗生素包括磺胺甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉中的至少一种。
本发明的第二方面提供了上述斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21在降解处理磺胺类抗生素方面的应用或在提高磺胺类抗生素降解去除率中的应用。
本发明的第三方面提供了一种磺胺类抗生素降解菌剂，包含以上所述的菌株和/或以上所述菌株的培养物。
优选地，所述降解菌剂为斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的菌悬液。
更优选地，所述菌悬液是斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21菌株活化培养后制备而成。
进一步优选地，所述菌悬液的制备方法包括：将斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonasstutzeri DLY-21接种于液体培养基中，恒温振荡培养制得活化种子液；然后将所述活化种子液接种到新鲜培养基，继续扩大培养后，离心弃上清液收集菌体，无菌水重悬得菌悬液。
本发明的第四方面提供了一种降解磺胺类抗生素的方法，将以上所述的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21或以上所述的菌剂在含有磺胺类抗生素的环境中培养。
优选地，所述培养条件包括：金属盐浓度为0.1-0.5g/L，pH为5.0-9.0，活化种子液的接种量为1％-5％，温度为10-40℃，培养时间为24h-7D。
更优选地，所述金属盐为镁盐、铁盐、锰盐、钙盐中的至少一种。
本发明的第五方面提供了以上所述的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonasstutzeri DLY-21或以上所述的磺胺类抗生素降解菌剂或以上所述的降解磺胺类抗生素的方法在降解畜禽粪便或其堆肥中的磺胺类抗生素中的应用。
本发明的有益效果至少包括：
本发明提供降解磺胺类抗生素的斯氏假单胞菌菌株及其应用，该菌株对畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥)中的磺胺类抗生素具有很强的降解能力，能够同时对畜禽粪便或其堆肥中的多种磺胺类抗生素具有很强的降解能力，而且与畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥)中的原生微生物菌群兼容性好，适应性强。具体而言，与现有技术相比：
(1)本发明提供的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21对于磺胺类抗生素的降解性能尚未有报道，实现了菌种资源的突破，为实现畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥)中的抗生素的去除提供了全新的思路和解决方案。
(2)本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21来源于畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥)，与其中的原生微生物菌群兼容性好，相较而言，生化污泥等其它来源的菌株或菌剂应用于粪污、粪便废水等畜禽废弃物处理，可能面临环境兼容性差，适应不良而导致无法较好执行降解功能的情况。
(3)本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21或包含该菌株的菌剂组合物或者降解磺胺类抗生素的方法，对不同磺胺类抗生素具有很强的降解能力，能够同时对畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥)中的多种磺胺类抗生素具有很强的降解能力(特别是在基础培养基中浓度为20mg/L的磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDM′)、磺胺喹噁啉(SQ)四种磺胺类抗生素，处理7D最大降解率可达95％)。
(4)本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21或包含该菌株的菌剂组合物或者降解磺胺类抗生素的方法可以应用于降解畜禽废弃物(尤其是畜禽粪便或其堆肥)中的磺胺类抗生素。
本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21，包含该菌株的菌剂组合物，以及降解磺胺类抗生素的方法都具有非常重要的实际应用价值和应用前景。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏说明
本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21保藏于广东省微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为：GDMCCNo:63596，保藏时间为：2023年8月22日。
附图说明
图1是本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的PCR图。
图2是本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的***发育树。
图3是本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的扫描电镜图。
图4是本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21在不同时间段下的生长曲线。
图5(a)至图5(d)显示温度对本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonasstutzeri DLY-21降解磺胺类抗生素的影响。
图6(a)至图6(d)显示pH对本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeriDLY-21降解磺胺类抗生素的影响。
图7(a)至图7(d)显示接种量对本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonasstutzeri DLY-21降解磺胺类抗生素的影响。
图8(a)至图8(d)显示不同金属盐对本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonasstutzeri DLY-21降解磺胺类抗生素的影响。
图9(a)至图9(d)显示金属盐FeSO4浓度对本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21降解磺胺类抗生素的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合附图和具体的实施方式对本发明作进一步详细的说明。所述实施例的示例在附图中示出。应理解，在下述本发明的实施方式中描述的具体的实施例仅作为本发明的具体实施方式的示例性说明，旨在用于解释本发明，而不构成对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。在本申请的描述中，除非另有说明，“多个/多种”等类似用词的含义是两个/种或两个/种以上。
本发明的第一方面提供了一种降解磺胺类抗生素的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21，所述斯氏假单胞菌菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63596。
在一些实施方式中，所述斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本发明中，斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21是发明人从畜禽(诸如猪，鸡)养殖场粪便好氧堆肥样品中采集，并经过筛选、分离纯化、驯化、活化得到能够高效降解磺胺类抗生素的降解菌株，而且能够同时降解多种磺胺类抗生素。
在本发明中，斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的菌学特性包括：该菌株经活化以后，在30℃有氧的条件下在固体营养培养基制成的平板上生长48h后，菌株DLY-21菌落通常细胞呈棒状，长1-3毫米，宽0.5毫米，具有单极鞭毛，表面有凸起颗粒(其扫描电镜图参见图3)。在一定条件下，可以产生一个或两个波长较短的侧鞭毛。表型特征包括革兰氏染色阴性，具有严格的呼吸代谢，为专性需氧菌。
分子生物学特性：扩增该菌株的16s rRNA基因并测序，得到如SEQ ID NO：1所示的DNA序列，利用该序列采用邻位相接法和最小进化法构建***发育树的结果表明，该菌与Stutzerimonas stutzeri strain SGAir0442同源性最高，且该菌在分子生物学层面上是属于Stutzerimonas stutzeri strain同一个属的同株种系，因此将本发明的磺胺类抗生素降解菌DLY-21命名为Stutzerimonas stutzeri DLY-21。
在一些优选的实施方案中，所述菌株降解的磺胺类抗生素包括磺胺甲基嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶(也可称为磺胺多辛)、磺胺喹噁啉中的至少一种。
本发明的第二方面提供了上述斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21在降解处理磺胺类抗生素方面的应用或在提高磺胺类抗生素降解去除率中的应用。
本发明首次利用斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21降解四种磺胺类抗生素，该菌株在降解畜禽粪便中的磺胺类抗生素方面具有很好的应用价值。
斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21应用于磺胺类抗生素降解的实验结果表明：在30℃，pH为7、转速为80r/min的筛选培养基(磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸铁0.01g/L、氯化钴0.01g/L)震荡培养的条件下，Stutzerimonas stutzeri DLY-21能够降解磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDM′)、磺胺喹噁啉(SQ)四种磺胺类抗生素，在初始浓度为150μg/mL-20mg/L的无机盐培养基培养28天均可正常生长。
在SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素的初始浓度在20mg/L、pH5-9的无机盐培养基培养16h，降解率均可达50％以上；在20mg/L、pH 5-9的无机盐培养基培养3天，降解率均可达到70％以上；在20mg/L、pH 5-9的无机盐培养基培养5天，降解率均可达80％以上；在20mg/L、pH 5-9的无机盐培养基培养7天，降解率均可达到90％以上；说明Stutzerimonasstutzeri DLY-21是一种降解磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDM′)、磺胺喹噁啉(SQ)四种磺胺类抗生素均很强的菌株，从而可以预见该菌对四种磺胺类抗生素均具有较好的耐受性和降解性，在磺胺类抗生素污染环境的生物修复中具有很好的应用前景。
本发明的第三方面提供了一种磺胺类抗生素降解菌剂，包含以上所述的菌株和/或所述菌株的培养物。
在本发明中，所述菌株的培养物可以为纯培养物或混合培养物，在一些实施方式中，纯培养物中全部或基本上全部由本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeriDLY-21的培养物组成。在一些实施方式中，混合培养物中包含本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21，以及其他若干种微生物，尤其是其他若干种细菌菌株。
在一些实施方式中，降解菌剂还包含可接受的载体。降解菌剂可制成液体、冷冻或干燥粉末形式；或以本行业常用的制剂形式来表述，如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。在一些优选的实施方式中，所述降解菌剂中包含固态载体。在一些更优选的实施方式中，所述固态载体包括玉米芯或秸秆。
在一些优选的实施方式中，降解菌剂为斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonasstutzeri DLY-21的菌悬液。
在一些优选的实施方式中，菌悬液是斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeriDLY-21菌株活化培养后制备而成。
在一些优选的实施方式中，所述菌悬液的制备方法包括：将斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21接种到液体培养基中，恒温振荡培养制得活化种子液；然后将种子液接种到新鲜培养基，继续扩大培养后，离心弃上清液收集菌体，无菌水重悬得菌悬液。更优选地，所述液体培养基为LB培养基。
本发明的第四方面提供了一种降解磺胺类抗生素的方法，将以上所述的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21或以上所述的降解菌剂在含有磺胺类抗生素的环境中培养或施用于含有磺胺类抗生素的环境中，从而实现降解磺胺类抗生素的目的。
在一些实施方式中，所述的含有磺胺类抗生素的环境是含有磺胺类抗生素的畜禽粪便或堆肥样品。
在一些优选的实施方式中，所述培养条件包括：金属盐浓度为0.1-0.5g/L，pH为5.0-9.0，活化种子液的接种量为1％-5％，温度为10-40℃，培养时间为24h-7D。更优选地，所述金属盐为镁盐、铁盐、锰盐、钙盐中的至少一种。
在本发明中，由斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21或以上所述的降解菌剂降解的磺胺类抗生素的浓度可以在宽的范围内选择。
在一些实施方式中，所述的磺胺类抗生素的浓度为1mg/L以上。在一些优选的实施方式中，所述的磺胺类抗生素的浓度为1mg/L-20mg/L。
在一些实施方式中，所述的磺胺类抗生素为磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDM′)、磺胺喹噁啉(SQ)。
在一些实施方式中，所述的环境中，在好氧情况下，温度10-40℃，初始pH为5-9。
在一些优选的实施方式中，所述的环境中，在好氧情况下，温度20-40℃，初始pH为5-9。
在一些更优选的实施方式中，所述的环境中，在好氧情况下，温度30-40℃，初始pH为6-8。
在一些更优选的实施方式中，一种降解磺胺类抗生素的方法，包括以下步骤：
(1)将适量的基础培养基置于容器中，加入金属盐，金属盐的浓度为0.1g/L以上，然后将pH值调节至5-9，121℃高压灭菌30分钟；其中，所述金属盐包含镁盐、铁盐、锰盐、钙盐中的至少一种，所述基础培养基中磺胺类抗生素的初始浓度为1mg/L-20mg/L；
(2)将以上所述的菌株或者菌剂接种至所述基础培养基中，以培养基的质量计，化种子液的接种量为3％以上，有效活菌数为1×108CFU/mL以上；
(3)在无菌条件下培养，温度为10℃以上，降解24h-7D。
在一些进一步优选的实施方式中，在步骤(1)中，基础培养基中包含磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁0.5g/L、氯化钙0.1g/L、硫酸铁0.01g/L、氯化钴0.01g/L。
在一些进一步优选的实施方式中，在步骤(1)中，金属盐的浓度为0.1-0.5g/L。在一些更优选的实施方式中，金属盐的浓度为0.5g/L。当金属离子MgSO4的浓度为0.5g/L，SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素最大降解率分别达到90％、94.75％、95％、95.75％。
根据本发明，在步骤(1)中，可以在较宽的范围内选择酸碱种类进行pH调节。优选地，采用H2SO4或NaOH调节pH。
根据本发明，在步骤(1)中，基础培养基中磺胺类抗生素的初始浓度为10mg/L以上，比如10mg/L-20mg/L。
根据本发明，在步骤(2)中，以基础培养基的质量计，活化种子液的接种量为1％以上，有效活菌数为1×108CFU/mL以上，例如可以为1×109CFU/mL以上，或3×109CFUm/L以上。
在一些优选的实施方式中，在步骤(2)中，以基础培养基的质量计，活化种子液的接种量为1％-5％，有效活菌数为1×108CFU/mL以上。更优选地，有效活菌数为5×108CFU/mL以上。在此范围内，活化种子液的接种量越大，磺胺类抗生素降解率越高。活化种子液的接种量为5％时，SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素最大降解率分别达到80.4％、95.25％、94％、95.52％。
根据本发明，在步骤(3)中，在无菌条件下培养，温度为10℃以上，降解24h以上。在一些优选的实施方案中，在步骤(3)中，在无菌条件下培养，温度为10℃-40℃，降解7D。
在一些进一步优选的实施方案中，降解磺胺类抗生素的方法包括以下步骤：
(1)将适量的基础培养基置于容器中，加入镁盐、铁盐、锰盐、钙盐中的至少一种，金属离子的浓度为0.1g/L-0.5g/L，然后将pH调节至5.0-9.0，再高压灭菌；其中，所述基础培养基中磺胺类抗生素的初始浓度为10mg/L-20mg/L；
(2)将所述斯氏假单胞菌菌株DLY-21或者所述的降解菌剂接种至所述基础培养基中，以基础培养基的质量计，活化种子液的接种量为1％-5％，有效活菌数为5×108CFU/mL以上；
(3)在无菌条件下培养，温度为10℃-40℃，降解7D。
根据本发明，在一些最优选的实施方式中，降解磺胺类抗生素的方法包括以下步骤：在步骤(1)中，加入金属盐MgSO4，浓度为5g/L，初始pH6.0-7.0；在步骤(2)中，活化种子液的接种量为5％；在步骤(3)中，培养温度为40℃，降解时间7D。本发明人出乎意料地发现，在40℃的高温下，其他多种微生物已经无法存活，而本发明的菌株不仅能够存活，而且对磺胺类抗生素的降解率非常高，甚至高达95％以上。
本发明的第五方面提供了以上所述的斯氏假单胞菌菌株DLY-21或以上所述的磺胺类抗生素降解菌剂或以上所述的降解磺胺类抗生素的方法在降解畜禽粪便或其堆肥中的磺胺类抗生素中的应用。
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1、斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的驯化和筛选方法
1、试验流程
(1)富集培养：称量10g用四分法处理后的试验样品于灭菌三角瓶中，加入灭菌蒸馏水振荡悬浮约5min，自然沉淀1h，取上清液1mL分别涂布于包含磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(SDM′，也可称为磺胺多辛)、磺胺喹噁啉(SQ)四种磺胺类抗生素富集培养基上，30℃培养。
(2)菌株初步筛选与分离纯化：将富集培养基上菌落颜色及大小相同的菌落进行多次分离纯化，直到显微镜观察为纯种为止。
(3)驯化：将筛选出来的细菌接种于分别含SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素的筛选培养基中，置于振荡培养器中，以浓度100μg·mL-1为起点，每100μg·mL-1为一个梯度，接种量为10％，30℃、80r/min振荡培养，每7D为一个驯化周期,逐级增加抗生素浓度，驯化4个周期。
(4)菌株复筛：取一定量的菌株驯化液接种于筛选培养基中，于30℃、80r/min振荡培养，定时取样测定磺胺类抗生素的含量，并求其降解率，从而筛选出降解能力强的高活性优势菌株。
(5)选取可降解抗生素的菌种，提取细菌总DNA，用16SrDNA通用引物(如表1所示)进行PCR扩增后，进行测序、同源性比对，确定降解菌的种属。
表1培养基配方
组分名称 浓度(g/L)
蛋白胨 10
酵母粉 5
NaCl 10
表2引物信息
检测片段 引物名称 引物序列 片段大小
细菌16S 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1500bp
1492R TACGGCTACCTTGTTACGACTT
V4-515F GTGCCAGCAGCCGCGGTAA
V4-806R GGACTACCAGGGTATCTAA
真菌18S ITS1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 400-800bp
ITS4 TCCTCCGCTTATTGATATGC
以斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的总DNA为模板，PCR扩增16SrRNA序列，PCR验证结果如图1所示，16S rRNA长度为1456bp。
(6)结果比对
测序结果进行NCBI-BLAST比对。
NCBI链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
(7)降解菌株的活化
将降解能力强的高活性优势菌株接种至LB液体培养基中，于30℃、160r/min恒温振荡器中培养12小时后制成活化种子液。
2、试验结果
在猪粪与木屑的好氧堆肥样品中，筛选到了1株磺胺类抗生素耐受菌株并进行了鉴定，为斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21。
本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的***发育树如图2所示。本发明的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21为革兰氏阴性菌，在NA培养基上呈现白色菌落，表面光滑且湿润。
实施例2菌株生长曲线的绘制
将活化种子液按3％的接种量接种到100mL基础培养基中，在30℃、150r/min条件下振荡培养，分别在0h、0.5h、1.5h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h分别取样测定菌株的OD600值。以培养时间为横坐标、OD600值为纵坐标绘制菌株的生长曲线。结果如图4所示。0-4h为延滞期，细菌对新环境进行适应，为细胞体积增大、代谢活跃、细胞增殖等储备充足的酶、能量及中间代谢产物；4-48h为对数生长期，细菌以几何级快速增殖；48-58h为稳定期，由于培养基中营养物质消耗及毒性代谢产物的积累，细菌的繁殖趋势逐渐下降；60h后为衰亡期，随着稳定期的发展细菌繁殖速率小于细胞自溶、死亡的速度。
实施例3温度对降解菌株降解磺胺类抗生素的影响
1、试验流程
取200mL基础培养基于500mL锥形瓶中，加入0.3g/L的MnSO4·7H2O，pH调节为7，121℃高压灭菌30分钟。SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素初始浓度为20mg/L，按照3％接种量加入活化种子液，无菌条件下使用橡胶塞和透气无菌封口膜封瓶口，确保培养过程中没有杂菌混入，分别置于温度为10、20、30和40℃的不同摇床中，160r/min条件下培养，降解时间为7天，每天取样测定SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素浓度。结果如图5(a)至图5(d)所示。四种磺胺类抗生素浓度总量随温度的升高而下降，在40℃时达到最低。当温度达到40℃时，SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素最大降解率分别达到81％、97.5％、96％、95.1％。
实施例4pH对降解菌株降解磺胺类抗生素的影响
取200mL基础培养基于500mL锥形瓶中，加入0.3g/L的MnSO4·7H2O，用H2SO4或NaOH调节pH分别为5、6、7、8、9，121℃高压灭菌30分钟。SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素初始浓度为20mg/L，按照3％接种量加入活化种子液，无菌条件下使用橡胶塞和透气无菌封口膜封瓶口，确保培养过程中没有杂菌混入，于30℃，160r/min条件下培养，降解时间为7天，每天取样测定SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素浓度。结果如图6(a)至图6(d)所示。酸性pH条件显著促进了磺胺类抗生素的生物降解。当pH为酸性条件时，SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素最大降解率分别达到77.75％、94.85％、95.5％、97％。
实施例5接种量对降解菌株降解磺胺类抗生素的影响
取200mL基础培养基于500mL锥形瓶中，加入0.3g/L的MnSO4·7H2O，pH调节为7，121℃高压灭菌30分钟。SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素初始浓度为20mg/L，分别按1％、2％、3％、4％、5％接种量加入活化种子液，无菌条件下使用橡胶塞和透气无菌封口膜封瓶口，确保培养过程中没有杂菌混入，于30℃，160r/min条件下培养，降解时间为7天，每天取样测定SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素浓度。结果如图7(a)至图7(d)所示。接种量越大，磺胺类抗生素降解率越高。当活化种子液的接种量为5％时，SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素最大降解率分别达到80.4％、95.25％、94％、95.52％。
实施例6不同金属盐对降解菌株降解磺胺类抗生素的影响
取200mL基础培养基于500mL锥形瓶中，分别加入0.3g/L的MgSO4·7H2O、FeSO4、MnSO4·H2O、CaSO4，pH调节为7，121℃高压灭菌30分钟。SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素初始浓度为20mg/L，按照3％接种量加入活化种子液，无菌条件下使用橡胶塞和透气无菌封口膜封瓶口，确保培养过程中没有杂菌混入，于30℃，160r/min条件下培养，降解时间为48H，每天取样测定SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素浓度。结果如图8(a)至图8(d)所示，对降解效果促进作用最为显著的是金属盐FeSO4。加入FeSO4的培养基，SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素最大降解率分别达到78.5％、92.5％、95.5％、96％。
实施例7金属盐FeSO4浓度降解菌株降解磺胺类抗生素的影响
取200mL基础培养基于500mL锥形瓶中，分别加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的FeSO4盐，pH调节为7，121℃高压灭菌30分钟。SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素初始浓度为20mg/L，按照3％接种量加入活化种子液，无菌条件下使用橡胶塞和透气无菌封口膜封瓶口，确保培养过程中没有杂菌混入，于30℃，160r/min条件下培养，降解时间为48H，每天取样测定SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素浓度。结果如图9(a)至图9(d)所示，当金属离子FeSO4的浓度为5g/L，降解效果最佳。SM1、SCP、SDM′、SQ四种磺胺类抗生素最大降解率分别达到95.4％、96.75％、98.7％、97.75％。
在本发明中，斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21能在培养环境下有效降解20mg/L的磺胺甲基嘧啶(即SM1)、磺胺氯哒嗪(即SCP)、磺胺邻二甲氧嘧啶(即SDM′)、磺胺喹噁啉(即SQ)四种磺胺类抗生素，降解率可达95％以上。
最后说明的是，以上的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并不构成对本发明内容的限制。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种降解磺胺类抗生素的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21，所述斯氏假单胞菌菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63596。
2.权利要求1所述的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21在降解处理磺胺类抗生素方面的应用或在提高磺胺类抗生素降解去除率中的应用。
3.一种磺胺类抗生素降解菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的菌株和/或权利要求1所述菌株的培养物。
4.根据权利要求3所述降解菌剂，其特征在于，所述降解菌剂为斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21的菌悬液。
5.根据权利要求4所述降解菌剂，其特征在于，所述菌悬液是斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21菌株活化培养后制备而成。
6.根据权利要求5所述降解菌剂，其特征在于，所述菌悬液的制备方法包括：将斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21接种于液体培养基中，恒温振荡培养制得活化种子液；然后将所述活化种子液接种到新鲜培养基，继续扩大培养后，离心弃上清液收集菌体，无菌水重悬得菌悬液。
7.一种降解磺胺类抗生素的方法，其特征在于，将权利要求1所述的斯氏假单胞菌菌株Stutzerimonas stutzeri DLY-21或权利要求3-6中任一项所述的菌剂在含有磺胺类抗生素的环境中培养。
8.权利要求1所述的菌株或权利要求3-6中任一项所述的菌剂或权利要求7所述的方法在降解畜禽粪便或其堆肥中的磺胺类抗生素中的应用。
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