CN102533589A

CN102533589A - 一株铜绿假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN102533589A
Application number: CN2011104077225A
Authority: CN
Inventors: 徐正顺; 牛彦良; 王凤兰; 伍晓林; 侯兆伟; 郭盟华; 金锐
Original assignee: Daqing Oilfield Co Ltd
Current assignee: Daqing Oilfield Co Ltd
Priority date: 2010-12-09
Filing date: 2011-12-09
Publication date: 2012-07-04

Abstract

本发明公开了一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M208114及其在石油污染物降解中的应用。本发明的菌株具有以下特性：1)具有高效的石油烃降解能力；2)该菌株在无机盐培养基中在正十四烷存在的条件下可以共代谢芴；3)该菌株的休止细胞体系具有很好的多环芳烃降解能力，并且可以耐受高的多环芳烃浓度；4)该菌株具有广泛的底物谱；5)该菌株在LB培养基或无机盐培养基(直链烷烃或多环芳烃作为唯一碳源和能源)中生长可以产生生物表面活性剂。该菌株可广泛应用于石油化合物污染的生物修复领域，适合大面积推广和应用。

Description

一株铜绿假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)DQ8 CCTCC M 208114及其在石油污染物降解中的应用。

背景技术

随着全球对能源需求的急剧增加，海上油轮泄露事故频频发生，油井与炼油厂等也同时排放了大量的含油废水，这些都造成了巨大的环境污染。对原油污染的不重视，便会危害环境，长期影响人类生存环境。如何处理这些原油污染己经成为许多国家所面临的重大课题。

据国家权威部门推算，我国每年有60多万吨石油进入环境，对土壤和海洋造成了严重的污染。以大庆油田为例，其开采场所周围土壤中石油总烃已超过土壤背景值60倍以上。我国大庆、辽河等油田污染区土壤表层(0-20cm)的含油量高达30-50％。对我国北方油田石油污染状况的调研表明，大庆油田和华北油田采油井周边土壤石油污染严重，含油量在4.8×10⁴-7.7×10⁴mg·kg^-1。大庆油田石油开发区污染土壤面积超过75％，农业开发区污染面积超过20％。我国每年排入大海的石油达11.5万吨，并且呈增长趋势。目前，我国近海海域石油平均浓度已达0.055mg/L。石油是各种烷烃、环烷烃和芳香族化合物所组成的混合物，其中还含有杂环化合物；其中的多环芳香族化合物(PAHs)和一些杂环类物质(如咔唑类、噻吩类、呋喃类等)具有持久性和致癌性，是公认的环境毒物。

目前，主要依靠机械刮油和化学吸附等物理、化学方法进行石油类污染的治理。但是物理、化学方法成本高、投资大，并且存在二次污染，因此，这不是解决石油污染的最优方法。而原油中的碳氢化合物能被自然界中的微生物降解，因此，生物修复是比较理想的治理原油污染的方法。但是一旦出现了原油泄露，被污染地区要在短时间内恢复正常需依赖于原油的快速降解微生物，这样的微生物不仅需要具有降解原油的能力，同时还要具备分泌生物表面活性剂以促进原油在水中的分散度才能使微生物摄取难溶性底物。可见，生物表面活性剂的存在是原油被降解的关键步骤。而原油污染地区的本土原油降解菌种类少，对原油的降解能力都比较弱，且很少分泌生物表面活性剂，因此，需要加入对原油降解效果较佳的外源微生物。

国际上对常见的几种有毒化合物进行了大量的研究，并且分离得到了许多可以降解多环芳烃类化合物的菌株(表1)，但是多数菌株降解底物谱相对较少，在实际应用中受到很大的限制，所以开发具有广泛底物谱的菌株具有重要的创新性和应用价值。

表1部分报道的多环芳烃降解菌株

石油烃降解菌(hydr ocarbon degradat ionbacter ia，HDB)能将石油烃作为唯一碳源进行生物降解，并产生气体、脂肪酸及生物表面活性剂等代谢产物。对石油污染环境的生物修复有重要作用，在微生物采油研究领域的应用日趋广泛。它能清除石油中的部分石蜡组分，代谢产物主要是有机酸、糖脂类、脂肽类表面活性剂，可进一步改善原油的流动性，降低油水之间的界面张力，有利于提高石油采收率。因此对新型微生物菌种的筛选及性能评价有重要的实用价值，开发具有多功能的石油烃降解菌已成为微生物采油研究的一项重要核心技术。

发明内容

本发明针对石油化合物造成的严重污染，提供了一株可降解石油污染物如多环芳烃等的铜绿假单胞菌。

本发明所提供的铜绿假单胞菌菌株(Pseudomonas aeruginosa)DQ8已于2008年08月04日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学)，保藏编号为CCTCC M 208114。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114菌落特征及细胞形态：该菌株在LB平板上生长2天形成直径约2～3mm的菌落，菌落圆形，凸起，表面湿润，边缘整齐，半透明。单细胞，呈短杆状，革兰氏阴性。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114生理生化特征：呼吸代谢，产荧光、脓青素，不产生H₂S、吲哚、甲基红；具有硝酸盐还原性和反硝化能力，不能水解淀粉，具有液化明胶能力，精氨酸双水解酶和接触酶阳性，不产芽胞，能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-果糖、乳糖、D-半乳糖、甘露醇、L-***糖、丙三醇、L-脯氨酸、β-苯丙氨酸、DL-精氨酸，不能利用海藻糖、肌醇。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114的16S rDNA基因序列长度为1580个碱基，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。

含有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114的菌剂也属于本发明的保护范围。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114及其休止细胞体系在降解石油污染物中的应用。

所述石油污染物包括：碳原子数12～25的直链烷烃，菲、荧蒽、芘等多环芳烃，噻吩、苯并噻吩类含硫杂环化合物，联苯呋喃、联苯醚类含氧杂环化合物，咔唑类含氮杂环化合物，氯代酚以及溴代联苯醚类卤代芳香烃。

具体来讲，所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114对石油污染物的降解方法为：①配制体积百分浓度5％的菌株种子液，②采用投菌法，直接向遭受污染环境接入菌株，同时提供这些微生物生长所需要的营养，包括常量的营养元素和微量的营养元素。常量营养元素包括氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁、锰等。

所述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114休止细胞体系对石油污染物的降解方法为：①用磷酸缓冲液调节细胞浓度为OD_600nm＝5，作为休止细胞体系；②采用投菌法，直接向遭受污染环境接入休止细胞体系，同时提供其生长所需要的营养，包括常量的营养元素和微量的营养元素。常量营养元素包括氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁、锰等。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114产生的生物表面活性剂及其在降低水溶液表面张力、油脂类化合物乳化中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明提供了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114。实验证明，本发明的菌株具有以下特性：

1)具有高效的石油烃降解能力：该菌株在无机盐培养基中生长可以降解碳原子数12～25的直链烷烃、芳烃，以及菲、荧蒽、芘等多环芳烃，并可以利用烷烃菲、荧蒽、芘等多环芳烃作为唯一碳源和能源生长。该菌株在含有2％(w/v)柴油的无机盐培养基中培养7天，总油量降低83％，并且柴油中各种组分都有明显降解。以菲、荧蒽、芘作为唯一碳源生长几乎可以完全降解40mg/L的菲，对四环PAHs(40mg/L)降解率约达40％。

2)该菌株在无机盐培养基中在正十四烷存在的条件下可以共代谢芴。共代谢结果表明该菌株对正十四烷和芴都有降解能力，生长第二天对芴的降解迅速，降解率达到60％以上，第二天以后降解缓慢，7天降解率达到95.6％。因为在实际应用中，原油作为一个复杂的体系存在，化合物种类多，而这种共代谢能力相对单一的利用某种化合物而言具有更大的实际应用前景。

3)该菌株的休止细胞体系具有很好的多环芳烃降解能力，并且可以耐受高的多环芳烃浓度，休止细胞反应24h内几乎可以完全降解40mg/L的芴和菲，并且在250mg/L的高浓度下仍保持一定的降解能力(芴和菲浓度降低约50mg/L)。

4)该菌株具有广泛的底物谱，还可降解噻吩、苯并噻吩类硫杂环化合物，联苯呋喃、联苯醚类含氧杂环化合物，咔唑类含氮杂环化合物，氯代酚以及溴代联苯醚类卤代芳香烃等有毒污染物：其中，对噻吩、苯并噻吩及其甲基化衍生物、联苯呋喃降解率达到90％以上，甚至有些化合物接近完全降解。对联苯醚、氯代酚以及溴代联苯醚亦有50％以上的降解(图5)。

5)该菌株在LB培养基或无机盐培养基(直链烷烃或多环芳烃作为唯一碳源和能源)中生长可以产生生物表面活性剂，培养液表面张力降低到32mN/m²。该生物表面活性剂对柴油具有高效的乳化能力，提取的生物表面活性剂稀释100倍与等体积柴油混合，激烈振荡5分钟即可完全乳化柴油，并且乳化状态可以持续三天以上。

上述实验结果表明该菌株可广泛应用于石油化合物污染的生物修复领域，适合大面积推广和应用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114降解柴油气相色谱图谱

图2A为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114以多环芳烃菲作为唯一碳源和能源生长的降解曲线

图2B为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114以多环芳烃荧蒽、芘作为唯一碳源和能源生长的降解曲线

图3为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114共代谢正十四烷和芴降解曲线

图4A为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114休止细胞体系对不同浓度芴的降解情况

图4B为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114休止细胞体系对不同浓度菲的降解情况

图5为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114休止细胞体系降解噻吩、苯并噻吩及其甲基化衍生物、联苯呋喃、联苯醚以及溴代联苯醚等环境有毒物的降解情况

图6为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114产生的生物表面活性剂对柴油的乳化情况

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114菌株的筛选及保藏

液体基本无机盐培养基配方为：KH₂PO₄ 0.5克/升，K₂HPO₄ 4克/升，NH₄Cl 1克/升，质量百分比为1％的CaCl₂ 2毫升/升，质量百分比为10％的MgCl₂·6H₂O 2毫升/升，质量百分比为1％的FeCl₃ 200微升/升，维生素混合液200毫升/升的，离子混合液5毫升/升。121℃条件下灭菌20分钟。

上述离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有：ZnCl₂ 0.5g；FeCl₂ 0.5g；MnCl₂·4H₂O0.5g；Na₂MoO₄·2H₂O 0.1g；CuCl₂·2H₂O 0.05g；Na₂WO₄·2H₂O 0.05g；HCl 120mmol/L。

上述维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有：400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。

LB培养基配方为，1升蒸馏水中含：10克蛋白胨，5克酵母粉，10克NaCl，固体LB培养基在上述配方的基础上再加入质量/体积比为1.6％的琼脂粉，121℃条件下灭菌20分钟。

取油田附近或者炼油厂附近被污染过的各种土壤，各称取5克，将土壤加入到50mL含有质量/体积比为1％的原油的液体无机盐基本培养基中，30℃、180转/分钟条件下振荡培养7天，然后以10％体积比的接种量接种新的含有质量/体积比为1％的原油的液体无机盐基本培养基中，30℃、180转/分钟条件下振荡培养7天，再继续转接，重复这一过程3～5次。将培养的菌液稀释1,000,000倍涂布含有质量/体积比为1.6％的琼脂LB固体培养基上，30℃条件下静止培养72小时。选取长出的单菌落继续接种于50mL含有质量体积比为1％的原有的液体无机盐基本培养基中，30℃、180转/分钟条件下振荡培养7天，筛选能够利用原油作为唯一碳源和能源生长的菌株，最终获得一株降解能力较好的菌株，即铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。表明该菌株具有非常高的稳定性，连续培养后降解原油的能力没有降低。

该菌株命名为DQ8，已于2008年8月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M208114。

实施例2、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114菌株16S rDNA基因的提取及测序

培养5mL的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114细菌培养物至饱和状态，取1.5mL培养物，6000转/分钟离心2分钟；向沉淀物加入565μlTE缓冲液(TE缓冲液配方：10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0)，用吸管反复吹打使之重悬，加入30μl质量/体积比为10％的十二烷基磺酸钠(SDS)和5μl 20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1小时；加入100μl 5mol/L NaCl，充分混匀，再加入μl的CTAB/NaCl溶液(CTAB/NaCl溶液配方：将质量/体积比为10％的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中)，混匀，于65℃温育10分钟；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，将上清液转入一个新管中；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12000转/分钟离心5分钟，将上清转入一支新管中；加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来，用一个封口的离心管将沉淀转移至1mL的70％乙醇中洗涤；12000转/分钟离心5分钟，弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于50μl的TE缓冲液。以提取的基因组DNA为模板，利用购自上海博亚生物技术有限公司的真细菌引物27f和1492r，进行PCR扩增，在50μl反应体系依次混匀下列试剂：35μl H₂O，5μl 10倍浓度的PCR反应缓冲液(PCR反应缓冲液配方：500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)、100mmol/L的用盐酸调整pH为8.8的Tris缓冲液、1mg/mL的牛血清白蛋白、15mmol/L的MgCl₂)，4μl 25mmol/L MgCl₂，1μl 4种dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl模板DNA即上述铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114的基因组DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。加入50μl矿物油再离心5秒钟。将混合物进行PCR扩增，反应条件为：先94℃加热5分钟；然后94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，总共30个循环；最后于72℃下保温10分钟，使反应混合物扩增充分，得到铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114的16S rDNA的PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行测序，测序结果：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114菌株16S rDNA基因序列长度为1516bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。参照《Bergey’s Mannual of SystematicBacteriology》Vol.VIII内容，根据其生理生化特征和16S rDNA基因序列，通过NCBIBLASTn程序比对，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114与Pseudomonas aeruginosa MML2212(EU344794)16S rDNA基因序列同源性为99％。鉴定该菌株确实为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。

实施例3、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114生长体系对柴油的降解

(1)菌种选择：选用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114；

(2)斜面培养：将菌种接种于含有质量/体积比为1.6％的琼脂的LB固体培养基中，30℃条件下静止培养24小时；

(3)种子培养：将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于5mL LB液体培养基((配方见实施例1)中，30℃条件下振荡培养12小时，将培养物用无菌的0.85％生理盐水洗涤三次，制得种子液；

(4)将步骤(3)中制得得种子液按照5％接种量接种10mL含有20g/L柴油的无机盐培养基(配方见实施例1)中，30℃条件下振荡培养7天，以不接菌的培养基作为对照；

(5)将步骤(4)中培养物用6N的HCl调节pH小于2，加入等体积乙酸乙酯萃取，取有机相氮吹浓缩至1mL，进行气相色谱检测，测定柴油降解率。

经过测定，柴油总降解率达到83％，并且柴油中各组分都明显降低，碳原子数12～25的烷烃都明显降低(图1，其中“空白”为未接种培养液中柴油气相色谱图谱；“降解”为接种培养液中柴油气相色谱图谱。)。

实施例4、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114生长体系对菲、荧蒽、芘的降解。

(2)斜面培养：与实施例3相同；

(3)种子培养：与实施例3相同；

(4)将步骤(3)中制得得种子液按照5％接种量接种10mL分别含有40mg/L菲、荧蒽或芘的无机盐培养基中，30℃条件下振荡培养7～12天，以不接菌的培养基作为对照；

(5)不同时间将步骤(4)中培养物用6N的HCl调节pH小于2，加入等体积乙酸乙酯萃取，取有机相氮吹浓缩至1mL，进行气相色谱检测，测定各种多环芳烃降解率。

该菌株经过7天的反应几乎可以完全降解40mg/L的菲，降解后残留菲浓度仅为2.49mg/L。并且四环的多环芳烃也具有较好的降解能力，经过12天的降解，荧蒽和芘降解率约为40％(图2A：菲降解曲线；图2B：荧蒽、芘降解曲线)

实施例5、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114共代谢正十四烷和芴

(2)斜面培养：与实施例3相同；

(3)种子培养：与实施例3相同；

(4)将步骤(3)中制得得种子液按照5％接种量分别接种于10mL含有100mg/L芴与1％正十四烷(v/v)，1％正十四烷(v/v)为碳源的无机盐培养基中，30℃条件下振荡培养7天，以不接菌的培养基(含相同量的正十四烷和芴)作为对照；

(5)将步骤(4)中培养物用6N的HCl调节pH小于2，加入等体积乙酸乙酯萃取，取有机相氮吹浓缩至1mL，进行气相色谱检测，测定各种芴和正十四烷的降解率。

结果参见图3，显示：该菌株可以以正十四烷为唯一碳源生长，并具有很好的降解效率，生长12h后开始降解正十四烷，以大约22mg/L·d的速度降解，到第四天降解率达到95.5％(参见图3中的正十四烷降解)。共代谢结果(参见图3中共代谢正十四烷和共代谢芴)表明该菌株对正十四烷和芴都有降解能力，生长第二天对芴的降解迅速，降解率达到60％以上，第二天以后降解缓慢，7天降解率达到95.6％，这种共代谢作用在促进原油的降解以及高效彻底清除原油中难降解化合物中具有更实际应用前景。

实施例6：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114休止细胞体系对不同浓度芴、菲的降解

(2)斜面培养：与实施例3相同；

(3)种子培养：与实施例3相同；

(4)休止细胞体系制备：将步骤(3)中种子液按照1％接种量接种1LLB液体培养基中，30℃条件下振荡培养12小时，4500rpm离心10分钟收集菌体，并使用100mM pH 7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀细胞，并重悬于此磷酸缓冲液中，调节细胞浓度为OD_600nm＝5，作为休止细胞体系；

(5)在10mL休止细胞体系中分别加入40、100、150、200、250mg/L芴或菲30℃振荡反应24h，以不接菌缓冲液和灭活菌体(115℃湿热灭菌5min)作为对照；

(6)反应结束加入6N HCl调节pH小于2，用等体积乙酸乙酯萃取，取有机相氮吹浓缩至1mL，进行气相色谱检测芴和菲的含量。

经过24h降解反应，菌株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114可以完全降解40mg/L的芴和菲，并且100mg/L浓度下仍可以降解70％以上的芴和菲，即使在250mg/L的高浓度下，芴和菲的浓度仍被降低了约50mg/L(图4A：不同浓度芴降解情况；图4B：不同浓度菲降解情况)。在对照组中，不接菌缓冲液的芴和菲浓度不变，而在不同的初始浓度下，灭活菌体作用后芴和菲的浓度被降低了约10mg/L，效果均不明显。

实施例7、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114休止细胞体系对噻吩、苯并噻吩及其甲基化衍生物、联苯呋喃、联苯醚以及溴代联苯醚等环境有毒物的降解

(2)斜面培养：与实施例3相同；

(3)种子培养：与实施例3相同；

(4)休止细胞体系制备：与实施例6相同；

(5)在10mL休止细胞体系中分别加入1mM的噻吩、苯并噻吩及其甲基化衍生物、咔唑、联苯呋喃类化合物，50mg/L的联苯醚、氯代酚、溴代联苯醚类化合物，30℃振荡反应5天；

(6)反应结束加入6N HCl调节pH小于2，用等体积乙酸乙酯萃取，取有机相氮吹浓缩至1mL，进行气相色谱检测各种化合物的含量。

GC检测结果发现菌株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114具有广泛的底物谱，参见图5所示，显示了噻吩(BT)、2-巯基苯并噻唑(MBT)、二苯并噻吩(DBT)、甲基二苯并噻吩(MDBT)、咔唑(BP)、二苯并呋喃(DBF)、联苯(CAR)、二氨基二苯甲烷(DD)、联苯醚(DE)、氯代酚(246-5C1-P)、溴代联苯醚(Br-DE)的降解率，其中对噻吩、苯并噻吩及其甲基化衍生物、联苯呋喃降解率达到90％以上，甚至有些化合物如巯基苯并噻唑接近完全降解。咔唑、联苯降解率在70％以上；氯代酚以及溴代联苯醚亦有50％以上的降解。

实施例8、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114产生生物表面活性剂提取、鉴定及C乳化能力测定

(2)斜面培养：与实施例3相同；

(3)种子培养：与实施例3相同；

(4)扩大培养：将步骤(3)中种子液按照1％接种量接种1L体积LB液体培养基中，30℃条件下振荡培养12小时；

(5)表面活性剂制备：将步骤(4)中培养物4500rpm离心15min去除菌体，收集培养液；用HCl调节培养液pH小于2，4℃避光沉淀过夜；12000rpm离心10min收集沉淀，并用pH小于2的水(HCl调节)洗涤三遍；将沉淀用pH约10的水(NaOH调节)洗涤沉淀三次，收集上清；将上清浓缩冷冻干燥；冻干粉用四氢呋喃振荡洗涤三次，合并四氢呋喃，减压蒸馏至完全除去四氢呋喃；蒸干后用甲醇重溶，然后氮气吹至恒重，即为粗制表面活性剂。

(6)生物表面活性剂成分鉴定：将上述粗制表面活性剂用毛细管点样于硅胶薄板；喷洒苯酚-硫酸试剂(3g苯酚和5mL浓硫酸溶解于95mL乙醇中)和茚三酮试剂(0.5％茚三酮的丙酮溶液)；降薄板置于105℃下显色5min；

上述提取物呈无色透明粘稠状，经过显色鉴定，茚三酮试剂检测没有颜色反应，说明此表面活性剂不含氨基酸成份；苯酚-硫酸试剂显色呈棕红色，说明此表面活性剂为糖脂类表面活性剂。

(7)生物表面活性剂对柴油的乳化：取蒸馏水、初始培养液、稀释100倍的生物表面活性剂粗提物分别与等体积柴油混合，剧烈振荡5分钟，静置观察柴油的乳化情况，以蒸馏水作为对照。

该生物表面活性剂对柴油具有很好的乳化能力，并且可以稳定乳化状态三天以上(参见图6，1：提取的生物表面活性剂对柴油的乳化；2：初始培养液对柴油的乳化；3为蒸馏水对照)；而初始培养液作用柴油，能保持20min的乳化状态，水对柴油没有乳化效果。

实施例9、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114的应用

使用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114对石油污染物进行降解。方法为①配制体积百分浓度5％的菌株种子液，②采用投菌法，直接向遭受污染环境接入菌株，同时提供这些微生物生长所需要的营养，包括常量的营养元素和微量的营养元素。常量营养元素包括氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁、锰等。

使用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114休止细胞体系对石油污染物进行降解。方法为：①用磷酸缓冲液调节细胞浓度为OD_600nm＝5，作为休止细胞体系；②采用投菌法，直接向遭受污染环境接入休止细胞体系，同时提供其生长所需要的营养，包括常量的营养元素和微量的营养元素。常量营养元素包括氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁、锰等。

Claims

1.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114。

2.含有铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114的菌剂。

3.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114及其休止细胞体系在降解石油污染物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述石油污染物包括：碳原子数12～25的直链烷烃，菲、荧蒽、芘等多环芳烃，噻吩、苯并噻吩类硫杂环化合物，联苯呋喃、联苯醚类含氧杂环化合物，咔唑类含氮杂环化合物，氯代酚以及溴代联苯醚类卤代芳香烃。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CCTCC M 208114对石油污染物的降解方法为：

①配制体积百分浓度5％的菌株种子液；

②采用投菌法，直接向遭受污染环境接入菌株，同时提供这些微生物生长所需要的营养，包括常量的营养元素和微量的营养元素。常量营养元素包括氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁、锰等。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)CCTCC M 208114休止细胞体系对石油污染物的降解方法为：

①用磷酸缓冲液调节细胞浓度为OD_600nm＝5，作为休止细胞体系；

②采用投菌法，直接向遭受污染环境接入休止细胞体系，同时提供其生长所需要的营养，包括常量的营养元素和微量的营养元素。常量营养元素包括氮、磷、硫、钾、钙、镁、铁、锰等。

7.铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CCTCC M 208114产生的生物表面活性剂。

8.权利要求7所述的生物表明活性剂在降低水溶液表面张力、油脂类化合物乳化中的应用。