CN111808770B - 一株降解原油的空气芽孢杆菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株降解原油的空气芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。所述菌株为空气芽孢杆菌（Bacillus aerius）NUST‑1，已于2019年12月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.19124。本发明所述的空气芽孢杆菌NUST‑01具有高效的原油降解能力，可用于原油污染土壤的生物修复，且具有高效、无污染、不易产生抗药性等特征。

Description

一株降解原油的空气芽孢杆菌及应用
技术领域
本发明属于微生物及生物技术领域，具体涉及一株可以降解原油的空气芽孢杆菌及其应用。
背景技术
随着社会经济的不断发展，人们对原油资源的依赖也越来越大，在原油开采、储运和加工过程中会产生大量的含油污染物，这些污染物大多含有长链烷烃、芳香烃等有毒的原油组分，对人体健康和生态环境造成严重危害，因此无法直接排放，需进行妥善处理。
如今，针对原油污染物的处理方法主要分为3类：物理法、化学法和生物法。常规使用的物理法主要通过气浮、絮凝、膜分离、吸附等方法将原油组分从水中去除，但存在效率低、成本高、无法满足实际生产需要等问题。而借助焚烧、溶剂萃取的手段的化学法，虽然可以较为高效地去除这些原油污染物，但焚烧过程中会产生大量有毒有害气体，造成严重的二次污染；溶剂萃取过程中存在操作危险、大量使用有毒有害有机溶剂等问题，也会带来严重的二次污染。生物降解法利用微生物对原油组分进行降解，最终以CO2的形式排放，具有绿色环保、无毒无害、环境友好等特点，是处理原油污染土壤最具应用前景的技术。但限于高效降解菌株的缺乏，目前生物降解处理还存在效率低、普适性差、周期长等问题，尚无法应对日益严峻的原油污染物处理难题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株用于降解原油的空气芽孢杆菌，该菌株可应用于含油土壤的生物修复，以弥补现有技术的不足，具有良好的市场前景。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
本发明所提供的空气芽孢杆菌，为Bacillus aerius NUST-1，保藏编号为CGMCCNo. 19124，已于2019年12月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的目的之二在于提供上述空气芽孢杆菌NUST-1在含油土壤生物修复中的应用，具体步骤如下：
（1）将空气芽孢杆菌NUST-1接种到灭菌后的种子培养基中，30~40℃摇床震荡培养形成种子培养液，按1％-10％接种量将种子培养液接种到灭菌后的发酵培养基中；
（2）取被原油污染的土壤即含油土壤，加入步骤（1）所述的培养基，将混合后的油泥水溶液，置于37℃摇床中进行培养5天以上。
更佳的，种子培养基为LB培养基。
更佳的，发酵培养基组成为：NaNO3 2~8 g/L，MgSO4 0.1~0.3 g/L，NaCl 0.5~2 g/L，KCl 0.5~2 g/L，CaCl2 0.02~0.08g/L，H3PO4 3~6ml/L，pH=6.0~8.0。
更佳的，含油土壤与步骤（1）所述的培养基的比例为1：0.5~3 g/ml，含油土壤中原油含量为0.5~5wt%。
与现有技术相比，本发明的优点是：对原油的降解效率高，耐受原油的能力强。
具体实施方式
本发明所述的空气芽孢杆菌NUST-1是从被原油污染的土壤中分离获得的，该菌株于30oC在LB固体培养基上平板上生长，菌落为淡黄色，菌落表面湿润。对筛选分离后得到的纯种菌株进行了16sRNA测序，该菌株的16sRNA基因序列见序列表。经过与Genbank的对比确定是属于空气芽孢杆菌（Bacillus aerius）的新型菌株，命名为空气芽孢杆菌Bacillus aerius。
实施例1: 新型空气芽孢杆菌NUST-1分离筛选及鉴定：
1、菌株富集
将2g取自被原油污染的土壤放入含60 mL无菌蒸馏水的摇瓶中，至于30oC恒温摇床上培养15分钟，取2mL上清液放入60mL LB液体培养基进行富集培养12小时，获得可以在原油土壤中生存的菌株。LB液体培养基（g/L）的组成为：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，pH=7.0。
2、可降解原油菌株的筛选
1）以原油作为唯一碳源对菌株进行筛选：
以石油（又可称作“原油”）为唯一碳源进行菌株的筛选。取2 mL的菌株富集液，加入到60 mL含1%的石油的液体培养基中，然后在37oC恒温摇床进行培养，该液体培养基的组成为：NaNO3 4 g/L，MgSO4 0.2 g/L，NaCl 1 g/L，KCl 1 g/L，CaCl2 0.04 g/L，H3PO4 5 ml/L，石油1%，pH=7.0。
培养48小时后，将培养液进行梯度稀释，并涂于筛选培养基中，在37oC的培养箱中培养24小时，得到50个单菌落，筛选培养基为LB固体培养基（g/L）的组成为：蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，琼脂粉15，pH=7.0。挑选生长旺盛的单菌落，在相同的培养条件下反复进行筛选培养，由此可以获得纯种菌株，命名为空气芽孢杆菌Bacillus aerius。
2）以原油作为唯一碳源对菌株进行检测：
将上述获得的纯种菌株在60 mL LB液体培养基中进行富集培养后，取2mL扩大培养后的液体放入60mL以1%原油为唯一碳源的液体培养基中，在37oC恒温摇床进行培养，培养基的组成为：NaNO3 4 g/L，MgSO4 0.2 g/L，NaCl 1 g/L，KCl 1 g/L，CaCl2 0.04 g/L，H3PO4 5 ml/L原油1%，pH=7.0；
培养48小时后，对培养基内液体进行表面张力测定与接菌前的培养基内液体的表面张力进行比较，发现接菌后的培养基液体表面张力降低，说明该菌有可能产生生物表面活性剂，对接菌后的培养基测定原油含量，发现培养基内原油含量有所降低，因此该菌有降解原油的能力。
3、菌株的分类学鉴定
采用分子生物学的方法对筛选得到的高产酶菌株进行鉴定，测得其16S rRNA序列，在GenBank核酸数据库中进行比对，通过序列比对确认为空气芽孢杆菌,命名为空气芽孢杆菌Bacillus aerius，并于2019年12月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 19124。
实施例2：空气芽孢杆菌NUST-1降解原油能力的测定
将分离的空气芽孢杆菌NUST-1接种至不同原油（0.5、1、2、3、5 g/L）含量的培养基 中，置于37度摇床中培养5天，然后分析培养基中残留的原油含量，并计算原油的降解率。培 养基的组成为：NaNO3 4 g/L，MgSO4 0.2 g/L，NaCl 1 g/L，KCl 1 g/L，CaCl2 0.04 g/L， H3PO4 5 ml/L，原油0.5-5 g/L，pH=7.0.
初始原油含量 [g/L] 原油降解率（%）
0.5 78.2
1 70.2
2 67.4
3 60.2
5 55.8
实施例3：空气芽孢杆菌NUST-1处理含油土壤
将空气芽孢杆菌NUST-1接种到灭菌后的LB种子培养基中，37℃摇床（200rpm）震荡培养形成种子培养液，按3％接种量将种子培养液接种到灭菌后的发酵培养基（NaNO3 4 g/L，MgSO4 0.2 g/L，NaCl 1 g/L，KCl 1 g/L，CaCl2 0.04g/L，H3PO4 5 ml/L，pH=7.0）中；
取被原油污染的土壤（以下简称油泥）10 g，加入20 ml的培养基。其中油泥中的原油含量为0.85%（wt），将混合后的油泥水溶液，置于37℃摇床（220rpm）中进行培养，5天后分析油泥中残留的油含量。结果表明：油泥中残留量为0.15%，降解率为82.3%。
以上所述，仅为本发明专利的较佳示例而已，并非用于限定本发明专利的保护范围。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变化形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
序列表
<110> 南京理工大学
<120> 一株降解原油的空气芽孢杆菌及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 819
<212> DNA
<213> 空气芽孢杆菌(Bacillus aerius)
<400> 1
atacatgcag tcgagcggac agaagggagc ttgctcccgg atgttagcgg cggacgggtg 60
agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggagctaata 120
ccggatagtt ccttgaaccg catggttcaa ggatgaaaga cggtttcggc tgtcacttac 180
agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc 240
gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300
gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt 360
gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgcaagagt 420
aactgcttgc accttgacgg tacctaacca gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc 480
cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc cggaattatt gggcgtaaag ggctcgcagg 540
cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg 600
ggaaacttga gtgcagaaga ggagagtgga attccacgtg tagcggtgaa aatgcgtaga 660
gatgtggagg aacaccagtg gcgaaggcga ctctctggtc tgtaactgac gctgaggagc 720
gaaagcgtgg ggagcgaaca ggattagata ccctgctact ccacgccgta aaacgaatga 780
gtgctaagtg ttagggggtt tccgcccctt aatgctgca 819

Claims (8)

1.一种空气芽孢杆菌（Bacillus aerius）NUST-1，保藏编号为CGMCC No. 19124。
2.如权利要求1所述的空气芽孢杆菌在降解原油中的应用。
3.如权利要求1所述的空气芽孢杆菌在含油土壤生物修复中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，含油土壤是指被原油污染的土壤。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将空气芽孢杆菌NUST-1接种到灭菌后的种子培养基中，30~40℃摇床震荡培养形成种子培养液，按1％-10％接种量将种子培养液接种到灭菌后的发酵培养基中；
（2）取含油土壤，加入步骤（1）所述的培养基，将混合后的油泥水溶液，置于37℃摇床中进行培养5天以上。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，种子培养基为LB培养基。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成为：NaNO3 2~8 g/L，MgSO40.1~0.3 g/L，NaCl 0.5~2 g/L，KCl 0.5~2 g/L，CaCl2 0.02~0.08g/L，H3PO4 3~6ml/L，pH=6.0~8.0。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，含油土壤与步骤（1）所述的培养基的比例为1：0.5~3 g/ml，含油土壤中原油含量为0.5~5wt%。
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