CN110004085B - 分离自喷漆废水底泥的短单胞杆菌lm-r及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株分离自喷漆房废气淋洗废水底泥的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM‑R及其在含甲苯或二甲苯废水处理中的应用。具体而言，本发明公开了一种分离自喷漆废水底泥的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM‑R，为短单胞杆菌Brachymonas sp.，保藏编号：CGMCC No.17167，该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示，其能用于处理含甲苯和/或二甲苯的废水。
Description
技术领域
本发明涉及一株分离自喷漆房废气淋洗废水底泥的短单胞杆菌(Brachymonassp.)LM-R及其在含甲苯或二甲苯废水处理中的应用。
背景技术
机械设备等制造加工与维修过程中，常常进行烤漆和喷漆作业，而进行烤漆喷漆作业过程会产生大量的强烈刺激性气味的有机气体，这些气体中含有大量的甲苯、二甲苯等苯系物，喷涂废气中的这些物质具有很强的生物毒性、刺激性和致癌性。其毒性和致癌性主要以甲苯、二甲苯等苯系物为主，这些废气排入环境中，将会对长期暴露于这些气体中的人群产生严重危害，当从业人员长期接触有机溶剂时，也会引起食欲减退及白血球下降等症状。
水幕法是近年在喷涂废气处理领域使用较多的一种技术，水幕法的原理属于吸收法，是湿法处理废气的一种，即通过水来吸收喷涂废气中的物质。工作时，利用水幕对废气进行吸收，吸收废气后，形成的废水中含有大量的苯、甲苯等苯系物，必须经过处理达标后才能排放，由于苯系物含有苯环结构，通常性质稳定，难以降解，因此现有处理技术主要采用利用高级氧化法技术为主，包括：臭氧氧化处理技术、光催化氧化处理技术、电催化氧化技术、Fenton氧化处理技术、高压脉冲等离子处理技术等，其处理原理是利用物质的强氧化性，通过氧化反应直接将有机物转化为CO2、H2O等无机物，但其存在操作条件苛刻，运行成本偏高等问题，影响到其的广泛应用和推广，因此需寻找经济高效的替代处理技术，国外研究发现微生物技术不但处理效果较好，而且成本也较低，无二次污染，因而微生物技术受到广泛关注，而相关技术研究我国较少。
短单胞杆菌目前已知的用途多为反硝化微生物，已有研究表明，短单胞杆菌表现出较强的反硝化作用(王思宇，李军，王秀杰等，中国环境科学，2017，37(12)：4649-4656；Shaked T,Halpern M,Schumann P,2009，International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology,2009,59(12):3025-3029；Leta S,Assefa F,Dalhammar G,World Journal of Microbiology&Biotechnology,2005,21(4):545-552.)，其对水体和土壤中的硝态氮可进行反硝化作用，脱除水体及土壤中的硝态氮，是污水脱氮的重要微生物。至于其在对其他污染物的代谢方面的研究报道非常少，国内只有张海发现短单胞杆菌相近属Brachymonas denitrificans sp是处理青霉素废水的优势菌株的报道(张海，山西大学硕士论文，2016)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种能够用于含甲苯、二甲苯废水处理的菌株——短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R及其用途。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种分离自喷漆废水底泥(分离自喷漆房废气淋洗废水底泥)的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R，为短单胞杆菌Brachymonas sp.，保藏编号：CGMCC No.17167。
作为本发明的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R的改进：该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还同时提供了上述短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R的用途：处理含甲苯和二甲苯的废水。
作为本发明的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R的用途的改进：去除废水中的甲苯、二甲苯。
本发明菌株的保藏信息如下：
保藏名称：短单胞杆菌Brachymonas sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.17167，保藏日期：2019年01月11日。
该菌株的菌落特征如下：为杆菌，表面粗糙，不产胞子，具有小的荚膜，革兰氏阳性，菌体大小为(1.0～2.0)μm×(0.3～0.5)μm，在固体培养基上，菌落呈圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈米黄色，不透明。
该菌株16S rDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示：
本发明的菌株由采集上海市金山区麦格纳汽车镜像(上海)有限公司喷漆房废气淋洗废水底泥中筛选获得，根据Sherlock MIS软件***对菌株LM-R定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌LM-R为短单胞杆菌(Brachymonas sp.)，相似指数SI(similarity index)为0.987；用16S rDNA测序鉴定方法也证明该菌株为短单胞杆菌。
将本发明菌株接种至含甲苯或二甲苯废水中，在15～35℃、150～200r·min-1的好氧条件下进行培养0.5～2d，可有效去除废水中的甲苯或二甲苯。
本发明所述的含甲苯或二甲苯废水，是指主要含甲苯或二甲苯及同时含甲苯和二甲苯的废水，其甲苯浓度为50～500mg·L-1、二甲苯浓度50～500mg·L-1。
该菌株能用于含甲苯和/或二甲苯废水处理，在好氧条件下、pH6.8、温度(25～30)℃、OD415nm0.2、甲苯浓度500mg·L-1、二甲苯浓度500mg·L-1、转速180r·min-1的条件下，培养2天，过滤，甲苯和二甲苯的去除率分别为99.99％和99.97％，可达到GB31570-2015《石油炼制工业污染物排放标准》限量标准(甲苯0.1mg·L-1和二甲苯0.4mg·L-1)排放。
本发明的有益效果主要体现在：本发明经筛选获得了一株用于含甲苯或二甲苯废水处理的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R，其具有高效处理含甲苯或二甲苯及甲苯和二甲苯混合废水的潜力；本发明为控制含甲苯或二甲苯废水排放对环境的影响提供了技术基础，应用前景广阔。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R(放大30000倍)；
图2为16S rDNA PCR扩增结果(ZA：菌株LM-R；Marker：DNA标准分子量)；
图3为基于16S rDNA序列的菌株LM-R***发育树。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、降解菌株的筛选与鉴定
1材料与方法
1.1培养基和试剂
富集培养基：甲苯(5、10、20、30或50g，逐步提高加入进行驯化富集)，CaCl2·6H2O0.1g，MgCl2 0.25g，K2HPO4 1.5g，NH4Cl 1g，蛋白胨9g，H2O 500mL，pH＝6.5～7.0；
基础培养基：NH4NO31.00g，MgSO4.7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl0.5g，K2HPO4 1.5g，H2O 1000mL，pH4.0；
基础培养基加入1.5％(w/v，每100mL加1.5g)琼脂和50g.L-1的甲苯即配成相应的固体基础培养基；
pH6.8、甲苯浓度500mg·L-1、二甲苯浓度500mg·L-1的含甲苯及二甲苯的混合废水。
1.2菌株对含甲苯及二甲苯的混合废水处理效能的测定
将纯化后的单个菌株以菌量OD415nm＝0.2接种到100mL含甲苯及二甲苯的混合废水(pH6.8、甲苯浓度500mg·L-1、二甲苯浓度500mg·L-1)250mL三角瓶中，以不接菌的混合废水作对照，在30℃、180r·min-1的恒温摇床上振荡好氧培养2天。培养结束后，用0.20μm膜过滤，除去菌丝体，滤液用于相应甲苯及二甲苯的测定，甲苯及二甲苯的含量用气相色谱测定。
去除率(％)＝(对照样品残留量-处理样品残留量)×100/对照样品残留量。
1.3优势降解菌株选育
1.3.1菌株来源
采集上海市金山区麦格纳汽车镜像(上海)有限公司喷漆房废气淋洗废水底泥。
1.3.2降解菌株的分离、纯化和筛选
从每份喷漆房废气淋洗废水底泥中取10g，在无菌的条件下，分别加到100mL无菌液体富集培养基的250mL三角瓶中.在30℃下180r·min-1摇床上培养7天后，按10％接种量转移到下一批富集培养基上(甲苯梯度依次为5、10、20、30或50g·L-1)，同条件驯化培养7天。然后再按10％接种量转接到含100g·L-1甲苯的无菌液体的基础培养基(即，甲苯浓度为100g·L-1基础培养基)中，继续培养7天，连续转接2次后；取0.1mL所得的发酵液于固体基础培养基上反复进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面上，于4℃冰箱内保存。
上述甲苯浓度为100g·L-1基础培养基为每1000ml基础培养基中加入100g甲苯配制而得。
1.3.3菌株鉴定
菌株鉴定采用美国MIDI公司的Sherlock microbial identity system(MIS)软件***，该***将基础培养基上纯化的单菌落按照MIDI公司的操作规范进行脂肪酸的提取和分析，定性(种类)和定量(含量)地分析微生物的脂肪酸成份并生成脂肪酸图谱，将生成的图谱和数据库(Library)进行比对，根据相似指数SI(similarity index)鉴定未知菌种，相似指数SI大于0.9就基本可确定是某种微生物。该***是一相对快速和具有丰富菌库的微生物鉴定***，已得到较广泛的应用(吴愉萍，徐建明，汪海珍等.SherlockMIS***应用于土壤细菌鉴定的研究.土壤学报，2006，43(4):642-647)。
此外，同时用16S rDNA鉴定方法进行验证，与Sherlock microbial identitysystem(MIS)进行比较。以LM-R菌株总DNA为模板，用16S rDNA基因的通用引物进行PCR扩增，得到的扩增片段经回收、测序可明确其大小，再将测序结果用BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比较。
1.3.4菌株形态特征观察及生理生化特性测定
将菌株接种在固体基础培养基中，48h后电镜观察菌株形态特征；取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、结晶紫简单荚膜等染色；生理生化特性测定参照《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英)。
2.结果
2.1菌株的分离与筛选
经分离、纯化、筛选获得1株能有效处理含甲苯及二甲苯的混合废水的细菌，命名为LM-R，其它菌株降解力都不同程度地衰退，培养2天，发现LM-R对甲苯及二甲苯2种苯系污染物的去除率分别为99.99％和99.97％。
2.2菌株的鉴定
2.2.1菌株LM-R基本形态及生理生化特征
该菌为杆菌，表面粗糙，不产胞子且具有小的荚膜，革兰氏阳性，菌体大小约为长(1.0～2.0)μm、宽(0.3～0.5)μm(如图1)，在固体培养基上，菌落圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈米黄色，不透明。乙酰甲基甲醇生成试验(v-p)反应阳性，吲哚实验阴性，不能液化明胶，其他生理生化特性见表1。
表1、短单胞杆菌的生理生化特性
| 测试项目 | 结果 | 生理生化测试 | 结果 |
| 革兰氏染色 | + | V-P实验 | + |
| 甲基红 | - | 吲哚实验 | - |
| 脂酶 | - | 硫化氢 | - |
| 赖氨酸脱羧酸 | - | 苯丙氨酸脱氨酶 | - |
| 鸟酸氨脱羧酶 | + | 氧化酶 | + |
| 柠檬酸盐 | - | 脲酶水解 | - |
| 木糖 | + | 精氨酸双水解酶 | - |
| 葡萄糖产气 | + | 蔗糖产酸 | - |
| 丙二酸 | - | 麦芽糖产酸 | - |
| 乳糖 | + | 卫矛醇产酸 | - |
| L-丙氨酸 | + | 反硝化 | + |
| 水杨酸 | - | 液化明胶 | - |
注：+阳性反应；-阴性反应
2.2.2菌株LM-R鉴定
(1)Sherlock MIS***对LM-R的鉴定
根据Sherlock MIS软件***对菌LM-R脂肪酸定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌LM-R为短单胞杆菌(Brachymonas sp.)，相似指数SI(similarity index)为0.987。
(2)16S rDNA鉴定方法对LM-R的验证
I.DNA提取结果
以LM-R菌株总DNA为模板，用16S rDNA基因的通用因为进行PCR扩增，得到1条约为1kb的片段(图2)。扩增片段经回收、测序明确其大小为1283bp(SEQ ID NO.1)。
II.16S rDNA基因PCR扩增和序列分析
将测序结果用BLAST软件与GenBank中的序列进行同源性比较发现，LM-R菌株与短单胞杆菌(Brachymonas sp.)具有较高的同源性，同源性接近100％，遗传距离较近。
综合LM-R的生理生化性质、Sherlock MIS(MIDI鉴定***)及16S rDNA***进化分析可以看出，该菌属于短单胞杆菌(Brachymonas sp.)。
3结论
从上海市金山区麦格纳汽车镜像(上海)有限公司喷漆房废气淋洗废水底泥中分离得到1株能够用于含甲苯或二甲苯废水处理的高效菌LM-R(CGMCC No.17167)，经Sherlock MIS***和16S rDNA鉴定为短单胞杆菌(Brachymonas sp.)。
将LM-R进行了保藏，保藏信息如下：
保藏名称：短单胞杆菌Brachymonas sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.17167，保藏日期：2019年01月11日。
实施例2、菌株对含甲苯和二甲苯混合废水处理性能检测
1材料与方法
1.1培养基和试剂
基础培养基：NH4NO31.00g，MgSO4.7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl0.5g，K2HPO4 1.5g，H2O1000mL，pH4.0；
pH7.0、甲苯浓度400mg·L-1、二甲苯浓度500mg·L-1的混合废水。
1.2菌株对对含甲苯和二甲苯混合废水处理性能
将纯化后的单个菌株以菌量OD415nm＝0.2接种到100mL混合废水(pH7.0、甲苯浓度400mg·L-1、二甲苯浓度500mg·L-1)250mL三角瓶中，以不接菌的混合废水作对照，在30℃,180r·min-1的恒温摇床上振荡好氧培养2天。培养结束后，按照实施例1方法测定菌株LM-R对甲苯和二甲苯2种物质的去除率。
2.结果
菌株LM-R在pH7.0、OD415nm0.2、转速180r·min-1及好氧环境条件下，对甲苯和二甲苯的去除率分别为99.99％和99.97％。甲苯和二甲苯残余浓度分别为0.04mg·L-1和0.15mg·L-1，可达到GB31570-2015《石油炼制工业污染物排放标准》限量标准(甲苯0.1mg·L-1和二甲苯0.4mg·L-1)排放，表明本研究分离、筛选的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)是一株可有效处理含甲苯和二甲苯混合废水的高效菌株，对控制含甲苯和二甲苯混合废水对环境的影响具有一定的应用潜力。
对比实验、将筛选过程中获得的其余菌株以及目前现有的短单胞杆菌(如下表2所述)，替代LM-R后，按照实施例2所述方法进行检测，所得结果与LM-R的结果对比如下表2所述。
表2
可见本发明所发现的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R是一株可有效处理含甲苯和二甲苯混合废水的高效菌株，可同时高效去除废水中的甲苯和二甲苯，对控制含甲苯和二甲苯混合废水对环境的影响具有一定的应用潜力，而其他相近属却没有该能力或者能力较弱。
实施例3：菌株对含甲苯废水处理性能检测
1材料与方法
1.1培养基和试剂
基础培养基：NH4NO31.00g，MgSO4.7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl0.5g，K2HPO4 1.5g，H2O1000mL，pH4.0；
pH7.0、甲苯浓度600mg·L-1的废水。
1.2菌株对对含甲废水处理性能
将纯化后的单个菌株以菌量OD415nm＝0.2接种到100mL废水(pH7.0、甲苯浓度600mg·L-1)250mL三角瓶中，以不接菌的废水作对照，在30℃,180r·min-1的恒温摇床上振荡好氧培养2天。培养结束后，按照实施例1方法测定菌株LM-R对甲苯的去除率。
2.结果
菌株LM-R在pH7.0、OD415nm0.2、转速180r·min-1及好氧环境条件下，对甲苯的去除率为99.99％。甲苯残余浓度为0.06mg·L-1，可达到GB31570-2015《石油炼制工业污染物排放标准》限量标准(甲苯0.1mg·L-1)排放，表明本研究分离、筛选的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)是一株可有效处理含甲苯废水的高效菌株，对单独控制含甲苯废水对环境的影响也具有一定的应用潜力。
实施例4、菌株对含二甲苯废水处理性能检测
1材料与方法
1.1培养基和试剂
基础培养基：NH4NO31.00g，MgSO4.7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，NaCl0.5g，K2HPO4 1.5g，H2O1000mL，pH4.0；
pH7.0、二甲苯浓度600mg·L-1的废水。
1.2菌株对含二甲苯废水处理性能
将纯化后的单个菌株以菌量OD415nm＝0.2接种到100mL废水(pH7.0、二甲苯浓度600mg·L-1)250mL三角瓶中，以不接菌的废水作对照，在30℃,180r·min-1的恒温摇床上振荡好氧培养2天。培养结束后，按照实施例1方法测定菌株LM-R对二甲苯的去除率。
2.结果
菌株LM-R在pH7.0、OD415nm0.2、转速180r·min-1及好氧环境条件下，对二甲苯的去除率为99.98％。二甲苯残余浓度为0.12mg·L-1，可达到GB31570-2015《石油炼制工业污染物排放标准》限量标准(二甲苯0.4mg·L-1)排放，表明本研究分离、筛选的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)是一株可有效处理含二甲苯废水的高效菌株，对单独控制含二甲废水对环境的影响也具有一定的应用潜力。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 分离自喷漆废水底泥的短单胞杆菌LM-R及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1283
<212> DNA
<213> 短单胞杆菌(Brachymonas sp.)
<400> 1
tcttcggatg ctgacgagtg gcgaacgggt gagtaatgta tcggaacgtg cccagtagtg 60
ggggataact actcgaaaga gtagctaata ccgcatgaga actgaggttg aaagcggggg 120
accttcgggc ctcgcgctac tggagcggcc gatatcagat taggtagttg gtggggtaaa 180
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ccacgcccta aacgatgtca actggttgtt gggtctttgc tgactcagta acgaagctaa 780
cgcgtgaagt tgaccgcctg gggagtacgg ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg 840
gggacccgca caagcggtgg atgatgtggt ttaattcgat gcaacgcgaa aaaccttacc 900
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gagcgcaacc cttgccatta gttgctacga aagggcactc taatgggact gccggtgaca 1080
aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttataggtg gggctacaca 1140
cgtcatacaa tggccggtac aaagggtagc caacccgcga gggggagcca atcccataaa 1200
gccggtcgta gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta 1260
atcgtggatc agcatgtcac ggt 1283
Claims (3)
1.分离自喷漆废水底泥的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R，其特征在于：为短单胞杆菌Brachymonas sp.，保藏编号：CGMCC No.17167。
2.如权利要求1所述的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R的用途，其特征在于：处理含甲苯和/或二甲苯的废水。
3.根据权利要求2所述的短单胞杆菌(Brachymonas sp.)LM-R的用途，其特征在于：去除废水中的甲苯和二甲苯。
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