CN105950501B - 一株降解多环芳烃类有机污染物的泛菌 - Google Patents

一株降解多环芳烃类有机污染物的泛菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株降解多环芳烃类有机污染物的泛菌属(Pantoea sp.)PYR16，属于微生物和环境有机污染物修复治理领域，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016227。本发明所公开的菌株能高效降解多种多环芳烃，具有广泛的环境适应和抗重金属能力，可定植于恶劣的环境中修复被重金属和多环芳烃复合污染的土壤或水体。

Description

一株降解多环芳烃类有机污染物的泛菌
技术领域
本发明属于微生物和环境有机污染物修复治理领域，具体涉及一株降解多环芳烃类有机污染物的泛菌(Pantoea sp.)，本发明还涉及该泛菌的应用以及一种降解多环芳烃类有机污染物的方法。
背景技术
多环芳烃(简称PAHs)是指一类由两个或两个以上苯环以线状、角状或簇状排列的稠环碳氢化合物，其中具有4个苯环及4以上的PAHs称之为高分子量多环芳烃(Highmolecular weight-PAHs,简称HMW-PAHs)。多环芳烃的来源主要包括两个方面：一方面是自然界自身的活动，如森林火灾、动植物遗体腐烂、石油煤炭形成、火山喷发等；另外一个方面是人类污染行为，如化石燃料的不完全燃烧、城市固体废弃物的焚烧、石油开采、加工运输以及化工生产和汽车尾气的排放等。人类活动向环境贡献了绝大多数的多环芳烃污染，是公认的环境多环芳烃主要污染来源。多环芳烃通常存在于石化产品、橡胶、塑料、润滑油、防锈油以及不完全燃烧的有机化合物等物质中，它可以通过大气和水体的流动，发生长距离迁移，因此广泛分布在大气、土壤、水体、沉积物以及植物等各种环境介质中。由于多环芳经水溶性低、吸附性强、半衰期长，使其可以持续存在于环境中数年，通常随着芳环数和分子量的增大，其生物可利用性越差，因此修复高分子量多环芳香相较于低分子量多环芳香烃更加困难。多环芳烃的脂溶性使其可以通过食物链逐级富集到处于食物链末端人的体内，并分散到体内组织，通过蛋白质酮-稀醇互变异构过程中的催化作用，导致蛋白的不可逆转变，进而使细胞发生癌变。因此对人类健康和生态***造成巨大威胁，多环芳经的污染修复是国内外的研究热点。
传统的多环芳烃污染的修复主要是依赖物理化学修复(化学氧化、客土或翻土法、汽提、热解吸、焚烧、填埋等方法去除或固定土壤中的污染物)，这些方法往往处理成本高、修复不彻底、容易产生二次污染而且不适合大规模应用。另外，在自然界中单种污染物构成的环境污染虽时有发生，但事实上绝对意义上的单一污染是不存在的，污染多具伴生性和综合性即多种污染物形成的复合污染，由于重金属和多环芳烃一样能够持续存在于土壤环境中，因此重金属-多环芳烃复合污染是土壤污染的主要形式。
生物修复是利用微生物来修复污染物，它不仅克服了物理化学修复处理成本高、修复不彻底等缺陷，而且不会产生二次污染，对污染物具有修复效果的微生物菌剂也适合大规模应用。微生物修复的实质是利用土壤微生物专一性代谢土壤中的有机污染物，将其转化为细胞其它碳基大分子和二氧化碳的过程。因此有机污染物微生物修复技术的核心是代谢速度快，环境适应性强的降解菌的筛选。而直接从环境中富集筛选土著微生物，不仅有效避免了基因工程菌在实际应用中发生的生物安全性问题，而且还是一种简单方便理想的技术手段。目前人们已经从各类生态环境中筛选获得一批多环芳烃降解菌，包括假单胞菌(Pseudomonas)、节杆菌(Arthrobacter)、红球菌(Rhodococcus)、分枝杆菌(Mycobacterium)、芽孢杆菌(Bacillus)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、气单胞菌(Aeromonas)、拜叶林克氏菌(Beijerinckia)、拟诺卡氏菌(Nocardioides)、解环菌(Cycloclasticus)、伯克氏菌(Burkholderia)、丛毛单胞菌(Polaromonas)以及一些嗜热厌氧的菌属如嗜油菌(Neptunomonas)、两面神菌(Janibacter)、诺卡氏菌(Nocardia)、变性菌(Deltaproteobacteria)和产碱菌(Alcaligenes)等。
发明内容
本发明的目的是提供一种降解多环芳烃类有机污染物的泛菌。
申请人从石油污染的土壤中分离获得一株能够快速降解多环芳烃类污染物的菌株，通过生理生化鉴定和核糖体16S rDNA基因序列分析将其鉴定为泛菌属(Pantoea sp.)，命名为Pantoea sp.PYR16。该菌株已于2016年4月26日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016227。
试验结果表明：
1)该菌株具有对芘的高效降解能力，而且能降解高浓度的芘。
2)该菌株在pH为6-10范围内，对芘的降解效果最好，因此适合弱酸性到碱性环境条件下的多环芳烃污染物去除。
3)该菌株具有广泛的NaCl浓度适应能力。
4)该菌株具有广泛的温度适应能力，更适合低温条件下的多环芳烃有机污染物的清除，有利于在我国一年四季和北方地区开展土壤原位修复。
5)该菌株能够在较大范围内耐受重金属的毒害作用，维持对多环芳烃类污染物的高效降解，具有重金属-多环芳烃复合污染环境修复的能力。
6)该菌株对多种PAHs如菲、芴、荧蒽、芘有良好的降解功能，特别是对于4环及4环以下的多环芳香烃降解效果显著，这有利于该菌应用于复合污染物污染严重的地区。
7)该菌株具有广泛的抗重金属能力，这有利于该菌定植于恶劣的环境中修复被重金属和多环芳烃复合污染的土壤或水体。
更详细的技术方案见《具体实施方案》所述。
附图说明
图1是菌株PYR16在200mg/L芘浓度下的生长和降解曲线。
图2是菌株PYR16对不同起始芘浓度的降解曲线。
图3是菌株PYR16在不同pH条件下对芘的降解能力。
图4是菌株PYR16在不同钠离子浓度条件下对芘的降解能力。
图5是菌株PYR16在不同温度条件下对芘的降解能力。
图6是菌株PYR16对不同重金属离子存在条件下对芘的降解能力。
图7是菌株PYR16对不同种类多环芳香烃的降解能力。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细地说明。应该说明的是，本发明的实施例仅限于对于本发明进行说明，而没有限制作用。实施例中所涉及的有关筛选方法、缓冲液配制和常见培养基配方等可参照赵斌，何绍江主编的《微生物学实验》以及《分子克隆实验指南》所描述的内容(参见J.萨姆布鲁克等，2002，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，北京)。本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
实施例1PYR16菌株的分离鉴定
采用来自长庆油田长期受石油污染的土壤为筛选土壤，具体筛选方案如下：
1)取10g土壤，加入到含有200mg/L芘的无机盐培养基MSM中，28℃震荡培养15天，再以10％的接种量接到上述含有200mg/L芘的无机盐培养基MSM培养基中；连续转接5次。
2)取0.1ml步骤1)所得到的富集培养液，涂布到含芘的MSM固体平板上，28℃静止培养15天后，将平板上长出来的菌落转接到含芘的MSM固体平板上，继续培养生长，直到平板上出现单一的菌落。
3)挑取含芘的MSM固体平板上生长出来的单菌落，接种到含有200mg/L芘的MSM液体培养基中，28℃震荡培养15天，获得本发明的菌株。
进一步对菌株进行了形态学和分子生物学鉴定。
首先，对菌株的形态学特征进行了初步的观察，结果表明，该菌株为革兰氏阴性菌，短杆状。
同时，发明人分离获得菌株的基因组DNA，然后以细菌16S rRNA基因的通用引物27F和1492R引物对DNA进行PCR扩增；将获得的PCR扩增产物进行测序，其测序结果如序列表SEQ ID NO：1所示。然后，利用NCBI核酸数据库，根据菌株16S rRNA基因序列进行了BLAST分析，结果表明菌株的16S rRNA基因序列与泛菌属的同源性高达99％，结合革兰氏染色和形态学观察，发明人将该菌株命名为Pantoea sp.PYR16。
实施例2PYR16菌株对芘的降解特征
以芘为唯一碳源，利用MSM培养基为基础培养基，发明人对PYR16菌株对芘的降解能力进行了测试。首先，从-80℃取出保藏的菌株，然后接种到R2A固体培养基中活化1天；挑取单菌落接种到5毫升R2A液体培养基中培养至OD600＝0.5；然后取0.5ml菌液接种到25ml含有200mg/L的芘的MSM培养基中，置于28℃震荡培养。上述降解体系中，PYR16菌株的接入量约为105-106左右。每隔24小时取出一瓶培养物，分别测定OD600值，并利用丙酮/正己烷(1:1)萃取三角瓶中所有残留的芘，然后利用GC-FID进行芘含量分析。每次取三瓶进行平行分析。
如图1所示，接种PYR16菌株后第15天，培养基中的芘被降解70％以上，到第20天，降解体系中82％以上的芘都被完全去除。这充分说明本发明所提供的菌株具有快速、彻底去除芘的能力。
进一步的，发明人测试了PYR16菌株对不同起始浓度的芘的降解速率和降解效果。如图2所示，低浓度的芘(小于200mg/L)，PYR16菌株20天即可降解芘达80％以上；而当起始芘浓度提高到800mg/L的时候，接种PYR16菌株后20天即可完成约80％以上的去除率。这表明，本发明所提供的PYR16菌株具有快速去除高浓度芘的能力。
实施例3pH、钠离子和温度对PYR16菌株芘降解能力的影响
首先将MSM培养基用盐酸或氢氧化钠溶液调整为pH分别为4、5、6、7、8、9、10，然后按照实施例2的操作方法接种105-106左右的PYR16菌株，28℃震荡培养10天后分析培养体系中残留芘的浓度。如图3所示，在pH为6-10范围内，PYR16菌株均能够维持对芘的降解效果，但是当pH低于6的时候，其降解能力将得到显著抑制。因此，本发明所提供的芘降解菌的合适处理环境的pH应该调整为6-10之间，并且，当处理样品的pH调整为6-10的时候，PYR16菌株都能维持对芘物质的34％以上的降解效率。因此本发明所提供菌株适合弱酸性到碱性环境条件下的多环芳烃污染物去除。
类似的，发明人在上述MSM培养基中添加NaCl,使其浓度分别为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％，然后按照实施例2的操作方法接种105-106左右的PYR16菌株，28℃震荡培养10天后分析培养体系中残留芘的浓度。如图4所示，当培养体系中的NaCl浓度小于3％的时候，降解率可以维持在35％以上；当NaCl浓度提高到8％左右的时候，PYR16对芘的降解率仍然维持在30％左右。
此外，发明人按照实施例2的操作方法接种105-106左右的PYR16菌株，然后分别置于4℃、16℃、28℃、37℃、42℃震荡培养10天，然后分析培养体系中残留芘的浓度。如图5所示，在28℃、37℃培养温度下，PYR16菌株对芘的降解速率能够维持在65％以上，其中37℃的培养温度下，上述菌种能够维持最佳降解效果；而一旦温度提升到42℃，其降解效率将下降到60％左右。这表明本发明所提供的PYR16菌株生长适应温度较广且更适合低温条件下的环境芘污染物的清除，这将有利于在我国一年四季和北方地区开展土壤芘污染原位修复。
实施例4重金属离子对PYR16的芘降解效果的影响
按照实施例2所述接种方法，将PYR16接种到含有200mg/L芘的MSM培养基中，同时分别加入150mg/L硫酸锰、75mg/L硫酸锰、250mg/L硫酸铜、125mg/L硫酸铜，28℃震荡培养21天后，分别分析降解体系中残留的芘的浓度。如图6所示：75mg/L的硫酸锰对于PYR16菌株的芘降解能力几乎没有抑制，而150mg/L的硫酸锰存在条件下，PYR16对200mg/L芘的降解率接近40％左右；而PYR16降解能力受到硫酸铜的影响更大，在125mg/L硫酸铜存在条件下，菌株PYR16菌株仍然能够维持25％左右的降解率，而当硫酸铜浓度提高到250mg/L的时候，其降解率下降到16％左右。这表明本发明所提供的PYR16菌株能够在较大范围内耐受重金属的毒害作用，维持对多环芳烃类污染物的高效降解能力，具有重金属-多环芳烃复合污染环境修复的能力。
实施例5PYR16菌株对不同种类PAHs的降解效果
按照实施例2所述接种方法，将PYR16分别接种到含有200mg/L菲、200mg/L芘、200mg/L芴和200mg/L荧蒽的MSM培养基中，28℃震荡培养一周后，分别分析降解体系中残留的芘的浓度。如图7所示：在相同的培养条件下PYR16对菲的降解率达到了98％以上，几乎将菲降解完全，对芴和芘的降解效果也比较好，降解率分别达到了60％和35％，而对于生物可利用性极低的荧蒽也降解了23％，这也进一步说明了多环芳香烃苯环数的增加其对生物的毒性越大，降解过程会更加复杂，降解周期也会相对较长。总体来说菌株PYR16对多种PAHs有良好的降解功能，特别是对于4环及4环以下的多环芳香烃降解效果显著，这有利于该菌应用于复合污染物污染严重的地区。
实施例6PYR16菌株对不同种类重金属离子抗性
从-80℃取出保藏的菌株，然后接种到R2A固体培养基中活化1天；挑取单菌落接种到5毫升R2A液体培养基中培养至OD600＝0.5。在2毫升灭菌离心管中分别配置含有50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L、250mg/L五个浓度梯度的重金属溶液(配置液为：10*106的重金属母液和R2A培养基)，然后将培养好的PYR16菌液按照2％的接种量接入该种重金属溶液中，置于28℃摇床培养，每两天观察一次并记录其生长状况。由下表1可知PYR16对MnCl2和CuSO4有较大耐受能力，在分别含有150mg/LMnCl2和250mg/LCuSO4的培养基中仍然能生长，其对K2CrO4和Cd(NO3)2的最大抑制生长浓度也有100mg/L，这能与不同重金属对与PYR16代谢有机物相关酶系的作用机制不同有关。表明该菌株具有广泛的抗重金属能力，这有利于该菌定植于恶劣的环境中修复被重金属和多环芳烃污染的土壤或水体。
表1菌株PYR16在不同重金属浓度下的生长情况
注:+能生长；--不能生长。

Claims (4)

1.一株降解多环芳烃类有机污染物的泛菌属(Pantoea sp.)PYR16菌株，其特征在于：保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2016227。
2.权利要求1所述的泛菌属PYR16菌株在降解多环芳烃类有机污染物中的应用，所述多环芳烃类有机污染物为菲、芴、荧蒽、芘。
3.一种降解多环芳烃类有机污染物的方法，包括向被污染的样品中接种权利要求1所述的泛菌属PYR16菌株的步骤，所述多环芳烃类有机污染物为菲、芴、荧蒽、芘。
4.一种用于降解多环芳烃类有机污染物的微生物菌剂，其活性成分为权利要求1所述的泛菌属PYR16菌株，所述多环芳烃类有机污染物为菲、芴、荧蒽、芘。
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