CN105296381A - 一株枯草芽孢杆菌cyy-25及其应用 - Google Patents
一株枯草芽孢杆菌cyy-25及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株枯草芽孢杆菌CYY-25,属于微生物领域。该枯草芽孢杆菌CYY-25命名为Bacillus?subtilis,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC?No.8995。并且该菌株在盐浓度为0%~15%的条件下均可产生纤维素酶。本发明枯草芽孢杆菌CYY-25可以合成IAA、嗜铁素,溶解难溶无机磷,能够促进植物生长,对尖孢镰刀菌、稻梨孢菌、核盘菌、串珠镰刀菌、油菜菌核病菌等多种植物病原真菌都具有较好的抑制作用,且对苜蓿根腐病的防治具有重要意义,适于作为农业菌剂加以开发利用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一株枯草芽孢杆菌CYY-25及其应用。
背景技术
紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是目前世界上种植最早、栽培最广的优质多年生豆科牧草,具有产草量高、再生性强、利用年限长、适口性强、营养丰富等优点。至今,紫花苜蓿在我国的种植历史已超过两千年,其亦是我国种植面积最大的牧草。然而紫花苜蓿的一种世界性病害,根腐病(Rootrot),会危害紫花苜蓿的各个生长时期,主要症状表现为根部出现坏死斑,甚至腐烂、死亡,茎叶全部枯死,严重影响紫花苜蓿的品质和产量,这种病害还会随着种植面积和年限的增长而加重。虽然紫花苜蓿根腐病病原复杂,但据研究表明多与镰刀菌有关。
近年来,植物根际促生细菌(Plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR)的研究日益受到人们的关注。芽孢杆菌(Bacillusspp.)是PGPR重要的组成部分,既可以促进植物生长,还有生物防治作用。PGPR主要通过合成IAA和嗜铁素,溶解土壤中难溶的磷,促进植物营养物质的吸收,从而促进植物生长;PGPR主要产生的抑菌物质为脂肽化合物,包括丰原素(Fengycin)、伊枯草菌素(Ituin)和表面活性素(Surfactin)等,其在防治植物病害方面起着重要作用。因此,开发能够促进植物生长且能够有效防治植物病害的PGPR是目前研究工作的重点。
发明内容
本发明的目的在于提供一株枯草芽孢杆菌CYY-25及其应用。
本发明是通过以下技术方案来实现:
本发明提供了一株枯草芽孢杆菌CYY-25,该枯草芽孢杆菌CYY-25命名为Bacillussubtilis,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCCNo.8995。
该菌能够合成吲哚乙酸、嗜铁素,还能够溶解无机磷。本发明公开了枯草芽孢杆菌CYY-25作为促进植物生长菌剂的应用。所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。
本发明还公开了枯草芽孢杆菌CYY-25在制备用于促进植物生长的菌剂中的应用。
所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。
本发明公开了枯草芽孢杆菌CYY-25作为防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂的应用。
本发明公开了枯草芽孢杆菌CYY-25在制备用于防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂中的应用。
所述的菌剂为防治苜蓿根腐病的菌剂。
与现有技术相比,本发明具有以下有益的技术效果:
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CYY-25于2014年4月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),其保藏编号为CGMCCNo.8995。
本发明枯草芽孢杆菌CYY-25可以合成IAA、嗜铁素,溶解难溶无机磷,能够促进植物生长,对尖孢镰刀菌、稻梨孢菌、核盘菌、串珠镰刀菌、油菜菌核病菌等多种植物病原真菌都具有较好的抑制作用,且对苜蓿根腐病的防治具有重要意义,适于作为农业菌剂加以开发利用。
保藏说明
本发明对所述的枯草芽孢杆菌CYY-25进行了下述保藏:
保藏时间:2014年4月3日,保藏地点:中国,北京。北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC);保藏号为CGMCCNo.8995。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)在PDA培养基上的生长状况。
图2为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)在不同浓度L-Trp存在下IAA合成量的变化。
图3为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对紫花苜蓿(农牧803)促生30d时盆栽效果。
图4为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对11种植物病原真菌的抑制作用,其中:a:尖孢镰刀菌;b:稻梨孢菌;c:金黄壳囊孢菌;d:核盘菌;e:串珠镰刀菌;f:灰葡萄孢菌;g:禾谷镰孢菌;h:茄链格孢菌;i:立枯丝核菌;j:禾旋孢腔菌;k:油菜菌核病菌;
图5为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)的发酵液对尖孢镰刀菌菌丝和孢子生长的抑制作用(40×);
图6为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对紫花苜蓿根腐病的防治作用;
其中,对照1是仅破坏紫花苜蓿植株根部;对照2是破坏紫花苜蓿植株根部,且用尖孢镰刀菌浸根;实验组是破坏紫花苜蓿植株根部,用尖孢镰刀菌浸根,同时用CYY-25菌悬液灌根;
图7为枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)的***发育树图谱。
具体实施方式
下面结合具体的附图和实施例对本发明做进一步的详细说明,所述是对本发明的解释而不是限定。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量实验,均设置三次以上重复实验,结果取平均值。
一、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)的分离鉴定
1、一、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)的分离
1)土样采集
供试土样取于哈尔滨师范大学试验田种植的紫花苜蓿的根际,将植物根际土壤装入事先准备好的干净保鲜袋中,带回实验室4℃保存备用。
2)菌株的筛选和纯化
称取5g土样,加入盛有玻璃珠和45mL无菌水的锥形瓶中,在培养摇床上剧烈振荡30min(37℃)后于80℃的水浴锅中保持15min。然后用无菌水进行梯度稀释后涂布于PDA平板,37℃培养1-2d,取培养基上生长的菌落,纯化并得到纯培养的菌株。将得到的一株芽孢杆菌命名为CYY-25。
2、菌株CYY-25的鉴定
1)分子鉴定
对菌株CYY-25进行基因组DNA提取,然后进行16SrDNA的PCR扩增和测序。
PCR扩增所采用的引物为:
F8:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';
F1541:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。
PCR扩增条件为:94℃3min;94℃30s、55℃30s、72℃90s,30个循环;72℃10min,4℃无限循环。
对PCR扩增产物进行测序,测序结果如序列表SEQIDNO.1所示。
2)形态鉴定
参见图1,菌株CYY-25在PDA培养基上形成圆形或不规则形,乳白色,边缘不整齐,表面粗糙的菌落。
3)生理生化鉴定结果如表1:
表1
注:+,阳性;-,阴性。
参见图7,通过鉴定,菌株CYY-25属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。
二、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)产吲哚乙酸(IAA)的能力
采用Salkowski比色法测定菌株CYY-25分泌IAA的能力。CYY-25先在DF液体培养基中培养2d,再微量转入添加0、200和500μgL-Trp/mL的DF液体培养基中继续培养2d,测OD600值,其余培养液离心后,取500μL上清液,加入2mLSalkowski试剂迅速充分混合,室温暗培养20min后,测OD535值。IAA标准曲线平行2次,样品重复3次。得到标准曲线方程如下:y=0.0717x-0.0007(R2=0.999),其中x代表OD535值,y代表IAA浓度(μg/mL)。
如图2所示,即为CYY-25菌株的IAA合成量。由图可知,CYY-25在L-Trp浓度为0、200和500μg/mL时,合成IAA量分别为0.363、6.765和9.349μg/mL。该菌株不仅能够利用L-Trp产生IAA,而且随着L-Trp浓度的增加,其IAA的合成量也增加。
三、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)溶解无机磷的能力
将CYY-25菌株点接种于NBRIP培养基上,28℃培养2-3d,观察菌落周围是否产生无色透明晕圈。
参照钼锑抗显色法来测量CYY-25菌株溶解无机磷的能力。标准曲线平行2次,样品重复5次。根据测得的OD660值,绘制标准曲线,得到标准曲线方程如下:y=1.0104x+0.0047(R2=0.9974),其中x代表OD660值,y代表磷的质量浓度(μg/mL)。查标准曲线,按如下公式进行计算:
发酵液内有效磷含量(μg/mL)=(p·V·ts)/v
式中p为工作曲线上查得磷的质量浓度(μg/mL);V为显色液定容体积(mL);ts为分取倍数;v为测定发酵液的体积。
检测结果表明,枯草芽孢杆菌CYY-25的菌落周围能形成无色透明晕圈。发酵液内有效磷含量为455.55±10.50μg/mL,说明CYY-25菌株具有溶解无机磷的能力。
四、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)生产嗜铁素的能力
参照Schwyn和Neilands的方法,将CYY-25菌株点接种于铬奥醇CAS(Chromeazurolsulphonate)培养基上,28℃培养3d,观察菌落周围是否产生橘黄色的透明晕圈。
定量测定采用王平等描述的水溶性色素产生菌铁载体的定量检测法,样品中嗜铁素的相对含量为A/Ar,该值越小,说明合成嗜铁素能力越强。
检测结果表明,枯草芽孢杆菌CYY-25的菌落周围有橘黄色的透明晕圈产生。A/Ar值为1.189±0.013,说明CYY-25菌株具有合成嗜铁素的能力。
五、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)在盐碱环境下对紫花苜蓿(农牧803)的促生效果
将CYY-25菌株于LB培养基过夜培养,离心收集菌体,重悬于无菌水中,调节菌浓度OD600=0.5±0.04。挑选饱满、大小一致、无病害的健康紫花苜蓿种子,75%乙醇浸泡4min后,无菌水冲洗5次,然后将种子浸于2%次氯酸钠溶液中5min,再用无菌水冲洗5次,将表面杀菌的种子用菌悬液处理,对照组只用无菌水处理,室温培养至种子萌发后,种于盆中。
供试盐碱土壤采自黑龙江省农科院兰西基地,每盆装500g土,种15粒发芽的种子,每处理设5次重复。实验组每7d浇一次CYY-25菌悬液,对照组浇等量无菌水。温室培养,适当补充水分。种植30d后取样,分别测植株的株高、根长、鲜重和干重,结果如下表2:
表2
注:同列不同字母表示在0.05水平上的显著差异。
结果表明,用CYY-25菌悬液处理的紫花苜蓿植株与对照组相比,植株高、根长、植株鲜重和根鲜重均显著增加,分别增加了53.31%、56.69%、107.45%和64.81%。植株干重增加了83%,根干重增加了1倍。由此可见,促生效果显著。
六、枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对植物病原真菌的抑制作用
1、分离菌株拮抗植物病原真菌的平板对峙试验
枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)在PDA培养基上37℃活化后,将植物病原真菌(尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、稻梨孢菌(Pyriculariaoryzae)、金黄壳囊孢菌(Cytosporachrysosperma)、核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)、串珠镰刀菌(Fusariummoniliforme)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、茄链格孢菌(Alternariasolani)、立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)、禾旋孢腔菌(Cochliobolussativus)、油菜菌核病菌(Sclertiniasclerotiorum))置于PDA培养基中央,在距平皿边缘2cm处接种菌株CYY-25,培养皿置28℃下培养3-5d,观察菌落周围是否产生抑菌圈。
由图4可见,枯草芽孢杆菌CYY-25(Bacillussubtilis)对11种植物病原真菌均有不同程度的抑制作用。
2、发酵液对病原菌丝及孢子生长的抑制作用
PDA板活化尖孢镰刀菌,刮取培养基表面菌丝,接种于50mLPDA液体培养基中。同时,取200μL过夜培养的细菌发酵液也接入PDA液体培养基中。对照组不接种细菌发酵液,28℃震荡培养2d。显微镜下观察,不同处理尖孢镰刀菌菌丝及孢子的生长情况。
如图5所示,菌株CYY-25的发酵液对尖孢镰刀菌菌丝和孢子生长均有明显的抑制作用。在电子显微镜下观察,对照组(CK)菌丝大量生长,边缘光滑,可见清晰的分支结构,并伴有大量孢子生成。与对照组相比,菌株CYY-25处理过的病原菌菌丝明显减少,菌丝体扭曲、断裂、顶端膨大,菌丝量和孢子量也明显减少。
3、分离菌株防治紫花苜蓿根腐病的盆栽实验
按照郝晓娟等的方法,将紫花苜蓿种子经表面杀菌后密播于无菌蛭石中,45d后,将植株根部用石英砂揉搓制造伤口,浸入培养2d的尖孢镰刀菌菌丝体悬浮液40min,再将苜蓿重新种回无菌蛭石中,立即用CYY-25菌悬液对重新种回蛭石中的紫花苜蓿植株进行灌根。以只破坏根不接菌为对照1,只接种病原菌不接种拮抗菌为对照2,每处理4个重复。实验组每2d用CYY-25菌悬液灌根,对照组浇灌等量的无菌水。接种10d后调查记录病情。参照陈雅君等的病情指数分级标准,将紫花苜蓿根腐病分为5级:0级为健康植株,无枯萎或腐烂症状;1级为主根或根茎局部出现病斑,面积低于10%,地上部分生长良好;2级为主根及根茎出现连片病斑,面积在10%~30%间,地上部分生长较好;3级为30%~50%主根及根茎出现病斑,地上生长很差;4级为主根及根茎部病斑面积超过50%,全株枯死。根据病情指数分级标准计算不同处理的病情指数及其防治效果。
由图6可见,尖孢镰刀菌能够引起紫花苜蓿根腐病,紫花苜蓿根及根茎部出现黑色坏死斑,甚至腐烂、死亡,茎和叶逐渐枯死。菌株CYY-25对由尖孢镰刀菌引发的紫花苜蓿根腐病有明显的防治效果。对照1健康无病株;对照2在接种尖孢镰刀菌10d后,植株几乎全部发病,病情指数达到86.88%;而实验组接种CYY-25菌悬液10d后有部分植株表现出发病症状,但发病率低,症状轻,与对照2相比差异明显,病情指数为40%,相对防效为53.96%。
综上所述,本发明公开的枯草芽孢杆菌CYY-25能够合成吲哚乙酸,能够合成嗜铁素。而且,该菌能够溶解无机磷。
所以,该菌的应用包括:
所述枯草芽孢杆菌CYY-25在促植物生长的应用。
所述枯草芽孢杆菌CYY-25在制备促植物生长菌剂的应用。
所述的菌剂为促吲哚乙酸合成、促嗜铁素合成、溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。
所述枯草芽孢杆菌CYY-25抑制多种植物病原真菌生长的应用。
所述枯草芽孢杆菌CYY-25防治多种植物病原真菌引起的植物病害的应用。
所述在制备防治植物病害菌剂的应用。
所述的枯草芽孢杆菌CYY-25防治紫花苜蓿根腐病的应用。
Claims (9)
1.一株枯草芽孢杆菌CYY-25,其特征在于,该枯草芽孢杆菌CYY-25命名为Bacillussubtilis,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCCNo.8995。
2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25作为促进植物生长菌剂的应用。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。
4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25在制备用于促进植物生长的菌剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的菌剂为促吲哚乙酸合成的菌剂、促嗜铁素合成的菌剂或溶解无机磷的菌剂中的一种或几种。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25作为抑制植物病原真菌生长的菌剂的应用。
7.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25作为防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂的应用。
8.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CYY-25在制备用于防治植物病原真菌引起的植物病害的菌剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的菌剂为防治苜蓿根腐病的菌剂。
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