发明内容
鉴于限于技术所存在的问题,本发明提供一株玫瑰黄链霉菌及其应用,对植物具有明显的促生作用,同时能够抑制多种病原真菌,具有很好的促生及防治效果,因此具有良好的应用前景。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
一株玫瑰黄链霉菌,其特征在于,该菌株为玫瑰黄链霉菌(Streptomycesroseoflavus),其保藏号为CGMCC NO.13416。
该菌株已于2016年12月02日由中国普通微生物菌种保藏管理中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)保藏。
进一步,该玫瑰黄链霉菌具有SEQ ID NO.1所示的序列。
本发明还提供一种菌剂,含有上述玫瑰黄链霉菌和/或玫瑰黄链霉菌的发酵液。
本发明还提供一种上述菌剂的制备方法,包括以下步骤:
1)将权利要求1所述的玫瑰黄链霉菌接种到高氏1号培养基,培养,长出菌块;
2)选取步骤1)的菌块接种到发酵培养基中,发酵,获得种子液;
3)将步骤2)的种子液接种到发酵培养基中,发酵,得到发酵液。
进一步,步骤1)中,培养温度为28℃,培养时间为7天。
进一步,步骤2)中,发酵的方式为震荡发酵,转速为170rpm,培养温度为28℃,培养时间为48h;
进一步,步骤3)中,接种量为10%,培养温度为28℃,发酵96h,转速为220rpm;
进一步,步骤2)和步骤3)中的发酵培养基的配方均为:麦芽糖10%,酵母粉4.0%,葡萄糖4.0%,其余为水。
采用上述的配方的培养基以及培养条件有利于菌株正常生长,尽可能保持菌株的活性,从而提高其促生及抑菌代谢产物的产量和稳定。
进一步,在步骤3)后,还包括对发酵液离心取上清的步骤。例如:在具体操作时,离心的转速可以为9500rpm,离心的时间可以为10min。
本发明还提供一种上述玫瑰黄链霉菌在促进植物生长中的应用。发明人在研究中意外的发现,采用本发明所述的玫瑰黄链霉菌可以显著的促进植物的生长。所述植物可以为但不限于番茄、小麦、辣椒等。
本发明还提供一种上述玫瑰黄链霉菌在抑制病原真菌生长中的应用。发明人在研究中意外的发现,采用本发明所述的玫瑰黄链霉菌可以明显抑制病原真菌的生长,尤其是抑制病原真菌的菌丝的生长。所述病原真菌可以为但不限于番茄叶霉菌、玉米弯孢菌、稻曲病菌、鲁保1号、小麦纹枯病菌中的任一种或任几种的混合。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
本发明提供一株玫瑰黄链霉菌,对番茄、辣椒及小麦有明显的促生作用,同时能够抑制多种病原真菌,具有很好的促生及防治效果,因此具有良好的应用前景。
下面对于本发明的技术方案进行具体的介绍。
本发明所提供的菌株为玫瑰黄链霉菌(Stremptomyces roseoflavus),是张克诚研究员从青海省祁连山地区分离获得的,已于2016年12月2日保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC),保藏号为CGMCC No.13416,命名为NKZ-259。其具有以下生物学特征。
下面通过具体实施例对本发明的方案进行具体介绍。
实例1玫瑰黄链霉菌(Stremptomyces roseoflavus NKZ-259)的分离与纯化
本发明的玫瑰黄链霉菌(Stremptomyces roseoflavus NKZ-259)是从青海省祁连山土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的,分离纯化的方法为:
称取土样1g,放入盛有99ml无菌水的带有玻璃珠的三角瓶中,振荡摇匀30min,然后用移液枪从三角瓶中吸取1ml,加入另一盛有9ml无菌水的试管中,混和均匀,以此类推分别制成10-2、10-3、10-4不同稀释度的土壤溶液。取100μL土壤溶液涂布于高氏1号培养基平板上,每个稀释度做3个重复,28℃培养3d。挑取单菌落于高氏1号培养基平板上划线,定时观察菌落生长情况,然后采用平板划线法,纯化芽孢杆菌菌株,分别制作斜面标号保存于4℃冰箱。
高氏1号培养基的配方(g/L):可溶性淀粉20.0,硝酸钾1.0,磷酸氢二钾0.5,七水合硫酸镁0.5,氯化钠0.5,七水合硫酸亚铁0.01,琼脂17。称取后,加热搅拌溶解于蒸馏水中,分装三角瓶,121℃高压灭菌,倒平板。
实例2玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus strain NK-259)抑菌活性测定
1、平板对峙试验
将17种病原真菌(分别为番茄叶霉菌、玉米弯孢菌、棉花枯萎病菌、桃根霉、黑腐病菌、稻曲病菌、杨树溃疡病菌、玉米小斑病菌、苹果轮纹病菌、葡萄黑腐病菌、苹果腐烂病菌、鲁保1号、烟草赤星病菌、玉米大斑病菌、小麦赤霉、稻瘟菌、小麦纹枯病菌,均来自中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素研究组)在PDA上培养5天,然后用手术刀切小块菌块转接到PDA培养基(中文全称为马铃薯葡萄糖琼脂培养基,英文名称为Potato Dextrose AgarMedium)中央,在离病原菌等距离的两侧分别放入无菌牛津杯,然后分别加入玫瑰黄链霉菌NKZ-259的发酵液(28℃发酵96h)和无菌水,25℃培养养3-9天,观察NK-259发酵液对病原真菌生长的抑制效果。
结论:玫瑰黄链霉菌NKZ-259对上述17种病原真菌中的五种具有抑制作用,如图4A所示,分别是番茄叶霉菌、玉米弯孢菌、稻曲病菌、鲁保1号、小麦纹枯病菌。
2、对菌丝生长的影响
将玫瑰黄链霉菌NKZ-259接种到高氏1号培养基上,28℃培养7天,然后用手术刀切1cm2的菌块接种到发酵培养基中,震荡发酵96h(28℃,220rpm)。然后将发酵液离心(10000r/min,4℃),取上清液,用0.22μm滤膜过滤除菌得到无菌发酵液。
采用菌丝生长速率法,检测玫瑰黄链霉菌NKZ-259发酵液对5种供试病原真菌(番茄叶霉菌、玉米弯孢菌、稻曲病菌、鲁保1号、小麦纹枯病菌)菌丝生长的影响。在无菌条件下,取制备好的发酵液10mL和融化的PDA培养基90mL混匀,在无菌培养皿中制成含发酵液的平板培养基,以不加发酵液的培养基为对照,在每个培养基表面放入1个直径5mm的供试病原真菌菌饼,每个处理3次重复,25℃恒温培养7d后,十字交叉法测量菌落直径,计算菌丝生长抑制率:菌丝生长抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。实验结果如图4B所示。
表1
病原真菌 |
菌丝生长抑制率(%) |
番茄叶霉病菌 |
48.72±2.32 |
玉米弯孢菌 |
60.48±1.66 |
稻曲病菌 |
63.11±2.73 |
鲁保1号 |
40.00±1.13 |
小麦纹枯病菌 |
26.90±1.69 |
结论:由表1可以看出,玫瑰黄链霉菌NKZ-259菌株无菌发酵液对上述5种供试病菌菌丝生长都有明显的抑制作用,如图4B所示,抑制率分别为48.72%、60.48%、63.11%、40.00%、26.90%。
实例3玫瑰黄链霉菌(Stremptomyces roseoflavus NKZ-259)的形态观察
菌落形态观察:在高氏1号培养基上接种培养NKZ-259菌株,28℃,倒置培养7天后观察菌落形态,发现菌落呈淡粉色,有少量白色气生菌丝(如图1所示);
电子显微镜镜观察:用手术刀从培养基上切取少量菌丝,放入2-4%戊二醛固定液中固定1-2天,0.1M pH7.2PBS缓冲液洗,用1%OsO4固定后1-2小时,再用重蒸水冲洗30分钟,随后用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水,每级15-20分钟,样品脱水后用醋酸异戊酯处理,CO2临界点干燥,干燥好的样品粘贴在样品台上,用离子溅射仪表面喷金,喷金后样品在扫描电镜下扫描,观察芽孢形态拍照并记录。
通过培养和观察发现孢子丝直或柔曲,孢子呈卵圆形或椭圆形,表面光滑。(如图2A和图2B所示)。
实例4玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus strain NKZ-259)的16s rRNA基因序列鉴定
将菌株接种于YEME培养基中,摇床培养(28℃,220rpm)48h小时后,取500μL菌液到EP管中,离心,弃上清,收集菌体,提取DNA,然后进行PCR验证。用于PCR扩增的引物如下:正向引物F:5'-GCAGTCGAGCGGACAGAT-3';反向引物R:5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反应体系如下:2×TaqPCRmastermix12.5μL,正向F引物10.5μL,反向R引物0.5μL,菌液模板DNA1μL,ddH2O 10.5μL,总体系25μL。PCR扩增条件为:94℃5min;94℃1min;51℃30s;72℃1min,35个循环;72℃10min。电泳采用琼脂糖凝胶电泳,核酸染料为EB,Maker为DL2000。最后将PCR纯化产物送上海生工生物工程有限公司进行测序。所得序列NCBI GeneBank核酸数据库中相关序列进行比对分析。用正向引物F和反向引物R进行16SrRNA进行PCR扩增,得到大约1.4kb的片段,如SEQ ID NO.1所示。通过比对该序列与玫瑰黄链霉菌16S rRNA基因在相应区域核苷酸序列相似性为100%。
将获得的菌NKZ-25916s rRNA序列同GenBank中已有的20条不同种的新霉素属16srRNA序列进行比较,其中选择差异较大的组外序列为天蓝色链霉菌(StreptomycescoelicolorA3)。通过DNAMAN version6.0(LynnonBiosoft)对核苷酸和相应氨基酸序列进行分析对比,用Bioedit对全长核苷酸序列进行编辑整理。MEGA(version 4.1)进行ClustalW多序列比对和***进化分析;通过neighbour-joining的方法构建进化树,bootstrap设置为1000次重复。结果表明,获得的菌NKZ-259其***发育分析与玫瑰黄链霉菌strain Men-myco-93-63处于同一分支,说明其亲缘关系较近,结合形态结构和生理生化特性,发明人将该菌株鉴定为玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)(如图3所示)。
实例5玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus strain NKZ-259)的发酵过程
培养基配方:麦芽糖10%,酵母粉4.0%,葡萄糖4.0%,其余为水。配方中的百分数均为质量百分数。
发酵过程:
(1)将玫瑰黄链霉菌NKZ-259用无菌牙签涂布接种到高氏1号培养基上,置于28℃培养7天;
(2)用手术刀切1cm2的菌块接种到发酵培养基中,震荡发酵48h(28℃,170rpm);
(3)按照体积比为10%的接种量将第二步的种子液接种到发酵培养基中,震荡发酵96h(发酵温度为28℃,转速为220rpm)。
实例6玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus strain NKZ-259)促生效果测定
(1)番茄促生试验方法:
试验采用穴盘种植,于营养土中进行,营养土与蛭石按9:1的比例配置基质,将其置于穴盘中。每穴撒2-3粒番茄种子,用少量的营养土覆盖种子,浇灌适量的水,并用保鲜膜覆盖,待苗出土长出2片子叶时去掉保鲜膜。试验分为两组,试验组使用稀释100倍的NKZ-259发酵液灌根,对照组浇灌清水,每个处理20株苗,3次重复。于温室中25℃,相对湿度为60%的环境下培养,生长大约7天,番茄苗长出2片真叶时,开始灌浇菌液,之后每隔10天灌根一次,其他时间浇灌清水。在灌根3次后,也就是番茄苗生长到45天时,小心将番茄苗挖出,洗去根部泥土,测其生长指标:根长、株高、鲜重、干重。
表2菌株NKZ-259发酵液浸种对番茄生长的促进作用
由表2以及图5A、图5B和图5C,可以看出菌株NKZ-259发酵液灌根对番茄苗具有明显的促进生长的作用,发酵液灌根后的番茄苗与对照组相比生长迅速,叶片浓密,茎部粗壮,尤其是根系发达,根长增加显著,与对照组相比根长增加了39.23%,株高增加了5.62%,鲜重增加了11.70%,干重增加了31.82%。
(2)小麦浸种试验
首先分别用NKZ-259的发酵液和清水浸泡小麦种子24h,然后分别播种于玻璃培养皿中,培养皿底部铺两层滤纸,每皿放置15粒种子,重复3次。将发酵液稀释100倍,每天浇灌发酵液和清水,保证滤纸湿润,在温室25℃,相对湿度为60%的环境下培养,15天后,测量小麦的根长、株高、鲜重、干重。
表3菌株NKZ-259发酵液浸种对小麦生长的促进作用
由表3以及图6A和图6B可知,浸种试验表明菌株NKZ-259发酵液可以明显促进小麦的生长,发酵液浸种后的小麦苗比对照组根长增加32.50%,株高增加了23.79%,鲜重增加了46.93%,干重增加了37.03%。发酵液浸种后的小麦真叶比对照组出现的早,叶片大,叶柄粗,根系发达,生长更均一、旺盛。
(3)辣椒促生试验方法:
试验采用穴盘种植,于营养土中进行,营养土与蛭石按9:1的比例配置基质,将其置于穴盘中。每穴撒2-3粒辣椒种子,用少量的营养土覆盖种子,浇灌适量的水,并用保鲜膜覆盖,待苗出土长出2片子叶时去掉保鲜膜。试验分为两组,试验组使用稀释10倍的NKZ-259发酵液灌根,对照组浇灌清水,每个处理20株苗,3次重复。于温室中25℃,相对湿度为60%的环境下培养,辣椒苗长出2片真叶时,开始灌浇发酵液,之后每隔10天灌根一次,其它时间浇灌清水。在灌根3次后,也就是辣椒苗生长到约45天时,小心将辣椒苗挖出,洗去根部泥土,测其生长指标:根长、株高、鲜重、干重。
表4菌株NKZ-259发酵液浸种对辣椒生长的促进作用
由上表4以及图7A、图7B和图7C可知,菌株NKZ-259发酵液灌根对辣椒苗具有明显的促进生长的作用,发酵液灌根后的辣椒苗与对照组相比根系发达,生长迅速,叶片浓密,茎部粗壮,其株高比对照组增加了16.92%,根长增加了44.15%,鲜重增加了63.08%,干重增加了38.89%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>一株玫瑰黄链霉菌及其应用
<160>1
<210>1
<211>1413
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>16s rRNA基因
<400>1
tgcagtcgaa cgatgaagcc cttcggggtg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg 60
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