CN112111427A

CN112111427A - 一株枯草芽孢杆菌pa8及其应用

Info

Publication number: CN112111427A
Application number: CN202011023243.9A
Authority: CN
Inventors: 马连杰; 廖敦秀; 张慧; 卢文才; 杭晓宁; 胡留杰; 张健; 李燕; 余端; 梁涛
Original assignee: Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Chongqing Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-09-25
Filing date: 2020-09-25
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2040-09-25
Also published as: CN112111427B

Abstract

一株枯草芽孢杆菌PA8，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌PA8保藏于中国典型培养物保藏中心，分类名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏日期为2020年8月15日，保藏号为CCTCC M 2020387。本发明枯草芽孢杆菌PA8具有高效合成IAA的能力，IAA的产量可以高达187mg/L；具有优异的产铁载体能力，并对尖孢镰刀菌具有很强的抑制作用，通过上述多种作用，可以协同对蔬菜植物具有优异的促生效果，应用与育苗基质中，可以显著提高出苗量，对蔬菜植物有优异的促生作用。

Description

一株枯草芽孢杆菌PA8及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌PA8及其应用。

背景技术

根际促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)泛指一类生长在根际土壤环境中或根系内部，具有促进植物生长或增加作物产量、抑制病虫害能力的根际细菌，其对克服土壤逆境、改善微生态环境具有特殊意义。根际促生菌主要通过合成吲哚乙酸(IAA)等植物激素，通过溶磷、解钾、固氮、产铁载体等改变元素形态的方式增加植物养分吸收，促进植物生长。目前国内外已发现的PGPR包括假单胞菌属、芽孢杆菌属、农杆菌属、黄杆菌属、沙雷氏菌等20多个种属，此方面研究越来越受到重视，国际上每3年会开一次专业性研讨会。

蔬菜穴盘育苗作为蔬菜生产向规模化、集约化发展的重要环节，因其具备提高秧苗质量、增加移苗定殖率等优势而成为了蔬菜种植大户和工厂化育苗场的首选。随着穴盘育苗技术的广泛应用，育苗基质的市场需求也不断增加。育苗基质中稳定协调的水、气、肥成为幼苗根系的营养库，保证根系所需养分和水分。目前对育苗基质的研究主要集中在原材料选择及其配比方面，对如何培育抗病促生健苗、提高幼苗质量与抗病性的研究不多。本发明以普通育苗基质为材料，通过添加具有明显促生效果的生防菌制备成功能性生物育苗基质，达到提高种苗质量，健苗、壮苗的目的。

发明内容

针对上述技术问题，本发明目的在于提供一株枯草芽孢杆菌，能高效生产 IAA的同时，具有优异的产铁载体能力，并高效抑制尖孢镰刀菌。

本发明目的通过如下技术方案实现：

本发明提供了一株枯草芽孢杆菌PA8，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武汉大学，分类名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)PA8，保藏日期为2020年7月31日，保藏号为CCTCC NO：M 2020387。

枯草芽孢杆菌PA8的菌落形态称皱圆形，表面粗糙无光泽，菌苔为白色，培养一段时间后呈红棕色，其生理化测定结果为：革兰氏阳性菌。

所述枯草芽孢杆菌具有较强的合成IAA能力，同时具有优异的产铁载体能力，并高效抑制尖孢镰刀菌的生存。

进一步，所述枯草芽孢杆菌PA8在促IAA合成、铁载体合成、抑制尖孢镰刀菌一种或多种作用的菌剂中的应用。

上述枯草芽孢杆菌PA8的应用，其特征在于：具体在功能型蔬菜育苗基质中应用。

本发明的枯草芽孢杆菌PA8可用于育苗生物基质中，具体是将枯草芽孢杆菌PA8接种至普通育苗基质中混合均匀，形成新的育苗基质，枯草芽孢杆菌PA8 的接种量与基质干重比值为5mL/100g，枯草芽孢杆菌PA8的浓度为10⁸CUF/mL。

本发明具有如下技术效果：

本发明分离筛选的枯草芽孢杆菌PA8具有高效合成IAA的能力，IAA的产量可以高达187mg/L；具有优异的产铁载体能力，并对尖孢镰刀菌具有很强的抑制作用，通过上述多种作用，可以协同对蔬菜植物具有优异的促生效果，应用与育苗基质中，可以显著提高出苗量，对蔬菜植物有优异的促生作用。

附图说明

图1：PA8在LB平板上的菌落形态。

图2：菌株PA8在CAS平板上培养图(左图为正面图，右图为反面图)。

图3：PA8对尖孢镰刀菌GF12抑菌效果图(左为对照图，右为抑菌图)。

图4：100g基质中5mL功能菌PA8接入生物基质对黄瓜苗的出苗影响(左为CK 组，右为PA8组)。

图5：100g基质中5mL功能菌PA8接入生物基质对黄瓜苗的促生效果(左为PA8 组，右为CK组)。

图6：100g基质中5mL功能菌PA8接入生物基质对小白菜的促生效果(上为CK 组，下为PA8组)。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例1：菌株的分离纯化

1、培养基

LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，琼脂粉20g，蒸馏水 1L，120℃灭菌20分钟。

2试验步骤

2.1培养基配制

配制如1所述LB培养基，制备液体培养基及斜面培养基。

2.2土壤稀释液的制备

土壤样品采自重庆市奉节县平安乡的水稻田，土壤称取样品5g，置入装有 45mL无菌水的三角瓶中，摇床180rpm振荡30min，放置到80℃的水浴锅中煮 20min，以杀死其它细菌。制成土壤悬液，采用10倍稀释法配制浓度梯度为10^-2、 10^-3、10^-4的土壤悬液样品。

2.3稀释涂布

取10^-2、10^-3、10^-4的土壤稀释液100μL，涂布于LB培养基培养基上，每个梯度重复3次，30℃培养，培养1-2d后挑取表型不一的单菌落，经平板纯化保存。

实施例2：生长素的测定及菌株PA8的筛选和鉴定

1培养基

金氏培养基(King)：蛋白栋20g、MgSO₄·7H₂O 1.5g，K₂HPO₄ 1.15g、甘油 15mL，蒸馏水1L，pH6.8用于产IAA能力测定。

S2比色液：FeCl₃ 4.5g，10.8mol/L H₂SO₄ 1L其测定范围为5-200ug/mL，一般超过10ug/mL需要稀释比色液。

2试验步骤

采用Salkowski比色法进行生长素测定，具体步骤如下：

(1)植物生长激素IAA定性测定：将分离纯化后的菌悬液按培养基体积的 1％接种于上述金氏培养基(King)中，在30℃、180r/min恒温摇床上振荡培养 7d，12000r/min离心10min，取0.1mL上清液滴至检测板上，加等量S2比色液，另取S2比色液0.1mL，分别加入50、30、10mg/L标准植物生长激素IAA 0.1 mL作梯度对照，室温静置15min后观察颜色变化，确定菌株是否具有分泌IAA 的能力。

(2)植物生长激素IAA定量测定：取能够分泌IAA菌株的上清液，加入等量S2比色液中，于黑暗中静置30min后用紫外分光光度计在535nm处测定吸光度，根据IAA标准曲线计算各菌株的IAA分泌量。通过定性测定和定量测定，获得一株促生能力优异的菌株PA8，一般情况下，在加入L-Trp可以促进枯草芽孢杆菌合成IAA，在不添加L-Trp的情况下，菌株PA8的IAA产生量为187mg/L，保存留待进一步研究。测定过程中，我们尝试用其他培养基进行接种培养后检测，检测结果变化不明显，IAA产生量均维持在187±2mg/L。

3菌株鉴定

菌株PA8用平板培养出来的菌落呈皱圆形，表面粗糙无光泽，菌苔白色，培养一段时间后呈红棕色。对菌株进行生理化鉴定，测定结果为：革兰氏阳性菌，接触酶试验、淀粉水解、纤维二糖、果糖、甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨苷试验均呈阳性；柠檬酸盐试验、酪氨酸水解、木糖、乳糖、半乳糖、试验均呈阴性。

菌株PA8的16SrDNA基因序列测定结果图图2所示，将此16SrDNA基因序列进行Blast结果分析，得到与Bacillus subtilis菌株相似度达99％，根据16SrDNA 基因序列测定结果来看，该菌株可归为Bacillus subtilis PA8。

实施例3：产铁载体能力的测定

1培养基

CAS培养基：每100mL含20％蔗糖溶液1mL，10％酸水解酪素3mL， 1mmol/L CaCl₂100μL，1mmol/L MgSO₄ 2mL，琼脂1.8g，在约60℃时缓慢加入磷酸盐缓冲液和CAS染液各5mL，即得CAS蓝色培养基。

表1：0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)，使用时稀释10倍。

NaH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O	0.5905g
		KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>	0.075g
NH<sub>4</sub>Cl	0.250g
		NaCl	0.125g
去离子水	定容至100mL

铁载体检测CAS染液：

溶液A：将0.079g CAS(铬天青)溶于50mL去离子水中，再加入10mL 1mmol/L FeCl₃溶液(含12mmol/LHCl)；

溶液B：将0.069g十六烷基三甲基溴化铵(HDTMA)溶于40mL的去离子水中；

CAS蓝色检测液(100mL)：将A溶液沿烧杯壁缓缓加入B溶液中，搅拌混匀即得。

2试验步骤

从LB固体斜面培养基上活化的PA8菌株中挑取单菌落接种至LB去铁液体培养基内，3个重复，置于28℃微生物培养箱内培养2～3d，挑取单菌落转接至LB液体培养基中，180rpm摇床培养48h，用移液枪吸取菌液点接于CAS检测平板上，30℃恒温倒置培养，点植数量4个/皿，3次重复，在28℃下培养5d。观测经过培养的CAS检测平板，分泌铁载体的细菌菌落周围会出现明显的橙色至黄色铁载体晕圈。通过比较平板上色透明圈的大小，来确定各菌株产铁载体能力的强弱。

3产铁载体功能测定

3.1产铁载体功定性测定：菌株PA8在CAS检测平板上生长5d后，可明显的观测到菌株周围有一圈黄色透明圈，如图3所示，透明圈直径(D)为1.8cm，菌株直径(d)为1.1cm，D/d＝1.64。可见，菌株PA8具有较强的产铁载体能力。

3.2铁载体定量测定：采用王平等描述的水溶性色素产生菌铁载体的定量检测法，测得铁载体的相对含量为A/Ar，该值越小，说明合成嗜铁素能力越强。

取PA8菌苔转移至已灭菌的MKB液体培养基中(酪蛋白氨基酸5g、甘油 15mL、K2HPO42.5g、MgSO4·7H2O 2.5g,双蒸水1L，pH＝7.2)，28℃摇床培养48h 后离心，将3mL上清液，加入一定量的CAS检测液，体积比为1:1，充分混匀静置1h后，采用分光光度计测定630nm波长处的吸光度值(A)。并取双蒸水对照调零。另取3mL未接种的培养基和3mL的CAS检测液混合，以同法测定630nm 波长处的吸光度值作为参比值(Ar)，A/Ar的值为0.38，通过计算铁载体活性单位Su＝[(Ar-A)/Ar]*100，可得出PA8的活性载体单位为61.94％。

实施例4：抑制尖孢镰刀菌能力的测定

1培养基

选用PDA培养基进行抑菌试验所用培养基，培养基配方如下：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，PH自然。

2试验步骤

将活化好大豆根腐病原菌尖孢镰刀菌接种于PDA平板中央，在距离平板中心2.5cm处均匀打4个孔，分别加OD600为0.1的PA8菌悬液50μL，对照加等量的无菌水，将平板转移至28℃恒温箱培养5d左右，观察抑菌效果。

3抑菌能力确定

如图4所示，平板上能够看到菌株PA8对尖孢镰刀菌有明显的抑制效果。

实施例5：以菌株PA8为功能菌的生物基质

1菌株培养

LB培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，琼脂粉20g，蒸馏水1L，120℃灭菌20分钟。

菌株的培养：将PA8接入装有300ml LB培养基的500ml三角瓶中，30℃180 rpm摇床培养48h，备用。

菌株PA8摇培后，8000rpm，4℃离心10min，用自来水洗涤2次，将菌株PA8 重悬于无菌水，调节浓度为10⁸CUF/mL。

2基质的研发

2.1以菌株PA8为功能菌的生物基质对黄瓜的育苗效果

育苗试验处理如下：(1)普通育苗基质(CK)；(2)将重悬无菌水后的菌株 PA8按每100g基质干重中加入5mL的量接种至普通育苗基质中(PA8)，每个处理25个重复，20天左右分别测定相关生长指标：株高、根长、茎粗、叶长、叶宽、地上部鲜重、根重。

表2测定生物基质育苗20天对黄瓜苗期生长的影响

注：同列不同字母表示在0.05水平上的显著差异。

育苗试验中，相比于普通育苗基质(CK)，添加了功能菌PA8制成的育苗生物基质(PA8)对黄瓜苗的出苗有显著影响，如图4所示，对照组的基质穴盘中有多个穴盘中没有出苗，而加了功能菌PA8的育苗生物基质中，每个穴盘均有出苗现象，黄瓜苗出苗量显著优于对照组，并且对其生长有明显的促生效果，株高、根长、茎粗、地上部鲜重、根重、叶面积等指标均有显著增加，依次分别增加了86.23％、25.92％、77.5％、64.21％、211.8％、120.93％。

2.2以菌株PA8为功能菌的生物基质对白菜的育苗效果

育苗试验处理如下：(1)普通育苗基质(CK)；(2)将重悬无菌水后的菌株 PA8按每100g基质干重中加入5mL的量接种至普通育苗基质中(PA8)。将黄瓜种子消毒浸种催芽，露白后，埋入处理的基质中，每个处理50个重复。12天左右分别测定植株株高、茎粗、叶片数、根长、地上部鲜重。

表3：生物基质育苗12天对白菜苗期生长的影响。

处理	株高(cm)	茎粗(mm)	叶片数(片)	根长(cm)	地上鲜重(g)
						CK	11.71a	2.75a	5.3a	5.81a	6.60a
PA8	15.26b	3.20b	5.7a	7.06b	9.57b

注：同列不同字母表示在0.05水平上的显著差异。

白菜苗盘育苗试验中：相比于普通育苗基质(CK)，添加功能菌研制成的育苗生物基质(PA8)均对白菜苗的生长有明显的促生效果，出叶片数以外，其他生长指标均有显著性差异(表3和图6)。

2.3以菌株PA8为功能菌的生物基质对番茄的育苗效果

育苗试验处理如下：(1)普通育苗基质(CK)；(2)将重悬无菌水后的菌株 PA8按每100g基质干重中加入5mL的量接种至普通育苗基质中(PA8)。将番茄种子消毒浸种催芽，露白后，埋入处理的基质中，每个处理50个重复。经40 天左右测定植株株高、茎粗、叶片数、根长、地上部鲜重。

表4：生物基质育苗对番茄苗期生长的影响。

注：同列不同字母表示在0.05水平上的显著差异。

番茄苗盘育苗试验中：相比于普通育苗基质(CK)，添加功能菌研制成的育苗生物基质(PA)对番茄苗的株高、茎粗、地下部鲜重均有显著性差异(表4)。

综上所述，苗盘育苗试验中：相比于普通育苗基质(CK)，添加功能菌研制成的育苗生物基质(PA)对黄瓜苗、白菜、番茄的生长有明显的促生效果，部分生长指标均有显著性差异。

序列表

<110> 重庆市农业科学院

<120> 一株枯草芽孢杆菌PA8及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1454 bp

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

gggcatggcg ggtgctataa tgcgatcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta wttcraagca acgcgaagaa cccttaccag 960

gtcttgacat cctctgacaa tcctagaaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020

ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag 1080

cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga 1140

caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca 1200

cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca 1260

aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag 1320

taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc 1380

acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttagga gccagccgcc 1440

gaagtgacag atgt 1454

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌PA8，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌PA8保藏于中国典型培养物保藏中心，分类名为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏日期为2020年8月15日，保藏号为CCTCC M 2020387。

2.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌PA8在促IAA合成、铁载体合成、抑制尖孢镰刀菌一种或多种作用的菌剂中的应用。

3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌PA8的应用，其特征在于：具体在功能型蔬菜育苗基质中应用。

4.如权利要求2所述的枯草芽孢杆菌PA8的应用，其特征在于：具体是将枯草芽孢杆菌PA8接种至普通育苗基质中混合均匀，形成新的育苗基质，枯草芽孢杆菌PA8的接种量与基质干重的比值为5mL/100g，枯草芽孢杆菌的浓度为10⁸ CUF/mL。