CN104498363A - 一种促生长的植物内生球孢白僵菌菌株及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促生长的植物内生球孢白僵菌菌株及应用，所述的植物内生球孢白僵菌菌株为球孢白僵菌菌株(Beauveria bassiana)Bb4，已于2014年4月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.9097；将该菌株接种于玉米、小麦等，可在宿主体内定殖，能促进宿主植物的生长，对玉米螟幼虫有一定的毒性。将该菌株用于生产微生物肥料制剂，有助于减少农药残留，保护生态环境。

Description

一种促生长的植物内生球孢白僵菌菌株及应用
技术领域
本发明涉及一种促生长的植物内生球孢白僵菌菌株及应用。
背景技术
    内生真菌可通过自身的代谢产物或存在本身借助于信号作用对植物施加影响，从而在“内生菌--植物--动物--环境”的复合生态***中扮演重要角色。很多研究表明，感染了内生真菌的宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗病害、抗动物危害等优势，比未感染植株更具有生存竞争力；并且由于内生真菌分布广、种类多，因而近年来植物内生真菌已引起了微生物学家、生态学家、植物保护学家的广泛兴趣，逐渐成为国内外研究的热点；目前发现，内生菌对宿主植物至少有以下几个方面的有益作用：促进宿主植物的生长发育、增强宿主植物的抗干旱、抗高温耐性、抗动物(昆虫、线虫、食草哺乳动物等)摄食、抗病原真菌和细菌以及他感作用等。
很多的植物内生真菌具有促生长作用，Diene等发现内生真菌Helminthosporium velutinum侵染宿主后能够明显增加甜高粱的生物量；Malinowski等发现感染了内生真菌的酥油草根系有更强的吸收P的能力，同时根系内Ca、Mg含量也较高；高微微等研究发现3种小菇属内生真菌能够促进铁皮石斛幼苗生长、促进金线莲侧芽及侧根的萌发，对铁皮石石斛和金线莲的成功栽培具有实际应用价值。
球孢白僵菌是一种昆虫病原真菌，广泛分布于全世界，可寄生鞘翅目、半翅目、鳞翅目等共 15目、149科、521属、707种昆虫以及蜱螨目的6科、10余种螨和婢。具有致病力强，寄主范围广，对人、畜无毒害，不伤害天敌，不污染环境等优点，广泛应用于有害生物的综合防治。
球孢白僵菌不仅是一种昆虫病原真菌，也是植物的内生真菌。从上个世纪90年代开始，国内学者已陆续在西红柿、马铃薯、棉花、咖啡、香蕉等植物体内分离到球孢白僵菌。不过目前仍然没有见到内生球孢白僵菌促进宿主植物生长的报道。据国家***发布的统计数字表明，2012 年玉米已成为我国第一大粮食作物品种，如果内生球孢白僵菌具有促生效应，将为玉米的丰产高产提供参考依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促生长的植物内生球孢白僵菌菌株及应用。
本发明的技术方案如下：
促生长的植物内生球孢白僵菌菌株，所述的植物内生球孢白僵菌菌株为球孢白僵菌菌株(Beauveria bassiana)Bb4，已于2014年4月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.9097，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
促生长的植物内生球孢白僵菌菌株，所述球孢白僵菌菌株（Beauveria bassiana）Bb4的菌落粉状，呈白色，稍后逐渐变为淡黄色；所述的菌株菌丝有隔膜和分枝；分生孢子近球形或球形，透明，光滑；产孢细胞瓶梗形，生于菌丝、分生孢子梗或柄细胞上，在分生孢子梗或膨大的泡囊上会形成产孢轴，呈膝状弯曲，即之字形。
将保藏的植物内生球孢白僵菌菌种按5%接种量到SDAY固体培养基中，活化培育10-14天即可制备得到孢子悬浮液。
将保藏的植物内生球孢白僵菌菌种按2-3%接种量到液体SDAY培养基中，活化培育7-15天得到菌液。 
所述的促生长的植物内生球孢白僵菌菌株在玉米、小麦等作物的种子或幼苗中的应用。
用真菌通用引物ITS1/ITS4对该菌株进行rDNA ITS的PCR扩增，并对ITS PCR扩增产物进行测序，将测序结果去除载体引物序列后拼接成完整的核苷酸序列，其大小均为569 bp，将所得序列在GenBank核酸序列数据库中进行BLAST搜索，发现测试菌株的ITS区域与已报道的球孢白僵菌B. bassiana和有性型Codyceps bassiana的同源性最高，多数达100%；利用软件分析，采用邻接法构建了进化树，结合其形态学特征，因此确定该菌株为球孢白僵菌(B. bassiana)。
通过常规的微生物固体发酵或液体发酵方法可以培养本发明所述的植物内生真菌，并制得以本发明所述的植物内生真菌----内生球孢白僵菌为主要成分的微生物肥料；该菌的最适生长温度为25℃，最适pH为6.0-7.0，可用一般发酵工业中固体发酵罐和机械搅拌发酵罐进行培养，在制造以本发明所述的内生球孢白僵菌为微生物肥料时，可以使用该技术领域中已知球孢白僵菌生防菌剂通用的培养基，配制成水剂、粉剂等剂型。
本发明的有益效果：
本发明的菌种接种于玉米、小麦等，可在宿主体内定殖，能促进宿主植物的生长，对玉米螟幼虫有一定的毒性；将该菌株用于生产微生物肥料制剂，有助于减少农药残留，保护生态环境。
附图说明
图1   内生球孢白僵菌浸种法处理20d后玉米不同器官内目标菌回收结果；
图2    内生球孢白僵菌对玉米发芽的影响；
图3   内生球孢白僵菌对玉米出苗率的影响；
图4    内生球孢白僵菌对玉米幼苗根系活力的影响；
图5   内生球孢白僵菌对玉米幼苗叶绿素含量的影响。
具体实施方式
实施例1：内生球孢白僵菌通过浸种法在玉米体内的定殖情况，如图1所示：
挑选产孢良好的球孢白僵菌各菌株平板，用接种环刮取孢子加入 50ml 无菌水中，漩涡振荡仪振荡混匀后，过滤，计数，调整孢悬液浓度为5×107 个/ml，挑选颗粒饱满的玉米种子，放入孢悬液中浸泡 8h ，将浸泡处理的玉米种子种下，做好标记，对照用无菌水处理。20d 后不仅从根内分离得到接种菌，从茎、叶、叶柄内同样可以分离得到接种菌，说明菌体能够通过玉米的种皮入侵植株，并且菌体可以从根部向茎部、叶部转移。
实施例2：内生球孢白僵菌促玉米发芽实验，如图2所示：
挑选产孢良好的球孢白僵菌各菌株平板，制备浓度为1×106个/ml的孢悬液；分别将种粒饱满，大小均匀的玉米种子浸入 75% 乙醇中浸泡 10min，无菌水冲洗后浸入内生球孢白僵菌孢子悬浮液中，室温下浸泡 12h 后取出，以用无菌水浸泡的种子为对照。
用灭过菌的吸水纸吸干多余的悬浮液，置于铺有用无菌水润湿过滤纸的培养皿中，每皿 20 粒，每个处理 5 个皿，5 次重复，置于 25℃ 光照培养箱中培养3d，每隔 12h 记录发芽数，计算发芽势和发芽率。结果显示，使用内生球孢白僵菌浸种处理玉米后，可显著提高玉米的发芽势、发芽率。
实施例3：内生球孢白僵菌促玉米幼苗生长实验；
随机挑选玉米种子，表面消毒后，用浓度为1×107 个/ml的球孢白僵菌孢子悬浮液浸泡12h后种于灭菌蛭石中，25℃温室条件，浇适量无菌水，30d后调查出苗数、株高、生物量和根系活力，每个处理100株，共设5次重复。以无菌水浸泡处理的种子作为对照。结果显示内生球孢白僵菌出苗率、生物量、株高、根系活力、植株叶片总叶绿素含量，对玉米具有一定的促生长作用，如表1、图3、4、5所示。
表1内生球孢白僵菌对玉米幼苗生物量和株高的影响

Claims (5)

1.一种促生长的植物内生球孢白僵菌菌株，其特征在于，所述的植物内生球孢白僵菌菌株为球孢白僵菌菌株(Beauveria bassiana)Bb4，已于2014年4月28日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.9097。
2.根据权利要求1所述的促生长的植物内生球孢白僵菌菌株，其特征在于，所述球孢白僵菌菌株(Beauveria bassiana)Bb4的菌落粉状，呈白色，稍后逐渐变为淡黄色；所述的菌株菌丝有隔膜和分枝；分生孢子近球形或球形，透明，光滑；产孢细胞瓶梗形，生于菌丝、分生孢子梗或柄细胞上，在分生孢子梗或膨大的泡囊上会形成产孢轴，呈膝状弯曲，即之字形。
3.一种如权利要求1所述的促生长的植物内生球孢白僵菌菌株的培育方法，其特征在于，将保藏的植物内生球孢白僵菌菌种按5％接种量到SDAY固体培养基中，活化培育10-14天即可制备得到孢子悬浮液。
4.一种如权利要求1所述的促生长的植物内生球孢白僵菌菌株的培育方法，其特征在于，将保藏的植物内生球孢白僵菌菌种按2-3％接种量到液体SDAY培养基中，活化培育7-15天得到菌液。
5.如权利要求1所述的促生长的植物内生球孢白僵菌菌株在玉米、小麦等作物的种子或幼苗中的应用。
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