CN104450551A

CN104450551A - 一株防治立枯病的枯草芽孢杆菌dppg-26及应用

Info

Publication number: CN104450551A
Application number: CN201410386872.6A
Authority: CN
Inventors: 武占省; 凃亮; 李春; 何艳慧; 樊艳爽
Original assignee: Beijing Institute of Technology BIT; Shihezi University
Current assignee: Beijing Institute of Technology BIT; Shihezi University
Priority date: 2014-08-03
Filing date: 2014-08-03
Publication date: 2015-03-25

Abstract

本发明公开了一株防治苗期立枯病的枯草芽孢杆菌DPPG-26，所述菌种的保藏号为CGMCC No.9393。该菌为革兰氏阳性菌，具有广谱抑菌活性和极强的抗逆能力，并能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，控制病害发生。菌株DPPG-26发酵原液抑菌效价为213.3 U₁，经硫酸铵逐级盐析结合离子交换层析分析其抑菌物质主要是蛋白质。另外，该菌能产生几丁质酶，能够很好的抑制病原菌立枯丝核菌菌丝的延伸，能够有效的防治加工番茄立枯病发生。本发明的发酵菌液其处理过的植株株高、鲜重和干重分别增加了23.81％、42.57％和30.38％，防治效果为58.62％，能有效增加植株的营养体生物量。本发明的菌株培养条简单，易保存，对环境友好，具有良好的开发应用潜力。

Description

一株防治立枯病的枯草芽孢杆菌DPPG-26及应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域。更具体的，本发明涉及一株防治立枯病的枯草芽孢杆菌DPPG-26及应用。

背景技术

加工番茄是新疆主要的经济作物。新疆加工番茄种植面积达一百多万亩，番茄年生产总值占全国的90％，番茄产业经过15年的发展，已经形成产业化、规模化生产，年出口量占全国市场份额的70％，有番茄酱生产厂40余家，建成番茄酱加工生产线151条，年加工能力已达到80万吨，加工装备能力占全国加工总能力的90％。但加工番茄苗期立枯病发生严重，直接影响到新疆加工番茄产业的可持续性发展。因此，找到适合新疆本土土壤和气候条件并能够结合新疆栽培模式使用的生物农药受到更多关注。

立枯丝核病菌Rhizictonia solani Kuhn，是一种土壤习居菌，可寄生180多科、上千种植物，棉花及番茄幼苗出土至定植前均可受害。低温高湿的条件十分有利于该病的发生，由于新疆春季较寒冷，作物播种后通常会发生倒春寒和阴雨天气，常引起苗期立枯病大发生，为害严重。由Rhizictonia solani Kuhn引起的棉苗烂根病一般发病率为27％-75％，严重的达90％以上，有时由于烂种死苗较多，造成缺苗断垄，大大影响植株生长。一般加工番茄苗期立枯病的发病率为10-20％，有些年份可达50％以上，严重年份甚至可造成作物毁种重播。近年来，随着滴灌措施的实施和常年连作，该病发生率还有逐年上升的趋势。

由立枯丝核菌(Rhizictonia solani)引起的苗期立枯病是一类分布广、危害重、难防治的土传病害，在病害防治方面，由于化学农药存在污染环境，易造成农药残留，破坏生态平衡等问题，而选育和推广抗性品种由于要考虑病原菌复杂的致病型，因此难以取得很大的突破。针对这种情况，人们逐渐地将目光转向从自然界中筛选和开发防治立枯病的高效生防菌剂。芽孢杆菌作为一种良好的研究材料一直倍受瞩目。国内外筛选到的许多生防有效菌株都是该属的成员。

目前国外利用枯草芽孢杆菌防治由Rhizoctonia solan，Pvthium spp.，Fusarium spp.和Botryadiplodia solani-tuberosi引起的病害，取得较好的效果。美国已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局(EPA)商品化或有限商品化生产应用许可，它们是GB03，MBI600，QST713 和FZB24。美国Gustafson公司和MierobioLtd.公司开发的GB03和MB1600，GB03和MB1600用于拌种或根施可防治Fusarium、Aspergillus、Altrernaria和Rhizoctonia引起的棉花、豆类、麦类和花生根部病害；菌株FZB24用于温室或室内栽培树苗和灌木根部可防治Fusarium和Rhizoctonia引起的根腐病和枯萎病；菌株QST713能防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的细菌和真菌病害。日本东京技术研究所的Bacillus subtills RB14和Bacillus subtilis NB22分别对Rhizoctonia solani，Fusarium oxysporum和Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防效(Asaka O，Shoda M.Biocontrol of Rhizoctonia solani damping-off of tomato with Bacillus subtilis RB14[J].Appl Environ Microbiol，1996，62(11)：4081-4085.)。很多优良的枯草芽孢杆菌菌株已经应用于生产实践。

我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平。江苏农业科学院植物保护研究所的B916菌株对多种病原真菌和水稻白叶枯病菌都有显著抑制作用，对水稻纹枯病田间防效达50-81％，与井岗霉素按一定比例混合后可提高防病效果。目前已进行农药登记，年使用面积达67000公顷。南京农业大学生防菌B3对小麦纹枯病田间防效达50-80％，增产达5.6-20.2％。莱阳农学院BL03和XM16菌株对苹果霉心病和棉花炭疽病田间防效达90％。B.subtilis S9和生防菌绿色木霉、毛壳菌可以混合使用，提高防病效果(林福呈，李德葆.枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis S9对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报，2003，33(2)：174-177)，现已开发了生防制剂产品威绿达(VIRIDA)，在浙江省蔬菜作物中使用累计推广面积达到333公顷。B.subtilis S0113对水稻白叶枯病菌(Xan thomonas Oryzae pv.Orzae)具有强烈的抑菌作用(林东，徐庆，刘忆舟，等.枯草芽孢杆菌S0113分泌蛋白的抑菌作用及抑菌蛋白的分离纯化[J].农业生物技术学报，2001，9(1)：77-80.)。

然而，生物农药能够对土壤中的这些病原物产生一定抑制作用从而起到防病功能，但土壤中存在的大量微生物也能影响生物农药中的主要成分活性微生物的存活从而影响其防病效能，防治作物土传病害的微生物农药存在很强的地域适应性，而且，不同的气候条件和土壤性质都影响了功能微生物的生防效应的发挥。因此许多在其它地方具有很好防病效能的微生物农药，到了新疆很多时候表现不稳定。

这就迫切需要利用从新疆本地筛选出的适合本土的高效防病微生物，开发适宜于新疆特殊地理气候条件下使用的新的生物农药，不但可以很好地控制以加工番茄和棉花为主的经济作物上的土传病害的发生，还会保证新疆农业和经济可持续发展，同时将会取得良好的经济和生态效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种适宜于新疆特殊地理气候环境下能够很好地控制以加工番茄为主的经济作物的立枯病病害发生的防病促生菌株及其用途。

本发明所述的DPPG-26菌为枯草芽孢杆菌，保藏日期：2014年6月30日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.9393，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。其特点在于该菌为革兰氏阳性菌，该菌能产生抑菌蛋白和几丁质酶，具有广谱抑菌活性和极强的抗逆能力，并能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，能够有效的防治加工番茄早春苗期立枯病害的发生，为提高加工番茄的品质和产量提供技术支持。

具体内容如下：

在本发明中，首先从新疆特殊环境中分离筛选获得抑制立枯病菌生长的生防菌DPPG-26菌株。经过生理生化试验鉴定：菌株DPPG-26经革兰氏染色和芽孢染色后镜检，结果发现，该细菌经芽孢染色后可以看见红色短杆状的菌体中间有绿色芽孢，形状近似椭圆形，经革兰氏染色后均呈蓝紫色，KOH实验没有丝状物拉出，为革兰氏阳性菌。菌株的16S rDNA鉴定表明，基因测序获得的菌株DPPG-26的16S rDNA序列片段大小为1546bp，在NCBI网站进行序列同源性比对分析，结合生理生化特征的鉴定结果，DPPG-26为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

将活化的DPPG-26接种到BPY培养基中，培养基初始pH值为6.0，装液量为250mL三角瓶装液50mL，接种量为5％，在温度30℃的摇床中培养48h，转速为180r/min，获得活菌数为10⁹--10¹¹cfu/mL。

采用本发明的发酵菌液浸种加工番茄种子和苗期菌液灌根接种处理后，能明显增加工番茄种子的发芽率、出苗率及幼苗的鲜重和干重，进一步说明该菌株具有一定的防病促生作用。

具体技术措施是将DPPG-26菌株的发酵液(10⁹--10¹¹cfu/mL)浸泡加工番茄种子和苗期菌液灌根接种处理1次，并设3个对照(CK₁：灭菌培养液浸种，土壤接种丝核菌；CK₂：灭菌培养液浸种，土壤为灭菌土；CK₃：用种子重量0.8％的化学农药PCNB拌种，土壤接种丝核菌)。调查出苗率和发病情况。采用本发明的发酵菌液灌根处理加工番茄种子，对加工番茄早春苗期立枯病具有较好的防治效果，其防治效果为58.62％，而PCNB的防治效果为12.62％。对各处理的干重和鲜重进行了测定，结果表明本发明的发酵菌液其处理过的其处理过的植株株高、鲜重和干重分别增加了23.81％、42.57％和30.38％，能有效增加植株的营养体生物量。

通过对本发明的发酵产物进行硫酸铵分级盐析、水合茚三酮反应表明本发明的发酵菌生长的过程中主要产生了蛋白类的抗菌物质。该抑菌蛋白除了对加工番茄立枯病菌有较高的抑菌活性外，对茄菌核、番茄早疫病菌、西瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌也有较好的抑制作用，对病原细菌西瓜细菌性果斑病菌也有一定的抑菌效果。

所述的防病菌株为枯草芽抱杆菌，菌株发酵原液抑菌效价为213.3U_I，该菌能产生几丁质酶，能够很好的抑制病原菌立枯丝核菌菌丝的延伸，能够有效的防治加工番茄立枯病的发生。

本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种适宜于新疆特殊地理气候条件应用的防病促生菌株DPPG-26(CGMCC No.9393)，防病能力强、应用效果稳定。特别是可以很好地控制以加工番茄为主的经济作物的立枯丝核菌发病的生防菌株，具有较强潜力开发适宜于新疆特殊地理气候条件下使用的新型生物农药。

附图说明

图1：不同培养基对DPPG-26生长的影响

图2：DPPG-26抑菌粗蛋白的DEAE-sepharose离子交换色谱图

图3：纯化后几丁质酶平板对峙实验

图4：纯化后几丁质酶抑菌显微观察

具体实施方式

下面通过具体实施例对发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1防病促生菌DPPG-26的鉴定

将活化的DPPG-26接种到BPY培养基中，培养基初始pH值为6.0，装液量为250mL三角瓶装液50mL，接种量为5％，在温度30℃的摇床中培养48h，转速为180r/min。

根据菌体形态特征、菌落形态及革兰氏染色结果，结合《伯杰细菌鉴定手册》(Bergey’s Manual of etermitive Bacteriology)第八版和《常见细菌鉴定手册》进行生理生化特性的鉴定。以及芽孢杆菌的16S rDNA鉴定。

经过生理生化试验鉴定：菌株DPPG-26为红色短杆状的菌体中间有绿色芽孢，形状近似椭圆形，经革兰氏染色后均呈蓝紫色，KOH实验没有丝状物拉出，为革兰氏阳性菌。

表1 菌株DPPG-26的生理生化特性

注：“+”：反应呈阳性或者可以生长、利用；“-”：反应呈阴性或者不可以生长、利用。

16S rDNA鉴定

测序获得的DPPG-26的16S rDNA序列片段大小为1546bp，菌株DPPG-26菌株形态学、生理生化特征符合枯草芽孢杆菌属(Bacillus subtilis)特征，且序列分析表明，菌株DPPG-26与Bacillus atrophaeus strain ATCC 51189(EF188847.1)的同源性最高，同源性在99％以上。由此鉴定，菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

实施例2枯草芽孢杆菌DPPG-26的培养特性

1、BPY培养基：

蛋白陈10.0g，酵母浸膏5.0g，牛肉浸膏5.0g，NaCl 5.0g，葡萄糖5.0g，蒸馏水1000mL，pH6.0

2、合成培养基：

合成培养基：MgSO₄·H₂O 0.2％，K₂HPO₄ 1.05％，KH₂PO₄ 0.45％，(NH₄)₂SO₄ 1％，柠檬酸钠·2H₂O 0.5％，1％胶体几丁质20％。

从图1中可以看出，使用合成培养基与BPY培养基相比，菌株DPPG-26菌体量减小，发酵时延滞期明显变长，在8小时达到对数生长期；达到稳定期的时间提前，比在BPY培养基培养提前3个小时，并且出现明显的稳定期。

实施例3枯草芽孢杆菌DPPG-26对番茄生物量的测定

将DPPG-26菌株的发酵液(10¹¹cfu/mL)浸泡加工番茄种子12h后晾干备用。立枯丝核菌用麦麸培养基培养5-7天与灭菌土以1∶8的体积比充分拌匀后装入营养钵中。将处理过的加工番茄种子均匀播入拌有立枯丝核菌的营养钵中，每钵15粒种子，每处理重复3次，并设3个对照(CK₁：灭菌培养液浸种，土壤接种丝核菌；CK₂：灭菌培养液浸种，土壤为灭菌土；CK₃：用种子重量0.8％的化学农药PCNB拌种，土壤接种丝核菌)。定期浇水，出苗后15天调查出苗率和发病情况，对各处理的干重和鲜重经行了测定。

表2 番茄苗期立枯病防效测定

表2结果可以看出，DPPG-26能提高番茄种子的发芽率，促进加工番茄苗期的生长，又可显著抑制病原菌，降低番茄苗期立枯丝核菌的发病率，具有促生和防病双重功能。DPPG-26处理相对防治效果为58.62％，高于化学农药PCNB的防治效果。发酵菌液其处理过的植株株高、鲜重和干重分别增加了23.81％、42.57％和30.38％，表明DPPG-26能有效增加植株的营养体生物量。

实施例4枯草芽孢杆菌PPG-26抑菌粗蛋白的分析

将DPPG-26发酵液经硫酸铵分级盐析的抗菌粗蛋白，离心过滤后，分别用平衡缓冲液(20mmol/L pH7.0的磷酸钠缓冲液)稀释，经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析后，分别用含0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L和1mol/L NaCl进行分步洗脱，并配合紫外检测仪在280nm的波长下检测，并收集各个洗脱液浓度下洗脱下来的蛋白检测其抑菌活性。

从图2可看出，DPPG-26有四个蛋白洗脱峰，分别为蛋白质浓度高，无抑菌活性，主要为杂蛋白质的磷酸缓冲液洗脱的流穿峰，而含0.3mol/L、0.4mol/L和0.5mol/L NaCl溶液洗脱出来的具有抑菌活性的活性蛋白峰。

实施例5枯草芽孢杆菌DPPG-26产几丁质酶抗菌活性

平板对峙法检测抗菌活性

将分离纯化的几丁质酶按照平板对峙法测定其抑菌活性，从图3中可以发现DPPG-26产几丁质酶能够很好的抑制病原菌立枯丝核菌菌丝的延伸，在孔周围出现抑菌圈，菌丝靠近抑菌圈边缘菌丝发黄，萎缩，卷曲不规则，说明新生菌丝无法延伸，有新物质不断沉积，菌株DPPG-26产几丁质酶能够有效的抑制病原菌新生菌丝的合成，具有抑菌作用。

抗菌机理的光学显微分析

为检测DPPG-26产几丁质酶对立枯丝核菌成熟菌丝的作用，用纯化的几丁质酶处理立枯丝核菌菌丝48h后，在光学显微镜下(20×20倍)观察结果，以用三蒸水处理为对照。

从图4中可以明显看出，使用几丁质酶处理的病原菌菌丝断裂，细孢壁被降解，原生质外泄，说明DPPG-26产几丁质酶能够杀死立枯丝核病原真菌，具有杀菌作用。

Claims

1.一株防治立枯病的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DPPG-26菌株，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2014年6月30日，保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号：CGMCC No.9393。

2.权利要求1所述菌株，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌DPPG-26由新疆特殊环境中分离筛选获得，在BPY培养基上，30℃条件下培养48h。在培养基上呈乳白色，近似椭圆形，中央突起，无荧光。

3.根据权利要求2所述菌株，其特征在于所述的BPY培养基是由下列成分组成：蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，牛肉浸膏5.0g，NaCl5.0g，葡萄糖5.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

4.根据权利要求2所述菌株，其特征在于该菌为革兰氏阳性菌，具有广谱抑菌活性和极强的抗逆能力，并能在真菌性病原菌丝体表面繁衍定殖，有效抑制病菌生长，控制病害发生。

5.根据权利要求4所述菌株，其特征在于所述的目标病原真菌是病原真菌：瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、立枯丝核病菌(Rhizoctonia solani)、番茄枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、菌核病菌(Sclerotiniasclerotioum)。

6.根据权利要求4所述菌株，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌DPPG-26产几丁质酶，能够有效的抑制病原菌新生菌丝的合成，具有抑菌作用。

7.根据权利要求4所述菌株，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌DPPG-26，经硫酸铵逐级盐析结合离子交换层析分析其抑菌物质主要是蛋白质。

8.根据权利要求4所述菌株，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌DPPG-26的发酵液其处理过的植株株高、鲜重和干重分别增加了23.81％、42.57％和30.38％，防治效果为58.62％，提高棉花种子的出苗率和发芽率，且促进了棉苗的生长。