CN105272968B - (3s,6r)‑3,6二取代哌嗪‑2,5‑二酮,其制备及应用 - Google Patents
(3s,6r)‑3,6二取代哌嗪‑2,5‑二酮,其制备及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了u‑PA抑制剂(3S,6R)‑3‑(4‑丁氨基)‑6‑(吲哚‑3‑乙基)‑哌嗪‑2,5‑二酮,公开了它的制备方法,公开了它抑制肿瘤细胞侵袭和迁移,进一步公开了它的止血和抗炎等作用。本发明属于生物医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及了下面结构式所示的小分子u-PA抑制剂,涉及它的制备方法和作为u-PA抑制剂在抑制肿瘤侵袭和迁移、止血和抗炎方面的应用。本发明属于生物医药领域。
背景技术
纤溶酶原激活***由纤溶酶原激活剂(Pas),纤溶酶原激活抑制剂(PAIs)和细胞外纤溶酶原激活剂受体(PAR)组成。纤溶酶原激活***涉及细胞迁移,血管生成,伤口愈合,胚胎发育,肿瘤细胞扩散和转移等一系列过程。在哺乳动物体内主要有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)两种纤溶酶原激活剂。
尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)是从人尿或肾细胞组织培养液中提取的一种丝氨酸蛋白酶,属双链尿激酶型纤溶酶原活化剂(tcu-PA),分子量为55000或33000,是外源性纤维溶解***的激活剂。u-PA可以直接裂解纤溶酶原的精氨酸(560)-缬氨酸(561)肽键,使无活性的单链纤溶酶原转变为有活性的双链纤溶酶。
在肿瘤组织中,u-PA激活纤溶酶原转化为纤溶酶,纤溶酶直接或间接造成细胞外基质降解,进一步导致肿瘤细胞的浸润,转移和血管生成,促进肿瘤的增殖。在血液循环中,u-PA通过激活纤溶酶原参与调节血管内凝血-纤溶的平衡,对抑制血栓起重要作用。
在炎症应答过程中,u-PA通过与炎症细胞表面的u-PAR结合,参与调节炎症细胞对血管和组织的渗透能力,促进炎症细胞向炎症部位迁移,促进炎症反应以及炎症因子的释放,而炎症因子的释放又会诱导u-PA表达上升。
由于u-PA的酶活性贯穿在肿瘤-纤溶-炎症复杂的交叉联系中,所以影响u-PA的活性会影响复杂的交叉联系。也就是说,发明优秀活性的u-PA抑制剂对于抑制u-PA在肿瘤-血栓-炎症交叉联系有重要意义。这种意义体现在70%以上癌症病人死于癌转移;有大约10%的癌症晚期病人出现出血症状,例如出现几乎无法预测鼻,咽,肺或胃肠道大出血; 摘除肿瘤手术发生的出血,也恶化病人的预后。针对这种状况,本发明提出了(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮,其制备及治疗作用。
此前,发明人曾报道下面结构的二酮哌嗪包括CIPPC是u-PA抑制剂(结构见图1),有优秀的止血活性。1nmol/kg剂量下,CIPPC能显著降低小鼠鼠尾出血时间[33,34]。不幸的是,在10nmol/kg剂量下CIPPC能促进血栓生成。血栓是肿瘤本人重要的并合症,是造成肿瘤本人死亡的重要因素。CIPPC能促进血栓生成的作用为肿瘤病人带来了新的威胁。对比之下,(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮的意想不到的优势是,除了与CIPPC一样有优秀的止血活性外,还有抑制肿瘤细胞浸润和转移,抑制肿瘤本人并发炎症作用,同时不会引起血栓形成。
发明内容
本发明的第一个内容是提供下面结构式的u-PA抑制剂(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮;
本发明的第二个内容是提供(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮的制备方法,该方法包括下面四个反应步骤:
(1)在DCC和HOBt存在下L-Trp-OBzl在无水四氢呋喃中与L-Boc-Lys(Z)缩合为D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl;
(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl脱去Boc生成D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl;
(3)在乙酸乙酯和5%NaHCO3存在下D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl生成(3S,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮;
(4)在Pd/C和H2存在下,在甲醇中(3S,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮反应生成(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮。
上面的四个反应步骤可以用图2的合成路线描述。
本发明的第三个内容是评价小分子u-PA抑制剂(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮在抑制肿瘤细胞侵袭和转移方面,以及止血和抗炎等方面的作用。
附图说明
图1此前发明人报道的u-PA抑制剂二酮哌嗪CIPPC的结构。
图2合成(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮的路线1.i)DCC,HOBt,NMM,THF;ii)HCl/EA(4N);iii)EA,5%NaHCO3(3a)or EA,TEA,80℃(3b,3c);iv)CH3OH,Pd/C,H2。
图3(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮在体外对UK激活纤溶酶原活力的影响。其中1列为单组分的人纤溶酶原(PLG),2列为UK与PLG的共孵育;3列为100μg(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮和5μL UK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分;4列为50μg(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮和5μL UK(400U/mL)与5μL PLG(5mg/mL)的共孵育组分;5列为10μg(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮和5μL UK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分;6列为500μg的EACA和5μLUK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分;7列为250μg的EACA和5μLUK(400U/mL)与5μL PLG(5mg/mL)的共孵育组分。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明,下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的,它们仅用来对本发明进行具体描述,不应当理解为对本发明的限制。
实施例1制备D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl(1)
将1.9g(5.0mmol)D-Boc-Lys(Z)混悬于20mL无水四氢呋喃,室温搅拌下向溶液中加入0.675g(5.0mmol)HOBt,冰浴搅拌下加入1.133g(5.5mmol)DCC,得到反应液I,冰浴下搅拌30分钟。将1.47g(5.0mmol)L-Trp-OBzl混悬于20mL无水四氢呋喃中,然后逐渐加入NMM,调节pH至8-9,得到反应液II。将反应液II加入反应液I中,先在冰浴下搅拌1h,再在室温搅拌,TLC监测至原料点消失。后处理:减压过滤除去DCU,将滤液减压浓缩除去四氢呋喃,残留物用150mL乙酸乙酯溶解,将得到的溶液置于250mL分液漏斗中,依次用5%KHSO4水溶液洗和饱和NaCl水溶液各洗3次,乙酸乙酯层用无水Na2SO4干燥30min,减压过滤,滤液减压浓缩至干,得到的黄色泡状物,经硅胶柱层析纯化(CH2Cl2∶CH3OH=100∶1~20∶1),得到2.863g(87.3%)标题化合物,为无色固 体。ESI-MS(m/e):657[M+H]+。
实施例2制备D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl(2)
将纯品2.62g(4.0mmol)D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl(1)置于100mL茄瓶中,冰浴搅拌下缓慢向反应瓶中滴加30mL4N氯化氢-乙酸乙酯溶液,加干燥管,冰浴搅拌下反应4小时后TLC监测原料点消失,终止反应。后处理:搅拌下用水泵将反应液减压抽干,加乙酸乙酯溶解后再次用水泵减压抽干,重复三次;加无水***充分混悬后静置,倾倒出***,抽干产物,重复三次,得2g(90.9%)标题化合物,为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e):557[M+H]+。
实施例3制备(3R,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(3)
将1.83g(3.29mmol)化合物D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl(2)以80mL乙酸乙酯溶解,用三乙胺调pH至9,油浴80℃反应6小时,TLC显示原料点基本消失。后处理:将反应液直接用硅胶拌样,硅胶柱层析纯化(CH2Cl2∶CH3OH=100∶1-20∶1),得到1.28g(86.9%)标题化合物,为无色固体。ESI-MS(m/e):449[M+H]+.1H NMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=10.89(s,1H),8.03(s,1H),7.85(s,1H),7.56(d,J=9.0Hz,1H),7.35(m,6H),7.19(t,J=6.0Hz,1H),7.05(m,2H),6.95(t,J=6.0Hz,1H),4.99(s,2H),4.07(s,1H),3.25(dd,J=3.0Hz,J=15.0Hz,1H),3.09(dd,J=3.0Hz,J=15.0Hz,1H),2.99(s,1H),2.91(q,J=6.0Hz,2H),1.48(m,2H),1.24(m,2H),1.16(m,2H)。
实施例4制备(3R,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(4)
将0.12g(0.26mmol)化合物(3R,6S)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮(3)置于50mL反应瓶中,加入10mL甲醇溶解,向溶液中加入30mg Pd/C,通入H2,室温搅拌反应48小时,TLC显示原料的基本消失,滤去Pd/C,减压浓缩得63mg(75%)标题化合物,为无色粉末。ESI-MS(m/e):315[M+H]+.Mp189-190℃.IR(KBr):3250,2860,2312,1662,1456,1325,1230,1093,1006,736cm-1.(c=0.32,CH3OH).1HNMR(300MHz,DMSO-d6):δ/ppm=10.92(s,1H),8.05(s,1H),7.88(s,1H),7.56(d,J=9.0Hz,1H),7.31(d,J=9.0Hz,1H),7.06(s,1H),7.04(t,J=9Hz,1H),6.94(t,J=9Hz,1H),4.07(s,1H),3.26(dd,J=3Hz,J=12Hz,1H),3.02(dd,J=6.0Hz,J=15Hz,1H),2.84(m,2H),2.44(m,2H),1.19(m,2H),1.10(m,2H).13C NMR(200MHz,DMSO-d6):δ/ppm=168.60,168.09,136.37,128.05,125.02,121.31,119.26,118.85,111.62,108.86,55.89,53.59,41.05,31.94,31.65,29.39,21.16.Elem.Anal:C17H22N4O2.C,64.95;H,7.05;N,17.82。
实验例1测定(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对尿激酶(UK)活性的影响
1)主要试剂和仪器
试剂:SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂及氨基己酸(EACA)均为市售试剂;
人纤溶酶原(PLG)和尿激酶(UK)购自Sigma公司。
仪器:垂直电泳槽Mini-PROREN Tetra System(BIO-RAD);
电泳仪Power Pac(BIO-RAD);
扫描仪Scanmaker8700(MICROTEK)。
2)溶液的准备
PLG溶液的配制:称取PLG5mg,置于15mL离心管中,加入1mL生理盐水溶解即得PLG溶液,浓度为5mg/mL;分装,每管0.1mL,-20℃保存待用;
UK溶液的配制:将整瓶UK(100,000U)以10mL生理盐水溶解,得母液;取0.1mL母液以生理盐水稀释至2.5mL,得UK溶液,浓度为400U/mL;分装,每管0.1mL,-20℃保存待用;
EACA溶液的配制:称取50mg化合物,以1mL生理盐水溶解,即得母液1,浓度为50mg/mL;取0.5mL母液1,以生理盐水稀释至1mL,得溶液2,浓度为25mg/mL;
(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮溶液的配制:称取5mg(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮,以1mL生理盐水溶解,浓度为5mg/mL;-20℃保存待用。
3)样品的准备
取5μL UK(400U/mL)溶液;分装,每管0.1mL,置于0.5mL离心管中,再向其中分别加入10μL生理盐水或(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮溶液,37℃孵育15分钟;再向各离心管中分别加入5μL PLG溶液,37℃孵育15分钟;孵育结束后,再向各离心管中分别加入5μL5×SDS电泳上样缓冲液,混匀后将各离心管于100℃水浴中变性5分钟,快速冰浴冷却后以12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离。
4)SDS-PAGE凝胶电泳
试剂准备:
30%储备胶溶液:丙烯酰胺(Acr)29.0g,亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g,混匀后加超纯水(up-H2O),37℃溶解,定容至100mL,棕色瓶存于室温;
1.5M Tris-HCl(pH8.0):Tris18.17g加up-H2O溶解,浓盐酸调pH至8.0,定容至100mL:
1M Tris-HCl(pH6.8):Tris12.11g加up-H2O溶解,浓盐酸调pH至6.8,定容至100mL;
12%SDS:电泳级SDS12.0g加up-H2O于68℃助溶,浓盐酸调至pH7.2,定容至100mL;
10%过硫酸铵(AP):100mg AP加up-H2O 1mL;
考马斯亮兰染色液:甲醇-水-醋酸=45mL+45mL+10mL,加入100mg考马斯亮蓝固体,配制成染色液;
脱色液:甲醇-水-醋酸=10mL+90mL+10mL,配制成脱色液。
操作步骤:
采用垂直式电泳槽装置
(一)聚丙烯酰胺凝胶的配制
1.分离胶(12%)的配制:
超纯水4.0mL
30%储备胶溶液3.3mL
1.5M Tris-HCl2.5mL
12%SDS0.1mL
10%AP0.1mL
取1mL上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)10μL封底,余加TEMED4μL,混匀后灌入玻璃板间,以水封顶,注意使液面平,凝胶完全聚合需大约60min。
2.浓缩胶(4%)的配制:
超纯水1.4mL
30%储备胶溶液0.33mL
1M Tris-HCl0.25mL
12%SDS0.02mL
10%AP0.02mL
TEMED2μL
将分离胶上的水倒去,加入上述混合液,立即将梳子***玻璃板间,完全聚合需大约30min。
(二)样品处理:将样品加入相应量的5×SDS上样缓冲液,100℃加热3-5min使蛋白变性,取出,快速降温。
(三)上样:将处理后的样品加入样品池中,并加入20μL蛋白分子量标准品作对照。
(四)电泳:在电泳槽中加入1×电泳缓冲液,连接电源,负极在上,正极在下,电泳时,浓缩胶电压80V,30min,分离胶电压100V至电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需1.5h)。
(五)染色:将胶从玻璃板中取出,考马斯亮兰染色液染色,于摇床(60RPM)室温10min。
(六)脱色:将胶从染色液中取出,放入脱色液中,于摇床(60RPM)室温脱色过夜。
(七)将脱色后的胶用扫描仪扫描,观察结果。
5)结果见图3,(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮浓度依赖地抑制UK水解人纤溶酶原的活性。说明它是UK的抑制剂。
实验例2测定(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对HCCLM3细胞侵袭能力的影响
1)受试样品
(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮用含0.1%DMSO的DMEM培养基配制成50μM浓度;
RGDS用含0.1%DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。
2)细胞株
HCCLM3(高转移人肝癌细胞),购自ATCC。
3)主要仪器及耗材
超净台:VS-1300-U洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;
细胞孵育箱:INC153,memmer公司;
显微镜:Zeiss公司;
8.0μm孔径的Transwell小室、12孔细胞培养板和25cm2培养瓶:Coming Costar公司。
4)主要试剂
DMEM培养基干粉:Gibco公司;
PBS缓冲液:每1L溶液中含有NaCl8.2g、KCl0.2g、Na2HPO4·H2O1.56g、KH2PO40.2g,PH值7.4;
胎牛血清:Hyclone公司;
0.25%胰酶溶液:Hyclone公司;
青霉素、链霉素:石药集团中诺药业(石家庄)有限公司;
DMSO(二甲基亚砜):Hyclone公司;
Matrigel(基质胶):BD公司;
结晶紫染液:碧云天公司。
5)评价方法
包被基质胶:将冻存于-20℃冰箱的matrigel 4℃过夜,变成液态;取720 μL无血清DMEM培养基,加入180 μL Matrigel,混匀,加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室,100μL/个;放入37℃、5%CO2培养箱中,孵育5 h;
水化基底膜:吸除小室中残留液体,每孔加入50 μL的DMEM培养基,37℃、5%CO2培养箱中孵育30 min;
接种细胞:消化HCCLM3细胞,无血清DMEM培养基洗3次,计数,配成细胞悬液,密度为5×105个/mL;每孔加入100 μL细胞悬液,同时加入25 μL(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮使终浓度为10 μM,RGDS终浓度为20μM;下室加入600 μL的含10%FBS的DMEM培养基,在37℃、5%CO2培养箱中培养48小时;
结晶紫染色:用棉签擦去基质胶和上室内的细胞;用4%的多聚甲醛固定细胞30min,吸除固定液,用PBS洗3次;用0.1%的结晶紫染液染色30 min,吸除染色液,用PBS洗3次;
计数:在每个小室选取9个大致相同的视野观察,拍照,计数;实验数据统计均采用t检验和方差分析,细胞数以(个)表示。
6)结果见表1,(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮能有效地抑制HCCLM3细胞侵袭。
表1.(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对HCCLM3细胞侵袭能力的影响a
a)n=3;b)与生理盐水比P<0.05.
实验例3评价(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对HCCLM3细胞迁移能力的影响
1)受试样品
化合物4用含0.1%DMSO的DMEM培养基配制成50μM浓度;
RGDS用含0.1%DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。
2)细胞株
HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。
3)主要仪器及耗材
超净台:VS-1300-U洁净工作台,苏州安泰空气技术有限公司;
细胞孵育箱:INC153,memmer公司;
显微镜:Zeiss公司;
8.0μm孔径的Transwell小室、12孔细胞培养板和25cm2培养瓶:Coming Costar公司。
4)主要试剂
DMEM培养基干粉:Gibco公司;
PBS缓冲液:每1L溶液中含有NaCl8.2g、KCl0.2g、Na2HPO4·H2O1.56g、KH2PO40.2g,PH值7.4;
胎牛血清:Hyclone公司;
0.25%胰酶溶液:Hyclone公司;
青霉素、链霉素:石药集团中诺药业(石家庄)有限公司;
DMSO(二甲基亚砜):Hyclone公司;
结晶紫染液:碧云天公司。
5)评价方法
接种细胞:消化HCCLM3细胞,无血清DMEM培养基洗3次,计数,配成细胞悬液,密度为2×106个/mL;每孔加入100μL细胞悬液,同时加入25μL(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮使终浓度为10μM,RGDS终浓度为20μM;下室加入600μL的含10%FBS的DMEM培养基,在37℃、5%CO2培养箱中培养6小时;
结晶紫染色:用棉签擦去基质胶和上室内的细胞;用4%的多聚甲醛固定细胞30min,吸除固定液,用PBS洗3次;用0.1%的结晶紫染液染色30min,吸除染色液,用PBS洗3次;
计数:在每个小室选取9个大致相同的视野观察,拍照,计数;实验数据统计均采用t检验和方差分析,细胞数以(个)表示。
6)结果见表2,(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮能有效地抑制HCCLM3细胞迁移。
表2.(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对HCCLM3细胞迁移能力的影响a
a)n=3;b)与生理盐水比P<0.05.
实验例4评价(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对ICR小鼠鼠尾出血时间的影响
1)实验材料
受试化合物:化合物4;
阳性对照为6-氨基己酸(EACA);阴性对照为生理盐水(NS);
实验动物:ICR雄性小鼠(清洁级),体重18-22g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供;每10只小鼠一组,空白和阳性对照各一组;
溶剂:生理盐水。
2)药物配制
按量称取化合物4,加入生理盐水至所需浓度即可;6-氨基己酸(EACA)为生理盐水溶液。
3)给药剂量及给药方式
给药剂量:EACA为1.96mmol/kg;(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮为0.05μmol/kg;按照小鼠体重,每10g给0.1mL药液或者生理盐水;灌胃给药。
4)动物模型的建立
ICR雄性小鼠70只,体重18-22g,随机分为化合物组、EACA组和空白对照组,每组10只。各组按剂量灌胃给药。给药30分钟后,将小鼠装入固定装置内,使其尾巴暴露在外,以毫米尺准确测量,在距鼠尾末端3mm处做标记,用利剪在鼠尾末端标记出快速剪断,待血液能够自行溢出时开始计时,每隔30秒,用滤纸轻轻拭去断口处血滴,直至血液自然停止,即滤纸吸时无血为止。
5)统计方法
本实验数据统计均采用t检验和方差分析,出血时间以表示。
6)结果见表3,在比阳性对照EACA的剂量低3920倍时(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮仍然有效地缩短小鼠出血时间,说明它可有效地止血。
表3.(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对ICR小鼠鼠尾出血时间的影响 a
a)n=10;b)与生理盐水比P<0.01;c)与生理盐水比P>0.05.
实验例5测定(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-2酮对大鼠颈动脉血栓生成的影响
1)实验材料
受试化合物:(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮;
阳性对照为阿司匹林(Aspirin);阴性对照为生理盐水(NS);
实验动物:SD雄性大鼠(清洁级),体重180-220g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供;每10只大鼠一组,空白和阳性对照各一组;
溶剂:生理盐水。
2)药物配制
按量称取(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮,依次加入生理盐水至所需浓度即可;阿司匹林为生理盐水溶液。
3)给药剂量及给药方式
给药剂量:阿司匹林为50μmol/kg;(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮为0.05μmol/kg;按照大鼠体重,每100g给0.3mL药液或者生理盐水;灌胃给药。
4)动物模型的建立
SD雄性大鼠70只,体重180-220g,随机分为化合物组、阿司匹林组和空白对照组,每组10只。各组按剂量灌胃给药。给药30分钟后,各组大鼠以10%水合氯醛麻醉,分离出颈总动脉和颈总静脉,以大鼠颈总动脉-静脉插管旁路循环丝线法造成大鼠动脉血栓模型;循环15分钟,取出旁路管中的带栓丝线,拭去表面浮血,称带栓丝线湿重,减去丝线重量后,即得形成血栓的湿重,记录数据。
5)统计方法
本实验数据统计均采用t检验和方差分析,血栓湿重以表示。
6)结果见表4,在0.05μmol/kg剂量下(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮没有促进小鼠血栓形成作用,即没有血栓形成风险。
表4.(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对SD大鼠颈动脉血栓生成量的影响a
a)n=10;b)与生理盐水比P>0.05;c)与生理盐水比P<0.01.
实验例6评价(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响
1)实验材料
受试化合物:(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮;
阳性对照为阿司匹林(Aspirin);阴性对照为生理盐水(NS);
实验动物:ICR雄性小鼠(清洁级),体重18-22g,由北京维通利华实验物技术有限公司提供。每10只小鼠一组,空白和阳性对照各一组。
2)药物配制
按量称取(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮,依次加入生理盐水至所需浓度即可;阿司匹林为生理盐水溶液。
3)给药剂量及给药方式
给药剂量:阿司匹林为1.11mmol/kg;(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮为0.05μmol/kg;按照小鼠体重,每10g给0.1mL药液或者生理盐水;灌胃给药。
4)动物模型的建立
ICR雄性小鼠70只,体重18-22g,随机分为(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮组、阿司匹林组和空白对照组,每组10只。各组按剂量灌胃给药。给药30分钟后,在小鼠左耳朵耳廓内侧均匀涂抹30μL二甲苯,2小时后颈椎脱臼处死小鼠,分别将左、右两耳外耳廓剪下并重合叠放在一起,用直径7mm的打孔器在同一位置打取圆形耳片,称重,记录并计算两耳重量差;鼠耳肿胀度=左耳片重-右耳片重。
5)统计方法
本实验数据统计均采用t检验和方差分析,鼠耳肿胀度以表示。
6)结果见表5,在0.05μmol/kg剂量下(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮有效地抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀,即有效地抑制炎症。
表5.(3S,6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮对ICR小鼠耳肿胀度的影响a
a)n=10;b)与生理盐水比P<0.05;c)与生理盐水比P<0.01。
Claims (5)
1.一种u-PA抑制剂,(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮,结构式如下:
2.制备权利要求1的(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮的方法,该方法由以下步骤构成:
(1)在DCC和HOBt存在下L-Trp-OBzl在无水四氢呋喃中与D-Boc-Lys(Z)缩合为D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl;
(2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-OBzl脱去Boc生成D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl;
(3)在乙酸乙酯和5%NaHCO3存在下D-Lys(Z)-L-Trp-OBzl环合生成(3S,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮;
(4)在Pd/C和H2存在下,在甲醇中(3S,6R)-3-(4-丁氨基苄基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮脱去苄基生成(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮。
3.权利要求1的(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮在制备肿瘤转移和侵润抑制疾病药物中的应用。
4.权利要求1的(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮在制备止血剂的应用。
5.权利要求1的(3S,6R)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2,5-二酮在制备抗炎剂的应用。
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