CN105272980A

CN105272980A - [2,3-b]并[3’,4’-b]哌嗪-2’,5’-二酮,其制备及应用

Info

Publication number: CN105272980A
Application number: CN201410260128.1A
Authority: CN
Inventors: 彭师奇; 赵明; 王玉记; 吴建辉; 王枫
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2014-06-10
Filing date: 2014-06-10
Publication date: 2016-01-27

Abstract

本发明涉及下面结构式的小分子u-PA抑制剂(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮，涉及它的制备方法和作为u-PA抑制剂在抑制肿瘤侵袭和迁移，抗栓和抗炎方面的应用。本发明属于生物医药领域。

Description

[2,3-b]并[3’,4’-b]哌嗪-2’,5’-二酮,其制备及应用

技术领域

本发明涉及了下面结构式所示的小分子u-PA抑制剂(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮，涉及它的制备方法和作为u-PA抑制剂在抑制肿瘤侵袭和迁移、抗炎和抗血栓方面的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

纤溶酶原激活***由纤溶酶原激活剂(Pas)，纤溶酶原激活抑制剂(PAIs)和细胞外纤溶酶原激活剂受体(PAR)组成。纤溶酶原激活***涉及细胞迁移，血管生成，伤口愈合，胚胎发育，肿瘤细胞扩散和转移等一系列过程。在哺乳动物体内主要有组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)两种纤溶酶原激活剂。

尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)是从人尿或肾细胞组织培养液中提取的一种丝氨酸蛋白酶，属双链尿激酶型纤溶酶原活化剂(tcu-PA)，分子量为55000或33000，是外源性纤维溶解***的激活剂。u-PA可以直接裂解纤溶酶原的精氨酸(560)-缬氨酸(561)肽键，使无活性的单链纤溶酶原转变为有活性的双链纤溶酶。

在肿瘤组织中，u-PA激活纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶直接或间接造成细胞外基质降解，进一步导致肿瘤细胞的浸润，转移和血管生成，促进肿瘤的增殖。在血液循环中，u-PA通过激活纤溶酶原参与调节血管内凝血-纤溶的平衡，对抑制血栓起重要作用。

在炎症应答过程中，u-PA通过与炎症细胞表面的u-PAR结合，参与调节炎症细胞对血管和组织的渗透能力，促进炎症细胞向炎症部位迁移，促进炎症反应以及炎症因子的释放，而炎症因子的释放又会诱导u-PA表达上升。

由于u-PA的酶活性贯穿在肿瘤-纤溶-炎症复杂的交叉联系中，所以影响u-PA的活性会影响复杂的交叉联系。也就是说，发明优秀活性的u-PA抑制剂对于抑制u-PA在肿瘤-血栓-炎症交叉联系有重要意义。这种意义体现在70％以上癌症病人死于癌转移；有大约80％的癌症病人合并血栓症，使得血栓成为癌症病人死亡的重要原因；癌症病人普遍并发炎症，炎症也恶化病人的预后。针对这种状况，本发明提出了(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮，其制备及治疗作用。

此前，发明人曾报道下面结构的(3S，6’S)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮可逆转肿瘤细胞对阿霉素的耐药性。不幸的是，它对于肿瘤的并发症没有任何作用。对比之下，本发明的(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮的意想不到的优势是，有优秀的抑制肿瘤细胞浸润和转移，抑制肿瘤本人并发炎症作用，同时抑制血栓形成。它们的结构见图1，此前，发明人报道可逆转肿瘤细胞耐药的(3S，6’S)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮(左)和本发明的(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮(右)的结构；它们的结构的唯一差异是6’位的碳的构型。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下面结构式的u-PA抑制剂(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮；

本发明的第二个内容是提供(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮的制备方法，该方法包括下面五个反应步骤：

(1)在硫酸存在下，L-Trp和甲醛反应生成3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸；

(2)在甲醇和二氯亚砜存在下，3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯；

(3)在DCC和HOBt存在下3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯在无水四氢呋喃中与D-Boc-Lys(Z)缩合为3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-2-(D-Boc-苄氧羰基赖氨酰)-3-羧酸甲酯；

(4)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-苄氧羰基氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮；

(5)在Pd/C和H₂存在下，在甲醇中(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-苄氧羰基氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮生成(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮。

上面的五个反应步骤可以用图1的合成路线描述。

本发明的第三个内容是评价小分子u-PA抑制剂(3R，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮在抑制肿瘤细胞侵袭和转移方面，以及止血，抗血栓和抗炎等方面的作用。

附图说明

图1发明人此前报道可逆转肿瘤细胞耐药的(3S，6’S)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮(左)和本发明的(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮(右)的结构。

图2合成(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮的路线。i)HCHO，H₂SO₄；ii)MeOH，SOCl₂；iii)DCC，HOBt，NMM，THF；iv)HCl/EA(4N)，MeOH，TEA；v)MeOH，Pd/C，H₂。

图3(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮在体外对UK激活纤溶酶原活力的影响。其中1列为单组分的人纤溶酶原(PLG)，2列为UK与PLG的共孵育；3列为100μg(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮和5μLUK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分；4列为50μg(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮和5μLUK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分；5列为10μg(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮和5μLUK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分；6为500μg的EACA和5μLUK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分；7为250μg的EACA和5μLUK(400U/mL)与5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)

将0.4mL浓硫酸加入800mL蒸馏水中，搅拌均匀，加入10gL-Trp，超声助溶；加入20mL甲醛溶液至反应液中，室温搅拌反应10小时。后处理：向反应液中滴加浓氨水调pH到6，静置，有无色固体析出，过滤晾干，得产物粗品11.32g.ESI-MS(m/e)：215[M-H]^-。

实施例2制备3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(2)

加60mL甲醇于250mL反应瓶中，冰浴下滴加7mL二氯亚砜，活化30分钟，向反应液中加入6.2g3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸(1)，室温搅拌过夜，TLC显示原料的基本消失。后处理：减压除去溶剂，残余物用100mL乙酸乙酯溶解，三乙胺调PH至8，硅胶柱层析纯化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝100∶1-20∶1)，得到4.625g(70％)3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯，为无色固体。ESI-MS(m/e)：231[M+H]⁺。

实施例3制备3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-2-(D-Boc-苄氧羰基赖氨酰)-3-羧酸甲酯(3)

将1.9g(5.0mmol)D-Boc-Lys(Z)混悬于20mL无水四氢呋喃，室温搅拌下向溶液中加入0.675g(5.0mmol)HOBt，冰浴搅拌下加入1.133g(5.5mmol)DCC，得到反应液I，冰浴下搅拌30分钟；将1.15g(5.0mmol)3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧酸甲酯(2)混悬于20mL无水四氢呋喃中，得到反应液II；将反应液II加入反应液I中，冰浴下搅拌1h，室温搅拌过夜。后处理：减压过滤除去DCU，将滤液减压浓缩除去四氢呋喃，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，将得到的溶液置于250mL分液漏斗中，依次用5％KHSO₄水溶液洗和饱和NaCl水溶液各洗3次，乙酸乙酯层用无水Na₂SO₄干燥30min，减压过滤，滤液减压浓缩，得到的黄色油状粗品，经硅胶柱层析纯化(CH₂Cl₂∶CH₃OH＝100∶1-20∶1)，得到2.785g(94.1％)3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-2-(D-Boc-苄氧羰基赖氨酰)-3-羧酸甲酯，为无色固体。ESI-MS(m/e)：593[M+H]⁺。

实施例4制备(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-苄氧羰基氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮(4)

将2.368g(4mmol)3S-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-2-(D-Boc-苄氧羰基赖氨酰)-3-羧酸甲酯(3)置于100mL茄瓶中，冰浴搅拌下缓慢向反应瓶中加入30mL4N氯化氢-乙酸乙酯溶液，加干燥管，冰浴搅拌下反应4小时后TLC监测原料点消失，终止反应。后处理：搅拌下减压除去溶剂，加乙酸乙酯复溶后再减压除去溶剂，重复三次；残余物以80mL甲醇溶解，用三乙胺调pH至9，油浴80℃反应约6小时，TLC显示原料的基本消失。后处理：减压除去溶剂，残余物以10mL甲醇分散，过滤，收集滤饼得到1.334g(72.5％)(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-苄氧羰基氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮，为无色固体。ESI-MS(m/e)：461[M+H]⁺。

实施例5制备(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮(5)

将0.200g(0.435mmol)(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-苄氧羰基氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮(4)置于50mL反应瓶中，加入10mL甲醇溶解，向溶液中加入40mgPd/C，通入H₂，室温搅拌反应48小时，TLC显示原料的基本消失；滤去Pd/C，减压除去溶剂得117mg(83％)(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮，为无色粉末。ESI-MS(m/e)：327[M+H]⁺.Mp212-213℃.(c＝0.30，CH₃OH).IR(KBr)：3261，2933，2856，1672，1456，1332，1242，1141，740cm^-1.¹HNMR(300MHz，DMSO-d6)：δ/ppm＝10.99(s，1H)，8.37(s，1H)，7.44(d，J＝9Hz，1H)，7.32(d，J＝9Hz，1H)，7.06(t，J＝9Hz，1H)，6.98(t，J＝9Hz，1H)，5.41(d，J＝18Hz，1H)，4.41(d，J＝9Hz，1H)，4.21(d，J＝15Hz，1H)，3.97(m，1H)，2.86(m，2H)，2.57(m，2H)，1.76(m，1H)，1.68(m，1H)，1.33(m，3H)，1.08(m，1H).¹³CNMR(200MHz，DMSO-d₆)：δ/ppm＝166.88，165.61，135.82，129.91，126.24，120.93，118.60，117.51，111.00，105.31，55.71，53.41，41.08，32.44，32.27，26.15，20.61.Elem.Anal：C₁₈H₂₂N₄O₂.C，66.24；H，6.79；N，17.17。

实验例1测定(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮对尿激酶(UK)活性的影响

1)主要试剂和仪器

试剂：SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂及氨基己酸(EACA)均为市售试剂；

人纤溶酶原(PLG)和尿激酶(UK)购自Sigma公司。

仪器：垂直电泳槽Mini-PRORENTetraSystem(BIO-RAD)；

电泳仪PowerPac(BIO-RAD)；

扫描仪Scanmaker8700(MICROTEK)。

2)溶液的准备

PLG溶液的配制：称取PLG5mg，置于15mL离心管中，加入1mL生理盐水溶解即得PLG溶液，浓度为5mg/mL；分装，每管0.1mL，-20℃保存待用；

UK溶液的配制：将整瓶UK(100,000U)以10mL生理盐水溶解，得母液；取0.1mL母液以生理盐水稀释至2.5mL，得UK溶液，浓度为400U/mL；分装，每管0.1mL，-20℃保存待用；

EACA溶液的配制：称取50mg化合物，以1mL生理盐水溶解，即得母液1，浓度为50mg/mL；取0.5mL母液1，以生理盐水稀释至1mL，得溶液2，浓度为25mg/mL；

(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮溶液的配制：称取5mg(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮，以1mL生理盐水溶解，浓度为5mg/mL；-20℃保存待用。

3)样品的准备

取5μLUK(400U/mL)溶液；分装，每管0.1mL，置于0.5mL离心管中，再向其中分别加入10μL生理盐水或(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮溶液，37℃孵育15分钟；再向各离心管中分别加入5μLPLG溶液，37℃孵育15分钟；孵育结束后，再向各离心管中分别加入5μL5×SDS电泳上样缓冲液，混匀后将各离心管于100℃水浴中变性5分钟，快速冰浴冷却后以12％的SDS-PAGE凝胶电泳分离。

4)SDS-PAGE凝胶电泳

试剂准备：

30％储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr)29.0g，亚甲双丙烯酰胺(Bis)1.0g，混匀后加超纯水(up-H₂O)，37℃溶解，定容至100mL，棕色瓶存于室温；

1.5MTris-HCl(pH8.0)：Tris18.17g加up-H₂O溶解，浓盐酸调pH至8.0，定容至100mL；

1MTris-HCl(pH6.8)：Tris12.11g加up-H₂O溶解，浓盐酸调pH至6.8，定容至100mL；

12％SDS：电泳级SDS12.0g加up-H₂O于68℃助溶，浓盐酸调至pH7.2，定容至100mL；

10％过硫酸铵(AP)：100mgAP加up-H₂O1mL；

考马斯亮兰染色液：甲醇-水-醋酸＝45mL+45mL+10mL，加入100mg考马斯亮蓝固体，配制成染色液；

脱色液：甲醇-水-醋酸＝10mL+90mL+10mL，配制成脱色液。

操作步骤：

采用垂直式电泳槽装置

(一)聚丙烯酰胺凝胶的配制

1.分离胶(12％)的配制：

超纯水4.0mL

30％储备胶溶液3.3mL

1.5MTris-HCl2.5mL

12％SDS0.1mL

10％AP0.1mL

取1mL上述混合液，加TEMED(N，N，N’，N’-四甲基乙二胺)10μL封底，余加TEMED4μL，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平，凝胶完全聚合需大约60min.

2.浓缩胶(4％)的配制：

超纯水1.4mL

30％储备胶溶液0.33mL

1MTris-HCl0.25mL

12％SDS0.02mL

10％AP0.02mL

TEMED2μL

将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子***玻璃板间，完全聚合需大约30min。

(二)样品处理：将样品加入相应量的5×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min使蛋白变性，取出，快速降温。

(三)上样：将处理后的样品加入样品池中，并加入20μL蛋白分子量标准品作对照。

(四)电泳：在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓缩胶电压80V，30min，分离胶电压100V至电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需1.5h)。

(五)染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色，于摇床(60RPM)室温10min。

(六)脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，于摇床(60RPM)室温脱色过夜。

(七)将脱色后的胶用扫描仪扫描，观察结果。

5)结果见图2，(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮浓度依赖地抑制UK水解人纤溶酶原的活性。说明它是UK的抑制剂。

实验例2测定(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮对HCCLM3细胞侵袭能力的影响

1)受试样品

(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成50μM浓度；

RGDS用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。

2)细胞株

HCCLM3(高转移人肝癌细胞)，购自ATCC。

3)主要仪器及耗材

超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

细胞孵育箱：INC153，memmer公司；

显微镜：Zeiss公司；

8.0μm孔径的Transwell小室、12孔细胞培养板和25cm²培养瓶：CorningCostar公司。

4)主要试剂

DMEM培养基干粉：Gibco公司；

PBS缓冲液：每1L溶液中含有NaCl8.2g、KCl0.2g、Na₂HPO₄·H₂O1.56g、KH₂PO₄0.2g，PH值7.4；

胎牛血清：Hyclone公司；

0.25％胰酶溶液：Hyclone公司；

青霉素、链霉素：石药集团中诺药业(石家庄)有限公司；

DMSO(二甲基亚砜)：Hyclone公司；

Matrigel(基质胶)：BD公司；

结晶紫染液：碧云天公司。

5)评价方法

包被基质胶：将冻存于-20℃冰箱的matrigel4℃过夜，变成液态；取720μL无血清DMEM培养基，加入180μLMatrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室，100μL/个；放入37℃、5％CO₂培养箱中，孵育5h；

水化基底膜；吸除小室中残留液体，每孔加入50μL的DMEM培养基，37℃、5％CO₂培养箱中孵育30min；

接种细胞：消化HCCLM3细胞，无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为5×10⁵个/mL；每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮使终浓度为10μM，RGDS终浓度为20μM；下室加入600μL的含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养48小时；

结晶紫染色：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用4％的多聚甲醛固定细胞30min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0.1％的结晶紫染液染色30min，吸除染色液，用PBS洗3次；

计数：在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数；实验数据统计均采用t检验和方差分析，细胞数以表示。

6)结果见表1，(3R，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮能有效地抑制HCCLM3细胞侵袭。

表1.(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮对HCCLM3细胞侵袭能力的影响^a

a)n＝3；b)与生理盐水比，P＜0.05。

实验例3评价(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮对HCCLM3细胞迁移能力的影响

1)受试样品

RGDS用含0.1％DMSO的DMEM培养基配制成100μM浓度。

2)细胞株

HCCLM3(高转移人肝癌细胞)。

3)主要仪器及耗材

超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

细胞孵育箱：INC153，memmer公司；

显微镜：Zeiss公司；

8.0μm孔径的Transwell小室、12孔细胞培养板和25cm²培养瓶：ComingCostar公司。

4)主要试剂

DMEM培养基干粉：Gibco公司；

胎牛血清：Hyclone公司；

0.25％胰酶溶液：Hyclone公司；

青霉素、链霉素：石药集团中诺药业(石家庄)有限公司；

DMSO(二甲基亚砜)：Hyclone公司；

结晶紫染液：碧云天公司。

5)评价方法

接种细胞：消化HCCLM3细胞，无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为2×10⁶个/mL；每孔加入100μL细胞悬液，同时加入25μL(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮使终浓度为10μM，RGDS终浓度为20μM；下室加入600μL的含10％FBS的DMEM培养基，在37℃、5％CO₂培养箱中培养6小时；

6)结果见表2，(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮能有效地抑制HCCLM3细胞迁移。

表2.(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮对HCCLM3细胞迁移能力的影响^a

a)n＝3；b)与生理盐水比P＜0.05。

实验例4评价(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮对大鼠颈动脉血栓生成的影响

1)实验材料

受试化合物：(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮；

阳性对照为阿司匹林(Aspirin)；阴性对照为生理盐水(NS)；

实验动物：SD雄性大鼠(清洁级)，体重180-220g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供；每10只大鼠一组，空白和阳性对照各一组；

溶剂：生理盐水。

2)药物配制

按量称取(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮，依次加入生理盐水至所需浓度即可；阿司匹林为生理盐水溶液。

3)给药剂量及给药方式

给药剂量：阿司匹林为50μmol/kg；(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮为5μmol/kg；按照大鼠体重，每100g给0.3mL药液或者生理盐水；灌胃给药。

4)动物模型的建立

SD雄性大鼠70只，体重180-220g，随机分为化合物组、阿司匹林组和空白对照组，每组10只。各组按剂量灌胃给药。给药30分钟后，各组大鼠以10％水合氯醛麻醉，分离出颈总动脉和颈总静脉，以大鼠颈总动脉-静脉插管旁路循环丝线法造成大鼠动脉血栓模型；循环15分钟，取出旁路管中的带栓丝线，拭去表面浮血，称带栓丝线湿重，减去丝线重量后，即得形成血栓的湿重，记录数据。

5)统计方法

本实验数据统计均采用t检验和方差分析，血栓湿重以表示。

6)结果见表3，在5μmol/kg剂量下(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮有效地抑制大鼠形成血栓，即有抗血栓作用。

表3.(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮对大鼠颈动脉血栓生成量的影响^a

a)n＝10；b)与生理盐水比P＞0.05；c)与生理盐水比P＜0.01。

实验例6评价(3R，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响

1)实验材料

受试化合物：(3R，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮；

阳性对照为阿司匹林(Aspirin)；阴性对照为生理盐水(NS)；

实验动物：ICR雄性小鼠(清洁级)，体重18-22g，由北京维通利华实验

物技术有限公司提供。每10只小鼠一组，空白和阳性对照各一组。

2)药物配制

按量称取(3R，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮，依次加入生理盐水至所需浓度即可；阿司匹林为生理盐水溶液。

3)给药剂量及给药方式

给药剂量：阿司匹林为1.11mmol/kg；(3R，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮为0.05μmol/kg；按照小鼠体重，每10g给0.1mL药液或者生理盐水；灌胃给药。

4)动物模型的建立

ICR雄性小鼠70只，体重18-22g，随机分为(3R，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮组、阿司匹林组和空白对照组，每组10只。各组按剂量灌胃给药。给药30分钟后，在小鼠左耳朵耳廓内侧均匀涂抹30μL二甲苯，2小时后颈椎脱臼处死小鼠，分别将左、右两耳外耳廓剪下并重合叠放在一起，用直径7mm的打孔器在同一位置打取圆形耳片，称重，记录并计算两耳重量差；鼠耳肿胀度＝左耳片重-右耳片重。

5)统计方法

本实验数据统计均采用t检验和方差分析，鼠耳肿胀度以表示。

6)结果见表5，在0.05μmol/kg剂量下(3S，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮有效地抑制二甲苯引起的小鼠耳肿胀，即有效地抑制炎症。

表5.(3R，6S)-3-(4-丁氨基)-6-(吲哚-3-乙基)-哌嗪-2，5-二酮对ICR小鼠耳肿胀度的影响^a

a)n＝10；b)与生理盐水比P＜0.05；c)与生理盐水比P＜0.01。

Claims

1.下面结构式所示的u-PA抑制剂，(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮。

2.制备权利要求1的(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮的方法，该方法由以下步骤构成：

3.权利要求1的(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮作为肿瘤转移和侵润抑制剂的应用。

4.权利要求1的(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮作为抗炎剂的应用。

5.权利要求1的(3S，6’R)-四氢咔啉[2，3-b]并[3’，4’-b]-6’-(1-氨基丁-4-基)-哌嗪-2’，5’-二酮作为抗血栓剂的应用。