CN105176943A - 一种耐盐耐有机溶剂的低温碱性酯酶EstSL3及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，本发明提供了一种来源于嗜盐嗜碱菌的酯酶EstSL3，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.？1所示，上述酯酶的基因组编码基因<i>estSL3</i>，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株。该酯酶EstSL3最适pH？9.0，最适反应温度30℃，在0℃的时候还具有70%左右的酶活，表明该酶是一个低温酯酶。在0.5–4.0？M？NaCl存在的情况下剩余98%以上的酶活，且在4M和5M？NaCl的浓度下非常稳定。本发明的酯酶具有低温、碱性、耐盐、耐洗涤剂和耐有机溶剂的特点，可应用于精细化工、制药、洗涤剂以及食品等工业领域。

Description

一种耐盐耐有机溶剂的低温碱性酯酶EstSL3及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐盐耐有机溶剂的低温碱性酯酶EstSL3及其基因和应用。

背景技术

酯酶(EsteraseE.C.3.1.1.1)是一种催化酯键水解和合成的酶的总称。水解时催化酯键产生醇类和羧酸，合成时脱水缩合酸的羧基与醇的羟基形成酯及其他香料产品。酯酶的催化反应过程中对底物具有较高催化特异性，其反应条件温和、副产物少且不需要辅酶，在工业生产及环境治理方面具有很高的应用价值。

产酯酶生物在自然界中分布非常广泛，从动植物的组织中到不同环境的微生物中都普遍存在。微生物酯酶具有来源广、种类多、反应条件温和、稳定性好、底物专一、催化活性高等特点，是工业用酯酶的主要来源。从分类上看主要来源于真菌，包括青霉、红曲霉、黑曲霉等；其次细菌，包括芽孢杆菌属、伯克霍尔德菌属等；个别种类的酵母菌及放线菌属也能产生一些的酯酶。其中一些具有工业生产价值的己被使用，如来自于黑曲霉(Aspergillus)、根霉(Rhizopusarrhizus)、毛霉菌(Mucorsp.)、根毛霉(Rhizomucorsp.)、荧光假单胞菌(Pseudomanasfluoreseens)、假丝酵母(Candidasp.)等微生物的酯酶。

微生物酯酶在食品加工、洗涤剂、化工用品、环保等方面具有重要的应用价值。例如，在食品加工上，酯酶可应用于改善啤酒、白酒及其他饮品的风味，如在啤酒工艺生产中使用酵母菌的酯酶和乙酰转移酶，在两者的共同作用下，产生酯酸异戊酯，可以增进啤酒的风味。在精细化工品方面，其酯转换和合成反应可制备具有经济效益的日用化学品，酯酶催化糖酯等重要的生物表面活性剂的合成。及手性药物生产方面，主要应用酰基转移及水解作用合成药物。

极端环境来源的微生物能够产生一些极端酶，这些酶在极端条件下具有很高的酶活性，因此能够适应工业生产中苛刻的条件而具有巨大的应用前景。现在研究较多的是嗜热酶，嗜碱酶，嗜酸酶，嗜冷酶，嗜盐酶等。其中嗜冷酶由于其在低温条件下具有高活性而且反应过程容易控制而受到越来越多的研究。此外，能够适应多种极端条件的酶也受到越来越多的关注。

目前所获得的酯酶大多数来源于常规环境，最适温度在40℃左右，最适pH为中性偏碱性，在很多工业中没法应用。盐碱湖是一个天然的稳定的碱性环境，pH在9-11之间，有时会达到12左右，通常同时具有中高度的盐存在因此。盐碱湖中存在大量的嗜盐碱微生物。而且从这些分离的嗜盐碱微生物中获得了具有工业价值的碱性酶如碱性蛋白酶、碱性纤维素酶、碱性淀粉酶等。

本发明从盐碱湖中分离了一株能够产低温碱性耐盐酯酶的菌株嗜盐嗜碱菌（Alkalibacteriumsp.SL3），利用分子生物学和基因工程的方法获得了该低温耐盐碱性酯酶的编码基因，并对该基因进行了重组表达，重组酶具有低温（最适温度30℃，0℃还具有70%左右的酶活），碱性（最适pH9.0）。该酶还具有很好的盐的耐受性和稳定性（5MNaCl处理2h还剩88%的酶活）。此外，该酶对一些金属离子、常见的有机溶剂以及洗涤剂具有较好的抗性。酯酶EstSL3具有低温、碱性、耐盐、耐洗涤剂和耐有机溶剂的特点，可应用于精细化工、制药、洗涤剂以及食品等工业领域。

发明内容

本发明一种耐盐耐有机溶剂的低温碱性酯酶EstSL3及其基因和应用，首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在精细化工、制药，洗涤剂和食品工业中应用的新酯酶。本发明获得一种低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3，在低温碱性及高盐条件下具有很高的酶活，而且该酶对一些常见的有机溶剂、化学试剂以及洗涤剂具有较好的抗性。这些性质符合食品工业，精细化工以及制药工业的的要求，降低能耗，增加产物得率，优化生产过程。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种低温碱性耐盐耐有机溶剂酯酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明提供了编码上述低温碱性耐盐耐有机溶剂酯酶estSL3基因。具体地，该基因的基因序列如SEQIDNO.2所示。

本发明还提供了包含上述低温碱性耐盐耐有机溶剂酯酶estSL3的重组载体，优选为pET28a-estSL3。

本发明还提供了包含上述低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌和丝状真菌。

本发明还提供了一种制备低温碱性耐盐耐有机溶剂酯酶EstSL3的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组酯酶表达；以及

3）回收并纯化所表达的酯酶EstSL3。

本发明还提供了上述低温碱性耐盐耐有机溶剂酯酶EstSL3的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在精细化工、制药，洗涤剂和食品工业中应用的新酯酶。本发明获得一种低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3，在低温碱性及高盐条件下具有很高的酶活，而且该酶对一些常见的有机溶剂、化学试剂以及洗涤剂具有较好的抗性。这些性质符合食品工业，精细化工以及制药工业的的要求，降低能耗，增加产物得率，优化生产过程。

本发明所述低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3可得自大布苏盐碱湖底泥分离的嗜盐嗜碱菌（Alkalibacteriumsp.），其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示：

MKINKNDTLLFIGDSITDVGRDRMDGEDLGKGFPLMVASHLQSRYPAKRLTVLNRGIGGDSLKDLKRRWEDDCLITNPDIVTLLIGVNDTWRNQNDGVELTDEELDEFESDYRFLLKSLHQRTDARVILMESFVLPYPKRRVGWRNDLDKRIQIVRKMARDYQTELIPLDGLLNAAGIRDGFSYYTGDDGVHPTVAGHGLIANSWLKAVDE。

本发明的酯酶EstSL3总共含211个氨基酸，N端无预测的信号肽，理论分子量为24.04kDa，理论等电点为5.28。

本发明的酯酶EstSL3的最适pH为9.0,EstSL3的表观最适pH为9.0，当pH小于6.0酶活性急剧下降，在pH5.0时，基本检测不到酶活性。该酯酶在pH6.0-10.0之间均很稳定,在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80%以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

本发明的酯酶EstSL3的最适温度为30℃，在0℃时剩余70%左右的酶活。在50℃下稳定，处理60min后仍能保持90%以上的活性。在60℃下不稳定，半衰期小于5min。

本发明的酯酶EstSL3还具有很好的盐的耐受性和稳定性。在0.5–4.0MNaCl存在的情况下剩余98%以上的酶活。在4M和5MNaCl的浓度下处理60min,剩余88%以上的酶活。表明该酯酶对盐具有非常好的耐受性和稳定性。

Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，EDTA和β-mercaptoethanol在低浓度和高浓度的情况下均能够促进酶活；Co²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺和Cu²⁺对酶有部分抑制作用；Ag⁺，Fe²⁺，Hg²⁺和Pb²⁺⁺对酶活力有强烈抑制。

低浓度的Tween80和TritonX-100对EstSL3有促进作用，其中1%Tween80促进作用最为明显，可达131%左右；而高浓度下对EstSL3有部分抑制作用。低浓度的Tween20和SDS对酶有部分抑制作用；而高浓度下对酶有强烈的抑制作用。

10%与20%的乙醇、丙醇、正己烷对酶活影响不大，酶活仍能保持在90%以上。甲醇、甘油、乙腈则对酶活具有轻微的抑制作用。低浓度的丁醇、异丁醇、丙酮、氯仿对酶活影响不大，而当浓度为20%具有明显抑制作用，酶活为50%以下。

本发明还提供了编码上述低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3的基因estSL3,该基因序列如SEQIDNO.2所示（其在NCBI中的登录号为KT225466）：

ATGAAAATCAACAAGAATGATACGTTGCTGTTCATCGGTGACAGCATAACAGATGTAGGCCGTGACCGTATGGATGGCGAAGATTTAGGTAAGGGATTCCCATTGATGGTCGCTTCGCACCTTCAGTCACGCTATCCGGCGAAAAGGCTGACGGTTTTGAATCGGGGCATTGGCGGGGACAGTCTGAAAGATCTTAAAAGGCGATGGGAAGATGATTGCCTGATCACTAATCCTGACATCGTCACATTACTTATAGGTGTAAATGACACCTGGCGTAATCAGAATGACGGAGTAGAACTTACAGATGAGGAACTGGATGAGTTTGAATCAGACTACCGCTTTCTTCTGAAATCGCTTCACCAGAGAACGGATGCTCGAGTCATTTTAATGGAGTCTTTTGTACTGCCTTATCCGAAAAGAAGAGTGGGCTGGAGGAATGACCTGGATAAACGAATCCAGATCGTCAGGAAGATGGCCAGAGATTATCAGACTGAACTCATTCCGCTGGATGGACTTTTGAATGCCGCTGGAATAAGGGACGGGTTCAGCTATTACACAGGAGATGACGGCGTCCATCCGACTGTAGCCGGTCACGGACTAATCGCGAACAGCTGGCTGAAAGCTGTCGATGAATAA。

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一酯酶基因estSL3,DNA全序列分析结果表明,酯酶EstSL3结构基因estSL3全长636bp,起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，GC含量47.2%，编码211个氨基酸组成的多肽(EstSL3),N端无预测的信号肽序列，中间为一个SGNH家族的催化结构域。在GenBank中的比对结果表明它与来自于Alkalibacteriumsp.AK22(WP_034300718)的未做过功能的假释酯酶的最高一致性为69%，表明EstSL3是一个新的酯酶。

本发明还提供了包含上述酯酶基因estSL3的重组载体，优选为pET28a-estSL3。将本发明的酯酶基因estSL3***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将酯酶基因estSL3***到质粒pET28a上的NcoI和HindIII限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pET28a-estSL3。

本发明还提供了包含上述酯酶基因estSL3的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌和丝状真菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/estSL3。

本发明的优点在于：本发明提供了一种性质优良的、适合于在食品、精细化工和制药等工业中应用的新酯酶。精细化工以及制药过程中通常在有机溶剂中进行的。本发明所提供的酯酶最适反应温度为30℃，50℃以上酶的热稳定性很差，便于酶促反应控制。此外，该酶对常见的有机溶剂具有很好的耐受性，可满足工业上对多种不同溶剂的要求。该酯酶还具有很好的pH耐受性，在pH6.0～10.0非常稳定。此外，该酶还具有很好的盐耐受性和稳定性。因此本发明的低温碱性耐盐耐洗涤剂和耐有机溶剂的酯酶可在精细化工、制药工业中应用，可以降低生产温度，减少能耗；降低非特异性反应，增加目的产物得率。由于该酶在低温条件下具有很高的酶活以及对洗涤剂的良好耐受性，因此该酶还可以应用于洗涤工业。此外，该酶还可以用于食品工业，改善酒类和液体食品的风味等。

附图说明

图1：在大肠杆菌中表达的重组酯酶EstSL3的SDS-PAGE分析。其中，M:低分子量蛋白质Marker；1:未诱导的含有酯酶基因载体pET-estSL3的大肠杆菌培养上清液；2:诱导的含有酯酶基因载体pET-EstSL3的大肠杆菌培养上清液浓缩液；3:通过镍柱纯化的达到电泳纯的EstSL3蛋白。

图2：重组酯酶EstSL3的最适pH。

图3：重组酯酶EstSL3的pH稳定性。

图4：重组酯酶EstSL3的最适温度。

图5：重组酯酶EstSL3的热稳定性。

图6：重组酯酶EstSL3的盐耐受性。

图7：重组酯酶EstSL3的盐稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：大肠杆菌(Escherichiacoli)TransⅠ-T1和BL21(DE3)购于北京TransGen公司，载体pET-28a(+)和pMD19-T载体分别购于美国Novagen公司和日本TaKaRa公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA聚合酶号和dNTPs购于日本TaKaRa公司。基因组提取试剂盒购于北京Tiangen公司，纯化及质粒提取试剂盒购于美国OMEGA公司。对硝基苯酚（pNP）、对硝基苯酯类（pNP-esters）购于美国Sigma公司；蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(YeastExtract)为英国OXOID公司产品，其余试剂为国产分析纯。

3、培养基：

（1）LB培养基（g/l）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl10.0,用1M的碳酸钠调pH至9.6。

（2）LB固体培养基（g/l）：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl10.0,琼脂15.0，用1M的碳酸钠调pH至9.6。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：酯酶基因EstSL3的克隆

嗜盐嗜碱菌基因组DNA的提取：采用天根公司的细菌基因组提取试剂盒(DP302)提取基因组DNA，具体操作完全按照该试剂盒的说明书进行。

我们从该菌中克隆木聚糖酶基因的时候，获得了该酯酶基因的3’端，序列比对分析表明该基因的相似性还比较低，而且都没有做过性质，因此根据测序得到的酯酶基因的3’端的核甘酸序列，设计上游三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定（为方便电泳识别结果，sp2和sp3一般间距100bp），引物长度一般22～30nt，退火温度在62℃。并将它们分别命名为estSL3-uSP1,estSL3-uSP2,estSL3-uSP3见表1。按照TAIL-PCR中的程序对5’端侧翼序列进行扩增。

表1酯酶EstSL3TAIL-PCR扩增和全长扩增所需的引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送英俊公司测序。通过序列拼接获得该片段的上下游侧翼序列，全序列共长1.17kb，找到一个完整的开放阅读框（ORF）。酯酶基因estSL3(GenBankaccessionno.KT225466)由636个碱基组成，编码211个氨基酸和一个终止密码子，在GenBank中的比对结果表明它与来源于Alkalibacteriumsp.AK22(WP_034300718)的假想酯酶基因全序列相似性为69%，而且未做过功能研究。estSL3编码蛋白预计分子量为24.04kDa，等电点为5.28。经预测，EstSL3无信号肽序列，中间为一个SGNH家族的催化结构域。

实施例2重组酯酶的制备。

以在基因5’和3’端分别引入了NcoI和HindIII酶切位点estSL3-m-F和estSL3-m-R为引物对（见表一），嗜盐嗜碱菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30sec，51℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环，72℃保温5min。将表达载体pET28a(+)进行双酶切(NcoI+HindIII)，同时将编码酯酶的基因estSL3双酶切(NcoI+HindIII)，切好的编码成熟酯酶的基因片段与表达载体pET28a(+)连接，获得含有酯酶基因estSL3的重组质粒pET28a-estSL3并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/estSL3。

取含有重组质粒pET28a-estSL3的BL21菌株，接种于5mLLB(100μg/mL的氨苄青霉素)培养液中，37℃培养过夜。将培养好的菌液按1%接种于20mLLB(加有100μg/mL的氨苄青霉素),37℃振荡培养约2~3h(OD600达到0.5)后加入终浓度0.5mmol/L的诱导剂IPTG，30℃180rpm震荡培养12h。12000rpm离心5min，收集菌体进行超声波破碎。利用对硝基酚比色法测定酯酶酶活测定酯酶的活力。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组酯酶在大肠杆菌中得到了表达。所表达的酯酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。

实施例3重组酯酶EstSL3的性质测定

1、重组酯酶的活性分析

重组酯酶的活性测定采取比色法测定酯酶酶活：具体方法如下：在pH9.0，30℃条件下，1mL的反应体系包括100μL适当的稀释酶液，20μL底物（10mM），加入880μL50mmol/LpH9.0磷酸缓冲液，反应10min后立即在OD₄₀₄处测定其吸光值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1μmol对硝基苯酚所需的酶量。

2、重组酯酶EstSL3的最适pH和pH稳定性的测定

最适pH测定：将纯化好的重组酯酶EstSL3在37℃下和0.1MpH5.0–9.0的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH稳定性测定：将酶液置于0.1MpH4.0–11.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH9.0及30℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1MMcIlvainebuffer（pH4.0–7.0），0.1MTris-HClbuffer（pH7.0–10.0）和0.1Mglycine-NaOH（pH10.0–11.0）。以pNP-C2为底物，反应10min，测定EstSL3的活力。结果表明：EstSL3的最适pH为9.0,在pH7.5到9.0之间时剩余最大酶活性的60%以上(图2)；此酯酶在pH6.0-10.0之间均很稳定,在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在80%以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性（图3）。

3、重组酯酶EstSL3的最适温度及热稳定性测定

酶的最适温度的测定：在pH9.0的缓冲液中，于0–70℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于50℃、55℃和60℃中，处理0–60min后，在pH9.0及30℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以pNP-C2为底物，反应10min。酶反应最适温度测定结果(图4)表明,其最适温度为30℃。该酯酶在0℃还具有70%左右的酶活，表明该酶是一个低温酶。酶的热稳定性性试验表明(图5)，重组酶在50℃时稳定性非常好。55℃下保温60min，剩余酶活性为21.3%,60℃处理60min酶活几乎全部丧失。

4、重组酯酶EstSL3的V _max和K_m的测定

以不同终浓度(0.02，0.05，0.1，0.15，0.2和0.3mmol)的底物pNP-C2为底物，在最适条件下测定酶活性，计算相应的反应速度，利用米氏方程双倒数法求得K_m值及V_max。结果表明：该酶的V _max为769.23±6.55μmolmin^–1mg^–1，K_m为0.15±0.008mgmL^–1。

5、不同金属离子化学试剂对EstSL3酶活的影响测定

在酶促反应体系中加入1和5mM的金属离子，研究其对酶活性的影响。在30℃及pH9.0条件下，以pNP-C2为底物测定酶活性。结果（表2）表明：Li⁺，Na⁺，K⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，EDTA和β-mercaptoethanol在低浓度和高浓度的情况下均能够促进酶活；Co²⁺，Zn²⁺，Mn²⁺和Cu²⁺对酶有部分抑制作用；Ag⁺，Fe²⁺，Hg²⁺和Pb²⁺⁺对酶活力有强烈抑制。

表二金属离子及化学试剂对重组酯酶EstSL3活性的影响

6、不同洗涤剂和有机溶剂对EstSL3酶活的影响测定

在酶促反应体系中分别加入3种不同的三个浓度(终体积浓度为1%、5%L和10%)的吐温20、吐温80、TritonX-100和SDS，以研究其对酶活性的影响。在最适pH和最适温度的条件下测定酶活性，以同样条件下未加任何试剂的酶促反应为对照组。在酶促反应体系中分别加入11种不同的两个浓度(终体积浓度为10%和20%)的有机溶剂，包括：甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、异丁醇、异戊醇、丙酮、正己烷、甘油、氯仿、乙腈。以研究其对酶活性的影响。在最适pH和最适温度的条件下测定酶活性，以同样条件下未加有机溶剂的酶促反应为对照组。

结果表明（表三），低浓度的Tween80和TritonX-100对EstSL3有促进作用，其中1%Tween80促进作用最为明显，可达131%左右；而高浓度下对EstSL3有部分抑制作用。低浓度的Tween20和SDS对酶有部分抑制作用；而高浓度下对酶有强烈的抑制作用。10%与20%的乙醇、丙醇、正己烷对酶活影响不大，酶活仍能保持在90%以上。甲醇、甘油、乙腈则对酶活具有轻微的抑制作用。低浓度的丁醇、异丁醇、丙酮、氯仿对酶活影响不大，而当浓度为20%具有明显抑制作用，酶活为50%以下。其中异戊醇最为明显，酶活仅为7.3%左右。

表三洗涤剂及有机溶剂对重组酯酶EstSL3活性的影响

7、不同浓度NaCl对重组酯酶EstSL3的活性和稳定的测定

NaCl对重组酯酶EstSL3的活性影响：在酶促反应体系中加入不同浓度（0.5-4M）的NaCl，研究其对酶活性的影响。在30℃及pH9.0条件下，以pNP-C2为底物测定酶活性。NaCl对重组酯酶EstSL3的稳定性的影响：将酶液分别置于含有4M和5M的pH9.0的缓冲液中，在37℃下处理2h，然后在pH9.0及30℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。结果表明：在0.5–4.0MNaCl存在的情况下，该酶能够剩余98%以上的酶活（图6），表明该酶具有很好的盐耐受性。在4M和5MNaCl的浓度下处理120min,剩余88%以上的酶活（图7），表明该酶具有非常好的盐稳定性。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

SEQUENCELISTING

<110>福州大学

<120>一种耐盐耐有机溶剂的低温碱性酯酶EstSL3及其基因和应用

<130>7

<160>7

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>211

<212>PRT

<213>酯酶EstSL3氨基酸序列

<400>1

MetLysIleAsnLysAsnAspThrLeuLeuPheIleGlyAspSerIle

151015

ThrAspValGlyArgAspArgMetAspGlyGluAspLeuGlyLysGly

202530

PheProLeuMetValAlaSerHisLeuGlnSerArgTyrProAlaLys

354045

ArgLeuThrValLeuAsnArgGlyIleGlyGlyAspSerLeuLysAsp

505560

LeuLysArgArgTrpGluAspAspCysLeuIleThrAsnProAspIle

65707580

ValThrLeuLeuIleGlyValAsnAspThrTrpArgAsnGlnAsnAsp

859095

GlyValGluLeuThrAspGluGluLeuAspGluPheGluSerAspTyr

100105110

ArgPheLeuLeuLysSerLeuHisGlnArgThrAspAlaArgValIle

115120125

LeuMetGluSerPheValLeuProTyrProLysArgArgValGlyTrp

130135140

ArgAsnAspLeuAspLysArgIleGlnIleValArgLysMetAlaArg

145150155160

AspTyrGlnThrGluLeuIleProLeuAspGlyLeuLeuAsnAlaAla

165170175

GlyIleArgAspGlyPheSerTyrTyrThrGlyAspAspGlyValHis

180185190

ProThrValAlaGlyHisGlyLeuIleAlaAsnSerTrpLeuLysAla

195200205

ValAspGlu

210

<210>2

<211>636

<212>DNA

<213>基因estSL3

<400>2

atgaaaatcaacaagaatgatacgttgctgttcatcggtgacagcataacagatgtaggc60

cgtgaccgtatggatggcgaagatttaggtaagggattcccattgatggtcgcttcgcac120

cttcagtcacgctatccggcgaaaaggctgacggttttgaatcggggcattggcggggac180

agtctgaaagatcttaaaaggcgatgggaagatgattgcctgatcactaatcctgacatc240

gtcacattacttataggtgtaaatgacacctggcgtaatcagaatgacggagtagaactt300

acagatgaggaactggatgagtttgaatcagactaccgctttcttctgaaatcgcttcac360

cagagaacggatgctcgagtcattttaatggagtcttttgtactgccttatccgaaaaga420

agagtgggctggaggaatgacctggataaacgaatccagatcgtcaggaagatggccaga480

gattatcagactgaactcattccgctggatggacttttgaatgccgctggaataagggac540

gggttcagctattacacaggagatgacggcgtccatccgactgtagccggtcacggacta600

atcgcgaacagctggctgaaagctgtcgatgaataa636

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

cagcccactcttcttttcggataaggcag29

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

gactcgagcatccgttctctggtgaag27

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cctcatctgtaagttctactccgtcattctg31

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

gcgccatgggcatgaaaatcaacaagaatgatacg35

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

ccgaagcttttcatcgacagctttcagcc29

Claims (10)

1.一种低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.一种低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶基因estSL3，其特征在于，编码权利要求1所述的低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3。

3.根据权利要求2所述的低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶基因estSL3，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。

4.包含权利要求2或3所述低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶基因estSL3的重组载体。

5.包含权利要求2或3所述低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶基因estSL3的重组载体pET28a-estSL3。

6.包含权利要求2或3所述低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶基因estSL3的重组菌株。

7.根据权利要求6的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌和丝状真菌。

8.一种制备低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求4所述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组酯酶表达；

3）回收并纯化所表达的酯酶EstSL3。

9.如权利要求1所述低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3在精细化工和制药中的应用。

10.根据权利要求9所述的低温碱性耐盐耐有机溶剂的酯酶EstSL3用于生产特定的化学产品或药物前体；在洗涤剂中的应用；在食品上改善酒类和液体食品的风味中的应用。