CN104962534A

CN104962534A - 一种深海沉积物来源酯酶est22及其编码基因与应用

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Publication number: CN104962534A
Application number: CN201510466274.4A
Authority: CN
Inventors: 许学伟; 霍颖异; 李正阳; 王春生
Original assignee: CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION; Second Institute of Oceanography SOA
Current assignee: CHINA OCEAN MINERAL RESOURCES R&D ASSOCIATION; Second Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2015-07-31
Filing date: 2015-07-31
Publication date: 2015-10-07

Abstract

本发明涉及一种深海沉积物来源酯酶EST22及其编码基因与应用。一种深海来源酯酶基因EST22由宏基因组筛选获得，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的酯酶基因经异源表达后，可获得高表达量和高酶活的酯酶EST22，底物为对硝基苯酚乙酸酯(C2)时催化活性最高，酶活达2065U/mg。酯酶EST22在有机溶剂中仍保持较高活性，特别是在二甲基亚砜、甲醇、Triton X-100、吐温20和80条件下，酶学活性增大。该酯酶酶学活性高，成本低廉，可应用于手性药物合成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业等领域。

Description

一种深海沉积物来源酯酶EST22及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种深海沉积物来源酯酶EST22、其编码基因及其应用。

背景技术

酯酶(esterase EC 3.1.1.1)广泛存在于微生物中，能够催化酯类化合物的水解和合成。酯酶具有许多优良的特性，例如具有高度手性选择特异性，催化反应不需要辅酶和辅因子，拥有较广的底物谱，在有机溶液中保持高稳定性等，使得酯酶在工业生产中成为重要的催化剂。酯酶可广泛应用于手性药物合成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业等领域。

微生物产生的酯酶种类多，不同来源的酯酶具有多方面不同性质，从而导致各具特色的应用范围。因而需要持续不断地开发新特性酯酶以更好的满足工业需要。海洋来源的酯酶通常具有与海洋环境相关的优良性质，例如温度稳定性、耐盐性、耐碱性、耐低温、以及优异的手性选择性等等，因此，从海洋徼生物中筛选出独具特性的酯酶就成了开发新型工业酶制剂的一个重要方向。宏基因组技术可从海洋环境中直接获取酶资源而不依赖于海洋微生物菌株的培养，已成为海洋酯酶获取的重要手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的深海来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明从太平洋海山深海沉积物宏基因组文库中，通过特异性底物(三丁酸甘油酯)筛选获得一种新的酯酶基因Est22，经PCR、酶切、克隆和测序，酯酶基因Est22的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。酯酶基因Est22大小为1035bp，碱基组成为：236A(22.80％)、204T(19.71％)、288C(27.83％)和307G(29.66％)，编码蛋白大小为344个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的酯酶来源于γ-变形杆菌纲细菌Glaciecola pallidula，相似性为71％(其在GenBank数据库中的注册号为WP_006015116)。***发育分析结果表明，酯酶Est22属于酯酶家族中的第Ⅳ家族。氨基酸序列分析结果显示，酯酶Est22具有甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸和甘氨酸组成的催化结构域(氨基酸位置为186至190)，构成酯酶催化中心，说明Est22属于酯酶第IV家族GDSAG亚家族。综上所述，Est22应为酯酶家族中的一名新成员。

在不影响酯酶Est22蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO:2所示的远离186-190氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶Est22活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶Est22突变体具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

同理，本发明还保护对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶Est22蛋白生物学活性的DNA分子。优选的酯酶Est22突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶Est22基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶Est22。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达***E.coli。

合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达载体。一个优选的例子是将本发明筛选到的酯酶基因Est22连接到大肠杆菌表达载体pET28b(Novagen)上，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中,经诱导表达出高活性的重组酯酶。通过酯酶活力测定表明，Est22酯酶或上述能表达Est22酯酶的宿主菌可用于水解短链脂肪酸酯，例如C2-C10短碳链脂肪酸酯。优选的短链脂肪酸脂为具有C2-C10短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯乙酸酯、对硝基苯丁酸酯、对硝基苯己酸酯、对硝基苯辛酸酯和对硝基苯癸酸酯等，其中底物为对硝基苯酚乙酸酯(C2)时催化活性最高，酶活达2065U/mg。

Est22酯酶催化水解温度范围为10～55℃，优选为35～45℃；所述水解的pH值为5.0～10.0，优选为6.0～8.0。在添加EDTA或有机溶剂二甲基亚砜、甲醇、Triton X-100、吐温20和80条件下，酶学活性增大。

本发明从太平洋海山深海沉积物宏基因组文库中筛选获得新的酯酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯和酶法合成酯产品生产过程中。获得的酯酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产酯酶，为后续的工业应用提供成本低廉的酯酶起始材料。该酶的生产可在洗涤剂、印染助剂和生物柴油制备等工艺中显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为纯化酯酶Est22的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。

图2为酯酶Est22的底物特异性图。C2：对硝基苯乙酸酯；C4：对硝基苯丁酸酯、C6：对硝基苯己酸酯；C8：对硝基苯辛酸酯；C10：对硝基苯癸酸酯；C12：对硝基苯十二酸酯；C14：对硝基苯十四酸酯；C16：对硝基苯十六酸酯；定义底物为C2时测定值为100％。

图3为酯酶Est22最适反应温度图。

图4为酯酶Est22最适反应pH图。

图5为二价阳离子对酯酶Est22活性影响图。

图6为有机溶剂和去垢剂对酯酶Est22活性影响图。

具体实施方式

实施例1酯酶基因Est22的获取

深海沉积物样品于2008年由深海可视多管取样器采集自太平洋海山边缘。宏基因组文库构建采用CopyControl^TM HTP fosmid libraryproduction kit(Epicentre Biotechnologies，美国)，宿主菌株为E.coliEPI300(Epicentre Biotechnologies，美国)，载体为pCC2FOS fosmidvector(Epicentre Biotechnologies，美国)。经脉冲场电泳检测，***片段大小为36～48kb。

采用酯酶筛选平板筛选具有酯酶基因的克隆子。酯酶筛选培养基配方为LB培养基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，pH 7.2)中加入10g/L三丁酸甘油酯；灭菌后，无菌条件下加入氯霉素，使其终浓度为12.5μg ml^-1。取10μl文库菌液稀释至100μl，涂布于酯酶筛选平板，30℃培养2天，菌落周围出现明显透明圈即为阳性克隆。将阳性克隆挑出，经重复验证获得酯酶克隆E22。

经重复验证的酯酶阳性克隆E22接入3ml LB液体培养基(含12.5μg ml^-1氯霉素和6μl CopyControl^TM Fosmid AutoinductionSolution)，37℃ 250rpm震荡培养18h。采用质粒抽提试剂盒(Axygen，美国)提取fosmid质粒。携带酯酶基因的fosmid质粒采用限制性内切酶Sau3AI进行不完全酶切，割胶回收1.5～4kb大小的DNA片段，将其连接至pUC19质粒，再转化入E.coli DH5α菌株，涂布于含有100μg ml^-1氨苄青霉素的酯酶筛选培养基平板筛选阳性亚克隆。30℃培养2天后挑选产生透明圈的亚克隆，经划线重复验证后测序，获得***片段DNA序列。

针对***片段的序列，基于NCBI ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析获得***片段中开放阅读框信息，通过Blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与数据库中已知酯酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得Est22基因，大小为1035bp，碱基组成为：236A(22.80％)、204T(19.71％)、288C(27.83％)和307G(29.66％)，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。编码蛋白大小为344个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的酯酶来源于γ-变形杆菌纲细菌Glaciecolapallidula，相似性为71％，其在GenBank数据库中的注册号为WP_006015116。

***发育分析结果表明，酯酶Est22属于酯酶家族中的第Ⅳ家族。氨基酸序列分析结果显示，酯酶Est22具有甘氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸和甘氨酸组成的催化结构域(氨基酸位置为186至190)，构成酯酶催化中心，说明Est22属于酯酶第IV家族GDSAG亚家族。

综上所述，Est22应为酯酶家族中的一名新成员。

实施例2酯酶基因Est22的重组表达质粒和重组菌株的构建

将本发明获得的酯酶基因Est22克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBI ORF Finder的ORF分析获得的酯酶基因的开放阅读框序列，设计扩增酯酶全基因的上游引物Est22F(5’-ATTCCATATGACGAACAAGATTGCAGAAG-3’，NdeI)和下游引物Est22R(5’-TCCCAAGCTTCAGCCACCTTTGCAGA-3’，HindIII)，PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用NdeI和HindIII双酶切PCR产物，纯化后的片段与经NdeI和HindIII双酶切的质粒pET28b连接，采用CaCl₂转化法转化至E.coli DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Axygen，美国)提取阳性克隆的质粒，经NdeI和HindIII双酶切鉴定，获得1000bp左右的DNA片段，经测序鉴定为酯酶基因Est22。将重组表达质粒转化到E.coli Rosetta(DE3)表达菌株中，构建表达重组菌株。

实施例3利用重组表达菌株表达重组酯酶基因Est22

将构建好的3ml重组表达菌株转接到100ml含有20μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，转入25℃以150r/min振荡培养8h。低温离心收集菌体，重悬于NTA-10溶液(500mM氯化钠，10mM咪唑，20mM Tris盐酸，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，采用NTA-Ni²⁺亲和柱层析纯化表达蛋白。所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，可亲和吸附到层吸柱上，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测，得到电泳纯的重组酯酶蛋白Est22，分子量约37kDa，与预测值一致(图1)。用Lowry法测定蛋白质浓度，得到约2.18mg/100ml发酵液的表达量。

实施例4重组酯酶基因Est22的活性检测

利用对硝基苯丁酸酯法测定纯化的重组酯酶Est22活性。具体操作：1ml反应体系中包括1mM对硝基苯乙酸酯，100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)和18ng纯酶蛋白(为10μl经稀释的纯化酶液)，采用紫外可见光分光光度计(Beckman DU800型，美国)于40℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅2min，使用失活的酶液作为对照用于调零。一个酶活力单位定义为每分钟从对硝基苯酚酯催化产生lμmol对硝基苯酚的所需要的酶量。测得的酯酶活性为2065U/mg。

实施例5酯酶Est22底物特异性分析

酯酶Est22的底物特异性分析采用体系：100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，1mM底物，加入18ng纯酶蛋白，在40℃下连续测定吸光值A₄₀₅2min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明，酯酶Est22对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C2、C4、C6、C8和C10)具有催化活性，其中底物为对硝基苯酚乙酸酯(C2)时催化活性最高，较难水解对硝基苯酚十四酸酯(C12)、对硝基苯酚十四酸酯(C14)和对硝基苯酚十六酸酯(C16)(图2)。结果表明，酯酶Est22对酰基碳链较短脂类物质具有催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。

实施例6酯酶Est22最适反应条件分析

酯酶Est22最适反应温度在10～55℃范围内测定。具体操作为：100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，1mM对硝基苯酚乙酸酯，加入18ng纯酶蛋白，分别在10、15、20、25、30、35、40、45、50和55℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅2min。测定结果表明Est22的反应温度范围为10～50℃，最适反应温度为35-45℃(图3)。

酯酶Est22最适反应pH在3.0～10.0范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1mM对硝基苯酚乙酸酯和18ng纯酶蛋白，在40℃下连续测定吸光值A₃₄₈2min。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.0)，100mM磷酸二氢钾—氢氧化钠缓冲液(pH 6.0～8.0)，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5～8.5)和100mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 8.5～10.0)。测定结果表明，酯酶Est22最适反应pH为pH 7.5，在pH 5.0～10.0范围内具有活性(图4)。

实施例7酯酶Est22酶学稳定性分析

二价阳离子对酯酶Est22活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Co²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Ba²⁺和乙二胺四乙酸(EDTA)，测定酶活性。测酶活体系为：100mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)，1mM对硝基苯酚乙酸酯，18ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅2min。测定结果表明，酯酶Est22活性会被Zn²⁺和Cu²⁺完全抑制，在Co²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、Mg²⁺和Mn²⁺存在下仍能保持较强活性，在EDTA存在下活性增大(图5)。

有机溶剂和去垢剂对酯酶Est22活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入15％(v/v)有机溶剂(异丙醇、乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺)和1％去垢剂(w/v或v/v)(SDS、吐温20、吐温80和Triton X-100)然后测定酶的活性。测活体系为：100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.5)，1mM对硝基苯酚乙酸酯，18ng纯酶蛋白，于40℃下连续测定吸光值A₄₀₅2min。测定结果表明，酯酶Est22活性会被SDS、DMF和乙腈抑制，而二甲基亚砜、甲醇、Triton X-100、吐温20和80可增强其活性(图6)。

Claims

1.一种酯酶Est22，是具有如下(1)或(2)特征的蛋白质：

(1)、其氨基酸序列与Seq ID NO.2所示序列一致；

(2)、对SEQ ID NO:2所示的远离186-190氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶Est22活性的衍生蛋白质。

2.根据权利要求1所述的酯酶Est22，其特征在于：所述的具有酯酶Est2活性的衍生蛋白质具有至少与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性。

3.编码权利要求1所述的酯酶Est22蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶Est22蛋白生物学活性的突变基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述的酯酶Est22突变体基因具有至少与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性。

5.携带有权利要求3-4任一项所述基因的载体。

6.一种宿主，其由权利要求5所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

7.根据权利要求6所述的宿主，其为细菌、酵母或哺乳动物细胞。

8.权利要求1所述的深海酯酶Est22或权利要求6所述的能表达Est22酯酶的宿主菌在催化酯类水解中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的酯类为短链脂肪酸酯。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述短链脂肪酸酯为C2-C10短碳链。