CN104762276A - 酯酶蛋白及其编码基因以及它们的应用 - Google Patents

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翟磊
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Abstract

本发明公开了一种酯酶蛋白，其中，该酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。另一方面，本发明还提供了一种编码酯酶蛋白的基因，其中，该基因的核苷酸序列为能够编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。另外，本发明还提供了如上所述的酯酶蛋白及其编码基因的应用。由实施例可以看出，本发明的提供的酯酶蛋白具有较高的酯酶活性，能够有效地降解硝基苯酚酯。

Description

酯酶蛋白及其编码基因以及它们的应用
技术领域
本发明涉及一种酯酶蛋白，还涉及该酯酶蛋白的编码基因，含有编码酯酶蛋白的基因的重组载体和细胞，含有该酯酶蛋白的组合物，以及所述酯酶蛋白及其编码基因的应用。
背景技术
酯酶（EsteraseE.C.3.1.1.1）是自然界中常见的酯水解酶类，普遍存在于动物、植物和微生物中，其中微生物来源的酯酶种类最为丰富。不同来源的酯酶基因差别大，同源性不高，但在蛋白质三维结构上具有极高的相似性，即α/β折叠酶结构；催化反应机理都遵循丝氨酸水解酶的反应机制，即催化结构域包含丝氨酸-组氨酸-谷氨酸（或天冬氨酸）三联体活性中心结构并在丝氨酸活性位点附近存在丝氨酸水解酶的特征保守序列G-X-S-X-G。酯酶和脂肪酶在结构和催化机理上具有极高的相似性，其主要区别：酯酶主要是水解短链水溶性酯底物，催化过程中遵循典型的米氏方程；而脂肪酶能够催化水解疏水性长链脂肪酸脂底物，并且在催化过程中表现界面活性。
微生物来源的酯酶种类最为繁多，根据的它们的氨基酸序列相似性和基本生物学特性，Arpigny于1999年将其***划分为8个大的家族；其中家族一为脂肪酶，家族二到八为酯酶。几年来随着大量新的酯酶基因的发现，目前已提出了9到15酯酶家族。
酯酶/脂肪酶由于其蛋白分子稳定、催化反应简单、不依赖辅助因子、底物范围广等优点，被广泛的应用于食品加工、洗涤剂，医药、化妆品、化合物制备等行业。据初步统计全球工业酶产值在2004达到了20亿，并以每年4-5%的数率在增长，其中脂肪酶类的使用占总用酶频率的10%。近年来随着手性化合物在制药、农药、香料、液晶、功能性高分子等工业中广泛的应用，酯酶对手性化合物拆分的特性更加凸现出来。相比于脂肪酶，酯酶在手性拆分上表现着更显著的效果，例如利用酯酶NP对手性萘普生进行拆分可以得到99%光学纯的转化率达到95%的对应体产物。
发明内容
本发明的发明人基于对来自西藏冰川土壤的分析，意外的发现了酯酶蛋白及其编码基因。另外，本发明还提供了含有编码所述酯酶蛋白的基因的重组载体、细胞，以及含有所述酯酶蛋白的组合物，以及它们的应用。
第一方面，本发明提供了一种酯酶蛋白，其中，该酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
第二方面，本发明提供了一种编码酯酶蛋白的基因，其中，该基因的核苷酸序列为能够编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供了一种引物对，其中，该引物对包括如SEQ IDNo：3所示的上游引物和如SEQ ID No：4所示的下游引物。
第四方面，本发明提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有如上所述的基因。
第五方面，本发明提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有如上所述的基因。
第六方面，本发明提供了一种组合物，其中，该组合物含有如上所述的酯酶蛋白。
第七方面，本发明提供了如上所述的酯酶蛋白、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的转基因细胞和如上所述的组合物在降解硝基苯酚酯和/或在食品、洗涤用品、医药、化妆品中的应用。
由实施例可以看出，本发明的提供的酯酶蛋白具有较高的酯酶活性，能够有效地降解硝基苯酚酯。并且具有广泛的pH值耐受性、低温耐受性以及耐盐的特性。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为表达纯化的各个阶段中重组蛋白溶液的SDS-PAGE电泳图；M：蛋白Marker；1：对照酶液；2：重组菌粗酶液；3：Ni-NDA His-Bind Column第一次纯化后得到的重组蛋白溶液；4：Ni-NDA His-Bind Column第二次纯化后得到的重组蛋白溶液。
图2显示了重组蛋白对不同底物的比活。
图3显示了重组蛋白在不同温度下的比活。
图4显示了重组蛋白在不同pH下的比活。
图5显示了重组蛋白在不同NaCl浓度下的比活。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种酯酶蛋白，其中，该酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
根据本发明，所在酯酶蛋白可以由人工合成获得，也可以通过该酯酶蛋白的氨基酸序列获得其编码基因，然后再进行相应的生物表达获得。
基于此，第二方面，本发明提供了一种编码如上酯酶蛋白的基因。
本领域技术人员公知，遗传密码子具有简并性，因此，在了解如上酯酶蛋白的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据常规的技术手段能够获得核苷酸序列不同的、且能够编码如上酯酶蛋白编码基因。优选的情况下，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示。
第三方面，本发明提供了一种引物对，其中，该引物对包括如SEQ ID No：3所示的上游引物（5'-GCGGGATCCATGACTGTGAATCCTC-3'）和如SEQ IDNo：4所示的下游引物（5'-GCGGAGCTCGGACTATTTTTGTCCCAG-3'）。
本发明提供的上述引物对能够特异性的扩增SEQ ID No：1所示的基因。所述特异性扩增是指所述引物对能够扩增SEQ ID No.1所示的核酸、并产生特定大小的目标条带，所述引物对不能够扩增SEQ ID No.1所示的核酸以外的核酸或者扩增不能产生特定大小的目标条带。
另外，根据本发明，为了便于该引物对所扩增的基因片段能够有效地与载体相连，所述引物对上还设计有酶切位点，如SEQ ID No：3所示的上游引物下划线部分为BamHI的酶切位点，SEQ ID No：4所示的下游引物下划线部分为SacI的酶切位点。
本发明需要说明的是，本发明提供的所述引物中的酶切位点并不能够作为对本发明的引物的限制，本领域技术人员根据预定的与所述引物对扩增的基因相连的载体上的酶切位点，能够相应的设计具有不同酶切位点的引物对。
第四方面，本发明还提供了一种重组载体，其中，该重组载体含有如上所述的基因。
根据本发明，所述重组载体具体可以为重组表达载体。可以用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。为了增强目的基因的转录，在使用所述基因构建重组表达载体时，可以在其转录起始密码子前添加任何一种本领域常规的增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用。此外，为了进一步增强目的基因的转录和/或翻译，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用转录增强子和/或翻译增强子。
本领域技术人员能够理解的是，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。
根据本发明，上述启动子以及增强子可以为本领域常规的启动子和增强子，在此不再详细赘述。
根据本发明，所述“载体”可选用本领域已知的各种载体，如市售的各种质粒、粘粒、噬菌体及反转录病毒等。优选地，所述载体为pET28a质粒。
根据本发明，为了便于目的蛋白的分离与纯化，在构建所述载体时，还可以加入表达如表1所示的标签的核苷酸序列，在目的蛋白中，表1所示的标签连接在目的蛋白的氨基末端或羧基末端。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6（通常为5个） RRRRR
Poly-His 2-10（通常为6个） HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
第五方面，本发明提供了一种转基因细胞，其中，该转基因细胞含有如上所述的基因。
所述转基因细胞优选为原核细胞，更优选为大肠杆菌。
根据本发明，本发明提供的转基因细胞可以用于所述酯酶蛋白的制备，具体地，所述转基因细胞可以为大肠杆菌，可以在35-40℃的条件下进行培养，当OD值达到0.7-0.8时，加入诱导剂，然后在28-32℃的条件下诱导目的基因的表达。所述诱导剂通常为异丙基硫代半乳糖苷（IPTG），其终浓度例如可以为0.4-0.6mM。
第六方面，本发明提供了一种组合物，其中，该组合物含有如上所述的酯酶蛋白。
根据本发明，所述组合物中所述酯酶蛋白的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。
另外，根据预定的用途不同，本发明提供的组合物可以制备为不同的剂型，并且添加有相应的赋形剂等成分。具体的选择为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。
第七方面，本发明提供了如上所述的酯酶蛋白、如上所述的基因、如上所述的重组载体、如上所述的转基因细胞和如上所述的组合物在降解硝基苯酚酯和/或在食品、洗涤用品、医药、化妆品中的应用。
根据本发明，所述硝基苯酚酯为对硝基苯酚乙酸酯，对硝基苯酚丙酸酯，对硝基苯酚丁酸酯，对硝基苯酚己酸酯、对硝基苯酚辛酸酯和对硝基苯酚癸酸酯中的一种或多种。
根据本发明，本发明提供的酯酶可以在任何能够不使其失活的条件下进行使用，例如，温度可以为10-80℃，优选为30-50℃；pH值可以为4-9.5，优选为7-9；最高可耐受可以不低于2.5M，优选为0.5-1.5M的氯化钠浓度。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。
下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例用于说明编码酯酶蛋白核苷酸序列的克隆
（1）目的基因的获得
按照DNA recovery from soils of diverse composition（Zhou等，ApplEnviron Microbiol62:316-322）中记载的方法，从西藏卡诺拉冰川土样中提取总DNA，之后用脉冲场电泳PFGE法进行纯化，得到纯化的总DNA溶液，总DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为：A260/A280＝1.947，A260/A230＝2.15。
将上述总DNA溶液用注射器抽取方法切断DNA并回收36-48kb的DNA片段，用CopyControl Fosmid文库试剂盒（购自Epicentre）并按照其说明书，将获得的DNA片段连接至CopyControl载体上形成Fosmid克隆文库，并转化E.coli，之后涂布于含有12.5μg ml-1的氯霉素的LB平板上，37℃培养14-16h。获得了近10000个克隆子。克隆子经过含有1%的三丁酸甘油酯的LB平板筛选，得到一个具有酯酶活性的阳性克隆子，经测序公司对其***片段进行测序及序列分析，获得SEQ ID NO.1所示序列，命名为estH9。
SEQ ID NO.1所示序列表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，命名为H9Est蛋白，与来自Acinetobacter sp全基因组测序中的推测蛋白具有65-99%的同源性，而与已鉴定蛋白特性的来自Acinetobacter lowffii的酯酶具有最高同源性，同一性为67%。根据酯酶H9Est蛋白序列可以将该酶归于酯酶/脂肪酶家族IV。
（2）目的基因的克隆
根据步骤（1）中获得的酯酶基因的核苷酸序列设计特异性引物对，其中，上游引物如SEQ ID NO.3所示（5'-GCGGGATCCATGACTGTGAATCCTC-3'，下划线部分为BamHI的酶切位点），下游引物如SEQ ID NO.4所示（5'-GCGGAGCTCGGACTATTTTTGTCCCAG-3'，下划线部分为SacI酶切位点）。
以上述具有酯酶活性的阳性克隆子的重组载体DNA为模板，用所述特异性引物，以及扩增试剂盒（购自大连宝生物，货号为D332C）对进行PCR扩增。扩增体系如下：
用无菌水补充至50μl。
PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30秒，30个循环；72℃延伸10min。
PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用DNA纯化试剂盒（购自天根生化）纯化。将纯化产物进行测序，序列如SEQ ID NO.1所示，证明本发明的引物对能够特异性扩增目的基因片段。
实施例2
本实施例用于说明本发明提供的酯酶蛋白的获得。
（1）重组质粒pETEst的构建
用BamHI和SacI双酶切实施例1得到的纯化后的PCR产物，反应体系为：PCR产物（约含30μg的DNA）50μl、BamHI和SacI各5μl、反应缓冲液（产品自带）10μl和去离子水30μl，37℃温育4h，琼脂糖电泳回收酶切产物。质粒pET28a在同样的条件下进行双酶切和电泳回收。
使用T4DNA连接酶（购自TAKARA，D2011A），并根据其说明书的记载，将所回收的双酶切后的PCR产物和质粒进行连接，构建成pETEst重组表达载体。将此重组载体电击转化大肠杆菌BL21（DE3）。然后，将重组菌涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃培养14-16h，即得含有SEQ ID NO.1的重组表达载体的转化菌株pETEst/E.coliBL21（DE3）。
（2）酯酶蛋白的表达和纯化
①将重组菌pETEst/E.coliBL21（DE3）加入到200ml LB液体培养基（含有50μg/ml卡那霉素）中，37℃摇床培养；
②当OD600达到0.8左右时，加入诱导剂IPTG（终浓度为0.5mM），30℃诱导过夜；
③6000rpm离心10分钟，收集菌体，按1：6（1mg:6mL）加入50mMTris-HCl（pH8.0）缓冲液，超声波破碎10分钟（60W，超声2，停止2s）；
④15000rpm离心10min，去除细胞碎片，得到粗酶液。
（3）酯酶蛋白的Ni-NDA His·Bind Column纯化
将粗酶液流过Novagen公司生产的His·Bind Column（带Ni的NDA，1.25mL预装柱）。待粗酶液完全流过层析柱后，用5ml溶液A（20mM pH7.9的Tris-Cl，0.5M的NaCl，10mM的咪唑）冲洗Ni柱去除未结合的杂蛋白。再用10ml溶液B（20mM pH7.9的Tris-Cl，0.5M的NaCl，60mM的咪唑）漂洗Ni柱去除结合较弱的杂蛋白。最后用5ml溶液C（20mM pH7.9的Tris-Cl，0.5M的NaCl，500mM的咪唑）洗脱，收集洗脱液1，将洗脱液1重复用Ni-NDA His·Bind Column纯化一次，得到洗脱液2，然后将洗脱液2用FPLC（快速蛋白液相层析）脱盐，得到脱盐后的样本，即纯化后的酯酶蛋白溶液。
表达纯化的各个阶段中，酯酶蛋白溶液的SDS-PAGE电泳结果见图1，其中，M为蛋白Marker；1：对照酶液（按照实施例2步骤（2）进行处理的仅转化有pET28a的E.coliBL21（DE3）的对照粗酶液）；2：重组菌粗酶液；3：Ni-NDA His-Bind Column第一次纯化后得到的重组蛋白溶液；4：Ni-NDA His-Bind Column第二次纯化后得到的重组蛋白溶液。
测试例1
温度对本发明的酯酶的活性的影响。
以硝基苯酚丁酸酯作为酯酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为50mM Tris-HCl（pH8.0），底物的终浓度为0.2mM，10μl实施例2得到的纯化后的酯酶蛋白溶液或对照酶液，不同温度、1M氯化钠浓度下用DU800紫外可见分光光度计（Beckman）测定1分钟内405nm的光吸收值的变化曲线。结果见图2。
结果表明，酯酶蛋白的最适温度为40℃，对照酶液均没有活性。以该最高酶活为100%，所述酯酶蛋白在其它几种温度下的比活性如图2所示。
测试例2
pH对本发明的酯酶的活性的影响。
以对硝基苯酚丁酸酯作为酯酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为A-C中的一种，底物的终浓度为0.2mM，10μl实施例2得到的纯化后的酯酶蛋白溶液或对照酶液，40℃、1M氯化钠浓度下用DU800紫外可见分光光度计（Beckman）测定1分钟内405nm的光吸收值的变化曲线。结果见图3。
A：缓冲体系为磷酸钠溶液（pH6.0-8.0）；
B：缓冲体系为Tris-HCl溶液（pH8.0-9.0）；
C：缓冲体系为甘氨酸-氢氧化钠溶液（pH9.0-10.0）；
结果表明，酯酶蛋白最适pH为8.0，在pH7-9下，该酶都能发挥较好的催化活性。对照酶液均没有活性。以该最高酶活为100%，所述酯酶蛋白在其它几种pH下的比活性如图3所示。
测试例3
盐浓度对酶活性的影响。
以硝基苯酚丁酸酯作为酯酶水解底物，反应体系为1ml，缓冲体系为50mM Tris-HCl（pH8.0），底物的终浓度为0.2mM，10μl实施例2得到的纯化后的酯酶蛋白溶液或对照酶液，40℃、不同盐度（0-2.5M的NaCl）下用DU800紫外可见分光光度计（Beckman）测定1分钟内405nm的光吸收值的变化曲线。结果见图4。
结果表明，酯酶蛋白的最适盐度为1M，对照酶液均没有活性。以该最高酶活为100%，所述酯酶蛋白在其它几种盐浓度下的比活性如图4所示。
测试例4
本测试例用于说明本发明提供的酯酶蛋白对硝基苯酚酯的降解。
分别以对硝基苯酚乙酸酯（C2)，对硝基苯酚丙酸酯（C3)，对硝基苯酚丁酸酯（C4），对硝基苯酚辛酸酯（C8），对硝基苯酚癸酸酯（C10），对硝基苯酚棕榈酸酯（C16）为底物。
反应体系为1ml，缓冲体系为50mM Tris-HCl（pH8.0），底物的终浓度为0.2mM，10μl实施例2得到的纯化后的酯酶蛋白溶液或对照酶液，40℃，1M氯化钠浓度下用DU800紫外可见分光光度计（Beckman）测定1分钟内405nm下的光吸收值的变化曲线。结果见图5。
其中，酯酶蛋白对硝基苯酚丁酸酯（短链底物）具有最高酶活，对照酶液均没有活性。并以该最高酶活为100%，所述酯酶蛋白对其它几种底物的比活性如图5所示。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种酯酶蛋白，其特征在于，该酯酶蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。
2.一种编码酯酶蛋白的基因，其特征在于，该基因的核苷酸序列为能够编码SEQ ID No：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的基因，其中，该基因的核苷酸序列如SEQ IDNo：1所示。
4.一种引物对，其特征在于，该引物对包括如SEQ ID No：3所示的上游引物和如SEQ ID No：4所示的下游引物。
5.一种重组载体，其特征在于，该重组载体含有权利要求2所述的基因。
6.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求2所述的基因。
7.根据权利要求6所述的转基因细胞，其中，所述转基因细胞为原核细胞。
8.一种组合物，其特征在于，该组合物含有权利要求1所述的酯酶蛋白。
9.权利要求1所述的酯酶蛋白、权利要求2所述的基因、权利要求5所述的重组载体、权利要求6所述的转基因细胞和权利要求8所述的组合物在降解硝基苯酚酯和/或在食品、洗涤用品、医药、化妆品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其中，所述硝基苯酚酯为对硝基苯酚乙酸酯，对硝基苯酚丙酸酯，对硝基苯酚丁酸酯，对硝基苯酚己酸酯、对硝基苯酚辛酸酯和对硝基苯酚癸酸酯中的一种或多种。
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