CN102286441A

CN102286441A - 一种低温酯酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN102286441A
Application number: CN2011102082110A
Authority: CN
Inventors: 许学伟; 吴敏; 江夏薇; 王春生; 杨俊毅; 刘镇盛
Original assignee: Second Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Second Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2011-07-24
Filing date: 2011-07-24
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-07-24
Also published as: CN102286441B

Abstract

本发明公开了一种低温酯酶、编码基因及其应用。本发明从太平洋深海沉积物宏基因组文库中筛选获得新的酯酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，催化水解温度范围为10～50℃，水解的pH值为6.0～9.0。在0～20℃条件下，酶蛋白可保持良好的稳定性，在添加二价离子Mg²⁺、Mn²⁺或有机溶剂吐温20和80条件下，酶学活性增大。获得的酯酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产酯酶，可应用于催化水解酯和酶法合成酯产品生产过程中，将会在洗涤剂、印染助剂和生物柴油制备等工艺中显示出重要的经济和社会价值。

Description

一种低温酯酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说，涉及一种低温酯酶、其编码基因及其应用。

背景技术

酯酶(esterase，EC 3.1)是一种水解酶，可在水分子的参与下，经由水解作用，将酯类切割成酸类与醇类。酯酶存在于动物、植物和微生物细胞中。根据氨基酸序列差异，目前细菌酯酶可分为8个家族(I-VIII)。近年来，随着基因工程技术的发展，一些新的酯酶陆续被发现，例如：筛选至韩国海域的LipG、南中国海水体和沉积物环境的EstA和EstF，植物根部土壤的EstD2、以及羊瘤胃的EstGK1和EstZ3等。

宏基因组，又称元基因组，源于20世纪70年代土壤微生物基因组DNA直接提取技术，由Handelsman等人于1998年首次提出并完善了该名词。宏基因组是指生境中全部微小生物遗传物质总和。宏基因组技术可从环境样品中直接提取微生物基因组DNA，克隆于不同载体，再将重组载体转移到适宜的宿主以建立宏基因组文库，结合不同筛选技术，从基因文库中筛选获得新基因或新的生物活性物质。应用这种免培养的新技术，可绕过微生物菌种分离培养技术难点，直接在基因水平上研究、开发和利用未培养的微生物资源，为工业、农业、医药和环境可持续发展提供微生物基因资源。中国专利200710143545.8提供了种编码β-葡萄糖苷酶的基因，它通过构建土壤未培养微生物的宏基因组DNA文库和文库克隆的β-葡萄糖苷酶活性检测筛选法获得。

目前授权的细菌酯酶及其基因专利多数直接来源于分离培养的菌株。中国专利98811110.1提供了一种耐热碱性磷酸酯酶的氨基酸序列、编码基因序列，以及生产重组酶的方法。中国专利200410091990.0提供了一种假单胞菌磷酸甘油磷酸酯酶基因及其克隆方法。中国专利200810222671.7提供了一种酯酶及其编码基因与应用，发明的酯酶适用于化工、食品、生物转化、医药工业和其它相关工业。中国专利200910144213.0提供了一种从中温链霉菌中获取的热稳定性羧酸酯酶基因、编码蛋白及其应用。然而，细菌酯酶及其基因专利也有通过未培养技术筛选于宏基因文库。中国专利200810226942.6提供了一种酯酶新基因Est p1及其重组表达体系，该基因克隆自中国南海海底100m深海洋底泥宏基因组文库。中国专利200810222671.7提供了一种酯酶及其编码基因与应用，该基因克隆自中国南海778.5m深海沉积物宏基因组文库，发明的酯酶适用于化工、食品、生物转化、医药工业和其它相关工业。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的低温酯酶、编码基因及其制备方法，该酯酶用于脂类降解及其他油脂类化合物的生物催化和转化。

本发明从中太平洋深海沉积物(水深5886m)宏基因组文库中，通过特异性底物(三丁酸甘油酯)筛选获得一种新的酯酶基因Est6，包含该基因的表达重组菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(100101)，保藏编号为CGMCC No.5084，保藏日期为2011年7月18日，拉丁分类命名为Escherichia coli。经PCR克隆测序，酯酶基因Est6的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。Est6大小为909bp，碱基组成为：148A(16.28％)、329C(36.19％)、292G(32.12％)和140T(15.40％)，编码蛋白大小为302个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，发现一个与之相似性最高为61％的蛋白来源于一株未培养细菌的酯酶(其在GenBank数据库中的注册号为ACL67845)。结构预测显示，酯酶Est6具有甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸组成的催化结构域(氨基酸位置为142至146)，构成酯酶催化中心；还具有组氨酸、甘氨酸、甘氨酸和甘氨酸组成的氧阴离子洞(氨基酸位置为74至77)。综上所述，Est6应为酯酶家族一名新成员。

在不影响Est6蛋白活性前提下，可对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有Est6酯酶活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。

因而，在已知74-77和142-146位氨基酸为酯酶的活性结构域的基础上，根据公知常识和逻辑推理，通过合理的实验安排可以得到对Est6蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸从而获得基本保留Est6酯酶生物学活性的蛋白突变体，优选的为对Est6蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸进行点突变从而获得基本保留Est6酯酶生物学活性的蛋白突变体。

相应地，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响Est6基因表达的条件下，可对编码上述蛋白的基因序列进行修改。因此，本发明还保护对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留Est6酯酶蛋白生物学活性的DNA分子。例如对Est6基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留Est6酯酶蛋白生物学活性的DNA分子，优选的为对Est6基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列进行点突变从而获得编码能基本保留Est6酯酶蛋白生物学活性的DNA分子。

利用基因克隆技术，可将上述获得的酯酶基因连接到合适载体上，并转化或转染到原核或真核生物宿主表达制备重组酯酶。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达***E.coli。

一个优选的例子是将本发明筛选到的酯酶基因Est6连接到大肠杆菌表达载体pET28b(Novagen)上，并转化到大肠杆菌Rosetta中，经诱导表达出高活性的重组酯酶。

本发明还提供所述Est6在催化水解酯、酯交换或合成、以及蛋白运输保藏中的应用。通过酯酶活力测定表明，Est6酯酶或上述能表达Est6酯酶的宿主菌可用于水解短链脂肪酸脂。优选的短链脂肪酸脂为具有C2-C10短碳链的对硝基苯酚酯，例如对硝基苯乙酸酯、对硝基苯丁酸酯、对硝基苯己酸酯、对硝基苯辛酸酯和对硝基苯癸酸酯等，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时催化活性最高。

Est6酯酶为一种低温酯酶，催化水解温度范围为10～50℃，优选为20～30℃；所述水解的pH值为6.0～9.0，优选为7.5～8.0。在0～20℃条件下，酶蛋白可保持良好的稳定性，在添加二价离子Mg²⁺、Mn²⁺或有机溶剂吐温20和80条件下，酶学活性增大。

本发明从中太平洋深海沉积物宏基因组文库中筛选获得新的酯酶基因，发现了该基因编码蛋白具有优良的酶学特性，可应用于催化解酯和酶法合成酯产品生产过程中。获得的酯酶基因可克隆到合适的宿主中实现异源表达，实现工业化生产酯酶，为后续的工业应用提供成本低廉的酯酶起始材料。该酶的生产，将会在洗涤剂、印染助剂和生物柴油制备等工艺中显示出重要的经济和社会价值。

附图说明

图1为纯化酯酶Est6的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。

图2为酯酶Est6的底物特异性图。C2：对硝基苯乙酸酯；C4：对硝基苯丁酸酯、C6：对硝基苯己酸酯；C8：对硝基苯辛酸酯；C10：对硝基苯癸酸酯；C12：对硝基苯十二酸酯；C14：对硝基苯十四酸酯；C16：对硝基苯十六酸酯；定义底物为C4时测定值为100％。

图3为酯酶Est6最适反应温度图。

图4为酯酶Est6最适反应pH图。

图5为酯酶Est6热稳定性图。

图6为二价阳离子对酯酶Est6活性影响图。

图7为有机溶剂和去垢剂对酯酶Est6活性影响图。

具体实施方式

实施例1：酯酶基因Est6的获取

深海沉积物样品于2008年8月采用多管取样器采集自中太平洋，水深5886m。宏基因组文库构建采用CopyControlTM HTP fosmidlibrary production kit(Epicentre，美国)，克隆载体为pCC2 FOS fosmidvector(Epicentre，美国)，宿主为EPI300-T1R E.coli(Epicentre，美国)。经脉冲场电泳检测，***片段大小为36～48kb。

采用氯霉素酯酶筛选平板[1％(w/v)三丁酸甘油酯，12.5μg ml^-1氯霉素，LB培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母抽提物，10g氯化钠，pH 7.0)]筛选具有酯酶基因的克隆子。取10μl文库菌液稀释至100μl，涂布于酯酶筛选平板，30℃培养2天，菌落周围出现明显透明圈即为阳性克隆。将筛选出来的阳性克隆挑出，在氯霉素酯酶筛选平板上划线重复验证。经筛选和重复验证获得酯酶阳性克隆E6。

经重复验证的酯酶阳性克隆E6接入3ml LB液体培养基(含12.5μg ml^-1氯霉素和6μl 500×CopyControl Fosmid AutoinductionSolution)，37℃震荡培养18h，震荡速率为250rpm。采用质粒抽提试剂盒(Axygen，美国)抽提fosmid质粒。携带酯酶基因的fosmid质粒采用限制性内切酶Sau3AI进行不完全酶切，割胶回收1.5～4kb大小的DNA片段，将其克隆至pUC19质粒，再转化E.coli DH5α菌株，最后涂布氨苄青霉素酯酶筛选平板[1％(w/v)三丁酸甘油酯，100μg ml^-1氨苄青霉素，LB培养基]筛选阳性亚克隆。30℃培养2天后挑选产生透明圈的亚克隆，经划线重复验证后测序，获得***片段DNA序列。经阳性亚克隆测序获得1748bp***片段。

针对***片段的序列，基于NCBI/ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)的ORF分析，获得***片段中开放阅读框序列信息，通过Blastx(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)比对序列与已知酯酶基因序列的同源性。经数据库比对分析获得Est6基因，大小为909bp，碱基组成为：148A(16.28％)、329C(36.19％)、292G(32.12％)和140T(15.40％)，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。编码蛋白大小为302个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，发现一个与之相似性最高为61％的蛋白来源于一株未培养细菌的酯酶，其在GenBank数据库中的注册号为ACL67845。

结构预测结果显示，酯酶Est6具有甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸组成的催化结构域(氨基酸位置为142至146)，构成酯酶催化中心；还具有组氨酸、甘氨酸、甘氨酸和甘氨酸组成的氧阴离子洞(氨基酸位置为74至77)，其在催化过程中可向过渡状态中带负电荷的氧原子提供氢键。***发育分析结果表明，酯酶Est6属于酯酶家族中的IV家族。

综上所述，Est6应为酯酶家族中的一名新成员。

实施例2：酯酶基因Est6的重组表达质粒和重组菌株的构建

将本发明获得的酯酶基因Est6克隆到表达载体上，构建重组表达菌株。基于NCBI/ORF Finder的ORF分析获得的酯酶基因的开放阅读框序列，设计扩增酯酶全基因的上游引物Est6F(5’-CGCACATATGGCCAGTCCACAGCTCC-3’，NdeI)和下游引物Est6R(5’-AATTAAGCTTCTAGCGTGCGGCGGCG-3’，HindIII)，PCR扩增确认基因全长序列。采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用NdeI和HindIII双酶切PCR产物，割胶回收酶切后的片段与经NdeI和HindIII双酶切的质粒pET28b连接，采用CaCl2转化法转化至大肠杆菌DH5α中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(Axygen，美国)提取阳性克隆的质粒，经NdeI和HindIII双酶切鉴定，获得909bp的DNA片段，经测序鉴定为酯酶基因Est6。表明已成功构建了表达质粒，将此重组表达质粒转化到大肠杆菌Rosetta表达菌株中，构建了表达重组菌株。包含该基因的表达重组菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所(100101)，保藏编号为CGMCC No.5084，保藏日期为2011年7月18日，拉丁分类命名为Escherichia coli。

实施例3：利用重组表达菌株表达重组酯酶基因Est6

将构建好的3ml重组表达菌株转接到100ml含有20μg/ml卡那霉素和34μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀达到0.6，此时加入终浓度为0.5mM的IPTG进行诱导表达，转入25℃以150r/min振荡培养7h。低温离心收集菌体，重悬于Buffer A(500mM氯化钠，10mM咪唑，20mM Tris盐酸，pH 8.0)中，在冰上进行超声波破碎处理。低温离心收集上清，然后进行NTA-Ni²⁺亲和柱层析，所表达的重组蛋白含有N端的6×His tag，能亲和吸附到层吸柱中，经过不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱后，收集洗脱液。经SDS-PAGE检测，得到电泳纯的重组酯酶蛋白Est6，分子量32kd，与预测值一致(图1)。用Bradford方法测定蛋白质浓度，得到约2.28mg/100ml发酵液的表达量。

实施例4：重组酯酶基因Est6的活性检测

利用对硝基苯丁酸酯法测定纯化的重组酯酶Est6活性。具体操作：在1ml的反应体系中包括1mM对硝基苯丁酸酯，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)和0.57μg纯酶蛋白(为10μl经稀释的纯化酶液)，采用紫外可见光分光光度计(Beckman DU800型，美国)于20℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅ 3min，使用失活的酶液作为对照用于调零。测得的酯酶活性为104.41U/mg。另外，将纯化的酶液直接滴于1％(w/v)三丁酸甘油酯平板上，可观察到明显的透明圈。表明这个重组表达的酯酶Est6具有酯酶水解活性，为后续的研究和应用提供了材料。

实施例5：酯酶Est6底物特异性分析

酯酶Est6的底物特异性分析采用体系：100mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)，1mM底物，加入0.57μg纯酶蛋白，在20℃下连续测定吸光值A₄₀₅3min。测定采用的底物为：对硝基苯酚乙酸酯(C2)，对硝基苯酚丁酸酯(C4)，对硝基苯酚己酸酯(C6)，对硝基苯酚辛酸酯(C8)，对硝基苯酚癸酸酯(C10)，对硝基苯酚十二酸酯(C12)，对硝基苯酚十四酸酯(C14)，对硝基苯酚十六酸酯(C16)。经测定表明，Est6能特异性水解化合物对硝基苯酚丁酸酯的酯键。酯酶Est6对酰基碳链较短的对硝基苯酚酯(C2、C4、C6、C8和C10)具有催化活性，其中底物为对硝基苯酚丁酸酯(C4)时催化活性最高，较难水解对硝基苯酚十四酸酯(C14)和对硝基苯酚十六酸酯(C16)(图2)。结果表明，酯酶Est6对酰基碳链较短脂类物质具有催化活性，对于短链脂类的水解活力优于长链脂类。

实施例6：酯酶Est6最适反应条件分析

酯酶Est6最适反应温度在10～50℃范围内测定。具体操作采用体系：100mM Tris-盐酸缓冲液(pH 7.5)，1mM对硝基苯酚丁酸酯，加入0.57μg纯酶蛋白，分别在10、15、20、25、30、35、40、45和50℃条件下连续测定吸光值A₄₀₅3min。测定结果表明Est6为低温酶，在10℃条件下仍具有催化活性，最适反应温度为20℃(图3)。

酯酶Est6最适反应pH在3.0～10.0范围内测定。具体操作为：在不同pH缓冲液中加入1mM对硝基苯酚丁酸酯和0.57μg纯酶蛋白，在20℃下连续测定吸光值A₃₄₈ 3min。测定使用的缓冲液为：100mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH 3.0～6.5)，100mM磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液(pH 6.5～7.5)，100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5～9.0)和50mM 2-环己胺基乙磺酸-氢氧化钠缓冲液(pH 9.0～10.0)。测定结果表明，Est6最适pH为pH 7.5，在pH 6.0～9.0范围内具有活性(图4)。

实施例7：酯酶Est6酶学稳定性分析

酯酶Est6热稳定性分析在0～60℃范围内测定。具体操作为：将纯化后酶液分别保温在0、10、20、30、40、50和60℃下30min，然后测定酶活性。测酶活体系为：100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)，1mM对硝基苯酚丁酸酯，加入0.57μg纯酶蛋白，于20℃连续测定吸光值A₄₀₅3min。测定结果表明，Est6在0～20℃时保持良好的稳定性，在40～60℃保存时失去活性(图5)。

二价阳离子对酯酶Est6活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入10mM Co²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Sr²⁺、Mn²⁺、Ni²⁺、Ba²⁺和乙二胺四乙酸，测定酶活性。测酶活体系为：100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)，1mM对硝基苯酚丁酸酯，0.57μg纯酶蛋白，于20℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 3min。测定结果表明，酯酶Est6活性会被Zn²⁺、Cu²⁺和Ni²⁺抑制，在Co²⁺、Ca²⁺、Sr²⁺和Ba²⁺存在下仍能保持较强的活性，在Mg²⁺和Mn²⁺存在下活性增大(图6)。

有机溶剂和去垢剂对酯酶Est6活性影响的测定具体操作为：在反应体系中分别加入15％(v/v)有机溶剂(异丙醇、乙腈、乙醇、甲醇、丙酮、二甲基亚砜和二甲基甲酰胺)和1％去垢剂(w/v或v/v)(十二烷基硫酸钠、吐温20、吐温80和Triton X-100)然后测定酶的活性。测活体系为：100mM Tris盐酸缓冲液(pH 7.5)，1mM对硝基苯酚丁酸酯，0.57μg纯酶蛋白，于20℃下连续测定吸光值A₄₀₅ 3min。测定结果表明，酯酶Est6活性会被十二烷基硫酸钠抑制，但吐温20和80可增强其活性(图7)。

Claims

1.一种Est6酯酶蛋白，是具有如下(1)或(2)特征的蛋白质：

(1)、其氨基酸序列与Seq ID NO.2所示序列一致；

(2)、将Seq ID NO.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失和/或添加且具有酯酶活性的由(1)衍生的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的Est6酯酶蛋白，其特征在于：所述的衍生蛋白质为对Est6蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸从而获得基本保留Est6酯酶生物学活性的蛋白突变体。

3.根据权利2所述的Est6酯酶蛋白，其特征在于：所述的衍生蛋白质为对Est6蛋白1-73、78-141或147-302位氨基酸残基进行点突变从而获得基本保留Est6酯酶生物学活性的蛋白突变体。

4.编码权利要求1所述Est6酯酶蛋白的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；或为对SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留Est6酯酶蛋白生物学活性的DNA分子。

5.根据权利要求4所述的DNA分子，其特征在于：其为对SEQ ID NO.1所示基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留Est6酯酶蛋白生物学活性的DNA分子。

6.根据权利要求5所述的DNA分子，其特征在于：其为对SEQ ID NO.1所示基因序列第1-219、234-423或441-906位核苷酸序列进行点突变从而获得编码能基本保留Est6酯酶蛋白生物学活性的DNA分子。

7.携带有权利要求4-6任一项所述DNA分子的载体。

8.一种宿主***，其由权利要求7所述的载体经转化或转染原核生物或真核生物宿主得到。

9.权利要求1-3任一项所述的的Est6酯酶在催化水解酯、酯交换或合成、以及蛋白运输保藏中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的Est6酯酶可用于水解短链脂肪酸脂。