CN104357427A

CN104357427A - 一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4及其基因和应用

Info

Publication number: CN104357427A
Application number: CN201410629920.XA
Authority: CN
Inventors: 王国增; 叶秀云; 林娟
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2014-11-11
Filing date: 2014-11-11
Publication date: 2015-02-18

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4及其基因和应用。本发明提供了一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，以及编码上述木聚糖酶的基因组编码基因 xynSL4 ，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株。该木聚糖酶XynSL4最适pH7.0,在pH9.0和11.0的时候分别剩余95%和60%的酶活。该酶最适反应温度70℃，在0.25–3.0MNaCl存在的情况下剩余55%以上的酶活，且在3M和4MNaCl的浓度下非常稳定。本发明的木聚糖酶具有高温碱性耐盐的特点，可应用于造纸、生物能源以及食品等工业领域。

Description

一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4及其基因和应用。

背景技术

木聚糖是半纤维素的主要组成成分，是排在纤维素之后的第二丰富的碳水化合物，约占地球上可再利用有机碳的三分之一。木聚糖的降解需要多种酶的协同作用，包括，包括内切-1,4-β-D-木聚糖酶（endo-1,4-β-D-xylanase）、α-L- ***呋喃糖苷酶（α-L-arabinofuranosidase）、α-D- 葡糖醛酸糖苷酶（α-D-glucuronidase）、β-D- 木糖苷酶（β-D-xylosidase）和乙酰酯酶（acetylxylan esterases）等。其中最主要也是最重要的是内切-1,4-β-D-木聚糖酶，它能够从木聚糖的内部随机切割β-1,4-木糖连接键。基于催化结构的序列相似性，木聚糖酶被归类到糖苷水解酶第5，7，8，10，11和43家族。现在所获得的木聚糖酶大多数都属于第10和第11两个家族。

木聚糖酶分布较为广泛，在细菌、藻类、原生动物、植物等生物中都有存在。微生物来源的木聚糖酶由于其在食品、饲料、造纸、能源、纺织等领域中具有巨大的应用。如在饲料行业中可以消除或减少抗营养作用从而提高饲料的利用率；在食品行业中可以增加面包的体积及改善口感和用于果汁的澄清；在造纸和纸浆工业中可以促进木质素的释放从而减少漂白剂的利用；在纺织上可以辅助脱胶等。

其中碱性木聚糖酶在造纸和纸浆上的应用可以增加纸张白度和强度以及降低环境污染而备受关注。由于工业制浆通常是在高温和碱性条件下进行的，因此，具有高温碱性性质的木聚糖酶在这个过程中才会有效果。此外，高温碱性木聚糖酶在生物转化和洗涤剂中也有应用。因此，寻找新的高温碱性木聚糖酶来满足工业需求变得越来越重要。

目前所获得的木聚糖酶大多数来源于常规环境，最适温度在50℃左右，最适pH为中性，在很多工业中没法应用。因此需要开发一种性质优良的、适合于在造纸、生物质能源和食品工业中应用新的木聚糖酶。

发明内容

本发明的目的是提供一种高温碱性耐盐的木聚糖酶。

本发明的再一目的是提供编码上述高温碱性耐盐木聚糖酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述高温碱性耐盐木聚糖酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述高温碱性耐盐木聚糖酶的应用。

本发明首先获得一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4，在高温碱性及高盐条件下具有很高的酶活。这些性质符合造纸工业中对木聚糖酶的高温碱性的要求，降低漂白剂的使用，减少环境污染。

本发明所述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

MLKVLRKPLITGMALALLLPAGLNSSANAEDSLGALDVAPISERYADSFAIGAAVEPFQLEGKSGEVLKHHYNSIVAENVMKPISIQPEEGKFDFEEADKIVKFAKENDMEVRFHTLIWHSQVPDWFFLDKNGKPMVDETDVKQREKNKKIVLKRVEKHVKEIVKRYKNDIDSWDVVNETVDDNGGLRESQWYQLTGTDYIKVAFETARKFAGKDAKLYINDYNTEVEPKRTALYNLVKDLLADGVPIDGVGHQGHIQIGWPSLQETEDSINMFADLGLDNQITELDISLYGWPPRPAYPTYDAIPEERFEAQAERYNDMFELYEKLDDKISSVTFWGIADNRTWLNDRAREFNDGVGVDAPFVFGLDYKVKPAYWAIMD

本发明的木聚糖酶XynSL4总共含380个氨基酸，N端29个氨基酸为预测的信号肽，理论分子量为 43.44 kDa ，理论等电点为 4.82。

本发明的木聚糖酶XynSL4的最适pH为7.0, 在pH9.0时剩余95%的酶活，在pH11.0时还剩余60%的酶活。该木聚糖酶在 pH 6.0-11.0 之间均很稳定, 在此pH范围内处理 60min后剩余酶活性在 86% 以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性。

本发明的木聚糖酶XynSL4的最适温度为70℃，在50-75℃时剩余50%以上的酶活。在不存在底物的情况下，该酶在70 ℃不稳定，半衰期＜ 5 min。但是在存在底物的情况下，该酶再此温度下的热稳定性很好，处理半小时还剩余76%的酶活。

本发明的木聚糖酶XynSL4还具有很好的盐的耐受性和稳定性。在0.25–3.0 M NaCl存在的情况下剩余55%以上的酶活。在3 M和4M NaCl的浓度下处理60 min, 剩余90%以上的酶活。

本发明还提供了编码上述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4的基因, 该基因的碱基序列如SEQ ID NO. 2所示：

ATGCTGAAAGTTCTACGTAAACCACTAATCACCGGAATGGCGCTAGCACTCTTATTGCCTGCAGGCCTGAACAGTTCCGCGAATGCGGAAGACTCACTGGGAGCGCTTGATGTTGCTCCAATTTCTGAACGTTACGCGGATTCCTTTGCAATCGGCGCTGCTGTTGAACCCTTTCAACTCGAAGGAAAAAGTGGAGAAGTTCTAAAGCACCATTACAACAGCATTGTGGCTGAAAACGTCATGAAACCGATTTCGATTCAGCCCGAAGAAGGCAAGTTCGATTTTGAAGAAGCGGATAAGATCGTCAAGTTTGCGAAAGAAAATGATATGGAAGTTCGCTTCCATACGCTCATCTGGCACAGCCAAGTGCCCGACTGGTTCTTCCTTGATAAAAACGGAAAGCCGATGGTTGATGAAACGGATGTAAAACAACGCGAAAAAAATAAGAAAATCGTTCTGAAGCGTGTAGAAAAGCATGTGAAGGAAATAGTCAAACGCTATAAAAATGATATCGATTCGTGGGATGTTGTCAACGAAACGGTTGATGACAACGGAGGTCTTCGGGAATCGCAGTGGTAYCAACTCACTGGGACTGATTACATTAAAGTCGCGTTTGAGACTGCCAGAAAGTTTGCCGGCAAAGATGCAAAGCTTTATATCAACGATTACAATACCGAAGTAGAACCTAAGCGGACTGCTTTGTATAATCTGGTCAAAGACTTATTGGCTGACGGCGTTCCGATCGATGGGGTCGGCCACCAGGGACATATCCAGATCGGCTGGCCTTCTCTGCAGGAAACTGAGGATTCCATCAACATGTTCGCTGATCTTGGATTGGACAACCAAATCACTGAATTGGACATCAGCCTTTACGGTTGGCCGCCAAGACCGGCTTATCCGACTTACGACGCAATTCCGGAAGAACGCTTCGAAGCTCAGGCTGAGCGCTATAATGACATGTTTGAATTATATGAAAAGCTGGACGACAAAATCAGCAGTGTCACATTTTGGGGCATTGCCGACAACCGTACGTGGTTGAACGACCGCGCTAGAGAGTTCAATGACGGCGTCGGTGTGGACGCACCATTTGTCTTTGGGCTCGATTACAAAGTGAAACCTGCCTATTGGGCCATCATGGATTAA

本发明通过PCR的方法分离克隆了这一木聚糖酶基因xynSL4, DNA全序列分析结果表明, 木聚糖酶XynSL4结构基因xynSL4全长1143bp, 起始密码子为ATG，终止密码子为 TGA，GC 含量 47.0 %，编码 380 个氨基酸组成的多肽( XynSL4 ), N端29个氨基酸预测为信号肽序列，中间为一个第10家族的催化结构域。在GenBank 中的比对结果表明它与做过功能验证的来自于Geobacillus thermoleovorans (AEW07375)的高温碱性木聚糖酶的最高一致性为65%，表明XynSL4是一个新的木聚糖酶。

本发明还提供了包含上述高温碱性耐盐木聚糖酶基因xynSL4的重组载体，优选为pET22b- xynSL4。将本发明的木聚糖酶基因xynSL4***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将木聚糖酶基因xynSL4***到质粒pET22b(+)上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，得到重组表达质粒pET22b- xynSL4。

本发明还提供了包含上述高温碱性耐盐木聚糖酶基因xynSL4的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌和丝状真菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/xynSL4。

本发明还提供了一种制备高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶的表达；

3）回收并纯化所表达的木聚糖酶XynSL4。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21(DE3)，得到重组菌株BL21/ xynSL4。

本发明还提供了上述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4的应用，所述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4具有耐热耐强碱的性质，可用于工业上纸浆的漂白和生物质能源的制备过程中生物质的降解；具有耐盐的特性，可用于海产品的加工处理。

本发明提供了一种性质优良的、适合于在造纸、生物能源和食品工业中应用的新木聚糖酶XynSL4。造纸上的工业制浆通常是在高温和碱性条件下进行的。本发明所提供的木聚糖酶XynSL4最适反应温度为70℃，而且在底物存在的情况下在该温度下非常稳定，该酶的最适pH为7.0，在pH9.0的时候剩余95%的酶活，在pH11.0的时候剩余60%的酶活。该木聚糖酶还具有很好的pH耐受性，在pH6.0～11.0非常稳定。此外，该酶在0.25–3.0 M NaCl存在的情况下剩余55%以上的酶活，且在3 M和4M NaCl的浓度下非常稳定。本发明的木聚糖酶XynSL4具有高温碱性耐盐的特点，因此本发明的高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4可在造纸制浆的过程中使用，可以减少漂白剂的使用，增加纸张亮度和强度，减少环境污染。此外，该酶还可以应用于生物质能源制备过程中生物质降解以及海产品处理。

附图说明

图1 ：在大肠杆菌中表达的重组木聚糖酶XynSL4 的SDS-PAGE 分析。其中，M: 低分子量蛋白质Marker；1: 未诱导的含有木聚糖酶基因载体pET-xynSL4的大肠杆菌培养上清液；2: 诱导的含有木聚糖酶基因载体pET-xynSL4的大肠杆菌培养上清液浓缩液；3: 通过镍柱纯化的达到电泳纯的XynSL4蛋白。

图2：重组木聚糖酶XynSL4的最适pH。

图3：重组木聚糖酶XynSL4的pH稳定性。

图4：重组木聚糖酶XynSL4的最适温度。

图5：重组木聚糖酶XynSL4的热稳定性。

图6：重组木聚糖酶XynSL4的盐耐受性。

图7：重组木聚糖酶XynSL4的盐稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：大肠杆菌表达载体pET22b(+)及菌株Escherichia coli BL21 (DE3) 购自于Novagen公司。

2、酶类及其它生化试剂：限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、DNA聚合酶、dNTPs 和PMD 18-T载体购于日本TaKaRa公司。基因组提取试剂盒购于北京Tiangen公司，纯化及质粒提取试剂盒购于美国OMEGA公司。木聚糖(xylan from beechwood)购于美国Sigma公司；蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(Yeast Extract)为英国OXOID公司产品，其余试剂为国产分析纯。

3、培养基：

（1）LB培养基（g/l）：酵母粉 5.0，蛋白胨10.0， NaCl 10.0, pH7.0。

（2）平板筛选培养基（g/l）：酵母粉 5.0，蛋白胨10.0， NaCl 10.0, 琼脂15.0，pH7.0。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1：木聚糖酶基因xynSL4的克隆

动球菌基因组DNA的提取：利用木聚糖为唯一碳源的筛选培养基从吉林乾安大布苏盐碱湖的底泥中分离得到一株产碱性木聚糖酶的微生物，经16S鉴定为动球菌属，命名为Planococcus sp.SL4。采用天根公司的细菌基因组提取试剂盒(DP302)提取该不动球菌的基因组DNA，具体操作完全按照该试剂盒的说明书进行。

根据第十家族木聚糖酶基因的保守（YDWDVVNE和DGIGMQSH）序列设计合成了简并引物X10-F和 X10-R：

X10-F: 5'-CTACGACTGGGAYGTNIBSAAYGA-3';

X10-R 5'-GTGACTCTGGAWRCCIABNCCRT-3' (Wang et al., 2010)

以上述的动球菌基因组总DNA为模板进行PCR扩增。采用降落PCR方法进行基因片段的扩增。反应参数为：94℃预变性5 min； 94℃变性30 sec，56-50℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，10个循环（每个循环降落0.5℃）。然后94℃变性30 sec， 50℃退火30 sec，72℃延伸30 sec，30个循环，72℃保温5 min。得到一约250bp片段，将该片段回收后与PMD 18-T载体相连送到英俊公司测序。

根据测序得到的木聚糖酶基因的保守区的核甘酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定（为方便电泳识别结果，sp2和 sp3一般间距100 bp），引物长度一般22～30 nt，退火温度在62℃。并将它们分别命名为SL4-uSP1, SL4-uSP2, SL4-uSP3 (上游特异性引物); SL4-dSP1, SL4-dSP2, SL4-dSP3 (下游特异性引物)见表1。按照TAIL-PCR中的程序对两端侧翼序列进行扩增。

表1 木聚糖酶XynSL4 TAIL-PCR扩增和全长扩增所需的引物

通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送英俊公司测序。通过序列拼接获得该片段的上下游侧翼序列，全序列共长1.75kb，找到一个完整的开放阅读框（ORF）。木聚糖酶基因xynSL4(GenBank accession no. KM360098)由1143个碱基组成，编码380个氨基酸和一个终止密码子，在GenBank 中的比对结果表明它与来源于Planomicrobium glaciei CHR43 (ETP70492)的假想木聚糖酶基因全序列相似性为77%。与做过功能验证的来自于Geobacillus thermoleovorans (AEW07375) 的高温碱性木聚糖酶的最高一致性为65%。xynSL4编码蛋白预计分子量为43.4kDa，等电点为4.82。经预测，XynSL4前29个氨基酸为信号肽序列，中间为一个第10家族的催化结构域。

实施例2 重组木聚糖酶的制备。

以在基因5’和3’端分别引入了EcoRI和NotI酶切位点xynSL4-m-F和xynSL4-m-R 为引物对（见表一），动球菌基因组DNA 为模板，进行PCR 扩增。PCR 反应参数为：94℃预变性5 min； 94℃变性30 sec， 58℃退火30 sec，72℃延伸1.5 min，30个循环，72℃保温5 min。将表达载体pET22b(+)进行双酶切 (EcoRI+ NotI)，同时将编码木聚糖酶的基因xynGR40双酶切 (EcoRI+ NotI)，切好的编码成熟木聚糖酶的基因片段与表达载体pET22b(+)连接，获得含有木聚糖酶基因xynSL4的重组质粒pET22b- xynSL4并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21/ xynSL4。

取含有重组质粒pET22b- xynSL4的BL21菌株，接种于5 mL LB(100 μg/mL的氨苄青霉素)培养液中，37℃培养过夜。将培养好的菌液按1%接种于20 mL LB(加有100 μg/mL的氨苄青霉素), 37℃振荡培养约2~3 h (OD600达到0.5)后加入终浓度1 mmol/L的诱导剂IPTG，30℃ 180 rpm震荡培养12 h。12000 rpm离心5 min，收集培养基上清。DNS法测定木聚糖酶的活力。SDS-PAGE结果(图1)表明，重组木聚糖酶在大肠杆菌中得到了表达。所表达的木聚糖酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的95％以上。

实施例3 重组木聚糖酶XynSL4的性质测定

1、重组木聚糖酶的活性分析

重组木聚糖酶的活性测定采取3,5－二硝基水杨酸（DNS）法：具体方法如下：在pH7.0， 70℃条件下， 1 mL的反应体系包括100 μL适当的稀释酶液，900 μL 底物（1%榉木木聚糖），反应10 min，加入1.5 mL DNS终止反应，沸水煮5 min。冷却后540 nm测定OD值。1个酶活单位(U)定义为在给定的条件下每分钟释放出1 μmol还原糖的所需的酶量。

2、重组木聚糖酶XynSL4的最适pH和pH稳定性的测定

最适pH 测定：将纯化好的重组木聚糖酶XynSL4 在37℃下和0.1M pH4.0–11.0 的缓冲液中进行酶促反应。酶的pH 稳定性测定：将酶液置于0.1M pH4.0–11.0 的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH7.0 及70℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。缓冲液为：0.1M McIlvaine buffer（pH4.0–7.0），0.1 M Tris-HCl buffer（pH7.0–9.0）和0.1M glycine-NaOH（pH9.0–11.0）。以1%山毛榉木聚糖为底物，反应10min，测定XynSL4 的活力。结果表明：XynSL4的最适pH为7.0, 在pH9.0剩余95%的酶活，在pH11.0时剩余最大酶活性的60% (图2)；此木聚糖酶在 pH 7.0-11.0 之间均很稳定, 在此pH范围内处理 60min后剩余酶活性在 85% 以上，这说明此酶具有较好的pH稳定性（图3）。

3、重组木聚糖酶XynSL4的最适温度及热稳定性测定

酶的最适温度的测定：在pH 7.0 的缓冲液中，于0–80℃下进行酶促反应。酶的热稳定性测定：将同样酶量的酶液置于55℃、60℃和70℃中，处理0–60min 后，在pH7.0 及70℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。以1%山毛榉木聚糖为底物，反应10min。酶反应最适温度测定结果(图4)表明, 其最适温度为70℃。酶的热稳定性性试验表明(图5)，重组酶在55℃时稳定性非常好。60℃ 下保温60 min，剩余酶活性为25%, 70℃处理5min酶活全部丧失。

4、重组木聚糖酶XynSL4的V _max和K_m的测定

以不同浓度的榉木木聚糖（1，0.8，0.4，0.2，0.15和0.1%）为底物，在最适条件下测定酶活性，计算相应的反应速度，利用米氏方程双倒数法求得Km值及Vmax。结果表明：该酶的V _max为362.74±8.55μmol min^–1mg^–1，K_m为1.45±0.08 mg mL^–1。

5、不同金属离子化学试剂对XynSL4酶活的影响测定

在酶促反应体系中加入5 mM 的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响。在70℃及pH 7.0 条件下，以山毛榉木聚糖为底物测定酶活性。结果（表2）表明：Ca²⁺ 和 β-mercaptoethanol 能够分别提高酶活力到1.34倍和1.86 倍；Ag⁺, Cu²⁺, Hg²⁺, Pb²⁺, Zn²⁺, Fe³⁺和Cr³⁺几乎完全抑制酶活性；K⁺, Cr³⁺ Li⁺ 和 Na⁺对酶活力没有影响。

表2 金属离子及化学试剂对重组木聚糖XynSL4活性的影响

6、不同浓度NaCl对重组木聚糖酶XynSL4的活性和稳定的测定

NaCl对重组木聚糖酶XynSL4的活性影响：在酶促反应体系中加入不同浓度的NaCl，研究其对酶活性的影响。在70℃及pH 7.0 条件下，以山毛榉木聚糖为底物测定酶活性。NaCl对重组木聚糖酶XynSL4的稳定性的影响：将酶液分别置于含有3M 和4 M的pH7.0的缓冲液中，在37℃下处理1h，然后在pH7.0 及70℃下进行酶促反应，以未处理的酶液作为对照。结果表明：在0.25–3.0 M NaCl存在的情况下，该酶能够剩余55%以上的酶活（图6）。在3 M和4M NaCl的浓度下处理60 min, 剩余90%以上的酶活（图7）。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

<110> 福州大学

<120> 一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4及其基因和应用

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

<213> 动球菌（Planococcus sp.）SL4

<400> 1

Met Leu Lys Val Leu Arg Lys Pro Leu Ile Thr Gly Met Ala Leu Ala

1 5 10 15

Leu Leu Leu Pro Ala Gly Leu Asn Ser Ser Ala Asn Ala Glu Asp Ser

20 25 30

Leu Gly Ala Leu Asp Val Ala Pro Ile Ser Glu Arg Tyr Ala Asp Ser

35 40 45

Phe Ala Ile Gly Ala Ala Val Glu Pro Phe Gln Leu Glu Gly Lys Ser

50 55 60

Gly Glu Val Leu Lys His His Tyr Asn Ser Ile Val Ala Glu Asn Val

65 70 75 80

Met Lys Pro Ile Ser Ile Gln Pro Glu Glu Gly Lys Phe Asp Phe Glu

85 90 95

Glu Ala Asp Lys Ile Val Lys Phe Ala Lys Glu Asn Asp Met Glu Val

100 105 110

Arg Phe His Thr Leu Ile Trp His Ser Gln Val Pro Asp Trp Phe Phe

115 120 125

Leu Asp Lys Asn Gly Lys Pro Met Val Asp Glu Thr Asp Val Lys Gln

130 135 140

Arg Glu Lys Asn Lys Lys Ile Val Leu Lys Arg Val Glu Lys His Val

145 150 155 160

Lys Glu Ile Val Lys Arg Tyr Lys Asn Asp Ile Asp Ser Trp Asp Val

165 170 175

Val Asn Glu Thr Val Asp Asp Asn Gly Gly Leu Arg Glu Ser Gln Trp

180 185 190

Tyr Gln Leu Thr Gly Thr Asp Tyr Ile Lys Val Ala Phe Glu Thr Ala

195 200 205

Arg Lys Phe Ala Gly Lys Asp Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn

210 215 220

Thr Glu Val Glu Pro Lys Arg Thr Ala Leu Tyr Asn Leu Val Lys Asp

225 230 235 240

Leu Leu Ala Asp Gly Val Pro Ile Asp Gly Val Gly His Gln Gly His

245 250 255

Ile Gln Ile Gly Trp Pro Ser Leu Gln Glu Thr Glu Asp Ser Ile Asn

260 265 270

Met Phe Ala Asp Leu Gly Leu Asp Asn Gln Ile Thr Glu Leu Asp Ile

275 280 285

Ser Leu Tyr Gly Trp Pro Pro Arg Pro Ala Tyr Pro Thr Tyr Asp Ala

290 295 300

Ile Pro Glu Glu Arg Phe Glu Ala Gln Ala Glu Arg Tyr Asn Asp Met

305 310 315 320

Phe Glu Leu Tyr Glu Lys Leu Asp Asp Lys Ile Ser Ser Val Thr Phe

325 330 335

Trp Gly Ile Ala Asp Asn Arg Thr Trp Leu Asn Asp Arg Ala Arg Glu

340 345 350

Phe Asn Asp Gly Val Gly Val Asp Ala Pro Phe Val Phe Gly Leu Asp

355 360 365

Tyr Lys Val Lys Pro Ala Tyr Trp Ala Ile Met Asp

370 375 380

<210> 2

<211> 1143

<212> DNA

<213> 动球菌（Planococcus sp.）SL4

<400> 2

atgctgaaag ttctacgtaa accactaatc accggaatgg cgctagcact cttattgcct 60

gcaggcctga acagttccgc gaatgcggaa gactcactgg gagcgcttga tgttgctcca 120

atttctgaac gttacgcgga ttcctttgca atcggcgctg ctgttgaacc ctttcaactc 180

gaaggaaaaa gtggagaagt tctaaagcac cattacaaca gcattgtggc tgaaaacgtc 240

atgaaaccga tttcgattca gcccgaagaa ggcaagttcg attttgaaga agcggataag 300

atcgtcaagt ttgcgaaaga aaatgatatg gaagttcgct tccatacgct catctggcac 360

agccaagtgc ccgactggtt cttccttgat aaaaacggaa agccgatggt tgatgaaacg 420

gatgtaaaac aacgcgaaaa aaataagaaa atcgttctga agcgtgtaga aaagcatgtg 480

aaggaaatag tcaaacgcta taaaaatgat atcgattcgt gggatgttgt caacgaaacg 540

gttgatgaca acggaggtct tcgggaatcg cagtggtayc aactcactgg gactgattac 600

attaaagtcg cgtttgagac tgccagaaag tttgccggca aagatgcaaa gctttatatc 660

aacgattaca ataccgaagt agaacctaag cggactgctt tgtataatct ggtcaaagac 720

ttattggctg acggcgttcc gatcgatggg gtcggccacc agggacatat ccagatcggc 780

tggccttctc tgcaggaaac tgaggattcc atcaacatgt tcgctgatct tggattggac 840

aaccaaatca ctgaattgga catcagcctt tacggttggc cgccaagacc ggcttatccg 900

acttacgacg caattccgga agaacgcttc gaagctcagg ctgagcgcta taatgacatg 960

tttgaattat atgaaaagct ggacgacaaa atcagcagtg tcacattttg gggcattgcc 1020

gacaaccgta cgtggttgaa cgaccgcgct agagagttca atgacggcgt cggtgtggac 1080

gcaccatttg tctttgggct cgattacaaa gtgaaacctg cctattgggc catcatggat 1140

taa 1143

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaggtcttcg ggaatcgcag tggtac 26

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcgtttgag actgccagaa agtttgc 27

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cctaagcgga ctgctttgta taatctggtc 30

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggaacgccgt cagccaataa gtctttg 27

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccgcttaggt tctacttcgg tattgtaatc g 31

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cggcaaactt tctggcagtc tcaaacg 27

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaagaattcg gaagactcac tgggagcgct tg 32

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggagcggccg catccatgat ggcccaatag gcag 34

Claims

1.一种高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。

2.一种高温碱性耐盐木聚糖酶基因xynSL4，其特征在于，编码权利要求1所述的高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4。

3.根据权利要求2所述的高温碱性耐盐木聚糖酶基因xynSL4，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO. 2所示。

4.包含权利要求2或3所述高温碱性耐盐木聚糖酶基因xynSL4的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组载体pET22b- xynSL4。

6.包含权利要求2或3所述高温碱性耐盐木聚糖酶基因xynSL4的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或丝状真菌。

8.一种制备高温碱性耐盐木聚糖XynSL4的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2）培养重组菌株，诱导重组木聚糖酶表达；以及

3）回收并纯化所表达的木聚糖酶XynSL4。

9.权利要求1所述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4的应用，其特征在于：所述高温碱性耐盐木聚糖酶XynSL4用于工业上纸浆的漂白，生物质能源制备过程中生物质的降解，以及用于海产品的加工处理。