CN102719417B - 一种耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和应用。本发明提供了一种来源于脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillussp.B8的***呋喃糖苷酶Abf51B8，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本发明提供了编码上述***呋喃糖苷酶的编码基因abf51B8。本发明的***呋喃糖苷酶的具有以下性质：最适pH6.0，最适温度60℃，在70℃具有很好的热稳定性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于饲料，食品、能源工业等。

Description

一种耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8及其基因和应用。

背景技术

木聚糖是半纤维素中最丰富的一类物质，广泛存在于硬木（15-30%）、软木（7-10%）和草本类植物（少于30%）。木聚糖的基本糖单元是D-吡喃木糖，它的主链由木糖以β-1,4糖苷键连接形成，侧链上被各种不同的取代基所修饰，同时，这些侧链取代基团通过化学键互相交联，形成复杂的结构(Collins et al.FEMSMicrobiology Reviews.2005,29:3-23.)。木聚糖的降解需要主链水解酶和支链水解酶的协同作用，主链酶包括β-1，4-木聚糖酶和β-木糖苷酶，侧链水解需要α-L-***呋喃糖苷酶，α-葡萄糖醛酸，乙酰木聚糖酯酶等辅酶。其中，***呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase，EC 3.2.1.55)能从含有***糖残基的多聚物如***聚糖、***木聚糖、***半乳聚糖等的非还原末端水解生成一个***糖分子。目前，人们已将细菌、真菌和植物来源的α-L-***呋喃糖苷酶进行分离纯化、或者通过基因克隆、异源表达之后，深入研究酶的各种性质。来源于微生物的***呋喃糖苷酶的最适反应pH为酸性至中性之间(pH 3.0-7.0)，最适反应温度介于40-70℃之间。

作为半纤维素降解酶系之一，α-L-***呋喃糖苷酶参与低价的农产品残渣的再利用，产生可用于发酵生成燃料乙醇的单糖及其他副产品。在纤维素发酵生产燃料乙醇的过程中，有约70%的原材料将不能被完全降解生成单糖，适当的纤维素预处理过程可以加大纤维素的利用率。利用酶预处理的方法则减少了这些问题的发生。***呋喃糖酶是半纤维素的侧链降解酶，它能促进半纤维素的完全降解。另外，***糖呋喃糖苷酶作为一种饲料添加剂，去除了木聚糖上***糖侧链，促进木聚糖的降解，易于被动物消化吸收。***呋喃糖苷酶还被广泛应用于食品行业中，L-***糖做为一种低摄入量的甜味剂能代替传统的蔗糖，适于老年人和高血糖患者食用。***呋喃糖苷酶还能增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，提高酒的香味，增加果汁的澄清度，而被应用于果汁生产工业。因此，***呋喃糖苷酶的产生、纯化、性质特征及其在饲料加工、酿酒工业、果汁加工、以及能源等领域的应用正在不断深入。

工业生产需要酶进行短期高温处理，目前多数***呋喃糖苷酶最适温度在50℃左右，但较差的热稳定性质不能满足饲料制粒，酿造加工等工业的高温生产要求。因此获得热稳定性优良的酶能降低生产成本，满足不同工业对酶性质的要求。

本发明中来源于脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8的***呋喃糖苷酶Abf51B8具有以下性质：最适pH6.0，并在pH5.0～8.0范围内具有40%以上的酶活力，具有很好的pH稳定性，37℃下作用1h后，在pH 4.0–11.0之间，剩余酶活性均在80%以上。最适温度60℃，80℃下仍具有50%以上的活性，良好的热稳定性，70℃都有较好的稳定性，保温60min后酶活几乎不损失。良好的pH和热稳定性等特性使其在饲料，食品工业应用上具有很大的潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种能高效应用的耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8。

本发明的再一目的是提供编码上述耐高温***呋喃糖苷酶的基因。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供一种制备上述耐高温***呋喃糖苷酶的基因工程方法。

本发明的另一目的提供上述耐高温***呋喃糖苷酶的应用。

本发明从脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8中分离得到一种新的耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8。

本发明提供了一种耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

SEQ ID NO.1：

MSKSIARMTIDPQYQLADVDPRLFGSFIEHLGRAVYGGIYEPDHPSADEMGFRQDVLELVRELQVPIVRYPGGNFVSGYRWEDGVGPLASRPAQLDLAWRSLEPNRVGVNEFVEWAKRANSEVMMAVNLGTRGIDEAKQIVEYCNHPGGSYWSDLRKSHGYEQPHGIKVWCLGNEMDGPWQIGHKTAEEYGRIAEEAAKVMKWVDPSIELVACGSSGSKMPTFPDWERIVLEHTYDHVEYISMHSYYGNRENDLATYLAQSLDMDHFIRSVIATCDYVKAKKRSKKTINISFDEWNVWFHSNEADKQVAPWQVGPPLLEDVYTVEDALVVGCLLITLLRHADRVKMACLAQLVNVIAPIMTENGGVSWKQTIYYPFLHASRYGRGKVMHCSLQSPKYDCKEFTDVPLVESVAVWNQDIGELTIFAVNRSQDGGIELECDIRGFAQASVIEHTVLVHSDLKAANTKEEPQEVIPQHAQGAKVDGGLLFAPLPKLSWNVIRLRV

其中，该酶包含502个氨基酸，无信号肽序列。

本发明筛选到脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8，其产生***呋喃糖苷酶Abf51B8，该酶同时具有好的热稳定性，在常温下在中性的范围内均具有高活性，其最适pH值为6.0，在pH5.0～7.0的范围内维持60%以上的酶活性；最适温度为60℃，在40～80℃仍具有50％以上的酶活力。

本发明提供了编码上述耐高温***呋喃糖苷酶的基因abf51B8。具体地，该基因的基因组序列如SEQ IDNO.2所示：

atgtccaagtcgattgcacgtatgacgattgatccgcagtaccagctcgccgatgtcgatccaaggttgttcgggtcgttcatcgagcatctcgggcgcgccgtatatgggggtatttacgagcctgatcacccgtctgccgacgaaatgggtttccgtcaggacgtcctcgaactggtgcgcgaactccaggtgcccatcgtgcgctacccgggaggcaactttgtgtcaggttaccgttgggaagacggggtggggccgcttgcgtccaggcccgcccaactcgatctcgcttggcgaagcttggaacccaatcgtgtaggtgtcaacgaatttgtcgagtgggccaagcgggcaaactccgaagtcatgatggctgtcaatctcggcacgcgtggtatcgacgaagcgaagcagattgtcgagtactgcaatcatcctggcggcagttattggagcgatctacgaaaatcgcatggctatgaacagccgcacggcatcaaggtgtggtgcctgggcaacgagatggatggcccgtggcaaattgggcacaaaacggccgaagaatacggccgaatcgctgaagaagcggctaaggtcatgaaatgggtcgatccgtcgatagagcttgtcgcatgcggtagctccggctcgaaaatgcctacgtttcccgattgggaacgaattgtcctcgaacacacatacgatcacgtcgagtacatttccatgcacagctactacggaaatcgcgagaatgacctcgcgacgtaccttgctcaatcgctcgatatggaccatttcatccgttcggtgattgcgacatgtgactatgtcaaagcgaaaaaacgcagcaagaaaaccatcaacatctcgtttgacgagtggaatgtgtggtttcactcaaacgaagcggacaaacaagttgcaccgtggcaggttggcccgccgttgcttgaggacgtatatacggtcgaagatgcgcttgttgtcgggtgtttgttgatcacgcttttgcgccatgcggatcgggtgaagatggcgtgtcttgctcagttggtcaatgtgattgcgcccatcatgacggagaacggcggggtgtcctggaaacagaccatttactatccctttttgcacgcttcgcggtacggtagagggaaagtgatgcactgctcgctacaatcgccgaagtacgattgtaaggaatttaccgacgtgccgctggtcgagagcgttgcagtgtggaatcaggatatcggagagttgaccatttttgcggtcaaccgttcgcaagatggcggcatcgagttggaatgtgacatccgcgggtttgctcaagccagcgtgatcgagcatacggtgcttgtgcattcggatttgaaagcggcgaacacgaaagaagagccacaggaagtgattccgcagcatgcacaaggcgcaaaggtcgatgggggcttgctcttcgctccattacccaaactgtcttggaacgtcattcgattgcgcgtgtaa

根据本发明的具体实施例，通过PCR的方法分离克隆了***呋喃糖苷酶abf51B8，DNA全序列分析结果表明，***呋喃糖苷酶基因abf51B8全长1509bp。成熟蛋白理论分子量为56.6kDa，将***呋喃糖苷酶abf51B8序列及推导出的氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，该基因与来源于GeobacillusStearothermophilus T6的***呋喃糖苷酶序列一致性为68%。说明Abf51B8是一种新的***呋喃糖苷酶。

本发明还提供了包含上述***呋喃糖苷酶abf51B8的重组载体，优选为pPET-abf51B8。将本发明的***呋喃糖苷酶基因***到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的***呋喃糖苷酶基因***到质粒pPET-30a(+)上的Nde I和Not I限制性酶切位点之间，得到重组酵母表达质粒pPET-abf51B8。

本发明还提供了包含上述耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21/abf51B8。

本发明还提供了一种制备耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组***呋喃糖苷酶表达；以及

3)回收并纯化所表达的***呋喃糖苷酶Abf51B8。

其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌株BL21/abf51B8。

本发明还提供了上述***呋喃糖苷酶Abf51B8的应用。

本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、适合于在饲料、酿酒、食品工业中应用新的***呋喃糖苷酶。本发明的***呋喃糖苷酶最适pH为6.0，在pH5.0～7.0都有较高的酶活性；pH稳定性好。其耐高温特性，可使其在需求高温环境的工业生产上应用。本发明的***呋喃糖苷酶适用于饲料工业，可与木聚糖酶协同作用，有效消除或降低因粘度增加而引起的抗营养作用。在酿酒工业中，可有效降解可溶性和不可溶性的***木聚糖，有效降低麦芽汁的粘度提高过滤效率澄清啤酒。另外，在白酒、清酒的酿造中有助于增加酿酒过程中萜烯醇的浓度，增加香味。因此，本***呋喃糖苷酶在食品工业中的应用显示出其巨大的潜力。

附图说明

图1重组***呋喃糖苷酶的最适pH。

图2重组***呋喃糖苷酶的pH稳定性。

图3重组***呋喃糖苷酶的最适温度。

图4重组***呋喃糖苷酶的热稳定性。

具体实施方式

试验材料和试剂

1、菌株及载体：本发明从脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8中分离得到一种新的耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8。大肠杆菌表达载体pPET-30(a)及菌株EcoliBL21(DE3)购自于Invitrogen公司。

2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。p-nitrophenyl-a-L-arabionfuranoside(pNPAf)购自Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到)。

3、培养基：

（1）Alicyclobacillus sp.B8培养基为MEA培养基：麦芽提取物，17.0g/l；蛋白胨，3.0g/l；琼脂。通过1:1(w/w)的柠檬酸调整pH值为3.5

（2）大肠杆菌培养基LB(1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl,pH7.0)。

说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。

实施例1脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.B8***呋喃糖苷酶编码基因abf51B8的克隆

提取瓶霉Alicyclobacillus sp.B8基因组DNA：

将液体培养3天的菌体离心后放入研钵中,加入2mL提取液，研磨5min,然后将研磨液置于50mL离心管中，65℃水浴锅裂解20min，每隔10min混匀一次,在4℃下10000rpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白,再取上清加入等体积异丙醇,于室温静置5min后,4℃下10000rpm离心10min。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤两次,真空干燥,加入适量TE溶解,置于-20℃备用。

根据第51家族***呋喃糖苷酶基因的保守(GNEMDG和DEWNVW)序列设计合成了简并引物P1，P2

P1:5'-GGNAAYGARATGGAYGG-3'；

P2:5'-CCANACRTTCCAYTCRTC-3')。

以Alicyclobacillus sp.B8总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：94℃变性5min；然后94℃变性30sec，50℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环后72℃保温10min。得到一约378bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术有限公司测序。

根据测序得到的核苷酸序列，设计上游和下游各三条TAIL-PCR特异性引物：设计方向为需要扩增的未知区域方向，sp2的位置设计在sp1的内侧，sp3位于sp2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，引物长度一般22～30nt，退火温度在60～65℃。并将它们分别命名为usp1,usp2,usp3(上游特异性引物),dsp1,dsp2,dsp3(下游特异性引物)见表1。

表1.***呋喃糖苷酶Abf51B8TAIL-PCR特异性引物

通过反向TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。拼接后***呋喃糖苷酶Abf51B8基因全长1509bp，编码502个氨基酸和一个终止密码子。用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)进行分析表明该基因无信号肽。预测该基因所编码的成熟蛋白的理论分子量为56.6kDa。

实施例2重组***呋喃糖苷酶的制备

将表达载体pPET-30a进行双酶切(Nde I+Not I)，同时将编码***呋喃糖苷酶的基因abf51B8双酶切(Nde I+Not I)，切出编码成熟***呋喃糖苷酶的基因片段与表达载体pPET-30a连接，获得含有***呋喃糖苷酶基因abf51B8的重组质粒pPET-abf51B8并转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组毕赤酵母菌株BL21/abf51B8。

取含有重组质粒的BL21菌株，接种于300mL LB培养液中，37℃227rpm振荡培养2h后，加入终浓度0.6mM IPTG在30℃进行诱导4h。重组***呋喃糖苷酶表达量为5.6U/mL。SDS-PAGE结果表明，重组***呋喃糖苷酶在大肠杆菌中得到了表达。重组木聚糖的比活为98.8U/mg。

实施例3重组***呋喃糖苷酶的活性分析

***呋喃糖苷酶活性的测定：在405nm下测定酶水解底物pNPAf生成的产物p-nitrophenol的量。反应步骤：250μL 2mM pNPAf底物与150μL缓冲液混匀，加入100μL适当稀释的酶液，于40℃反应10min，加入1.5mL 1M Na₂CO₃终止反应，于405nm处测定OD值。

实施例4重组***呋喃糖苷酶的性质测定

1、重组***呋喃糖苷酶Abf51B8的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：

将纯化的重组***呋喃糖苷酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底物木聚糖用不同pH的0.1mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中60℃下进行活力测定。结果(图1)表明，重组酶Abf51B8的最适pH为6.0，在pH5.0~7.0有50%以上的相对酶活性。***呋喃糖苷酶于上述各种不同pH的缓冲液中37℃处理60min，再在pH6.0缓冲液体系中60℃下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果(图2)表明酶在pH 4.0-11.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在85%以上，这说明此酶在宽泛的pH范围内具有较好的pH稳定性。

2、***呋喃糖苷酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：

***呋喃糖苷酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为***呋喃糖苷酶在不同温度下处理不同时间，再在60℃下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果(图3)表明其最适温度为60℃。酶的热稳定性性试验表明(图4)，Abf51B8有良好的热稳定性，在60℃下温育1h，酶活几乎不丧失，在70℃下温育1h，能保持80%以上的酶活。

3、***呋喃糖苷酶的K_m值测定方法如下：

用不同浓度的pNPAf为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.0)缓冲液体系中，60℃下测定酶活性，计算出其在60℃下的K_m值。经测定，K_m值为0.5mg/mL，最大反应速度V_max为138.23μmol/min·mg。

4、不同金属离子化学试剂对***呋喃糖苷酶酶活的影响测定如下：

在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性的影响，各种物质终浓度为1mmol/L。在60℃、pH6.0条件下测定酶活性。结果表明，大多数离子和化学试剂β-巯基乙醇和EDTA在浓度为1mmol时重组***呋喃糖苷酶的活力没有明显变化。但是Ag⁺、Hg²⁺几乎可以完全抑制其活力，而SDS也强烈抑制其活力。

Claims (8)

1.一种耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种耐高温***呋喃糖苷酶基因abf51B8，其特征在于，编码权利要求1所述的耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8。

3.如权利要求2所述的耐高温***呋喃糖苷酶基因abf51B8，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

4.包含权利要求3所述耐高温***呋喃糖苷酶基因abf51B8的重组载体。

5.包含权利要求3所述耐高温***呋喃糖苷酶基因abf51B8的重组载体pPET-abf51B8。

6.包含权利要求3所述耐高温***呋喃糖苷酶基因abf51B8的重组菌株。

7.一种制备耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8表达；

3)回收并纯化所表达的耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8。

8.权利要求1所述耐高温***呋喃糖苷酶Abf51B8在饲料工业、在酿酒工业中的应用。

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