CN105163584B - 用于治疗癌症的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的药物组合物，其包含BRAF抑制剂(例如维罗非尼)和/或MEK抑制剂(例如曲美替尼、RO5068760)以及本发明的抗微管蛋白化合物或其它已知的微管蛋白抑制剂，以及使用这样的组合物来治疗例如黑色素瘤、耐药性癌症和癌症转移的癌症。

Description

用于治疗癌症的化合物
发明领域
本发明涉及用于治疗癌症的药物组合物，其包含BRAF抑制剂(例如维罗非尼(vemurafenib))和/或MEK抑制剂(例如曲美替尼(trametinib)、RO5068760)以及本发明的抗微管蛋白化合物或其它已知的微管蛋白抑制剂，以及使用这样的组合物来治疗例如黑色素瘤、耐药性癌症和癌症转移的癌症。
发明背景
癌症是美国第二大常见的死因，仅次于心脏病。在美国，癌症占到死亡原因的四分之一。1996年至2003年，所有诊断为癌症的患者的5年相对存活率是66％，在1975年至1977年的50％基础上提高(Cancer Facts & Figures American Cancer Society：Atlanta，GA(2008))。2000年至2009年，对于男性，新癌症病例比率平均每年下降0.6％，对于女性，保持不变。从2000年至2009年，对于男性，所有癌症的总死亡率平均每年下降1.8％，对于女性，平均每年下降1.4％。存活上的这一改善反映出早期诊断的进步和治疗的改善。发现高效低毒的抗癌剂是癌症研究的主要目标。
微管是由αβ-微管蛋白异二聚体构成的细胞骨架细丝，并且参与广泛的细胞功能，包括形状维持、囊泡输送、细胞运动和***。微管蛋白是微管的主要结构组分，并且是多种非常成功的抗癌药物的经过充分证实的靶点。能够干扰细胞中微管-微管蛋白平衡的化合物可有效地治疗癌症。能够干扰细胞中微管-微管蛋白平衡的如泰素和长春碱的抗癌药物被广泛地用于癌症化学疗法。
遗憾的是，临床使用的微管相互作用抗癌药物有两个共同的主要问题：耐药性和神经毒性。
恶性黑色素瘤是皮肤癌中最危险的形式，占皮肤癌死亡的约75％。在西方国家人口中黑色素瘤的发病率持续增加。在过去20年中病例的数目翻倍。全世界每年诊断出约160,000例新的黑色素瘤病例，并且在男性和白种人中更常见。根据WHO报告，全世界每年发生约48,000例与黑色素瘤相关的死亡。
当前，尚无治疗晚期/转移性黑色素瘤的有效方法。它对目前的化学疗法、放射疗法和免疫疗法有很强的抵抗力。晚期/转移性黑色素瘤预后很差，其中值存活率为6个月并且5年存活率低于5％。
不同中心使用多种化学治疗剂，包括达卡巴嗪(也称为DTIC)、免疫疗法(用白介素-2(IL-2)或干扰素(IFN))以及局部灌注。转移性黑色素瘤的总体成功非常有限。20年中，IL-2(阿地白介素)是最先获得批准用于治疗转移性黑色素瘤的新疗法。然而，完全缓解的患者只有不到5％。近年来，人们付出了巨大的努力试图抗击晚期黑色素瘤。无论是DTIC与其它化学治疗药物(例如顺铂、长春碱和卡莫司汀)的组合还是将干扰素-α2b加入DTIC，都没有表现出优于单独用DTIC治疗的存活益处。最近，使用抗体和疫苗治疗晚期黑色素瘤的临床试验也没有表现出令人满意的功效。伊匹木单抗是使用患者的免疫***来抗击黑色素瘤的药物。使用伊匹木单抗来治疗已经扩散到其最初位置之外的晚期黑色素瘤。靶向疗法使用设计为靶向癌细胞中的特定弱点的药物。
在约60％的黑色素瘤患者中发现BRAF突变，并且FDA批准的BRAF抑制剂(BRAFi；例如维罗非尼和达拉非尼(dabrafenib)(GSK2118436))和MEK抑制剂(MEKi；例如曲美替尼(GSK1120212)、RO5068760)已在BRAFV600突变型黑色素瘤的治疗中表现出引人注目的临床反应。BRAFi+MEKi组合的先期使用在初始疗法期间非常有效，但由于肿瘤异质性和旁路途径的活化，在约9个月内进展出耐药性，导致患者疾病复发和死亡。
维罗非尼是批准用于治疗不能手术治疗的晚期黑色素瘤或已扩散遍及全身的黑色素瘤的靶向疗法。就黑色素瘤而言，维罗非尼仅治疗具有某基因突变(BRAFV600)的肿瘤。同样，维罗非尼和其它BRAF抑制剂可在多种BRAF突变型癌症中有效。其中B-RAF以高频率突变的实例包括黑色素瘤(30-60％)、甲状腺癌(30-50％)、结直肠癌(5-20％)、卵巢癌(约30％)和其它癌症(1-3％)(Wellbrock C，Karasarides M，Marais R.“The RafProtein Takes Centre Stage”.Nat.Rev.(2004)5：875-885)。
维罗非尼在患有BRAFV600突变型黑色素瘤的患者中的持续临床活性受获得性耐药性的迅速进展限制(Lee JT，Li L，Brafford PA等人.“PLX4032，a potent inhibitor ofthe B-Raf V600E oncogene，selectively inhibits V600E-positive melanomas.”Pigment Cell Melanoma Res.(2010)23：820-827；Yang H，Higgins B，Kolinsky K等人.“RG7204(PLX4032)，a selective BRAFV600E inhibitor，displays potent antitumoractivity in preclinical melanoma models”.Cancer Res.(2010)70：5518-5527；YangH，Higgins B，Kolinsky K等人.“Antitumor activity of BRAF inhibitor vemurafenibin preclinical models of BRAF-mutant colorectal cancer”.Cancer Res.(2012)72：779-789.)。已对耐药性的进展机制进行了广泛的研究(Little AS，Smith PD，Cook SJ.“Mechanisms of acquired resistance to ERK1/2 pathway inhibitors”.Oncogene(2013)32(10)：1207-1215；Bollag G，Hirth P，Tsai J等人.“Clinical efficacy of aRAF inhibitor needs broad target blockade in BRAF-mutant melanoma”.Nature(2010)467：596-599；Flaherty KT.“Targeting metastatic melanoma”.Annu Rev Med.(2012)63：171-183；Su F，Bradley WD，Wang Q等人.“Resistance to selective BRAFinhibition can be mediated by modest upstream pathway activation”.Cancer Res.(2012)72：969-978.)。文献中已提出许多不同的机制，包括对BRAFi的固有耐药性、BRAF癌基团的扩增(Shi H，Moriceau G，Kong X等人.“Melanoma whole-exome sequencingidentifies(V600E)B-RAF amplification-mediated acquired B-RAF inhibitorresistance.”Nat.Commun.(2012)3：724)、下游MEK激酶的上调或活化突变、CRAF表达的上调(Montagut C，Sharma SV，Shioda T等人.“Elevated CRAF as a potential mechanismof acquired resistance to BRAF inhibition in melanoma”.Cancer Res.(2008)68：4853-4861)、NRAS的致癌活化(Nazarian R，Shi H，Wang Q等人.“Melanomas acquireresistance to B-RAF(V600E)inhibition by RTK or N-RAS upregulation”.Nature(2010)468：973-977)、上调的EGFR-SFK-STAT3途径(Girotti MR，Pedersen M，Sanchez-Laorden B等人.“Inhibiting EFG receptor or SRC family kinase signalingovercomes BRAF inhibitor resistance in melanoma.”Cancer Discov.(2013)3(2)：158-167)、看门(gatekeeper)突变(Whittaker S，Kirk R，Hayward R等人.“Gatekeepermutations mediate resistance to BRAF-targeted therapies.”Sci.Transl.Med.(2010)2：35ra41；Balzano D，Santaguida S，Musacchio A，Villa F.“A generalframework for inhibitor resistance in protein kinases.”Chem.Biol.(2011)18：966-975；Sierra JR，Cepero V，Giordano S.“Molecular mechanisms of acquiredresistance to tyrosine kinase targeted therapy.”Mol.Cancer(2010)9：75)、生长因子受体(例如***1受体)(IFG1R)(Villanueva J，Vultur A，Lee JT等人.“Acquired resistance to BRAF inhibitors mediated by a RAF kinase switch inmelanoma can be overcome by cotargeting MEK and IGF-1R/PI3K”.Cancer Cell(2010)18：683-695)或血小板源性生长因子受体(PDGFR)的上调，以及几种其它耐药性机制(Wilson TR，Fridlyand J，Yan Y等人.“Widespread potential for growth-factor-driven resistance to anticancer kinase inhibitors”.Nature(2012)487：505-509；Straussman R，Morikawa T，Shee K等人.“Tumour micro-environment elicits innateresistance to RAF inhibitors through HGF secretion”.Nature(2012)487：500-504)。已描述数种在BRAF抑制剂药物存在下维持磷酸化细胞外信号相关激酶1和2(p-ERK1/2)水平的方法，包括ERK激酶1(MEK1)突变、其它供选择的MEK1/2活化剂的募集、RAS突变或受体酪氨酸激酶(RTK)的上调。因此，在许多情况下，维罗非尼耐药性细胞对MEK抑制剂具有交叉耐药性(Little AS，Smith PD，Cook SJ.“Mechanisms of acquired resistance to ERK1/2 pathway inhibitors”.Oncogene(2013)32(10)：1207-1215；Atefi M，von Euw E，AttarN等人.“Reversing melanoma cross-resistance to BRAF and MEK inhibitors by co-targeting the AKT/mTOR pathway.”PLoS One(2011)6：e28973；Poulikakos PI，PersaudY，Janakiraman M等人.“RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization ofaberrantly spliced BRAF(V600E)”Nature(2011)480：387-390)。由于主要的获得性维罗非尼耐药性机制之一是持续的下游MEK/ERK活化，因此，靶向RAF-MEK-ERK途径内的元件的BRAFi+MEKi组合吸引了最多的关注，从而使得FDA在2013年批准了达拉非尼+曲美替尼组合。然而，由于肿瘤异质性和黑色素瘤中旁路途径的活化，平均在9.4个月内进展出对该组合治疗的耐药性，并且该组合在耐药性进展后具有很低的临床活性。
使用具有不同抗癌机制的药剂的药物组合可增强肿瘤反应和患者存活，特别是在晚期癌症患者的治疗中(Carrick S，Parker S，Wilcken N等人.“Single agent versuscombination chemotherapy for metastatic breast cancer”.Cochrane DatabaseSyst.Rev.2005：CD003372；Fassnacht M，Terzolo M，Allolio B等人.“Combinationchemotherapy in advanced adrenocortical carcinoma”.N.Engl.J.Med.(2012)366：2189-2197；Pannu V，Karna P，Sajja HK等人.“Synergistic antimicrotubule therapyfor prostate cancer”.Biochem.Pharmacol.(2011)81：478-487)。尽管已对维罗非尼与靶向相同的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径的药剂(例如MEK或ERK抑制剂)的组合进行广泛的研究，并且已表现出临床功效(Greger JG，Eastman SD，Zhang V等人.“Combinations ofBRAF，MEK，and PI3K/mTOR inhibitors overcome acquired resistance to the BRAFinhibitor GSK2118436 dabrafenib，mediated by NRAS or MEK mutations”Mol.CancerTher.(2012)11：909-920；Patel SP，Lazar AJ，Papadopoulos NE等人.“Clinicalresponses to selumetinib(AZD6244；ARRY-142886)-based combination therapystratified by gene mutations in patients with metastatic melanoma”.Cancer(2013)119(4)：799-805；Flaherty KT，Infante JR，Daud A等人.“Combined BRAF and MEKinhibition in melanoma with BRAF V600 mutations”.N.Engl.J.Med.(2012)367：1694-1703)，但它们仅可阻滞处于G0/G1期的细胞。这样的组合策略不可能有效地处理可从该细胞周期停滞逃脱的耐药性细胞。
长期选择的维罗非尼耐药性人黑色素瘤细胞(例如A375RF21)不能由维罗非尼以对敏感的亲代细胞系(即A375)有效的浓度阻滞在G0/G1期，并且维罗非尼耐药性细胞容易地进展到G2/M期(图2A)。因此，维罗非尼与强烈诱导后续G2/M期阻滞的化合物的组合应成功地捕获从G0/G1期阻滞逃逸的维罗非尼耐药性细胞，由此产生强大的协同作用。
最近，已发现一类新的抗有丝***剂，其由2-芳基-4-苯甲酰基咪唑(ABI)的骨架表示(Chen J，Li CM，Wang J等人.“Synthesis and antiproliferative activity ofnovel 2-aryl-4-benzoyl-imidazole derivatives targeting tubulinpolymerization”.Bioorg.Med.Chem.(2011)19：4782-4795；Chen J，Wang Z，Li CM等人.“Discovery of novel 2-aryl-4-benzoyl-imidazoles targeting the colchicinesbinding site in tubulin as potential anticancer agents”.J.Med.Chem.(2010)53：7414-7427；Chen J，Ahn S，Wang J等人.“Discovery of novel 2-aryl-4-benzoyl-imidazole(ABI-III)analogues targeting tubulin polymerization asantiproliferative agents”.J.Med.Chem.(2012)55：7285-7289；Li CM，Lu Y，Chen J等人.“Orally bioavailable tubulin antagonists for paclitaxel-refractorycancer”.Pharm.Res.(2012)29：3053-3063)。这些化合物在数种人和小鼠黑色素瘤细胞系中呈现在低纳摩尔(nM)范围的抗增殖IC50值。它们在秋水仙碱结合位点结合到微管蛋白。与许多现有的微管蛋白抑制剂(例如紫杉醇和长春碱)相比，ABI化合物可有效地规避数种临床相关多药耐药机制，包括由P-糖蛋白(Pgp)、多药耐药性相关蛋白(MRP)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)介导的耐药性。体内研究表明，它们显著抑制小鼠中的黑色素瘤B16-F10细胞肺转移(Wang Z，Chen J，Wang J等人.“Novel tubulin polymerization inhibitors overcomemultidrug resistance and reduce melanoma metastasis to the lung”.Pharm.Res.(2012)29：3040-3052)。
随着癌症，特别是黑色素瘤发病率的迅速上升以及对目前治疗剂的高耐药性，鉴定靶向旁路途径的更有效的药物组合以克服黑色素瘤的BRAFi耐药性会给患者带来显著益处。另外，由于BRAF突变也在许多其它类型的癌症，包括卵巢癌、结直肠癌和***状甲状腺癌中常见，因此，研发新的组合策略可对其中使用现有BRAFi+MEKi组合表现出很少临床活性的这些类型的癌症具有更广泛的影响，并且是迫切需要的。
发明概述
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂；以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含由式II的结构表示的化合物：
其中
A是单环或稠合的芳族或杂芳族环系；
R1是H、C1-C6线性或支化的烷基、芳基、苯基、苄基、卤代烷基、氨基烷基、-OCH2Ph、SO2-芳基、SO2-苯基、-(C＝O)-芳基、-(C＝O)-苯基或OH；
R4和R5各自独立地为氢、C1-C6线性或支化的烷基、C1-C6线性或支化的卤代烷基、C1-C6线性或支化的烷氧基、C1-C6线性或支化的卤代烷氧基、F、Cl、Br、I、CF3、CN、-CH2CN、NH2、OH、-OC(O)CF3、烷基氨基、氨基烷基、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H、-C(O)NH2或NO2；并且
n是1-4的整数；
或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体；以及
BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种；以及药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的(i)BRAF突变型癌症，(ii)BRAF抑制剂耐药性癌症，(iii)黑色素瘤，(iv)耐药性黑色素瘤，(v)癌症转移、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；或者(vi)延迟或预防个体的BRAF抑制剂耐药性癌症的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有BRAF突变型癌症的个体给药包含以下物质的组合物：BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种；以及由式II的结构表示的化合物：
其中
A是单环或稠合的芳族或杂芳族环系；
R1是H、C1-C6线性或支化的烷基、芳基、苯基、苄基、卤代烷基、氨基烷基、-OCH2Ph、SO2-芳基、SO2-苯基、-(C＝O)-芳基、-(C＝O)-苯基或OH；
R4和R5各自独立地为氢、C1-C6线性或支化的烷基、C1-C6线性或支化的卤代烷基、C1-C6线性或支化的烷氧基、C1-C6线性或支化的卤代烷氧基、F、Cl、Br、I、CF3、CN、-CH2CN、NH2、OH、-OC(O)CF3、烷基氨基、氨基烷基、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H、-C(O)NH2或NO2；并且
n是1-4的整数；
或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制、减轻、抑制、消除、延迟或预防患有癌症的之前用紫杉烷药物治疗的个体的对紫杉烷药物的继发性癌症耐药性的方法，所述方法包括向所述个体给药包含以下物质的组合物：BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及由式II的结构表示的化合物：
其中
A是单环或稠合的芳族或杂芳族环系；
R1是H、C1-C6线性或支化的烷基、芳基、苯基、苄基、卤代烷基、氨基烷基、-OCH2Ph、SO2-芳基、SO2-苯基、-(C＝O)-芳基、-(C＝O)-苯基或OH；
R4和R5各自独立地为氢、C1-C6线性或支化的烷基、C1-C6线性或支化的卤代烷基、C1-C6线性或支化的烷氧基、C1-C6线性或支化的卤代烷氧基、F、Cl、Br、I、CF3、CN、-CH2CN、NH2、OH、-OC(O)CF3、烷基氨基、氨基烷基、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H、-C(O)NH2或NO2；并且
n是1-4的整数；
或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体。
在一个实施方案中，本发明涉及：(i)治疗、遏制耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；(ii)遏制获得性BRAF抑制剂耐药性的方法；(iii)延迟或预防BRAF抑制剂耐药性的进展的方法；或(iv)治疗、遏制、抑制、消除、减轻、延迟或预防癌症转移的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂和MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。
在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和药学上可接受的载体。在另一实施方案中，所述BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，所述微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述微管蛋白抑制剂是本发明的化合物。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含由以下结构表示的化合物：
以及BRAF抑制剂和药学上可接受的载体。在另一实施方案中，所述BRAF抑制剂是维罗非尼。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含由以下结构表示的化合物：
以及MEK抑制剂和药学上可接受的载体。在另一实施方案中，所述MEK抑制剂是RO5068760。
在一个实施方案中，本发明涉及：(a)治疗、遏制个体的BRAF突变型癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；(b)治疗、遏制BRAF抑制剂耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；(c)治疗、遏制黑色素瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；(d)治疗、遏制耐药性黑色素瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；(e)治疗、遏制耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；(f)克服患有耐药性癌症的个体对用BRAF抑制剂治疗的耐药性的方法；或(g)预防、消除、减轻或延迟患有癌症的个体对癌症治疗的耐药性的方法，所述方法包括给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及本发明的化合物的组合物。在另一实施方案中，所述BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是耐药性癌症。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是耐药性黑色素瘤。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，所述微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。
附图说明
本说明书结论部分特别指出并清楚地要求保护视为本发明的主题。然而，通过参照下文的详细说明，同时阅读附图，可以最好地理解本发明的结构和操作方法以及其目标、特征和优点，其中：
图1示出使用历时3个月的长期选择用增加浓度的维罗非尼从亲代A375细胞系建立维罗非尼耐药性A375黑色素瘤细胞系(A375RF21)。MTS测定法显示，对于亲代A375黑色素瘤中的增殖抑制的IC50值(0.57±0.03μM)，当在维罗非尼耐药性A375RF21细胞(28.9±0.6μM)中测试时增加超过50倍。相比之下，化合物12da的IC50值未显著受影响(分别地，在A375亲代细胞系中为10.7±1.5nM，并且在A375RF21中为13.6±4.4nM)。化合物12da和维罗非尼的结构在图中示出。
图2示出细胞周期分析(n＝4)。A，用1μM维罗非尼处理24h并与DMSO对照组进行比较的A375或A375RF21细胞。1μM维罗非尼有效地将A375细胞阻滞在G0/G1期，但不能阻滞耐药性A375RF21细胞。B，用DMSO、30μM维罗非尼、20nM化合物12da、20nM多西他赛和组合处理24h的A375RF21细胞。化合物12da和多西他赛诱导A375RF21细胞的G2/M阻滞，并且它们与维罗非尼的组合将细胞阻滞在G1/G2/M期。
图3示出微管蛋白抑制剂与维罗非尼的组合以协同方式增加耐药性A375RF21细胞的细胞凋亡或死亡的比例。A，代表性象限图示出Q1(早期凋亡)、Q2(凋亡)、Q3(活)和Q4(死亡)中的细胞分布。具有高SSC(边散射)/低FSC(前向散射)细胞形态特征的细胞簇染色为黑色。灰色与黑色群体之间无回门控(back-gating)差异。B，凋亡分数通过将Q1、Q2和Q4中的分布百分比相加在一起来计算。药物组合组所诱导的凋亡比例与两个单一药剂治疗组中的凋亡分数的简单加和相比显著较高(*P＜0.05)。
图4示出单一药剂和组合治疗对基于纯化蛋白的微管蛋白聚合测定法的作用(n＝3)。与DMSO对照组相比，20μM的维罗非尼未显著影响微管蛋白聚合。组合治疗组中的微管蛋白聚合抑制效果仅由化合物12da促成。
图5示出用所指示的抗体在48h处理后A375RF21(A)、MDA-MB-435和WM164细胞(B)的裂解产物的蛋白质印迹法分析。使用GAPDH作为上样对照。A，尽管所指示的组合治疗仅造成中等降低的p-ERK水平，但它们大大抑制AKT磷酸化并增加包括裂解PARP和裂解半胱天冬酶-3在内的凋亡标记的水平。B，化合物12da也在其它两种BRAFV600E突变型人黑色素瘤细胞系MDA-MB-435和WM164中表现出AKT敲除效果。
图6示出在耐药性A375RF21异种移植物模型(n＝7)中的维罗非尼和化合物12da的体内组合。A，分离的肿瘤组织的图片。B，肿瘤体积生长曲线。C，小鼠体重相对于时间的曲线。D，在用单一药剂或组合治疗三周后肿瘤组织切片的H&E、Ki67、pAKT、pERK和S100染色的代表性免疫组织化学图像。各图像中的蓝色比例尺表示100μm。
图7示出在A375RF21异种移植物模型(n＝5)中的高剂量维罗非尼(30mg/kg)和化合物12da(15mg/kg)的体内组合。A，分离的肿瘤组织的图片。B，肿瘤体积生长曲线。C，小鼠体重相对于时间的曲线。在这个剂量下的化合物12da和维罗非尼的组合实现44.9％的肿瘤消退。
图8示出用于制备本发明的芳基-苯甲酰基-咪唑(ABI)化合物的合成路线。试剂和条件：(a)t-BuOH，I2，乙二胺，K2CO3，回流；(b)PhI(OAc)2，K2CO3，DMSO；(c)DBU，CBrCl3，DMF；(d)NaH，PhSO2Cl，THF，0℃-RT；(e)t-BuLi，被取代的苯甲酰氯，THF，-78℃；(f)Bu4NF，THF，RT。
图9示出用于制备本发明的芳基-苯甲酰基-咪唑(ABI)化合物的合成路线。试剂和条件：(a)NH4OH，乙二醛，乙醇，RT；(b)NaH，PhSO2Cl，THF，0℃-RT；(c)t-BuLi，被取代的苯甲酰氯，THF，-78℃；(d)Bu4NF，THF，RT；(e)BBr3，CH2Cl2；(f)c-HCl，AcOH，回流。
图10示出用于制备本发明的芳基-苯甲酰基-咪唑(ABI)化合物的合成路线。试剂和条件：(a)NaH，被取代的苯甲酰氯，THF。
图11示出化合物12dc、12fc、12daa、12dab、12cba的合成路线。(a)AlCl3，THF，回流；(b)用于12dab和12cba的NaH、CH3I，和用于12daa的BnBr，THF，回流。
图12示出化合物11gaa、12la的合成路线。(a)NH4OH，乙醇，乙二醛，RT；(b)NaH，被取代的PhSO2Cl，THF，0℃-RT；(c)t-BuLi(在戊烷中1.7M)，被取代的苯甲酰氯，THF，-78℃；(d)Bu4NF，RT。
图13示出12fa的合成路线。(a)NH4OH，乙二醛，乙醇，RT；(b)NaH，PhSO2Cl，THF，0℃-RT；(c)t-BuLi，3，4，5-三甲氧基苯甲酰氯，THF，-78℃；(d)Bu4NF，THF，RT。
图14示出17ya、17yab和17yac的合成路线。(a)1.KOH，乙醇，2.PhSO2Cl，丙酮，RT；(b)NH4OH，乙二醛，乙醇，RT；(c)NaH，PhSO2Cl，THF，0℃-RT；(d)t-BuLi(在戊烷中1.7M)，3，4，5-三甲氧基苯甲酰氯，THF，-78℃；(e)NaOH，乙醇，H2O，回流；(f)TBAF，THF，RT；(g)NaH，CH3I，THF。
图15示出用本发明的化合物(12q、70a、70f和70m)处理24小时的PC3细胞周期分布。
图16示出与其它抗癌药物和化合物相比对于多药耐药性黑色素瘤细胞系(MDR细胞)和相应的敏感亲代细胞系(正常黑色素瘤细胞)，2-芳基-4-苯甲酰基-咪唑化合物(ABI)的剂量反应曲线。对于紫杉醇、长春碱和秋水仙碱，两条曲线之间的大的距离表明，它们是P-糖蛋白(P-gp)的底物。各ABI化合物的两条曲线的重叠表明，ABI化合物不是P-gp的底物并且克服了多药耐药性。
图17示出在体外ABI化合物对微管蛋白聚合的作用。将微管蛋白(0.4mg/测定)暴露于10μM ABI化合物(媒介物对照，5％DMSO)。在37℃下每分钟监测340nm处的吸光度，持续15分钟，并且表明ABI化合物12da、12db和12cb在体外抑制微管蛋白聚合。
图18示出在软琼脂中的B16-F1黑色素瘤集落形成测定法，其表明ABI化合物以浓度依赖性方式抑制集落形成。图18A示出在100nM下的对照以及各测试化合物(12cb、12da和12fb)的代表性图片。各孔的直径为35mm。图18B示出各测试化合物(12cb、12da和12fb)的测定法结果的定量表示。使用Student′s t检验通过GraphPad Prism软件与对照比较来计算P值。柱，三次平行测定的平均值；棒，SD。
图19示出ABI化合物的体内研究。图19A示出12cb对C57/BL小鼠中的B16-F1黑色素瘤肿瘤的体内活性。图19B示出12fb对C57BL/6小鼠和SHO裸小鼠中的B16-F1黑色素瘤的体内活性。结果表明，12fb以剂量依赖性方式抑制黑色素瘤肿瘤生长。具有B16-F1黑色素瘤同种异体移植物的C57BL/6小鼠(每组n＝5)。各小鼠通过皮下注射到胁腹中接受0.5×106个细胞。当肿瘤大小达到约100mm3时，开始每天30μL腹膜内治疗。图19C示出12fb对A375人黑色素瘤异种移植物的体内活性。具有A375人黑色素瘤异种移植物的SHO裸小鼠(每组n＝5)。各小鼠通过皮下注射到胁腹中接受2.5×106个细胞。当肿瘤大小达到约150mm3时，开始每天30μL腹膜内治疗。对照，仅媒介物溶液；点，平均值；棒，SD。DTIC，(5-(3，3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲酰胺，达卡巴嗪。
图20示出17ya和55对微管蛋白聚合的作用。化合物17ya和55结合到微管蛋白上的秋水仙碱结合位点，并抑制微管蛋白聚合。图20A，竞争性重量结合。用不同浓度的鬼臼毒素、长春碱、化合物17ya和55来孵育微管蛋白(1mg/mL)和秋水仙碱(1.2μM)。N＝3；平均值±SD。鬼臼毒素和长春碱分别用作阳性对照和阴性对照。图20B，对微管蛋白聚合的作用。将微管蛋白(0.4mg)暴露于测试化合物(5μM)。将秋水仙碱用作阳性对照。图20C和20D，17ya和55增强在24h时在PC-3(C)和PC-3/TxR(D)细胞中的细胞质DNA-组蛋白复合物形成(细胞凋亡)的能力(N＝3)；平均值±SD。将多西他赛用作阳性对照。
图21示出体内抗癌功效。图21A，在第1和9天使用多西他赛(i.v.，10或20mg/kg)来治疗负荷PC-3肿瘤的裸小鼠。(N＝5-6)。棒，SE。图21B，在第1和9天使用多西他赛(i.v.，10或20mg/kg)来治疗负荷PC-3/TxR肿瘤的裸小鼠，每周五天每天一次化合物17ya治疗(p.o.，6.7mg/kg)。(N＝4-5)。棒，SE。图21C，在第一周中四天内每天两次使用化合物17ya(PO，3.3mg/kg)来治疗负荷PC-3/TxR肿瘤的裸小鼠，然后第2-4周内每周五天每天一次给药(N＝7)，四周内每周五天每天两次使用化合物55进行治疗(p.o.，10或30mg/kg)(N＝7)。棒，SE。图21D，四周内每周三次使用化合物17ya(PO，10mg/kg)来治疗负荷PC-3/TxR肿瘤的裸小鼠(N＝5)。棒，SE。
图22示出17ya在HL60白血病细胞异种移植物中的体内抗癌功效。
图23示出维罗非尼耐药性细胞的抗磷酸化组蛋白H3和PI(碘化丙啶)二变量染色细胞周期分析。将A375RF21细胞(生物学平行测定n＝4)用含有5‰DMSO(媒介物对照)、单一药剂或所指示的组合的细胞培养基处理24h，然后用抗磷酸化组蛋白488抗体和PI染色，然后用流式细胞术进行分析。A，示出细胞分布的代表图。手动限定红色线以显示如何相应计算细胞周期的期分布。B，细胞周期的期分布的定量数据(平均值±SD)。对照：5‰DMSO；Vem：维罗非尼30μM；ABI：化合物12da 20nM；Vem+ABI：维罗非尼30μM+化合物12da20nM；Doc：多西他赛20nM；Vem+Doc：维罗非尼30μM+多西他赛20nM。
图24示出各组合在A375细胞和A375RF21细胞中的体外剂量反应曲线(n＝5)。各曲线的X轴是在A+B组合处理中，关于药物A或B对A375细胞或A375RF21细胞的IC50浓度的剂量密度。图24A-24C是来自A375细胞的数据，并且图24D-24F是来自A375RF21细胞的数据。
图25示出A375RF21细胞的主要维罗非尼耐药性机制是PDGFβ的过表达和PI3K-AKT途径的活化。两种耐药性机制均已由临床肿瘤充分确定，表明A375RF21细胞的耐药性机制可代表临床相关的耐药性机制。图A：蛋白质印迹法分析，以比较在存在或不存在2.5μM维罗非尼(A375RF21细胞培养维持浓度)下敏感亲代A375细胞和维罗非尼耐药性A375RF21细胞中的差异蛋白质水平。将细胞用对照媒介物或2.5μM维罗非尼孵育24h。在用30μM过氧化氢刺激30分钟后测定磷酸化PI3K水平。图表示出三次独立实验的代表性结果。图B：在MTS测定法(n＝4)中测定的激酶抑制剂对A375细胞和A375RF21细胞的生长抑制功效。曲美替尼和司美替尼是MEK抑制剂，而舒尼替尼(苹果酸盐)是RTK抑制剂。图C：计算的IC50值(显示为平均值±SD)的比较。
图26示出A375细胞和维罗非尼耐药性亚系A375RF21细胞的体外生长曲线。将在100μl细胞生长培养基中的2000个细胞接种到96孔板中的各孔(n＝6)中，并在37℃、5％CO2下进行孵育。总蛋白量通过SRB测定法在各指定时间点相应地测定。然后，将564nm处的吸收值相对于生长时间作图。
图27示出研究策略的图示描述。植入P2维罗非尼敏感性或维罗非尼耐药性PDX肿瘤的NSG小鼠从JAX购买。将P2肿瘤在另外的NSG小鼠中繁殖以产生足量的P3肿瘤用于研究。对所收获P3肿瘤的基因图谱和组织学进行表征，并用来自在JAX建立的最初P0肿瘤的标准物进行验证，以确保肿瘤保真度。将P3肿瘤块植入小鼠中以形成P4肿瘤，以用于在目标1和2中所述的功效研究(实施例11)。另外，将来自P3肿瘤的单细胞悬浮液在实验黑色素瘤肺转移模型中尾静脉注射到小鼠中，以评估目标3中的组合对黑色素瘤转移的功效。
图28示出ABI 12cb、12da和12fb对小鼠中黑色素瘤到肺的转移的抑制。图A：具有黑色素瘤结节的肺的代表性照片(黑点，每组n＝8)。治疗是每周5天i.p.注射，持续2周。图B：各肺上黑色素瘤结节的数目。点：各结节数；中间的长线：平均值；顶部和底部的短线：95％置信区间**，并且##：p＜0.01。图C：实验过程中小鼠体重的变化。点：平均值；棒：SD。对照：仅媒介物溶液。
本领域技术人员会理解，为了简单明了地进行说明，所述图中所示的元素不一定是按照比例绘制的。例如，为了清楚起见，一些元素的尺寸可能相对于其它元素进行了放大。另外，在认为适当的情况下，参考数字可能重复出现于所述图中，以指示相应的或类似的元素。
发明详述
在一个实施方案中，本发明涉及由式I的结构表示的化合物：
其中
A是单环或稠合的芳族或杂芳族环系；
Z是O或S；
R1是H、C1-C6线性或支化的烷基、芳基、苯基、苄基、卤代烷基、氨基烷基、-OCH2Ph、SO2-芳基、SO2-苯基、-(C＝O)-芳基、-(C＝O)-苯基或OH；
R2、R3、R4和R5各自独立地为氢、C1-C6线性或支化的烷基、C1-C6线性或支化的卤代烷基、C1-C6线性或支化的烷氧基、C1-C6线性或支化的卤代烷氧基、F、Cl、Br、I、CF3、CN、-CH2CN、NH2、OH、-OC(O)CF3、烷基氨基、氨基烷基、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H、-C(O)NH2或NO2；并且
m和n各自独立地为0-4的整数；
或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体。
在一个实施方案中，A是芳基。在另一实施方案中，A是苯基。在另一实施方案中，A是吲哚基。在另一实施方案中，A是3-吲哚基。在另一实施方案中，Z是O。
在一个实施方案中，R2是OMe。在另一实施方案中，R3是H。在另一实施方案中，m是3。在另一实施方案中，R2是OMe，R3是H，并且m是3。
在一个实施方案中，R4是C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R4是Me。在另一实施方案中，R4是H。在另一实施方案中，R5是H。在另一实施方案中，n是1。在另一实施方案中，R4是Me，R5是H，并且n是1。在另一实施方案中，R4是H，R5是H，并且n是1。
在另一实施方案中，R1是H。在另一实施方案中，R1是C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R1是Me。
在一个实施方案中，本发明涉及由式II的结构表示的化合物：
其中
A是单环或稠合的芳族或杂芳族环系；
R1是H、C1-C6线性或支化的烷基、芳基、苯基、苄基、卤代烷基、氨基烷基、-OCH2Ph、SO2-芳基、SO2-苯基、-(C＝O)-芳基、-(C＝O)-苯基或OH；
R4和R5各自独立地为氢、C1-C6线性或支化的烷基、C1-C6线性或支化的卤代烷基、C1-C6线性或支化的烷氧基、C1-C6线性或支化的卤代烷氧基、F、Cl、Br、I、CF3、CN、-CH2CN、NH2、OH、-OC(O)CF3、烷基氨基、氨基烷基、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H、-C(O)NH2或NO2；并且
n是1-4的整数；
或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体。
在一个实施方案中，A是芳基。在另一实施方案中，A是苯基。在另一实施方案中，A是吲哚基。在另一实施方案中，A是3-吲哚基。
在一个实施方案中，R4是C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R4是Me。在另一实施方案中，R4是H。在另一实施方案中，R5是H。在另一实施方案中，n是1。在另一实施方案中，R4是Me，R5是H，并且n是1。在另一实施方案中，R4是H，R5是H，并且n是1。
在另一实施方案中，R1是H。在另一实施方案中，R1是C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R1是Me。
在一个实施方案中，本发明涉及由式III的结构表示的化合物：
其中
R1和R9各自独立地为H、C1-C6线性或支化的烷基、芳基、苯基、苄基、卤代烷基、氨基烷基、-OCH2Ph、SO2-芳基、SO2-苯基、-(C＝O)-芳基、-(C＝O)-苯基或OH；
R4和R5独立地为氢、C1-C6线性或支化的烷基、C1-C6线性或支化的卤代烷基、C1-C6线性或支化的烷氧基、C1-C6线性或支化的卤代烷氧基、F、Cl、Br、I、CF3、CN、-CH2CN、NH2、OH、-OC(O)CF3、烷基氨基、氨基烷基、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H、-C(O)NH2或NO2；并且
n是1-4的整数；
或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体。
在一个实施方案中，R4是H。在另一实施方案中，R5是H。在另一实施方案中，n是1。在另一实施方案中，R4是H，R5是H，并且n是1。在另一实施方案中，R9是H。在另一实施方案中，R9是Me。
在另一实施方案中，R1是H。在另一实施方案中，R1是C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R1是Me。
在另一实施方案中，式III的化合物由化合物17ya的结构表示：
在一个实施方案中，本发明涉及由式IV的结构表示的化合物：
其中
R1是H、C1-C6线性或支化的烷基、芳基、苯基、苄基、卤代烷基、氨基烷基、-OCH2Ph、SO2-芳基、SO2-苯基、-(C＝O)-芳基、-(C＝O)-苯基或OH；
R4和R5各自独立地为氢、C1-C6线性或支化的烷基、C1-C6线性或支化的卤代烷基、C1-C6线性或支化的烷氧基、C1-C6线性或支化的卤代烷氧基、F、Cl、Br、I、CF3、CN、-CH2CN、NH2、OH、-OC(O)CF3、烷基氨基、氨基烷基、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H、-C(O)NH2或NO2；并且
n是1-4的整数；
或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体。
在一个实施方案中，R4是C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R4是Me。在另一实施方案中，R4是H。在另一实施方案中，R5是H。在另一实施方案中，n是1。在另一实施方案中，R4是Me，R5是H，并且n是1。
在另一实施方案中，R1是H。在另一实施方案中，R1是C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R1是Me。
在另一实施方案中，式IV的化合物由化合物12da的结构表示：
在一个实施方案中，式I和II的化合物的A是Ph。在另一实施方案中，式I和II的化合物的A是吲哚基。在另一实施方案中，式I和II的化合物的A是2-吲哚基。在另一实施方案中，式I和II的化合物的A是3-吲哚基。在另一实施方案中，式I和II的化合物的A是4-吲哚基。在另一实施方案中，式I和II的化合物的A是5-吲哚基。在另一实施方案中，式I和II的化合物的A是6-吲哚基。在另一实施方案中，式I和II的化合物的A是7-吲哚基。
在另一实施方案中，R5位于对位。在另一实施方案中，R5位于间位。在另一实施方案中，R5位于邻位。在另一实施方案中，R5是4-Me。在另一实施方案中，R5是H。在另一实施方案中，R5是4-F。
在另一实施方案中，R4是H。
在另一实施方案中，n是1。
在一个实施方案中，式I和II的A基团是呋喃基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、吡啶基、苯基、联苯、三苯基、二苯基甲烷、金刚烷基、芴基，以及其它杂环类似物，例如，吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、吡咯嗪基(pyrrolizinyl)、吲哚基、异喹啉基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、喹嗪基、噌啉基、喹唑啉基(quinalolinyl)、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基、环氧乙烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、二噁烷基、呋喃基、吡喃鎓(pyrylium)、苯并间二氧杂环戊烯基(benzodioxolyl)、硫杂环丙基(thiranyl)、硫杂环丁基(thietanyl)、四氢噻吩基、二硫环戊基(dithiolanyl)、四氢噻喃基、噻吩基、硫杂基(thiepinyl)、硫茚基、氧硫杂环戊基(oxathiolanyl)、吗啉基、噻噁烷基(thioxanyl)、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基。
在一个实施方案中，A是苯基。在另一实施方案中，A是吲哚基；最优选3-吲哚基和5-吲哚基。
在一个实施方案中，式I的Z是O。在另一实施方案中，Z是S。
在一个实施方案中，式I、II、III和IV的R1是氢。在另一实施方案中，R1是C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R1是Me。在另一实施方案中，R1是C1-C6线性或支化的卤代烷基。在另一实施方案中，R1是CF3。在另一实施方案中，R1是苯基。在另一实施方案中，R1是苄基。在另一实施方案中，R1是SO2-芳基。在另一实施方案中，R1是(C＝O)-芳基。
在一个实施方案中，式I的R3位于对位。在另一实施方案中，R3位于间位。在另一实施方案中，R3位于邻位。
在一个实施方案中，式I的R2和R3独立地为氢。在另一实施方案中，R2和R3独立地为C1-C6线性或支化的烷氧基。在另一实施方案中，R2和R3独立地为OCH3。在另一实施方案中，R2和R3独立地为F。在另一实施方案中，R2和R3独立地为4-F。在另一实施方案中，R2和R3独立地为Cl。在另一实施方案中，R2和R3独立地为Br。在另一实施方案中，R2和R3独立地为I。在另一实施方案中，R2和R3独立地为C1-C6线性或支化的卤代烷基。在另一实施方案中，R2和R3独立地为CF3。在另一实施方案中，R2和R3独立地为CN。在另一实施方案中，R2和R3独立地为NH2。在另一实施方案中，R2和R3独立地为OH。在另一实施方案中，R2和R3独立地为C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R2和R3独立地为CH3。在另一实施方案中，R2和R3独立地为NO2。在另一实施方案中，R2和R3独立地为烷基氨基。在另一实施方案中，R2和R3独立地为4-N(Me)2。
在一个实施方案中，式I的m是0。在另一实施方案中，m是1。在另一实施方案中，m是2。在另一实施方案中，m是3。在另一实施方案中，m是4。
在一个实施方案中，式I、II、III和IV的R5位于对位。在另一实施方案中，R5位于间位。在另一实施方案中，R5位于邻位。
在一个实施方案中，式I、II、III和IV的R4和R5独立地为氢。在另一实施方案中，R4和R5独立地为C1-C6线性或支化的烷氧基。在另一实施方案中，R4和R5独立地为OMe。在另一实施方案中，R4和R5独立地为F。在另一实施方案中，R4和R5独立地为Cl。在另一实施方案中，R4和R5独立地为Br。在另一实施方案中，R4和R5独立地为I。在另一实施方案中，R4和R5独立地为C1-C6线性或支化的卤代烷基。在另一实施方案中，R4和R5独立地为CF3。在另一实施方案中，R4和R5独立地为CN。在另一实施方案中，R4和R5独立地为NH2。在另一实施方案中，R4和R5独立地为OH。在另一实施方案中，R4和R5独立地为C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R4和R5独立地为NO2。在另一实施方案中，R4和R5独立地为烷基氨基。
在一个实施方案中，式I、II、III和IV的n是0。在另一实施方案中，n是1。在另一实施方案中，n是2。在另一实施方案中，n是3。在另一实施方案中，n是4。
应理解，对于杂环，n限于可用取代的位置的数量，即CH基团的数量减去1。因此，如果A环是例如呋喃基、噻吩基或吡咯基，则n是0-2；并且如果A环是例如噁唑基、咪唑基或噻唑基，则n是0或1；并且如果A环是例如噁二唑基或噻二唑基，则n是0。
在一个实施方案中，式III的R9是氢。在另一实施方案中，R9是C1-C6线性或支化的烷基。在另一实施方案中，R9是CH3。在另一实施方案中，R9是C1-C6线性或支化的卤代烷基。在另一实施方案中，R9是CF3。在另一实施方案中，R9是苯基。在另一实施方案中，R9是-CH2Ph。在另一实施方案中，R9是SO2-芳基。在另一实施方案中，R9是(C＝O)-芳基。在另一实施方案中，R9是(SO2)Ph。在另一实施方案中，R9是(SO2)-Ph-OCH3。
本文中所用的“单环或稠合的芳族或杂芳族环系”可为任何这样的环，包括但不限于苯基、吲哚基、1H-吲哚、异吲哚基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、四嗪基、噻唑基、异噻唑基、噁唑基、异噁唑基、咪唑基、吡唑基、吡咯基、呋喃基、噻吩基、异喹啉基、萘基、蒽基、苯并咪唑基、吲唑基、2H-吲唑、4，5，6，7-四氢-2H-吲唑、3H-吲哚-3-酮、嘌呤基、苯并噁唑基、1，3-苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并噻唑基、1，3-苯并噻唑、4，5，6，7-四氢-1，3-苯并噻唑、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基、酞嗪基、喹啉基、异喹啉基、吖啶基、苯并呋喃基、1-苯并呋喃、异苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并[c]噻吩基、苯并间二氧杂环戊烯基、噻二唑基、[1，3]噁唑并[4，5-b]吡啶、噁二唑基、咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑、4H，5H，6H-环戊二烯并[d][1，3]噻唑、5H，6H，7H，8H-咪唑并[1，2-a]吡啶、7-氧代-6H，7H-[1，3]噻唑并[4，5-d]嘧啶、[1，3]噻唑并[5，4-b]吡啶、2H，3H-咪唑并[2，1-b][1，3]噻唑、噻吩并[3，2-d]嘧啶-4(3H)-酮、4-氧代-4H-噻吩并[3，2-d][1，3]噻嗪、咪唑并[1，2-a]吡啶、吡唑并[1，5-a]吡啶、咪唑并[1，2-a]吡嗪、咪唑并[1，2-a]嘧啶、1H-吡咯并[2，3-b]吡啶、吡啶并[2，3-b]吡嗪、吡啶并[2，3-b]吡嗪-3(4H)-酮、4H-噻吩并[3，2-b]吡咯、喹喔啉-2(1H)-酮、1H-吡咯并[3，2-b]吡啶、7H-吡咯并[2，3-d]嘧啶、噁唑并[5，4-b]吡啶、噻唑并[5，4-b]吡啶等。
本文中所用的“杂环系”是指饱和或不饱和的N-杂环，包括但不限于氮杂-和二氮杂-环烷基，例如氮丙啶基、氮杂环丁基、diazatidinyl、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基和氮杂环辛烷基(azocanyl)、吡咯基、吡唑基、咪唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、三嗪基、四嗪基、吡咯嗪基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、吲唑基、喹嗪基、噌啉基、喹诺酮基(quinololinyl)、酞嗪基、萘啶基、喹喔啉基等；饱和或不饱和的O-杂环，包括但不限于环氧乙烷基、氧杂环丁基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、二噁烷基、呋喃基、吡喃鎓、苯并呋喃基、苯并间二氧杂环戊烯基等；饱和或不饱和的S-杂环，包括但不限于硫杂环丙基、硫杂环丁基、四氢噻吩基、二硫戊环基、四氢噻喃基、噻吩基、苯并噻吩基、硫杂基、硫茚基等；饱和或不饱和的混合的杂环，其可为任何含有两个或更多个S-、N-或O-杂原子的杂环，包括但不限于氧硫杂环戊基、吗啉基、噻噁烷基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、噁唑基、异噁唑基、噁二唑基等。
除非另有说明，否则本文中所用的术语“烷基”可为任何含有至多约30个碳的直链或支链烷基。在另一实施方案中，烷基包括C1-C6碳。在另一实施方案中，烷基包括C1-C8碳。在另一实施方案中，烷基包括C1-C10碳。在另一实施方案中，烷基是C1-C12碳。在另一实施方案中，烷基是C1-C20碳。在另一实施方案中，环烷基具有3-8个碳。在另一实施方案中，支链烷基是被1至5个碳的烷基侧链取代的烷基。在一个实施方案中，所述烷基可被取代。在另一实施方案中，所述烷基可被卤素、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰氨基、烷基酰氨基、二烷基酰氨基、氰基、硝基、CO2H、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代和/或硫代烷基取代。
烷基可为单独的取代基，或者它可以为更大取代基的组分，例如在烷氧基、卤代烷基、芳基烷基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基酰氨基、烷基脲等中。优选的烷基为甲基、乙基和丙基，并且因此卤代甲基、二卤代甲基、三卤代甲基、卤代乙基、二卤代乙基、三卤代乙基、卤代丙基、二卤代丙基、三卤代丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、芳基甲基、芳基乙基、芳基丙基、甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲基酰氨基、乙酰氨基、丙基酰氨基、卤代甲基酰氨基、卤代乙基酰氨基、卤代丙基酰氨基、甲基脲、乙基脲、丙基脲等。
本文中所用的术语“芳基”是指任何直接键连到另一基团的芳族环。芳基可以为单独的取代基，或者芳基可以为更大取代基的组分，例如在芳基烷基、芳基氨基、芳基酰氨基等中。示例性芳基包括但不限于苯基、甲苯基、二甲苯基、呋喃基、萘基、吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基、三嗪基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、咪唑基、噻吩基、吡咯基、苯基甲基、苯基乙基、苯基氨基、苯基酰氨基等。取代包括但不限于：F、Cl、Br、I、C1-C5线性或支化的烷基、C1-C5线性或支化的卤代烷基、C1-C5线性或支化的烷氧基、C1-C5线性或支化的卤代烷氧基、CF3、CN、NO2、-CH2CN、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、羟基、-OC(O)CF3、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H或-C(O)NH2。
本文中所用的术语“烷氧基”是指被如上文所定义的烷基取代的醚基。烷氧基指线性烷氧基和支化烷氧基两者。烷氧基的非限制性实例是甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基。
本文中所用的术语“氨基烷基”是指被如上文所定义的烷基取代的胺基。氨基烷基是指单烷基胺、二烷基胺或三烷基胺。氨基烷基的非限制性实例是-N(Me)2、-NHMe、-NH3。
在另一实施方案中，“卤代烷基”是指被一个或多个卤素原子(例如F、Cl、Br或I)取代的如上文所定义的烷基。卤代烷基的非限制性实例是CF3、CF2CF3、CH2CF3。
在另一实施方案中，“烷氧基烷基”是指被如上文所定义的烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、叔丁氧基等)取代的如上文所定义的烷基。烷氧基烷基的非限制性实例是-CH2-O-CH3、-CH2-O-CH(CH3)2、-CH2-O-C(CH3)3、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-O-CH(CH3)2、-CH2-CH2-O-C(CH3)3。
在一个实施方案中，“环烷基”或“碳环”基团是指包含碳原子作为环原子的环结构，其可为饱和或不饱和、被取代或未被取代的。在另一实施方案中，环烷基是3-12元环。在另一实施方案中，环烷基是6元环。在另一实施方案中，环烷基是5-7元环。在另一实施方案中，环烷基是3-8元环。在另一实施方案中，环烷基可未被取代或被卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰氨基、烷基酰氨基、二烷基酰氨基、氰基、硝基、CO2H、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代和/或硫代烷基取代。在另一实施方案中，环烷基环可稠合到另一饱和或不饱和的环烷基或杂环3-8元环。在另一实施方案中，环烷基环是饱和环。在另一实施方案中，环烷基环是不饱和环。环烷基的非限制性实例包括环己基、环己烯基、环丙基、环丙烯基、环戊基、环戊烯基、环丁基、环丁烯基、环辛基、环辛二烯基(COD)、环辛烯(COE)等。
在一个实施方案中，“杂环”或“杂环基”是指除碳原子以外还包含硫、氧、氮或其任何组合作为环的一部分的环结构。在另一实施方案中，杂环是3-12元环。在另一实施方案中，杂环是6元环。在另一实施方案中，杂环是5-7元环。在另一实施方案中，杂环是3-8元环。在另一实施方案中，杂环基可未被取代或被卤素、烷基、卤代烷基、羟基、烷氧基、羰基、酰氨基、烷基酰氨基、二烷基酰氨基、氰基、硝基、CO2H、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羧基、硫代和/或硫代烷基取代。在另一实施方案中，杂环可稠合到另一饱和或不饱和的环烷基或杂环3-8元环。在另一实施方案中，杂环是饱和环。在另一实施方案中，杂环是不饱和环。杂环的非限制性实例包括吡啶、哌啶、吗啉、哌嗪、噻吩、吡咯、苯并间二氧杂环戊烯或吲哚。
在一个实施方案中，本发明提供本发明的化合物或其同分异构体、代谢产物、药学上可接受的盐、药物产品、互变异构体、水合物、N-氧化物、多晶型物或晶体或其组合。在一个实施方案中，本发明提供本发明的化合物的同分异构体。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物的代谢产物。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物的药学上可接受的盐。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物的药物产品。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物的互变异构体。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物的水合物。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物的N-氧化物。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物的多晶型物。在另一实施方案中，本发明提供本发明的化合物的晶体。在另一实施方案中，本发明提供组合物，其包含如本文中所述的本发明的化合物，或者在另一实施方案中，本发明的化合物的同分异构体、代谢产物、药学上可接受的盐、药物产品、互变异构体、水合物、N-氧化物、多晶型物或晶体的组合。
在一个实施方案中，术语“同分异构体”包括但不限于旋光异构体和类似物、结构异构体和类似物、构象异构体和类似物等。在另一实施方案中，同分异构体是旋光异构体。
在一个实施方案中，本发明的化合物是纯(E)-同分异构体。在另一实施方案中，本发明的化合物是纯(Z)-同分异构体。在另一实施方案中，本发明的化合物是(E)同分异构体和(Z)同分异构体的混合物。在一个实施方案中，本发明的化合物是纯(R)-同分异构体。在另一实施方案中，本发明的化合物是纯(S)-同分异构体。在另一实施方案中，本发明的化合物是(R)同分异构体和(S)同分异构体的混合物。
本发明的化合物也可以含有基本上等量的立体异构体的外消旋混合物的形式存在。在另一实施方案中，可使用已知方法制备或者分离本发明的化合物，以获得基本上不含其对应立体异构体(即基本上纯)的立体异构体。所谓基本上纯旨在表示立体异构体为至少约95％纯，更优选至少约98％纯，最优选至少约99％纯。
本发明的化合物也可以呈水合物形式，其表示化合物还包含通过非共价分子间力结合的化学计量或非化学计量的水。
本发明的化合物可以一种或多种可能互变异构体的形式存在，并且取决于特定条件，可将一些或所有互变异构体分离为单个且不同的实体。应理解，本文涵盖所有可能的互变异构体，包括所有另外的烯醇式和酮式互变异构体和/或同分异构体。例如，包括但不限于以下互变异构体。
咪唑环的互变异构化
本发明的互变异构体是自由互变的互变异构体，而不是未拆分的混合物。本发明的咪唑和其它环系是可互变异构的。所有互变异构体都被认为是本发明的一部分。
应充分理解的是，在本发明中所呈现的其中氮原子具有少于3个键的结构中，存在H原子以完成氮的化合价。
本发明包括本发明的化合物的“药学上可接受的盐”，其可通过本发明的化合物与酸或碱的反应制备。某些化合物，特别是具有酸性或碱性基团的化合物也可呈盐，优选药学上可接受的盐的形式。术语“药学上可接受的盐”是指保留游离碱或游离酸的生物效应和性质的盐，所述盐不是生物学上或其它方面不期望的。所述盐是用例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等的无机酸，以及例如乙酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、肉铁质酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、N-乙酰半胱胺酸等的有机酸来形成。本领域技术人员已知其它盐，并且依照本发明可容易地使其适于使用。
可由无机酸或有机酸制备本发明的化合物的胺的合适的药学上可接受的盐。在一个实施方案中，胺的无机盐的实例是硫酸氢盐、硼酸盐、溴化物、氯化物、半硫酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、2-羟基乙基磺酸盐(羟基乙磺酸盐)、碘酸盐、碘化物、异硫代硫酸盐(isothionate)、硝酸盐、过硫酸盐、磷酸盐、硫酸盐、氨基磺酸盐、磺胺酸盐、磺酸(烷基磺酸盐、芳基磺酸盐、卤素取代的烷基磺酸盐、卤素取代的芳基磺酸盐)、磺酸盐和硫氰酸盐。
在一个实施方案中，胺的有机盐的实例可选自脂族酸、环脂族酸、芳族酸、芳脂族酸、杂环酸、羧酸和磺酸类有机酸，其实例为乙酸盐、精氨酸、天冬氨酸盐、抗坏血酸盐、己二酸盐、邻氨基苯甲酸盐、海藻酸盐、烷烃羧酸盐、取代的烷烃羧酸盐、藻酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、碳酸氢盐、酒石酸氢盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环己基氨基磺酸盐、环戊烷丙酸盐、依地酸钙、樟脑磺酸盐、碳酸盐、克拉维酸盐、肉桂酸盐、二羧酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基磺酸盐、二盐酸盐、癸酸盐、庚酸盐(enanthuate)、乙磺酸盐、依地酸盐、乙二磺酸盐、依托酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、甲酸盐、氟化物、半乳糖醛酸盐、葡糖酸盐、谷氨酸盐、乙醇酸盐、葡萄糖二酸盐(glucorate)、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡庚糖酸盐、对羟乙酰氨基苯胂酸盐(glycollylarsanilate)、戊二酸盐、谷氨酸盐、庚酸盐、己酸盐、羟基马来酸盐、羟基羧酸、己基间苯二酚盐、羟基苯甲酸盐、羟基萘甲酸盐、氢氟酸盐、乳酸盐、乳糖醛酸盐、月桂酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、亚甲基双(β-氧基萘甲酸盐)、丙二酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐(mesylate)、甲磺酸盐(methane sulfonate)、甲基溴化物、甲基硝酸盐、甲基磺酸盐、马来酸一钾盐、粘酸盐、一元羧酸盐、萘磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、萘磺酸盐、N-甲基葡糖胺、草酸盐、辛酸盐、油酸盐、扑酸盐、苯基乙酸盐、苦味酸盐、苯基苯甲酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、邻苯二甲酸盐、苯基乙酸盐、果胶酸盐、苯基丙酸盐、棕榈酸盐、泛酸盐、聚半乳糖醛酸盐、丙酮酸盐、奎尼酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硬脂酸盐、磺胺酸盐、碱式醋酸盐、酒石酸盐、茶碱乙酸盐、对甲苯磺酸盐(托西酸盐)、三氟乙酸盐、对苯二酸盐、鞣酸盐、茶氯酸盐、三卤代乙酸盐、三乙基碘化物、三羧酸盐、十一酸盐和戊酸盐。
在一个实施方案中，羧酸或羟基的无机盐的实例可选自铵；包括锂、钠、钾、铯的碱金属；包括钙、镁、铝的碱土金属；锌；钡；胆碱；季铵。
在另一实施方案中，羧酸或羟基的有机盐的实例可选自精氨酸；包括脂族有机胺、脂环族有机胺、芳族有机胺的有机胺；苄星青霉素；叔丁胺；苯乙苄胺(N-苄基苯乙胺)；二环己胺；二甲胺；二乙醇胺；乙醇胺；乙二胺；海巴明；咪唑；赖氨酸；甲胺；蜜胺(meglamine)；N-甲基-D-葡糖胺；N，N’-二苄基乙二胺；烟酰胺；有机胺；鸟氨酸；吡啶；甲基吡啶(picoly)；哌嗪；普鲁卡因；三(羟基甲基)甲胺；三乙胺；三乙醇胺；三甲胺；氨丁三醇和脲。
在一个实施方案中，可通过常规方法形成所述盐，例如通过使产物的游离碱或游离酸形式与一当量或更多当量的合适酸或碱在盐不溶于其中的溶剂或介质中或者在例如水的溶剂(其在真空中或者通过冻干移除)中反应，或者通过将现有盐的离子交换为另一种离子，或者合适的离子交换树脂。
药物组合物
本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含药学上可接受的载体和至少一种根据本发明的方面的化合物。所述药物组合物可包含一种或多种本发明的上述化合物。通常，本发明的药物组合物会包含本发明的化合物，例如式I、II、III或IV的化合物或者17ya或12da或其药学上可接受的盐，以及BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种；以及药学上可接受的载体。本发明的药物组合物也可包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂；以及药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”是指任何合适的辅助剂、载体、赋形剂或稳定剂，并且可以是固体或液体形式，例如片剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂或乳剂。在一些实施方案中，所述药物组合物包含本发明的化合物，例如式I、II、III或IV的化合物或者17ya或12da或其药学上可接受的盐与BRAF抑制剂的组合，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物包含本发明的化合物，例如式I、II、III或IV的化合物或者17ya或12da或其药学上可接受的盐与MEK抑制剂的组合，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物包含本发明的化合物，例如式I、II、III或IV的化合物或者17ya或12da或其药学上可接受的盐与BRAF抑制剂和MEK抑制剂的组合，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物包含微管蛋白抑制剂与BRAF抑制剂的组合，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物包含微管蛋白抑制剂与MEK抑制剂的组合，以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述药物组合物包含微管蛋白抑制剂与BRAF抑制剂、MEK抑制剂的组合，以及药学上可接受的载体。
本文中所述的术语“BRAF”是指产生称为B-Raf的蛋白的人基因。B-Raf蛋白参与发送细胞内的参与引导细胞生长的信号。在2002年，指出其在人类癌症中发生突变。已研发治疗由BRAF引起的癌症的药物。维罗非尼是一种BRAF抑制剂药物，其被FDA批准用于治疗晚期黑色素瘤。正在研发用于抗癌用途的突变B-raf蛋白的其它特定抑制剂(本文中所用的“BRAF抑制剂”)。这些包括：GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、达拉非尼和LGX818。
本文中所述的术语“MEK”是指丝裂原活化蛋白激酶激酶MEK1和/或MEK2。MEK是磷酸化丝裂原活化蛋白激酶的激酶。MEK是在黑色素瘤中活化的MAPK信号转导级联的成员。当MEK被抑制时，细胞增殖被阻止并诱导细胞凋亡(受控的细胞死亡)。
术语“MEK抑制剂”是指抑制丝裂原活化蛋白激酶激酶MEK1和/或MEK2的化学品或药物。它们可用于影响在一些癌症中通常活动过度的MAPK/ERK途径。因此，MEK抑制剂具有治疗一些癌症，特别是BRAF突变型黑色素瘤和KRAS/BRAF突变型结直肠癌的潜力。MEK抑制剂包括但不限于：曲美替尼(GSK1120212)、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼(cobimetinib)或XL518和CI-1040或PD035901。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的两种具有抗癌活性的化合物和药学上可接受的载体。在另一实施方案中，所述组合物包含BRAF抑制剂和本发明的化合物，例如式I、II、III或IV的化合物或者17ya或12da。在另一实施方案中，所述组合物包含MEK抑制剂和本发明的化合物，例如式I、II、III或IV的化合物或者17ya或12da。在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的三种具有抗癌活性的化合物和药学上可接受的载体。在另一实施方案中，所述组合物包含BRAF抑制剂、MEK抑制剂和本发明的化合物，例如式I、II、III或IV的化合物或者17ya或12da。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼(GSK1120212)、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼或XL518、CI-1040或PD035901或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，本发明的化合物是式I、II、III或IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。在另一实施方案中，所述化合物呈其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的形式。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂；以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的BRAF抑制剂和微管蛋白抑制剂的组合以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的MEK抑制剂和微管蛋白抑制剂的组合以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含治疗有效量的BRAF抑制剂、MEK抑制剂、微管蛋白抑制剂的组合以及药学上可接受的载体。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼(GSK1120212)、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼或XL518、CI-1040或PD035901或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼或RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯(discodermolide)、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁(vinfluine)、多拉司他汀(dolastatin)、软海绵素(halichondrin)、哈米特林(hemiasterlin)、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。
通常，所述组合物会包含约0.01-99％、优选约20-75％的活性化合物，以及辅助剂、载体和/或赋形剂。尽管个体需求可能有所变化，但各组分有效量的最佳范围的确定在本领域的技术范围内。通常剂量包含约0.01至约100mg/kg体重。优选的剂量包含约0.1至约100mg/kg体重。最优选的剂量包含约1至约100mg/kg体重。本领域普通技术人员也可很容易地确定用于给药本发明的化合物的治疗方案。也就是说，给药频率和剂量大小可以通过常规优化方法确定，优选同时尽可能减小任何副作用。
在一个实施方案中，本发明的方法可包括以各种剂量给药本发明的式I-IV的化合物。在一个实施方案中，将式I-IV的化合物以0.1-200mg/kg的剂量给药。在一个实施方案中，将式I-IV的化合物以0.01-1mg/kg的剂量给药。在一个实施方案中，将式I-IV的化合物以0.1-10mg/kg或在另一实施方案中，0.1-25mg/kg或在另一实施方案中，10-50mg/kg或在另一实施方案中，10-25mg/kg或在另一实施方案中，0.3-30mg/kg或在另一实施方案中，0.5-25mg/kg或在另一实施方案中，0.5-50mg/kg或在另一实施方案中，0.75-15mg/kg或在另一实施方案中，0.75-60mg/kg或在另一实施方案中，1-5mg/kg或在另一实施方案中，1-20mg/kg或在另一实施方案中，3-15mg/kg或在另一实施方案中，30-50mg/kg或在另一实施方案中，30-75mg/kg或在另一实施方案中，100-2000mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将式I-IV的化合物以5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg或35mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将式I-IV的化合物以10mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将式I-IV的化合物以15mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将式I-IV的化合物以25mg/kg的剂量给药。
在一个实施方案中，将式I-IV的化合物以10mg的剂量给药。在一个实施方案中，将式I-IV的化合物以15mg的剂量给药。在一个实施方案中，将式I-IV的化合物以25mg的剂量给药。在另一实施方案中，将式I-IV的化合物以0.01mg、0.03mg、0.1mg、0.3mg、0.75mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg或100mg的剂量给药。
在一个实施方案中，本发明的方法可包括以各种剂量给药本发明的BRAF抑制剂。在一个实施方案中，将BRAF抑制剂以0.1-200mg/kg的剂量给药。在一个实施方案中，将BRAF抑制剂以0.01-1mg/kg的剂量给药。在一个实施方案中，将BRAF抑制剂以0.1-10mg/kg或在另一实施方案中，0.1-25mg/kg或在另一实施方案中，10-50mg/kg或在另一实施方案中，10-25mg/kg或在另一实施方案中，0.3-30mg/kg或在另一实施方案中，0.5-25mg/kg或在另一实施方案中，0.5-50mg/kg或在另一实施方案中，0.75-15mg/kg或在另一实施方案中，0.75-60mg/kg或在另一实施方案中，1-5mg/kg或在另一实施方案中，1-20mg/kg或在另一实施方案中，3-15mg/kg或在另一实施方案中，30-50mg/kg或在另一实施方案中，30-75mg/kg或在另一实施方案中，100-2000mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将BRAF抑制剂以5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将BRAF抑制剂以10mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将BRAF抑制剂以20mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将BRAF抑制剂以30mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将BRAF抑制剂以40mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将BRAF抑制剂以45mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。
在一个实施方案中，将BRAF抑制剂以10mg的剂量给药。在一个实施方案中，将BRAF抑制剂以15mg的剂量给药。在一个实施方案中，将BRAF抑制剂以25mg的剂量给药。在一个实施方案中，将BRAF抑制剂以45mg的剂量给药。在另一实施方案中，将BRAF抑制剂以5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg或50mg的剂量给药。
在一个实施方案中，本发明的方法可包括以各种剂量给药本发明的MEK抑制剂。在一个实施方案中，将MEK抑制剂以0.1-200mg/kg的剂量给药。在一个实施方案中，将MEK抑制剂以0.01-1mg/kg的剂量给药。在一个实施方案中，将MEK抑制剂以0.1-1mg/kg或在另一实施方案中，0.1-25mg/kg或在另一实施方案中，10-50mg/kg或在另一实施方案中，10-25mg/kg或在另一实施方案中，0.3-0.5mg/kg或在另一实施方案中，0.5-25mg/kg或在另一实施方案中，0.5-50mg/kg或在另一实施方案中，0.75-15mg/kg或在另一实施方案中，0.75-60mg/kg或在另一实施方案中，1-5mg/kg或在另一实施方案中，1-20mg/kg或在另一实施方案中，3-15mg/kg或在另一实施方案中，30-50mg/kg或在另一实施方案中，30-75mg/kg或在另一实施方案中，100-2000mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将MEK抑制剂以0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg或1mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将MEK抑制剂以0.1mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将MEK抑制剂以0.3mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将MEK抑制剂以0.5mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将MEK抑制剂以0.7mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，将MEK抑制剂以1mg/kg的剂量给药。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼或RO5068760。
固体单位剂型可以是常规类型的。所述固体剂型可以为胶囊剂等，例如包含本发明的化合物和载体(例如润滑剂和惰性填充剂，例如乳糖、蔗糖或玉米淀粉)的普通明胶类型。在另一实施方案中，将这些化合物与常规片剂基质(例如乳糖、蔗糖或玉米淀粉)以及粘合剂(例如***胶、玉米淀粉或明胶)、崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸)和润滑剂(例如硬脂酸或硬脂酸镁)制片。
片剂、胶囊剂等还可包含粘合剂例如黄蓍胶、***胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸；润滑剂例如硬脂酸镁；以及甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精。当所述剂量单位形式为胶囊剂时，除了上述类型的材料以外，其还可包含例如脂肪油的液体载体。
多种其它材料可作为包衣存在或用于改变所述剂量单位的物理形式。例如，可以用虫胶、糖或它们二者对片剂进行包衣。除了活性成分以外，糖浆剂还可包含蔗糖作为甜味剂、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂、染料以及调味剂例如樱桃或橙调味剂。
对于口服治疗性给药，可将这些活性化合物与赋形剂掺混，并以片剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂等的形式使用。这样的组合物和制剂应包含至少0.1％的活性化合物。当然，所述化合物在这些组合物中的百分比可有所变化，并且方便地可以为所述单位的重量的约2％至约60％。在这样的治疗上有用的组合物中的活性化合物的量是会获得合适剂量的量。制备优选的本发明的组合物，以使口服剂量单位含有约1mg至800mg的活性化合物。
可将本发明的活性化合物口服给药，例如与惰性稀释剂或与可同化的可食用载体一起口服给药，或者可将它们封装在硬胶囊或软胶囊中，或者可将它们压制成片剂，或者可将它们直接与饮食的食物掺混在一起。
适合注射使用的药物形式包括无菌水溶液剂或分散剂以及用于随时配制成无菌注射溶液剂或分散剂的无菌粉末。在所有情况下，所述形式应该是无菌的，并且其流动性程度应易于注射。在制造和储存条件下其应该是稳定的，并且应该进行保护以免于微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、其合适的混合物，以及植物油。
本发明的化合物或药物组合物还可以通过这些材料与药物辅助剂、载体或赋形剂在生理学上可接受的稀释剂中的溶液或悬浮液以可注射剂量给药。这样的辅助剂、载体或/或赋形剂包括但不限于添加或未添加表面活性剂以及其它药学上和生理上可接受的组分的无菌液体，例如水和油。示例性的油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。一般来说，水、盐水、葡萄糖水溶液及相关的糖溶液和二元醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别是对于注射用溶液。
这些活性化合物也可以通过肠胃外方式给药。这些活性化合物的溶液剂或混悬剂可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散剂。示例性的油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油或矿物油。一般来说，水、盐水、葡萄糖水溶液及相关的糖溶液和二元醇(例如丙二醇或聚乙二醇)是优选的液体载体，特别是对于注射用溶液。在一般的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。
对于用作气雾剂，可以将本发明的化合物的溶液或悬浮液与合适的抛射剂(例如烃抛射剂，如丙烷、丁烷或异丁烷)以及常规辅助剂一起包装入加压气雾剂容器中。本发明的材料还可以非加压的形式(例如在喷雾器或雾化器中)给药。
在一个实施方案中，本发明提供药物组合物，其包含如本文中所述的式I-IV的化合物和/或其同分异构体、药学上可接受的盐、药物产品、水合物、N-氧化物或其任何组合，单独或与另一治疗剂组合，所述另一治疗剂是例如抗癌剂，包括但不限于：微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂、MEK抑制剂或其它适合用于本文中所述的应用的药剂。在一个实施方案中，如本文中所述的式I-IV的化合物的药物组合物包含本发明的化合物以及BRAF抑制剂。在另一实施方案中，所述药物组合物包含本发明的化合物以及MEK抑制剂。在另一实施方案中，所述药物组合物包含本发明的化合物以及BRAF抑制剂和MEK抑制剂。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼(GSK1120212)、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼或XL518、CI-1040或PD035901或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼或RO5068760。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂；以及药学上可接受的载体。在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含微管蛋白抑制剂以及BRAF抑制剂和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含微管蛋白抑制剂以及MEK抑制剂和药学上可接受的载体。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼(GSK1120212)、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼或XL518、CI-1040或PD035901或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼或RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。
在一个实施方案中，将本发明的化合物与抗癌剂组合给药。在一个实施方案中，抗癌剂是BRAF抑制剂。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在一个实施方案中，抗癌剂是MEK抑制剂。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼(GSK1120212)、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼或XL518、CI-1040或PD035901或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼或RO5068760。
在一个实施方案中，本发明涉及药物组合物，其包含由式II的结构表示的化合物：
其中
A是单环或稠合的芳族或杂芳族环系；
R1是H、C1-C6线性或支化的烷基、芳基、苯基、苄基、卤代烷基、氨基烷基、-OCH2Ph、SO2-芳基、SO2-苯基、-(C＝O)-芳基、-(C＝O)-苯基或OH；
R4和R5各自独立地为氢、C1-C6线性或支化的烷基、C1-C6线性或支化的卤代烷基、C1-C6线性或支化的烷氧基、C1-C6线性或支化的卤代烷氧基、F、Cl、Br、I、CF3、CN、-CH2CN、NH2、OH、-OC(O)CF3、烷基氨基、氨基烷基、-OCH2Ph、-NHCO-烷基、COOH、-C(O)Ph、C(O)O-烷基、C(O)H、-C(O)NH2或NO2；并且
n是1-4的整数；
或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体；以及BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种；以及药学上可接受的载体。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
本发明的又一方面涉及治疗癌症的方法，所述方法包括选择需要治疗癌症的个体，以及在有效治疗癌症的条件下向所述个体给药药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的式I、II、III或IV的化合物，以及BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种；以及药学上可接受的载体。在另一实施方案中，所述癌症是耐药性癌症。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是BRAF突变型黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是维罗非尼耐药性癌症。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
当给药本发明的化合物时，可将它们全身给药，或者作为另外的选择，可将它们直接给药至癌细胞或癌前细胞所存在的特定部位。因此，可以任何有效递送所述化合物或所述药物组合物至所述癌细胞或癌前细胞的方式来完成给药。示例性的给药方式包括但不限于通过口服给药、局部给药、经皮给药、肠胃外给药、皮下给药、静脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、鼻内滴注给药、腔内或膀胱内滴注给药、眼内给药、动脉内给药、病灶内给药或通过施用至粘膜(例如鼻部、喉部和支气管的粘膜)来给药所述化合物或组合物。
在一些实施方案中，在如本文中所述的任何形式或实施方案中，任何本发明的组合物包含式I-IV的化合物或微管蛋白抑制剂，以及BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种。在一些实施方案中，在如本文中所述的任何形式或实施方案中，任何本发明的组合物由式I-IV的化合物或微管蛋白抑制剂，以及BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种组成。在一些实施方案中，在如本文中所述的任何形式或实施方案中，任何本发明的组合物基本上由式I-IV的化合物或微管蛋白抑制剂，以及BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种组成。在一些实施方案中，术语“包含”是指包含所指示的活性剂，例如式I-IV的化合物或微管蛋白抑制剂，并且包含其它活性剂，以及制药工业中已知的药学上可接受的载体、赋形剂、软化剂、稳定剂等。在一些实施方案中，术语“基本上由...组成”是指组合物的仅有的活性成分是所指示的活性成分，然而，也可包含用于制剂的稳定、防腐等但不直接参与所指示活性成分的治疗效果的其它化合物。在一些实施方案中，术语“基本上由...组成”可以指促进活性成分的释放的组分。在一些实施方案中，术语“由...组成”是指包含活性成分以及药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。
在一个实施方案中，本发明提供组合制剂。在一个实施方案中，术语“组合制剂”特别定义为“药盒”，在这个意义上，可将如上文所定义的组合部分独立地或者通过使用具有不同量的组合部分的不同固定组合，即，同时、并行、分开或顺序地给药。在一些实施方案中，然后可将药盒的部分例如同时或按时间顺序交错地给药，即对于药盒的任何部分在不同时间点且以相等或不同的时间间隔给药。在一些实施方案中，组合部分的总量的比率可以在组合制剂中给药。在一个实施方案中，组合制剂可以变化，例如，以应对要治疗的患者亚群的需要或单个患者的需要(不同的需要可由于可由本领域技术人员容易地确定的特定疾病、疾病的严重性、年龄、性别或体重引起)。
应理解，本发明涉及如本领域技术人员所理解适当时用于任何疾病、病症或病况的如本文中所述的组合物和组合疗法。这样的组合物和组合疗法的某些应用已经在上文针对特定疾病、病症和病况进行了描述，其代表本发明的实施方案，并且通过给药如本文中所述的化合物(单独或作为组合疗法的一部分)或者使用本发明的组合物治疗个体的这样的疾病、病症和病况的方法代表本发明的另外的实施方案。
生物活性
在一个实施方案中，本发明提供用于本发明的任意方法中的化合物和组合物(包括本文所述的任何实施方案)。在一个实施方案中，如本领域技术人员所理解，本发明的化合物或包含其的组合物的用途具有在个体中抑制、遏制、增强或刺激所期望的反应的功用。在另一实施方案中，所述组合物还可包含另外的活性成分，其活性可用于要给药本发明的化合物的特定应用。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制癌症、降低其严重性、降低其发生风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有癌症的个体给药本发明的化合物。在另一实施方案中，将所述化合物与BRAF抑制剂组合给药。在另一实施方案中，将所述化合物与MEK抑制剂组合给药。在另一实施方案中，将所述化合物与BRAF抑制剂和MEK抑制剂组合给药。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌或卵巢癌。
在一个实施方案中，本发明提供：a)治疗、遏制耐药性肿瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；b)治疗、遏制转移癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；c)治疗、遏制耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；d)治疗、遏制黑色素瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；e)治疗、遏制耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，其中所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌；f)治疗、遏制转移性黑色素瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；g)治疗、遏制BRAF突变型癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；h)治疗、遏制BRAF抑制剂耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；i)治疗、遏制BRAF抑制剂耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险、抑制、消除、延迟或预防其的方法；j)治疗、遏制BRAF抑制剂耐药性黑色素瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；k)治疗、遏制个体的癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，其中所述个体之前用化学疗法、放射疗法或生物疗法治疗；l)克服个体对用BRAF抑制剂治疗的耐药性的方法；m)治疗、遏制甲状腺癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；n)治疗、遏制结直肠癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；o)治疗、遏制卵巢癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法；p)治疗、遏制、减轻、抑制、消除、延迟或预防患有癌症的个体的癌症转移的方法；或q)治疗、遏制、减轻、抑制、消除、延迟或预防患有癌症的之前用紫杉烷药物治疗的个体的对紫杉烷药物的继发性癌症耐药性的方法，所述方法包括向所述个体给药本发明的化合物和/或所述化合物的同分异构体、代谢产物、药学上可接受的盐、药物产品、互变异构体、水合物、N-氧化物、多晶型物或晶体或其任何组合，以及BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种；或包含其的组合物的步骤。在另一实施方案中，所述方法包括给药本发明的化合物和/或所述化合物的同分异构体、代谢产物、药学上可接受的盐、药物产品、互变异构体、水合物、N-氧化物、多晶型物或晶体或其任何组合，以及BRAF抑制剂；或包含其的组合物。在另一实施方案中，所述方法包括给药本发明的化合物和/或所述化合物的同分异构体、代谢产物、药学上可接受的盐、药物产品、互变异构体、水合物、N-氧化物、多晶型物或晶体或其任何组合，以及MEK抑制剂；或包含其的组合物。在另一实施方案中，所述方法包括给药本发明的化合物和/或所述化合物的同分异构体、代谢产物、药学上可接受的盐、药物产品、互变异构体、水合物、N-氧化物、多晶型物或晶体或其任何组合，以及BRAF抑制剂和MEK抑制剂；或包含其的组合物。在另一实施方案中，所述方法包括给药BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂；或包含其的组合物。在另一实施方案中，所述方法包括给药微管蛋白抑制剂以及BRAF抑制剂；或包含其的组合物。在另一实施方案中，所述方法包括给药微管蛋白抑制剂以及MEK抑制剂；或包含其的组合物。在另一实施方案中，所述方法包括给药微管蛋白抑制剂以及BRAF抑制剂和MEK抑制剂；或包含其的组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的BRAF突变型癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有BRAF突变型癌症的个体给药包含BRAF抑制剂、MEK抑制剂或其组合以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物以及BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，所述癌症是耐药性癌症。在另一实施方案中，所述癌症对BRAF抑制剂具有耐药性。在另一实施方案中，所述癌症对紫杉烷具有耐药性。在另一实施方案中，所述癌症对多西他赛具有耐药性。在另一实施方案中，本发明的化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的BRAF抑制剂耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗癌症的条件下向患有BRAF抑制剂耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种；以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由所述化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，本发明的化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的维罗非尼耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有维罗非尼耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种；以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症对紫杉烷具有继发性耐药性。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，所述化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的黑色素瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗黑色素瘤的条件下向患有黑色素瘤的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是耐药性的。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是转移性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的甲状腺癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗甲状腺癌的条件下向患有甲状腺癌的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，甲状腺癌是耐药性的。在另一实施方案中，甲状腺癌是转移癌。在另一实施方案中，本发明的化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的卵巢癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗卵巢癌的条件下向患有卵巢癌的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，卵巢癌是耐药性的。在另一实施方案中，卵巢癌是转移癌。在另一实施方案中，本发明的化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的结直肠癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗结直肠癌的条件下向患有结直肠癌的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，结直肠癌是耐药性的。在另一实施方案中，结直肠癌是转移癌。在另一实施方案中，本发明的化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的耐药性黑色素瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗黑色素瘤的条件下向患有耐药性黑色素瘤的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是转移性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及克服患有耐药性癌症的个体对用BRAF抑制剂治疗的耐药性的方法，所述方法包括向患有耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述化合物是式1-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及预防、消除、减轻或延迟患有癌症的个体对癌症治疗的耐药性的方法，所述方法包括向患有耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种，以及本发明的化合物或其药学上可接受的盐、N-氧化物、水合物、互变异构体或同分异构体的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由本发明的化合物、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是转移性的。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述化合物是式I-IV的化合物。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物17ya。在另一实施方案中，本发明的化合物是化合物12da。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的BRAF突变型癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有BRAF突变型癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是耐药性癌症。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，所述癌症对BRAF抑制剂具有耐药性。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的BRAF抑制剂耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有BRAF抑制剂耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的维罗非尼耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗癌症的条件下向患有维罗非尼耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的黑色素瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗黑色素瘤的条件下向患有黑色素瘤的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是耐药性的。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是转移性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的甲状腺癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗甲状腺癌的条件下向患有甲状腺癌的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述甲状腺癌是耐药性的。在另一实施方案中，所述甲状腺癌是转移性的。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的结直肠癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗结直肠癌的条件下向患有结直肠癌的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述结直肠癌是耐药性的。在另一实施方案中，所述结直肠癌是转移性的。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的卵巢癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗卵巢癌的条件下向患有卵巢癌的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述卵巢癌是耐药性的。在另一实施方案中，所述卵巢癌是转移癌。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的耐药性黑色素瘤、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗黑色素瘤的条件下向患有耐药性黑色素瘤的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。在另一实施方案中，所述黑色素瘤是转移性的。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的耐药性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的方法，所述方法包括在有效治疗所述癌症的条件下向患有耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是V600E阳性黑色素瘤。
在一个实施方案中，本发明涉及克服个体对用BRAF抑制剂治疗的耐药性的方法，所述方法包括向患有耐药性癌症的个体给药包含BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种以及微管蛋白抑制剂的组合物。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和BRAF抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，所述组合基本上由微管蛋白抑制剂、BRAF抑制剂和MEK抑制剂组成。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼、达拉非尼、GDC-0879、PLX-4720、甲苯磺酸索拉非尼、LGX818或其任何组合。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是维罗非尼。在另一实施方案中，BRAF抑制剂是达拉非尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼、司美替尼、RO5068760、MEK162、PD-325901、可美替尼、CI-1040或其任何组合。在另一实施方案中，MEK抑制剂是曲美替尼。在另一实施方案中，MEK抑制剂是RO5068760。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是紫杉醇、埃博霉素、多西他赛、海绵内酯、秋水仙碱、考布他汀、2-甲氧基***、甲氧基苯磺酰胺(E7010)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、长春氟宁、多拉司他汀、软海绵素、哈米特林、cryptophysin 52、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛、秋水仙碱、长春碱、泰素或其任何组合。在另一实施方案中，微管蛋白抑制剂是多西他赛。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠癌或卵巢癌。在另一实施方案中，所述癌症是转移癌。在另一实施方案中，所述癌症是黑色素瘤。在另一实施方案中，所述癌症是V600E阳性黑色素瘤。
本发明的化合物可用于治疗癌症、转移癌、耐药性肿瘤、耐药性癌症和多种形式的癌症、降低其严重性、降低其风险或对其进行抑制。在优选的实施方案中，所述癌症是皮肤癌(例如黑色素瘤)、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、***癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、白血病、淋巴瘤、头颈癌、胰腺癌、食管癌、肾癌或CNS癌(例如胶质瘤、胶质母细胞瘤)。本文的实施例为治疗这些不同的癌症提供了支持。此外，根据公认的它们作为微管蛋白抑制剂的作用模式，相信向患者给药本发明的化合物或组合物同样也能治疗或预防其它形式的癌症。本发明的优选化合物对癌细胞具有选择性的破坏性，这导致癌细胞消融，但优选不导致正常细胞消融。重要的是，对正常细胞的伤害被尽可能减小，因为癌细胞在很低浓度的本发明的化合物下易受破坏。
在一些实施方案中，本发明提供本文所述的化合物或其同分异构体、代谢产物、药学上可接受的盐、药物产品、互变异构体、多晶型物、晶体、N-氧化物、水合物或其任何组合与BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种组合用于治疗、遏制个体的癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的用途。在另一实施方案中，所述癌症是皮肤癌(例如黑色素瘤)、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肾上腺皮质癌、***癌、膀胱癌、脑肿瘤、脑干肿瘤、乳腺癌、胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、松果体瘤、下丘脑胶质瘤、类癌瘤、癌、子***、结肠癌、中枢神经***(CNS)癌、子宫内膜癌、食管癌、肝外胆管癌、尤因氏家族肿瘤(Pnet)、颅外胚细胞瘤、眼癌、眼内黑色素瘤、胆囊癌、胃癌、胚细胞瘤、性腺外肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、喉癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、口腔癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、中枢神经***(原发性)淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、恶性间皮细胞瘤、Merkel细胞癌、转移性鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、外分泌胰腺癌、胰岛细胞癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、垂体癌、浆细胞肿瘤、***癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、涎腺癌、塞扎里综合征、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤癌、卡波西肉瘤、皮肤癌、黑色素瘤、小肠癌、软组织肉瘤、软组织肉瘤、睾丸癌、胸腺瘤、恶性肿瘤、尿道癌、子宫癌、肉瘤、儿童不寻常癌、***癌、外阴癌、肾母细胞瘤或其任何组合。在另一实施方案中，所述个体之前用化学疗法、放射疗法或生物疗法治疗过。
在一些实施方案中，本发明提供本文所述的化合物或其同分异构体、代谢产物、药学上可接受的盐、药物产品、互变异构体、多晶型物、晶体、N-氧化物、水合物或其任何组合与BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种组合用于治疗、遏制个体的转移癌、降低其严重性、降低其风险或抑制其的用途。在另一实施方案中，所述癌症是皮肤癌(例如黑色素瘤)、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肾上腺皮质癌、***癌、膀胱癌、脑肿瘤、脑干肿瘤、乳腺癌、胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、松果体瘤、下丘脑胶质瘤、类癌瘤、癌、子***、结肠癌、中枢神经***(CNS)癌、子宫内膜癌、食管癌、肝外胆管癌、尤因氏家族肿瘤(Pnet)、颅外胚细胞瘤、眼癌、眼内黑色素瘤、胆囊癌、胃癌、胚细胞瘤、性腺外肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、喉癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、口腔癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、中枢神经***(原发性)淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、恶性间皮细胞瘤、Merkel细胞癌、转移性鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、外分泌胰腺癌、胰岛细胞癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、垂体癌、浆细胞肿瘤、***癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、涎腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、皮肤T细胞淋巴瘤、皮肤癌、卡波西肉瘤、黑色素瘤、小肠癌、软组织肉瘤、软组织肉瘤、睾丸癌、胸腺瘤、恶性肿瘤、尿道癌、子宫癌、肉瘤、儿童不寻常癌、***癌、外阴癌、肾母细胞瘤或其任何组合。
在一些实施方案中，本发明提供本文所述的化合物或其同分异构体、代谢产物、药学上可接受的盐、药物产品、互变异构体、多晶型物、晶体、N-氧化物、水合物或其任何组合与BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种组合用于治疗、遏制个体的耐药性癌症或抵抗性癌症、降低其严重性、降低其风险或抑制其的用途。在另一实施方案中，所述癌症是皮肤癌(例如黑色素瘤)、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、肾上腺皮质癌、***癌、膀胱癌、脑肿瘤、脑干肿瘤、乳腺癌、胶质瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、松果体瘤、下丘脑胶质瘤、类癌瘤、癌、子***、结肠癌、中枢神经***(CNS)癌、子宫内膜癌、食管癌、肝外胆管癌、尤因氏家族肿瘤(Pnet)、颅外胚细胞瘤、眼癌、眼内黑色素瘤、胆囊癌、胃癌、胚细胞瘤、性腺外肿瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、头颈癌、下咽癌、胰岛细胞癌、喉癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、口腔癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、中枢神经***(原发性)淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金病、恶性间皮细胞瘤、黑色素瘤、Merkel细胞癌、转移性鳞状细胞癌、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性疾病、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口咽癌、骨肉瘤、卵巢上皮癌、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度潜在恶性肿瘤、胰腺癌、外分泌胰腺癌、胰岛细胞癌、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、***癌、嗜铬细胞瘤、垂体癌、浆细胞肿瘤、***癌、横纹肌肉瘤、直肠癌、肾癌、肾细胞癌、涎腺癌、塞扎里综合征、皮肤癌、皮肤T细胞淋巴瘤、卡波西肉瘤、皮肤癌、黑色素瘤、小肠癌、软组织肉瘤、软组织肉瘤、睾丸癌、胸腺瘤、恶性肿瘤、尿道癌、子宫癌、肉瘤、儿童不寻常癌、***癌、外阴癌、肾母细胞瘤或其任何组合。
在一个实施方案中，“转移癌”是指从其初始部位扩散(转移)到身体另一区域的癌症。几乎所有的癌症都具有扩散的潜能。是否会发生转移取决于多个肿瘤细胞因素(包括癌症的类型、肿瘤细胞的成熟(分化)程度、所在位置和癌症已存在多长时间，以及其它未完全了解的因素)之间复杂的相互作用。转移扩散有三种方式-从肿瘤到周围组织的局部扩展、通过血流到达远处的部位或通过淋巴***到达邻近或远处的***。每种癌症都可具有代表性的扩散途径。肿瘤是根据原发部位命名的(例如，已扩散到脑的乳腺癌被称为转移至脑的转移性乳腺癌)。
在一个实施方案中，“耐药性癌症”是指获得对化学疗法获得耐药性的癌细胞。癌细胞可通过一系列机制获得对化学疗法的耐药性，包括药物靶点的突变或过表达、药物的失活或药物从细胞消除。对化学疗法产生初始反应后复发的肿瘤可能对多种药物产生耐药性(它们是多药耐药的)。对耐药性的常规观点认为，肿瘤群体中的一个或数个细胞获得了赋予耐药性的遗传变化。因此，耐药性产生的原因尤其是：a)一些未被化学疗法杀死的细胞发生突变(改变)并且变得对药物耐药。一旦它们增殖，可能有比对化学疗法敏感的细胞更多的耐药性细胞；b)基因扩增。癌细胞可产生数百个拷贝的特定基因。该基因引发使抗癌药物无效的蛋白质过度产生；c)癌细胞可使用被称为p-糖蛋白的分子，以与药物进入一样快的速率将药物泵出细胞；d)由于转运药物穿过细胞壁的蛋白质停止工作，癌细胞可能停止吸收药物；e)癌细胞可能学会如何修复由一些抗癌药物导致的DNA断裂；f)癌细胞可能会进展出使药物失活的机制。多药耐药的一个主要原因是P-糖蛋白(P-gp)或其它药物流出泵(OAT、OCT、BCRP等)的过表达。该蛋白是临床上重要的转运蛋白，其属于细胞膜转运ATP结合盒家族。它可以通过ATP依赖性机制将包括抗癌药物在内的底物泵出肿瘤细胞。因此，对化学疗法中所使用的抗癌剂的耐药性是恶性病症治疗失败的主要原因，从而导致肿瘤变得耐药。耐药性是癌症化学疗法失败的主要原因。
在一个实施方案中，“耐药性癌症”是指如上文所述的耐药性癌症。在另一实施方案中，“耐药性癌症”是指获得了对任何治疗(例如化学疗法、放射疗法或生物疗法)的抵抗性的癌细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗、遏制个体的癌症、降低其严重性、降低其风险或对其进行抑制，其中所述个体之前用化学疗法、放射疗法或生物疗法治疗过。
在一个实施方案中，“化学疗法”是指用例如直接杀死癌细胞的药物进行的癌症的化学治疗。这样的药物被称为“抗癌”药物或“抗肿瘤药物”。现在的疗法使用超过100种药物来治疗癌症。用于治愈特定的癌症。化学疗法被用于当肿瘤不可能被治愈时控制其生长；在手术或放射疗法前缩小肿瘤；缓解症状(例如疼痛)；以及破坏在通过手术移除已知肿瘤后可能存在的微小癌细胞(称为辅助疗法)。给予辅助疗法是为了防止可能的癌症复发。
在一个实施方案中，“放射疗法”是指治疗疾病的高能量的X射线和类似射线(例如电子)。许多癌症病人会进行放射疗法作为他们的治疗的一部分。这可以使用X射线在体外进行的体外放射疗法或者在体内进行的体内放射疗法的形式给予。放射疗法通过破坏治疗部位中的癌细胞其作用。尽管正常细胞也可能由于放射疗法受到损害，但它们通常可以自我修复。放射疗法治疗可治愈一些癌症，也可降低手术后癌症复发的几率。其可用于减轻癌症的症状。
在一个实施方案中，“生物疗法”是指体内自然产生的破坏癌细胞的物质。有数种类型的治疗，包括：单克隆抗体、癌生长抑制剂、疫苗和基因疗法。生物疗法也被称为免疫疗法。
本发明的又一方面涉及治疗或预防癌性病况的方法，所述方法包括：提供包含本发明的化合物，例如式I、II、III或IV的化合物或者17ya或12da，以及BRAF抑制剂或MEK抑制剂中的至少一种的组合物，然后以有效治疗或预防所述癌性病况的方式向患者给药有效量的所述组合物。
根据一个实施方案，要治疗的患者的特征在于存在癌前病况，并且所述组合物的给药有效预防所述癌前病况进展为癌性病况。这可通过在癌前细胞进一步进展到癌性状态之前或同时破坏所述癌前细胞来进行。
根据另一实施方案，要治疗的患者的特征在于存在癌性病况，并且所述组合物的给药有效引起所述癌性病况的消退或抑制所述癌性病况的生长，即，使其生长全部停止或降低其生长速率。这优选通过破坏癌细胞来进行，而与它们在患者体内的位置无关。即不管所述癌细胞是位于原发肿瘤部位还是所述癌细胞已经转移并在患者体内产生了继发性肿瘤。
本文中所用的个体或患者是指任何哺乳动物患者，包括但不限于人和其它灵长类动物、狗、猫、马、牛、羊、猪、大鼠、小鼠和其它啮齿类动物。在一个实施方案中，所述个体为雄性。在另一实施方案中，所述个体为雌性。在一些实施方案中，本文中所述的方法可用于治疗雄性和雌性二者。
当给药本发明的化合物时，可将它们全身给药，或者作为另外的选择，可将它们直接给药至癌细胞或癌前细胞所存在的特定部位。因此，可以任何有效递送所述化合物或所述药物组合物至所述癌细胞或癌前细胞的方式来完成给药。示例性的给药方式包括但不限于通过口服给药、局部给药、经皮给药、肠胃外给药、皮下给药、静脉内给药、肌内给药、腹膜内给药、鼻内滴注给药、腔内或膀胱内滴注给药、眼内给药、动脉内给药、病灶内给药或通过施用至粘膜(例如鼻部、喉部和支气管的粘膜)来给药所述化合物或组合物。
当给药本发明的化合物或药物组合物来治疗、遏制癌性病况、降低其严重性、降低其风险或对其进行抑制时，所述药物组合物还可含有目前已知或今后研发用于治疗各类癌症的其它治疗剂或治疗方案，或者可与目前已知或今后研发用于治疗各类癌症的其它治疗剂或治疗方案联合给药。其它治疗剂或治疗方案的实例包括但不限于放射疗法、免疫疗法、化学疗法、手术干预和其组合。
给出以下实施例以便更充分地说明本发明的优选实施方案。然而，绝不应将它们理解为限制本发明的宽范围。
实施例
下面列出的实施例仅用于说明目的，而不是意图以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
用于治疗BRAF突变型黑色素瘤和维罗非尼耐药性癌症的化合物12da或17ya与维 罗非尼的组合
维罗非尼是被批准用于V600E突变体的新型抗黑色素瘤药物，但超过约9个月会进展出耐药性。对包括化合物12da和17ya在内的数种微管蛋白抑制剂进行筛选，以评估其与维罗非尼对亲代A375和MDA-MB-435细胞的抗增殖组合效果，所述A375和MDA-MB-435细胞两者均为BRAF V600E突变细胞系。这些组合可有助于克服耐药性。
在一组BRAFV600E突变亲代黑色素瘤细胞系和长期选择的维罗非尼耐药性A375RF21亚系中测试维罗非尼与12da或多西他赛的组合的协同细胞周期停滞的假设(Su F，BradleyWD，Wang Q等人.“Resistance to selective BRAF inhibition can be mediated bymodest upstream pathway activation.”Cancer Res.(2012)72：969-978)。所建立的维罗非尼耐药性A375RF21细胞在体外和体内用作疾病复发模型，以测试所提议的协同药物组合是否在相关的临床维罗非尼耐药性方面具有潜在治疗益处。
材料和方法
试剂和细胞系
维罗非尼(也称为PLX4032、RG7204或RO5185426)、曲美替尼、舒尼替尼(苹果酸盐)和多西他赛从LC Laboratories(Woburn，MA)购买。化合物12da如下文所述内部合成。将化合物在二甲基亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中溶解，以制备10mM的储备溶液。人黑色素瘤A375细胞系从ATCC(Manassas，VA)获得。WM164和MDA-MB-435细胞分别从Dr.Meenhard Herlyn(Wistar Institute，Philadelphia，PA)和Dr.Robert Clarke(Georgetown University，Washington，DC)获得。所有细胞系在用于该研究之前均经过验证。将细胞在补充有10％胎牛血清(FBS，Atlanta Biologicals，Lawrenceville，GA)、1％抗生素/抗霉菌混合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)和5μg/mL牛胰岛素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的DMEM培养基(Mediatech公司，Manassas，VA)中进行培养。
体外获得性维罗非尼耐药性
具有获得性维罗非尼耐药性的黑色素瘤细胞系通过按照报道的方法(Su F，Bradley WD，Wang Q等人.“Resistance to selective BRAF inhibition can bemediated by modest upstream pathway activation.”Cancer Res.(2012)72：969-978)将亲代A375细胞在增加浓度的维罗非尼中培养至少三个月长期选择。所分离的耐药性A375RF21细胞系对维罗非尼的IC50稳定地增加超过50倍(通过MTS测定法测定，与对于亲代A375细胞系的0.57±0.03μM相比，对于A375RF21细胞为28.9±0.6μM，图1)。将耐药性A375RF21细胞系在含有2.5μM维罗非尼的完全生长培养基中保持。
细胞增殖和体外组合测定法
细胞增殖生存力使用如之前所记载的MTS或SRB测定法进行研究。设计维罗非尼和微管蛋白抑制剂的组合的体外研究，并使用CalcuSyn软件(Biosoft，Ferguson，MO)以每组处理平行重复五次进行。基于来自先导研究的各测试药物的IC50值来选择药物浓度。协同作用、加性作用或拮抗作用通过Chou-Talalay方法(Chou TC.“Drug combination studiesand their synergy quantification using the Chou-Talalay method.”Cancer Res.(2010)70：440-446)测定，所述方法显示如软件输出中所计算的组合指数(CI)。
细胞周期分析
流式细胞术分析如之前记载(Wang Z，Chen J，Wang J等人.“Novel tubulinpolymerization inhibitors overcome multidrug resistance and reduce melanomalung metastasis.”Pharm.Res.(2012)29：3040-3052)进行。为测定G2和M期中的细胞周期分布(图23)，用胰蛋白酶收获细胞，使用抗磷酸化组蛋白488抗体在冰上于黑暗中染色1小时，然后按照制造商的说明书(#FCCH025103，EMD Millipore公司，Ballerica，MA)使用PI/RNA酶溶液在室温下于黑暗中染色30分钟。对数据进行进一步处理，并使用Modfit 2.0程序(Verity Software House，Topsham，ME)制图。
微管蛋白聚合测定法
HTS-微管蛋白聚合测定法如之前记载按照制造商的说明书(#BK004P，Cytoskeleton公司，Denver，CO)使用市售试剂盒进行。将牛脑微管蛋白(0.4mg)与5μM12da、20μM维罗非尼或两种药剂的组合混合，并在110μL通用微管蛋白缓冲液(80mM PIPES，2.0mM MgCl2，0.5mM EDTA和1mM GTP)中于pH 6.9下孵育。通过SYNERGYHT酶标仪(Bio-TekInstruments，Winooski，VT)在37℃下每1min动态记录340nm下的吸光度，持续45min。将来自单一或组合治疗的数据与10μM秋水仙碱的阳性对照组进行比较。
蛋白质印迹法分析
在所指示的处理时间，收集人黑色素瘤A375RF21、MDA-MB-435或WM164细胞，以通过蛋白质印迹法研究相关级联蛋白或细胞凋亡标记。将总蛋白质通过用含有磷酸酶-蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的RIPA缓冲液(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)裂解细胞来提取。然后，通过BCA方法使用试剂盒(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)来测定一般蛋白质浓度。将细胞裂解产物使用Laemmli上样缓冲液(Bio-Rad，Hercules，CA)稀释到相等的一般蛋白质浓度，并煮沸5分钟以使蛋白质变性。然后，将含有10μg一般蛋白质的组样品负载到4-15％Tris-HCl预制聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad，Hercules，CA)的各孔中以进行电泳，随后转移到0.2μm硝酸纤维素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)。在用5％牛血清白蛋白在1×TBST中在室温下阻断1小时后，将膜单独用以下初级兔抗体(Cell SignalingTechnology公司，Danvers，MA)在4℃下进一步孵育过夜：抗磷酸-ERK1/2(Thr202/Tyr204；#9101)、抗p44/42MAPK(ERK1/2；#9102)、抗磷酸-AKT(Ser473；#9271)、抗AKT(#9272)、抗细胞周期蛋白D1(92G2；#2978)；抗裂解PARP(Asp214；#9185)、抗裂解半胱天冬酶-3(Asp 175；#9664)、抗RAS(#3339)、抗ARAF(#4432)、抗BRAF(#9433)、抗CRAF(#9422)、磷酸-PI3激酶p85(Tyr458)/p55(Tyr199)(#4228)、抗PTEN(#9188)、抗PDGF受体β(#3169)或抗GAPDH(#3683)。然后，将膜用抗兔IgG HRP缀合二级抗体(Cell Signaling，#7071)在室温下孵育1小时。靶蛋白通过用1×试剂(Cell Signaling，#7003)孵育1分钟进行检测，并将其暴露于X射线胶片。将胶片灰度扫描，并用ImageJ软件(NIH，Bethesda，MD，USA)定量泳道强度。
细胞凋亡检测
将A375RF21细胞接种在6孔板(每孔1×106个)中，并用含有5‰DMSO、维罗非尼、12da、多西他赛或所指示组合的生长培养基处理。孵育48小时后，使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Abcam，Cambridge，MA)按照制造商的说明书进行细胞凋亡分析，并通过BDLSR-II流式细胞仪(BD Biosciences，San Jose，CA)进行分析。
肿瘤异种移植物和治疗
7-8周龄的雄性裸鼠从Charles River Laboratories International公司(Wilmington，MA)购买。将A375RF21细胞悬浮在冰冷的无酚红且无FBS的DMEM培养基中，并在使用之前以1∶1的比率与高浓度的Matrigel(BD Biosciences，San Joes，CA)混合。将100μL含有3×106个细胞的该混合物皮下(s.c.)注射到各小鼠的左侧背侧胁腹。在接种后一周，将小鼠随机分成4组(对于初始低剂量n＝7，并且对于后续的高剂量药物组合n＝5)，并开始治疗。将化合物12da或维罗非尼在PEG300(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)中稀释，并通过腹膜内(i.p.)注射每周五天每天一次给药，持续连续三周。媒介物对照组以相同给药频率i.p.注射相同体积(100μL)的PEG300。在实验结束时，将小鼠安乐死，并分离肿瘤组织，称重，然后固定在10％缓冲***磷酸盐溶液中。
各小鼠的肿瘤体积和体重每周评估三次。使用式a×b2×0.5计算肿瘤体积，其中a和b表示较大和较小的肿瘤直径。对于各组，数据显示为平均值±SD，并绘制为时间的函数。肿瘤生长抑制(TGI)计算为100-100×[(T-T0)/(C-C0)]，并且肿瘤消退计算为(T-T0)/T0×100，其中T、T0、C和C0分别为在治疗最后一天特定组的平均肿瘤体积、在治疗第一天同一组的平均肿瘤体积、在治疗最后一天媒介物对照组的平均肿瘤体积和在治疗第一天媒介物对照组的平均肿瘤体积。
病理学和免疫组织化学分析
将在***缓冲液中固定超过一周的肿瘤组织用苏木精和曙红染色。对于免疫组织化学(IHC)分析，使用以下初级抗体：兔抗Ki67、抗磷酸-AKT(Ser473)和抗磷酸-ERK1/2(Thr202/Tyr204)(#9027；#4060；#4376；Cell Signaling Technology公司，Danvers，MA)。抗S100初级抗体从Abcam(#ab868，Abcam公司，Cambridge，MA)购买。分析按照制造商的方案进行。
统计分析
使用Prism软件5.0(GraphPad Software公司，San Diego，CA)对数据进行分析。对于体外细胞凋亡检测和异种移植物研究，统计显著性(P＜0.05)通过Mann-Whitney秩检验、非参数t-检验和单向ANOVA进行评估。相应地，将治疗组与媒介物组进行比较，并将组合治疗组与接受单一药剂治疗的组进行比较。
结果
维罗非尼与微管蛋白抑制剂17ya和12da的组合在亲代和维罗非尼耐药性黑色素 瘤细胞系二者中表现出强大的协同作用。
对包括化合物12da和17ya在内的数种微管蛋白抑制剂进行筛选，以评估其与维罗非尼对亲代A375和MDA-MB-435细胞的抗增殖组合效果，所述A375和MDA-MB-435细胞两者均为BRAFV600E突变细胞系。包括两种熟知的微管蛋白抑制剂多西他赛和秋水仙碱以进行比较(表1和图24)。发现对于12da和维罗非尼的组合，在其ED50下，计算的CI值低至0.32(在A375细胞系中)和0.10(在MDA-MB-435细胞系中)。此外表明，MEKi(曲美替尼)和一般的受体酪氨酸激酶抑制剂(RTKi；舒尼替尼)仅表现出加性CI值(表1)。
基于下面的结果，这些组合可帮助克服在用维罗非尼治疗的患者中所见的耐药性。
17ya和12da两者当与维罗非尼或多西他赛组合时均表现出协同作用。这项工作以17ya开始，但对于体内研究，转移至12da。引入组合指数(CI)的概念。本质上，CI值＜1.0表示协同作用，1.0的值表示加性作用，并且值＞1.0表示低于加性作用或拮抗作用。
表1.维罗非尼与微管蛋白抑制剂的组合在亲代和维罗非尼耐药性黑色素瘤细胞系中表现出协同效果。维罗非尼与微管蛋白抑制剂的组合在该耐药性细胞系中保持强大的协同作用(CI＜0.9)，但Vem+MEKi或Vem+RTKi仅为加性作用。组合指数(CI)值基于细胞生存力MTS测定法(n＝5)的结果计算。CI＜0.9表示协同作用；0.9≤CI≤1.1表示加性效果；CI＞1.1表示在两种测试药物之间存在拮抗作用。从亲代A375细胞(IC50＝0.57μM)建立稳定的高度维罗非尼耐药性A375RF21亚系(IC50＝28.9μM)。
ND-未测定
在临床上，黑色素瘤肿瘤在接受维罗非尼化学疗法后仅3-6个月就不可避免地复发，因此，期望确定所观察到的协同作用在维罗非尼耐药性细胞中是否仍然有效。为实现该目标，由亲代A375人黑色素瘤细胞通过按照文献报道的方法(Su F，Bradley WD，Wang Q等人.“Resistance to selective BRAF inhibition can be mediated by modestupstream pathway activation.”Cancer Res.(2012)72：969-978)长期选择建立维罗非尼耐药性A375RF21亚系。使用A375和A375RF21细胞进行蛋白质印迹法分析，以确定已知导致维罗非尼耐药性的差异蛋白质活化。如图25A中所示，在2.5μM维罗非尼(其培养基的保持浓度)存在下A375RF21中的pERK水平没有改变，从而证实产生获得性维罗非尼耐药性。所述pMEK表达在A375RF21细胞中也保持活跃，表明其对MEK1/2抑制剂的潜在交叉耐药性。这种交叉耐药性通过用两种已知MEK抑制剂(曲美替尼和司美替尼，图25B和25C)孵育细胞证实。PI3K/AKT途径在A375RF21细胞中过度活化，但未观察到RAS、BRAF、ARAF、CRAF水平的显著变化。这些结果与Fei Su等人的报道一致。有趣的是，发现在A375RF21细胞中，在存在或不存在2.5μM维罗非尼维持培养基下，PDGF受体β的水平也显著增加。已知在A375RF21细胞中赋予耐药性的两种耐药性机制(pAKT和PDGFβ)在维罗非尼耐药性患者肿瘤中存在。
如表1中所示，使用A375RF21细胞重复的药物组合研究对于与维罗非尼组合的化合物12da所产生的计算CI值全部小于0.9(范围：0.53-0.70)，表明在所有测试浓度下都具有强烈的协同作用。在ED50下，所有三种微管蛋白抑制剂均与维罗非尼以协同方式起作用。随着药物浓度的增加，多西他赛或秋水仙碱组的CI值增加得相对较快。在ED90的剂量下，多西他赛与维罗非尼的组合几乎为加性作用(CI值为0.90)，而秋水仙碱与维罗非尼的组合效果已逆转为拮抗作用(CI值为1.36)。与其它两种微管蛋白抑制剂相比，化合物12da当与维罗非尼组合时在耐药性A375RF21细胞中表现出更强的协同作用。
令人惊讶地发现，在EC50下，12da与维罗非尼的组合的计算CI值低至0.1和0.3。由于临床肿瘤消退在接受维罗非尼化学疗法后仅3-6个月广泛地进展，因此，继续关于对于组合治疗主要观察到的协同效果对于维罗非尼耐药性A375RF21细胞系是否能够始终如一的研究。
在整个测试的化学治疗组内，B-RAF突变抑制剂维罗非尼在MDA-MB-435细胞中表现出特别协同的细胞毒性，MDA-MB-435细胞最初被认为是乳腺癌细胞，但目前已知为黑色素瘤细胞(表2)，对于维罗非尼+17ya，表现出0.10的CI值，并且在EC75和EC90下还表现出强烈但较低的协同作用(表5)。这种活性可合理化为B-RAF抑制剂和抗微管蛋白剂(17ya)分别使细胞停滞在细胞周期的不同部分，G1和G2/M(如本文中所讨论)。因此，有丝***的双重靶向应更完全地使有丝***细胞走向细胞死亡。协同CI结果也示于表3中，其中A375黑色素瘤细胞不仅用于17ya，还用于例如秋水仙碱、长春碱和泰素的其它抗微管蛋白剂。与AKT抑制剂观察到有限的协同作用，并且与MEK抑制剂未观察到协同作用(表4)。
表2.在EC50下，17ya与多种药物的组合的CI值。
CI：组合指数
加性效果：CI＝1 协同作用：CI＜1 拮抗作用：CI＞1
表3.对于A375细胞系的CI值。
表4.对于A375细胞系的CI值。
GSK1120212：MEK抑制剂，在IC50下，维罗非尼与GSK2126458(PI3K抑制剂)的CI值为0.45±0.13。
MK2206：AKT抑制剂，在EC90下，维罗非尼与PLX4032的CI值为0.384。
表5.对于MDA-MB-435细胞系的CI值。
12da和维罗非尼的组合在A375RF21细胞中产生协同细胞周期停滞(表1)
作为结合到秋水仙碱位点的微管蛋白抑制剂，化合物12da有效地以剂量依赖性方式将亲代A375细胞系阻滞在G2/M期。为确定化合物12da与维罗非尼的组合是否使维罗非尼耐药性细胞停滞在不同的复制期，在A375RF21细胞中进行细胞周期分析。在暴露于指定浓度的化合物溶液24小时后，图2B中的数据清楚地表明协同细胞周期停滞。对于DMSO对照，50％的A375RF21细胞分布在G0/G1期，并且处于S或G2/M期的细胞的百分比相应地为12％或32％。对于20nM浓度的化合物12da单一处理组，分布在G2/M期的细胞的百分比累积高达70％。使用维罗非尼作为单一药剂在耐药性A375RF21细胞系中产生类似的G0/G1细胞周期停滞，维罗非尼的浓度必须增加到30μM或更高，相比之下，在亲代A375细胞中浓度小于1μM。如预期，维罗非尼和化合物12da的组合强烈地使A375RF21细胞停滞在G0/G1期(48％)和G2/M期(43％)。另外，所述组合治疗产生更多细胞碎片，这表明癌细胞凋亡的增加。用维罗非尼和多西他赛的组合进行处理产生类似的协同效果。
组合治疗在维罗非尼耐药性细胞中诱导显著增加的凋亡细胞死亡
为更清楚地理解组合治疗的可能的细胞凋亡诱导效果，使用膜联蛋白V和碘化丙啶共染色流式细胞术来区分A375RF21中的活细胞和凋亡细胞。正如预期的那样，单一药剂处理在测试浓度下对于诱导细胞凋亡仅产生中等效果；相比之下，组合处理组显著增强细胞凋亡(图3A)。如图3B中所示(图3B将分布在Q1(早期凋亡)、Q2(凋亡)和Q4(死细胞)中的细胞的百分比总和进行量化)，化合物12da和维罗非尼的组合导致50±7.6％的计数细胞凋亡或死亡，这比两个单一药剂处理组的凋亡百分比(对于化合物12da，11.8±3.0％，并且对于维罗非尼，11.9±3.5％)的简单加和高得多。在含有多西他赛的组合处理组中也观察到类似的协同细胞凋亡诱导效果(对于多西他赛组，6.4±3.0％，对于组合，38.1±2.6％)。
组合通过下调pAKT或总AKT和激活细胞凋亡级联来缓和获得性维罗非尼耐药性。
已经确定，化合物12da靶向微管蛋白聚合(Chen J，Li CM，Wang J等人.“Synthesis and antiproliferative activity of novel 2-aryl-4-benzoyl-imidazolederivatives targeting tubulin polymerization.”Bioorg.Med.Chem.(2011)19：4782-4795；Chen J，Wang Z，Li CM等人.“Discovery of novel 2-aryl-4-benzoyl-imidazolestargeting the colchicines binding site in tubulin as potential anticanceragents.”J.Med.Chem.(2010)53：7414-7427)，并且维罗非尼靶向BRAFV600E。作为了解导致这种强的协同组合的负责分子机制的第一种方法，研究所述协同作用是否通过化合物12da或维罗非尼的直接靶点的增强来介导。如图4中所示，即使在20μM的高浓度下，维罗非尼本身对微管蛋白聚合也没有任何效果。将维罗非尼加入化合物12da中，与单一药剂化合物12da相比，对微管蛋白聚合的抑制最多略有增加。组合治疗对微管蛋白聚合的抑制仅由化合物12da达成，这表明协同组合并不是通过化合物12da的直接靶点抑制的增强介导。接着，使用蛋白质印迹法测定所述组合对pERK(维罗非尼抑制BRAFV600E的标志)是否具有任何效果。图5A表明，化合物12da或组合治疗在与A375RF21耐药性细胞一起孵育48小时后对pERK或总ERK水平没有明显效果。用另一种微管蛋白抑制剂多西他赛代替化合物12da产生类似结果(图5A)。因此，所述协同组合不可能通过BRAFV600E的抑制的增强实现。
组合通过下调pAKT或总AKT和激活细胞凋亡级联来缓和获得性维罗非尼耐药性。
最近，Fei Su等人报道，与在其亲代维罗非尼敏感性细胞中相比，pAKT水平在A375维罗非尼耐药性克隆中有所增加(Su F，Bradley WD，Wang Q等人.“Resistance toselective BRAF inhibition can be mediated by modest upstream pathwayactivation.”Cancer Res.(2012)72：969-978)。由于A375RF21细胞也具有强的pAKT活化(图25A)，因此推测组合治疗可能通过下调维罗非尼耐药性A375RF21细胞中的AKT途径的活性来产生其强的协同作用。如图5A中所示，在孵育48小时后，pAKT和总AKT(tAKT)在单一药剂化合物12da或其组合治疗组中均大大降低，这表明协同抗增殖可能通过同时靶向ERK和AKT磷酸化来介导。多西他赛也减少pAKT和tAKT的表达，并且在其与维罗非尼的组合治疗中具有类似效果。例如，除tAKT水平的明显降低以外，化合物12da和维罗非尼的组合也将pAKT水平降低到相对于tAKT的61％(从泳道密度的量化相对倍数计算：0.08/0.13×100％)，而单一药剂治疗仅将pAKT水平分别降低到相对于对应的tAKT水平的77％(12da，0.6/0.77×10％)和70％(维罗非尼，0.34/0.48×100％)。化合物12da的强剂量依赖性pAKT/tAKT抑制效果在其它两种BRAFV600E突变细胞系WM164和MDA-MB-435中进一步得到证实(图5B)。在维罗非尼耐药性细胞中(图5A)，维罗非尼和组合治疗组中的降低的细胞周期蛋白D1水平表明G0/G1细胞周期进展受到抑制。细胞凋亡标记(裂解PARP和裂解半胱天冬酶-3)被微管蛋白抑制剂高度诱导，而维罗非尼使其表达略有增加。该结果与凋亡检测实验中的观察一致。
维罗非尼和化合物12da的组合在体内以协同方式遏制维罗非尼耐药性肿瘤生长
为评估在体外针对A375RF21细胞观察到的强烈协同作用是否可转移到体内的维罗非尼耐药性肿瘤中，将对肿瘤生长的组合功效的效果与单一药剂治疗的效果进行比较。之前已经确定，化合物12da在25mg/kg的剂量下有效地遏制体内亲代A375黑色素瘤肿瘤生长(Wang Z，Chen J，Wang J等人.“Novel tubulin polymerization inhibitors overcomemultidrug resistance and reduce melanoma lung metastasis”.Pharm.Res.29(11)：3040-3052)。先导研究表明，维罗非尼耐药性A375RF21细胞在没有药物处理下与其亲代A375细胞具有类似的生长动力学(图26)。为避免由于其与维罗非尼组合而引起的任何潜在的不期望的毒性，将化合物12da的剂量降低到10mg/kg。
表6.在耐药性A375RF21异种移植物模型(n＝7)中维罗非尼和化合物12da的体内组合的肿瘤生长抑制(TGI)和肿瘤重量比较。与两个单一药剂治疗组的TGI的简单加和相比，10mg/kg的化合物12da和20mg/kg的维罗非尼的组合达到更高的抗肿瘤活性(TGI)(*P＜0.05)。所述协同肿瘤抑制在未进一步治疗下在另外一周后仍持续(*P＜0.05)。
如图6和表6中所示，在该维罗非尼耐药性肿瘤模型中，维罗非尼(20mg/kg)单一疗法仅实现极低(22.65％)的TGI，并且单独化合物12da(10mg/kg)达成稍好的38.12％的TGI；相反，其组合治疗在治疗3周后将肿瘤抑制显著增强到88.56％(图6A、6B和6D，表6)。接受组合疗法的七只小鼠中的三只小鼠维持另外7天不进行进一步治疗，未表现出显著的(P＝0.2857)肿瘤复发并维持81.27％的肿瘤遏制。在整个实验过程中，四组中没有小鼠体重减轻超过10％(图6C)，这表明这些治疗不具有严重毒性。当将小鼠安乐死时，将包括脑、心脏、肾、肝、脾和肺在内的主要器官分离，并分别进行病理分析。未观察到这些器官的异常。总之，这些结果强烈地表明，这种组合治疗在A375RF21黑色素瘤模型中有效帮助克服对维罗非尼的获得性耐药性，并且进一步证实在体外观察到的协同抗增殖效果。
为测定在体外观察到的由组合治疗引起的AKT信号转导下调在体内是否也起作用，对来自所有实验组的肿瘤切片进行免疫组织化学分析。也测定ERK途径的活性，并对肿瘤切片中由细胞标记Ki-67指示的增殖水平进行评估。如图6D中所证实，组合治疗组中的改善的途径和增殖抑制与总体肿瘤反应TGI结果很好地对应。在组合治疗组中，细胞核或细胞质中的ERK和AKT磷酸化以及Ki67表达水平大大降低。此外，组合治疗组中的肿瘤切片的H&E染色中由Matrigel染色的背景粉的广泛区域表明在组合治疗后，剩余很少肿瘤细胞(如果有的话)。组合治疗组中黑色素瘤细胞的显著减少由S100免疫染色中密度的降低进一步证实(图6D)。
维罗非尼与化合物12da的较高剂量组合导致显著的维罗非尼耐药性肿瘤的消退 而没有可观察到的毒性
由于图6和表6中所示的结果是有希望的，但似乎未导致肿瘤消退，因此通过将化合物12da和维罗非尼两者的剂量增加50％来重复实验。结果示于图7和表7中。
表7.在耐药性A375RF21异种移植物模型(n＝5)中，维罗非尼(30mg/kg)和化合物12da(15mg/kg)的体内组合的肿瘤生长抑制(TGI)和肿瘤重量比较。
治疗组 TGI(％) 肿瘤重量(克)
媒介物 - 1.60±0.22
维罗非尼30mg/kg 28.10±4.81 1.05±0.21
12da 15mg/kg 72.72±8.29 0.51±0.12
维罗非尼30mg/kg+12da 15mg/kg 103.38±1.42 0.08±0.03
维罗非尼的功效略有增加(20mg/kg下的22.65％TGI相对于30mg/kg下的28.10％TGI)，并且化合物12da的功效大幅增加(10mg/kg下的38.12％TGI相对于15mg/kg下的72.72％TGI)。如图7B中所示，在增加的药物剂量下，组合治疗组的中度肿瘤消退(44.9％)是明显的，而在较低剂量下未见到消退。总之，这些数据提供第一令人信服的证据：对于患有BRAFV600E突变的黑色素瘤患者，新型微管蛋白抑制剂(例如化合物12da)与维罗非尼的组合有可能克服对维罗非尼的获得性耐药性。
总之，这些研究强烈表明，BRAF抑制剂(例如维罗非尼)和新型微管蛋白抑制剂(例如化合物12da)的组合以数种可能的机制(包括协同细胞周期停滞、增强的细胞凋亡和AKT途径的强烈抑制)有效地克服BRAF突变型黑色素瘤中的获得性BRAF抑制剂耐药性。至少在体外，这样的组合似乎比维罗非尼与MEK抑制剂或AKT抑制剂或者现有的微管蛋白抑制剂的组合更有效。由于BRAFi+MEKi组合对于黑色素瘤缺乏持续功效，因此，研发这种靶向旁路途径的组合策略可能在这一领域具有高的影响。
讨论
尽管首先批准用于具有BRAFV600E突变的黑色素瘤患者的药物维罗非尼在初始治疗中表现出显著的反应，但几乎所有服用该药物的患者都在几个月内进展出维罗非尼耐药性(Bollag G，Tsai J，Zhang J等人.“Vemurafenib：the first drug approved for BRAF-mutant cancer.”Nat.Rev.Drug Discov.(2012)11：873-886)。了解原发性或获得性耐药性的机制并研发合适的组合策略可提供更有效的克服这样的耐药性的方法。关于寻找维罗非尼与其它药剂的有效组合以消除或降低黑色素瘤肿瘤对BRAF或MEK1/2抑制剂的耐药性的临床前研究和临床试验有丰富的文献(Greger JG，Eastman SD，Zhang V等人.“Combinations of BRAF，MEK，and PI3K/mTOR inhibitors overcome acquiredresistance to the BRAF inhibitor GSK2118436dabrafenib，mediated by NRAS or MEKmutations.”Mol.Cancer Ther.(2012)11：909-920；Patel SP，Lazar AJ，Papadopoulos NE等人.“Clinical responses to selumetinib(AZD6244；ARRY-142886)-basedcombination therapy stratified by gene mutations in patients with metastaticmelanoma.”Cancer(2013)119(4)：799-805；Flaherty KT，Infante JR，Daud A等人.“Combined BRAF and MEK inhibition in melanoma with BRAF V600 mutations.”N.Engl.J.Med.(2012)367：1694-1703；Niehr F，von Euw E，Attar N等人.“Combinationtherapy with vemurafenib(PLX4032/RG7204)and metformin in melanoma cell lineswith distinct driver mutations.”J.Transl.Med.(2011)9：76；Paraiso KH，HaarbergHE，Wood E等人.“The HSP90inhibitor XL888 overcomes BRAF inhibitor resistancemediated through diverse mechanisms.”Clin.Cancer Res.(2012)18：2502-2514；KoyaRC，Mok S，Otte N等人.“BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumoractivity of adoptive cell immunotherapy.”CancerRes.(2012)72：3928-3937)。RAF/MEK/ERK途径的抑制剂主要引起G1细胞周期停滞而不是黑色素瘤肿瘤细胞死亡。因此，靶向同一途径中的不同组分的药剂的组合(例如维罗非尼和MEK1/2抑制剂的组合)尽管最初有效(Little AS，Smith PD，Cook SJ.“Mechanisms of acquired resistance to ERK1/2pathway inhibitors.”Oncogene(2012)32(10)：1207-1215)，但对可从这些G1细胞周期停滞逃逸的耐药性细胞可能不能保持长效协同作用。由于微管蛋白抑制剂的主要标志之一是它们能够强烈地使细胞停滞在G2/M期，因此，维罗非尼和微管蛋白抑制剂的组合被认为协同停滞黑色素瘤细胞，从而实现增强的细胞凋亡，并克服获得性耐药性。在该研究中，选择新型微管蛋白抑制剂化合物12da针对黑色素瘤肿瘤来研究其与维罗非尼的组合。产生维罗非尼耐药性人黑色素瘤细胞系A375RF21，并且已表明，化合物12da和维罗非尼的组合在体外具有强烈的协同作用。据证实，该协同作用不可能通过对微管蛋白聚合的抑制的增强或p-ERK活化的减弱实现。相反，实验结果表明，该组合治疗通过协同G1和G2/M细胞周期停滞引起的增强的细胞凋亡诱导以及与AKT磷酸化有关的存活信号转导途径的实质损害来克服获得性维罗非尼耐药性。已表明，当在维罗非尼耐药性异种移植物模型中测试时，在体外观察到的强烈协同作用明确地转换成显著的体内功效。对组织切片的进一步免疫组织化学分析证实了对肿瘤增殖的强烈抑制和pAKT活性的降低。已表明，PI3K/AKT/mTOR信号转导途径的活化有助于人黑色素瘤细胞系中对ERK1/2抑制的选择性减弱(Bartholomeusz C，Gonzalez-Angulo AM.“Targeting the PI3K signaling pathway in cancer therapy.”Expert Opin.Ther.Targets(2012)16：121-130)，并且最近的数项研究已明确展示靶向PI3K/AKT/mTOR途径的抑制剂和BRAF抑制剂或MEK抑制剂的协同组合(Liu R，Liu D，XingM.“The Akt inhibitor MK2206 synergizes，but perifosine antagonizes，the BRAF(V600E)inhibitor PLX4032 and the MEK1/2 inhibitor AZD6244 in the inhibitionof thyroid cancer cells.”J.Clin.Endocrinol.Metab.(2012)97：E173-182)。最近报道了数种新型类型的化合物作为微管蛋白聚合的抑制剂，并且它们还表现出对AKT途径的强烈抑制(Krishnegowda G，Prakasha Gowda AS等人.“Synthesis and biologicalevaluation of a novel class of isatin analogs as dual inhibitors of tubulinpolymerization and Akt pathway.”Bioorg.Med.Chem.(2011)19：6006-6014；Viola G，Bortolozzi R，Hamel E等人.“MG-2477，a new tubulin inhibitor，induces autophagythrough inhibition of the Akt/mTOR pathway and delayed apoptosis in A549cells.”Biochem.Pharmacol.(2012)83：16-26；Zhang C，Yang N，Yang CH等人.“S9，anovel anticancer agent，exerts its anti-proliferative activity by interferingwith both PI3K-Akt-mTOR signaling and microtubule cytoskeleton.”PLoSOne(2009)4：e4881)。另外，已表明，组成型活性PI3K/AKT途径会导致对靶向微管的微管蛋白聚合剂(MTPA)的多药耐药性，并且表明，PI3K/AKT介导的信号转导途径的抑制会使癌细胞对MTPA诱导的细胞凋亡敏感(Bhalla KN.“Microtubule-targeted anticancer agents andapoptosis.”Oncogene(2003)22：9075-9086)。这些研究表明微管蛋白聚合抑制剂与癌细胞中的AKT下调之间有密切的相互作用。另外，最近已报道，当与多西他赛组合时，MEK抑制剂AZD6244诱导黑色素瘤细胞的生长停滞和肿瘤消退(Haass NK，Sproesser K，Nguyen TK等人.“The mitogen activated protein/extracellular signal-regulated kinasekinase inhibitor AZD6244(ARRY-142886)induces growth arrest in melanoma cellsand tumor regression when combined with docetaxel.”Clin.Cancer Res.(2008)14：230-239)。有趣的是，目前的结果与这些研究一致。本发明中提出的体内研究通过使用A375RF21异种移植物模型显示在已经维罗非尼耐药性的肿瘤细胞中的有效组合治疗。可以设想，如果在肿瘤细胞变得对维罗非尼具有耐药性之前使用所述组合，则肿瘤消退可以更加增强并且耐药性肿瘤细胞的进展可显著延迟或者甚至预防。这至少可以翻译成患者的实质上更长的无进展时间和/或增强的疾病消退。总之，本研究为组合强效微管蛋白抑制剂与靶向RAF/MEK/ERK途径的抑制剂以大大改善对黑色素瘤患者的治疗提供第一直接证据和原理。
实施例2
选择的芳基-苯甲酰基-咪唑化合物的合成
2-芳基-4，5-二氢-1H-咪唑14b、14c、14x的制备(图8)。
向适当的苯甲醛8(b、c、x)(60mmol)在t-BuOH(300mL)中的溶液中加入乙二胺(66mmol)，并在RT下搅拌30min。将碳酸钾(75mmol)和碘(180mmol)连续加入反应混合物中，随后在70℃下搅拌3h。加入亚硫酸钠(Na2SO3)，并将混合物用氯仿萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(氯仿∶甲醇20∶1)对残渣进行纯化，得到白色固体。收率：50-60％。
2-芳基-1H-咪唑的制备(9a-j、p、x；图8和9)。
方法A(仅对于9b、9x是必需的，图8)：向2-芳基-4，5-二氢-1H-咪唑14b、x(35mmol)在DMSO(100mL)中的溶液中加入碳酸钾(38.5mmol)和二乙酰氧基碘苯(38.5mmol)。将反应混合物在黑暗中搅拌过夜。加入水，随后用二氯甲烷萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。对残渣进行快速柱色谱法处理(己烷∶乙酸乙酯3∶2)，得到白色固体。收率：30％-50％。
方法B(仅对于9c是必需的；图8)：向2-芳基-4，5-二氢-1H-咪唑14c(50mmol)在DMF(70mL)中的溶液中加入DBU(55mmol)和CBrCl3(55mmol)。将反应混合物搅拌过夜，并加入饱和NaHCO3(水性)溶液，随后用二氯甲烷萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。对残渣进行快速柱色谱法处理(氯仿∶甲醇50∶1)，获得白色固体。收率：7％。
方法C(对于9a、9d-j、9p是必需的；图9)：在0℃下，向适当的苯甲醛(8a、8d-j、8p)(100mmol)在乙醇(350mL)中的溶液中加入40％乙二醛水溶液(12.8mL，110mmol)和29％氢氧化铵水溶液(1000mmol，140mL)。在RT下搅拌2-3天后，将反应混合物浓缩，并用二氯甲烷作为洗脱液对残渣进行快速柱色谱法处理，获得作为黄色粉末的标题化合物。收率：20％-40％。
2-芳基-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑的制备(10a-j、p、x；图8和9)。
在0℃下，向2-芳基-1H-咪唑9a-j、p、x(20mmol)在无水THF(200mL)中的溶液中加入氢化钠(在矿物油中的60％分散液，1.2g，30mmol)，并搅拌30min。加入苯磺酰氯(2.82mL，22mmol)，并将反应混合物搅拌过夜。用100mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释后，将反应混合物用乙酸乙酯(500mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯2∶1)对残渣进行纯化，得到苍白色固体。收率：50％-70％。
芳基(2-芳基-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑-4-基)甲酮的制备(11aa-ai、ba、ca、cb、da、db、ea、eb、fa、fb、ga、gb、ha、hb、ia、ib、ja、jb、pa；图8和9)。
在-78℃下，向2-芳基-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑(6.0mmol)10a-j、p、x在无水THF(30mL)中的溶液中加入在戊烷中的1.7M叔丁基锂(5.3mL，9.0mmol)，并搅拌10min。在-78℃下加入适当的取代的苯甲酰氯(7.2mmol)，并搅拌过夜。将反应混合物用100mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(200mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯4∶1)对残渣进行纯化，得到白色固体。收率：15％-40％。
用于制备芳基(2-芳基-1H-咪唑-4-基)甲酮的一般方法(12aa-ai、ba、ca、cb、da、db、ea、eb、fa、fb、ga、gb、ha、hb、ia、ib、ja、jb、pa；图8和9)。
向芳基(2-芳基-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑-4-基)甲酮(2.0mmol)11aa-ai、ba、ca、cb、da、db、ea、eb、fa、fb、ga、gb、ha、hb、ia、ib、ja、jb、pa在THF(20.0mL)中的溶液中加入1.0M四丁基氟化铵(4.0mmol)，并搅拌过夜。将反应混合物用50mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(100mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。将残渣通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯3∶1)进行纯化或从水和甲醇重结晶，得到白色固体。收率：80-95％。
(2-(4-羟基苯基)-1H-咪唑-4-基)(芳基)甲酮的制备(12ka、12kb；图9)。
向(2-(4-(苄基氧基)苯基)-1H-咪唑-4-基)(芳基)甲酮12ja或12jb(1mmol)在AcOH(20mL)中的溶液中加入浓HCl(2mL)，并回流过夜。移除溶剂后，将残渣从二氯甲烷重结晶，得到作为黄色固体的标题化合物。收率：70-85％。
(2-芳基-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三羟基苯基)甲酮13ea、13fa、13ha的制备(图9)。
向芳基(2-芳基-1H-咪唑-4-基)甲酮12ea、12fa或12ha(0.5mmol)在CH2Cl2(6.0mL)中的溶液中加入在CH2Cl2中的1.0M BBr3(2mmol)，并在RT下搅拌1h。加入水以破坏过量的BBr3。将沉淀的固体过滤并从MeOH重结晶，获得黄色固体。收率：60-80％。
芳基(2-芳基-1H-咪唑-4-基)甲酮-HCl盐(12db-HCl)的制备。
向12db(0.5mmol)在甲醇(20mL)中的溶液中加入氯化氢(5mmol)在***中的2M溶液，并在RT下搅拌过夜。将反应混合物浓缩，并将残渣用CH2Cl2洗涤，获得标题化合物。收率：95％。
芳基(2-苯基-1H-咪唑-1-基)甲酮的制备(12aba、12aaa；图10)。
在0℃下，向2-苯基-1H-咪唑9a(10mmol)在THF(20mL)中的溶液中加入NaH(15mmol)和取代的苯甲酰氯(12mmol)。将反应混合物搅拌过夜，并用饱和NaHCO3溶液稀释，随后用乙酸乙酯萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(氯仿)对残渣进行纯化，得到白色固体。收率：12-16％。
1-取代-(2-苯基-1H-咪唑-1-基)-芳基-甲酮的制备(12dc、12fc、12daa、12dab、12cba、11gaa、12la；图11-12)。
12dc、12fc和12daa、12dab和12cba的合成总结在图11中。化合物12da、12cb和12fa根据上文以及图8和9中所述的合成来合成。用氯化铝处理12da和12fa提供对-脱甲基化的12dc、12fc，其中3，5-二甲氧基是完整的。化合物12daa通过12da的N-1位的苄基化来制备。而12da和12cb的N-1位的甲基化分别获得化合物12dab和12cba。
12dc、12fc、12daa、12dab、12cba的合成：方法D.(对于12dc和12fc)[图11]：
R1＝CH3(12dc)
R1＝Cl(12fc)
向12da和12fa(200mg)在THF(20mL)中的溶液中加入氯化铝(10当量)。将反应混合物搅拌过夜。加入水，随后用乙酸乙酯萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。对残渣进行快速柱色谱法处理(己烷∶乙酸乙酯1∶1)，得到白色-淡黄色固体。收率：60％-80％。
12daa、12dab、12cba的合成，方法E：[图11]：
R1＝Me；R2＝Bn；R3＝3，4，5-(OMe)3(12daa)
R1＝Me；R2＝CH3；R3＝3，4，5-(OMe)3(12dab)
R1＝OMe；R2＝CH3；R3＝F(12cba)
在冰浴中，向12da和12cb(100mg)在THF(10mL)中的溶液中加入氢化钠(1.2当量)，随后加入碘甲烷(对于12dab、12cba)或苄基溴(对于12daa)(2当量)。将所得反应混合物在回流条件下搅拌5h。用50mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释后，将反应混合物用乙酸乙酯(100mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯2∶1)对残渣进行纯化，得到白色固体。收率：50％-98％。12daa：收率：92.8％；mp 135-137℃。1H NMR(CDCl3，500MHz)δ7.81(s，1H)，7.80(d，J＝6.5Hz，2H)，7.58(d，J＝8.0Hz，2H)，7.41-7.45(m，3H)，7.31-7.33(m，2H)，7.20(d，J＝7.0Hz，2H)，5.33(s，2H)，3.99(s，3H)，3.98(s，6H)，2.47(s，3H)。MS(ESI)C27H26N2O4的计算值为442.2，实测值为443.1[M+H]+。HPLC1：tR4.28min，纯度＞99％。
11gaa和12la的合成(图12)：
R1＝N(Me)2；R2＝(4-OMe)PhSO2(11gaa)
R1＝Br；R2＝H(12la)
将取代的苯甲醛化合物8(l、g)在氢氧化铵和乙二醛存在下转化为化合物9(l、g)以构建咪唑骨架。将化合物9(l、g)的咪唑环用适当的苯基磺酰基保护，随后与3，4，5-三甲氧基苯甲酰氯偶联以获得化合物11(la、gaa)。用四丁基氟化铵处理11la以移除保护基团获得12la。
(2-(4-溴苯基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(12la)的合成(图12)
9l、9g的合成：在0℃下，向适当的苯甲醛(8l和8g，100mmol)在乙醇(400mL)中的溶液中加入40％乙二醛(oxalaldehyde或glyoxal)水溶液(1.1当量)和29％氢氧化铵水溶液(10当量)。在RT下搅拌2-3天后，将反应混合物浓缩，并用二氯甲烷作为洗脱液对残渣进行快速柱色谱法处理，获得作为黄色粉末的标题化合物。收率：10％-30％。
10la、10gb的合成：在0℃下，向咪唑(9l、9g)(10mmol)在无水THF(200mL)中的溶液中加入氢化钠(在矿物油中的60％分散液，1.2当量)，并搅拌20min。加入4-甲氧基苯磺酰氯(对于10gb)或苯磺酰氯(对于其它)(1.2当量)，并将反应混合物搅拌过夜。用200mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释后，将反应混合物用乙酸乙酯(600mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯2∶1)对残渣进行纯化，得到苍白色固体。收率：40％-95％。
11la、11gaa的合成：在-78℃下，向2-芳基-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑(10la、10gb)(5.0mmol)在无水THF(30mL)中的溶液中加入在戊烷中的1.7M叔丁基锂(1.2当量)，并搅拌10min。在-78℃下加入3，4，5-三甲氧基苯甲酰氯(1.2当量)，并搅拌过夜。将反应混合物用100mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(300mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯3∶1)对残渣进行纯化，得到白色固体。收率：5％-45％。
12la的合成：向芳基(2-芳基-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑-4-基)甲酮(11la)(2.0mmol)在THF(25.0mL)中的溶液中加入1.0M四丁基氟化铵(2当量)，并搅拌过夜。将反应混合物用60mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(150mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。将残渣通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯4∶1)进行纯化或从水和甲醇重结晶，得到白色固体。收率：80-98％。
(4-氟苯基)(2-(4-甲氧基苯基)-1H-咪唑-4-基)甲酮(12cb)的合成(图8)。
向(4-氟苯基)(2-(4-甲氧基苯基)-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑-4-基)甲酮(11cb，872mg，2.0mmol)在THF(20.0mL)中的溶液中加入1.0M四丁基氟化铵(4.0mL，4.0mmol)，并搅拌过夜。将反应混合物用50mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(100mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。将残渣从水和甲醇重结晶，得到白色固体。收率：90％；mp245-247℃。
(2-(对-甲苯基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(12da)的合成(图9)。
向(1-(苯基磺酰基)-2-(对-甲苯基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(11da，492mg，1.0mmol)在THF(15.0mL)中的溶液中加入1.0M四丁基氟化铵(2.0mL，2.0mmol)，并搅拌过夜。将反应混合物用30mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(80mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。将残渣从水和甲醇重结晶，得到白色固体。收率：88.5％。
(2-(4-氯苯基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(12fa)的合成(图9和13)。
2-(4-氯苯基)-1H-咪唑(9f)：在0℃下，向4-氯苯甲醛(8f)(100mmol)在乙醇(350mL)中的溶液中加入40％乙二醛水溶液(12.8mL，110mmol)和29％氢氧化铵水溶液(1000mmol，140mL)。在RT下搅拌2-3天后，将反应混合物浓缩，并用二氯甲烷作为洗脱液对残渣进行快速柱色谱法处理，获得作为黄色粉末的标题化合物。收率：19.8％。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ13.60(br，1H)，7.94(d，J＝8.5Hz，2H)，7.51(d，J＝8.0Hz，2H)，7.27(s，1H)，7.03(s，1H)。MS(ESI)：C9H7ClN2的计算值为178.0，实测值为178.9[M+H]+。
2-(4-氯苯基)-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑(10f)：在0℃下，向2-(4-氯苯基)-1H-咪唑(9f)(20mmol)在无水THF(200mL)中的溶液中加入氢化钠(在矿物油中的60％分散液，1.2g，30mmol)，并搅拌30min。加入苯磺酰氯(2.82mL，22mmol)，并将反应混合物搅拌过夜。用100mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释后，将反应混合物用乙酸乙酯(500mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯2∶1)对残渣进行纯化，得到苍白色固体。收率：54.9％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.65(d，J＝2.0Hz，1H)，7.58(t，J＝7.5Hz，1H)，7.43(d，J＝8.5Hz，2H)，7.38(t，J＝8.0Hz，2H)，7.34-7.36(m，4H)，7.12(d，J＝1.5Hz，1H)。MS(ESI)：C15H11ClN2O2S的计算值为318.0，实测值为341.0[M+Na]+。
(2-(4-氯苯基)-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(11fa)：在-78℃下，向2-(4-氯苯基)-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑(10f)(6.0mmol)在无水THF(30mL)中的溶液中加入在戊烷中的1.7M叔丁基锂(5.3mL，9.0mmol)，并搅拌10min。在-78℃下加入3，4，5-三甲氧基苯甲酰氯(7.2mmol)，并搅拌过夜。将反应混合物用100mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(200mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯4∶1)对残渣进行纯化，得到白色固体。收率：36.8％；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.05(d，J＝7.5Hz，2H)，7.77(t，J＝7.5Hz，1H)，7.62(t，J＝8.0Hz，2H)，7.48(s，1H)，7.44(d，J＝9.0Hz，2H)，7.39(d，J＝8.5Hz，2H)，7.37(s，2H)。MS(ESI)：C25H21ClN2O6S的计算值为512.1，实测值为513.1[M+H]+。
(2-(4-氯苯基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(12fa)：向(2-(4-氯苯基)-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(11fa)(2.0mmol)在THF(20.0mL)中的溶液中加入1.0M四丁基氟化铵(4.0mmol)，并搅拌过夜。将反应混合物用50mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(100mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。将残渣通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯3∶1)进行纯化或从水和甲醇重结晶，得到白色固体。收率：80-95％。收率：36.9％；mp 193-195℃。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ10.75(br，1H)，7.96(d，J＝8.5Hz，2H)，7.83(s，1H)，7.47(d，J＝9.0Hz，2H)，7.23(s，2H)，3.97(s，3H)，3.94(s，6H)，2.43(s，3H)。MS(ESI)：C19H17ClN2O4的计算值为372.1，实测值为395.1[M+Na]+，370.9[M-H]-。HPLC梯度：溶剂A(水)和溶剂B(甲醇)：0-15min 40-100％B(线性梯度)，15-25min100％B；tR 16.36min，纯度＞99％。
(2-(4-氯苯基)-1H-咪唑-4-基)(4-氟苯基)甲酮(12fb)的合成(图9)。
向(2-(4-氯苯基)-1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑-4-基)(4-氟苯基)甲酮(11fb，440mg，1.0mmol)在THF(12.0mL)中的溶液中加入1.0M四丁基氟化铵(2.0mL，2.0mmol)，并搅拌过夜。将反应混合物用20mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(60mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。将残渣从水和甲醇重结晶，得到白色固体。收率：83.7％。
芳基-苯甲酰基-咪唑化合物和中间体的物理化学表征
实施例3
(吲哚基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(17ya)、(17yab)和(17yac) 的合成(图14)
(2-(1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(17ya)的合成：
1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-甲醛(8ya)的合成：在RT下，向吲哚3-甲醛(8y)(100mmol)在乙醇(500mL)中的溶液中加入氢氧化钾(1.1当量)。搅拌混合物，直到完全溶解。将乙醇在真空中完全移除，并将残渣在丙酮(250mL)中溶解，随后加入苯磺酰氯(1.1当量，110mmol)。将反应混合物搅拌半小时。将沉淀过滤出来，将滤液浓缩并从甲醇重结晶，得到白色固体。收率：33％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ10.17(s，1H)，8.25-8.39(m，2H)，7.97-8.09(m，3H)，7.69(t，J＝7.33Hz，1H)，7.59(t，J＝7.5Hz，2H)，7.39-7.54(m，2H)。MS(ESI)C15H11NO3S的计算值为285.1，实测值为286.0[M+H]+。
3-(1H-咪唑-2-基)-1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚(9ya)的合成：在0℃下，向1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-甲醛(8ya)(100mmol)在乙醇(400mL)中的溶液中加入40％乙二醛(oxalaldehyde或glyoxal)水溶液(1.1当量，110mmol)和29％氢氧化铵水溶液(10当量，1000mmol)。在RT下搅拌2-3天后，将反应混合物用水猝灭并用二氯甲烷萃取。将有机层真空移除，并用己烷/乙酸乙酯(4∶1-2∶1)作为洗脱液对残渣进行快速柱色谱法处理，获得作为黄色粉末的标题化合物。收率：12％。1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ8.33(d，J＝2.9Hz，2H)，8.13(d，J＝7.8Hz，2H)，7.98-8.04(m，1H)，7.62-7.67(m，1H)，7.55(d，J＝7.82Hz，2H)，7.22-7.34(m，4H)。MS(ESI)C17H13N3O2S的计算值为323.1，实测值为324.0[M+H]+。
1-(苯基磺酰基)-3-(1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑-2-基)-1H-吲哚(10ya)的合成：在0℃下，向3-(1H-咪唑-2-基)-1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚(9ya)(20mmol)在无水THF(300mL)中的溶液中加入氢化钠(在矿物油中的60％分散液，1.2当量，24mmol)，并搅拌20min。加入苯磺酰氯(1.2当量，24mmol)，并将反应混合物搅拌过夜。用200mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释后，将反应混合物用乙酸乙酯(600mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯5∶1)对残渣进行纯化，得到白色固体。收率：40％。1H NMR(CDCl3，300MHz)δ8.02-8.08(m，4H)，7.72(d，J＝1.5Hz，1H)，7.35-7.60(m，8H)，7.23(d，J＝1.5Hz，1H)，7.10-7.16(m，3H)。MS(ESI)C23H17N3O4S2的计算值为463.1，实测值为486.0[M+Na]+。
(1-(苯基磺酰基)-2-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(17yaa)的合成：在-78℃下，向1-(苯基磺酰基)-3-(1-(苯基磺酰基)-1H-咪唑-2-基)-1H-吲哚(10ya)(5.0mmol)在无水THF(100mL)中的溶液中加入在戊烷中的1.7M叔丁基锂(1.2当量，6.0mmol)，并搅拌10min。在-78℃下加入3，4，5-三甲氧基苯甲酰氯(1.2当量，6.0mmol)在THF中的溶液，并搅拌过夜。将反应混合物用100mL饱和NaHCO3溶液(水性)猝灭，并用乙酸乙酯(300mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯3∶1)对残渣进行纯化，得到白色固体。收率：30％。1H NMR(500MHz，CDCl3)δ8.09(d，J＝10Hz，1H)，8.04(d，J＝10Hz，2H)，7.91(s，1H)，7.76(d，J＝5Hz，2H)，7.65(t，J＝10Hz，1H)，7.55-7.58(m，5H)，7.40(s，2H)，7.33-7.36(m，3H)，7.25(t，J＝10Hz，1H)，4.05(s，3H)，4.03(s，6H)。MS(ESI)C33H27N3O8的计算值为657.0，实测值为680.1[M+Na]+。
(2-(1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(17ya)的合成：向(1-(苯基磺酰基)-2-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(17yaa)(1mmol)在乙醇(40mL)和水(4mL)中的溶液中加入氢氧化钠(10当量，10mmol)，并在回流条件下在黑暗中搅拌过夜。将反应混合物用50mL水稀释并用乙酸乙酯(200mL)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯1∶1)对残渣进行纯化，得到黄色固体。收率：60％。1H NMR(500MHz，CD3OD)δ8.31(d，J＝6.5Hz，1H)，7.99(s，1H)，7.90(s，1H)，7.48-7.52(m，3H)，7.24-7.28(m，2H)，4.00(s，6H)，3.93(s，3H)。MS(ESI)C21H19N3O4的计算值为377.1，实测值为400.1[M+Na]+。Mp 208-210℃。
(2-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(17yab)的合成：
向化合物17yaa(66mg)在THF(1.0ml)中的溶液中加入1.0M四丁基氟化铵(0.4mL，0.4mmol)，并搅拌过夜。将反应混合物用20mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释，并用乙酸乙酯(20ml)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。通过快速柱色谱法(己烷∶乙酸乙酯，2∶1)对残渣进行纯化，得到苍白色固体。收率：45％。Mp 110-112℃。1H NMR(CDCl3，500MHz)δ8.40-8.42(m，2H)，8.09(d，J＝8.0Hz，1H)，7.93-7.98(m，4H)，7.59(t，J＝7.5Hz，1H)，7.41-7.49(m，5H)，4.01(s，3H)，3.97(s，6H)。MS(ESI)C27H23N3O6S的计算值为517.1，实测值为540.0[M+Na]+。HPLC：tR 6.81min，纯度为96.3％。
(1-甲基-2-(1-(甲基)-1H-吲哚-3-基)-1H-咪唑-4-基)(3，4，5-三甲氧基苯基)甲酮(17yac)的合成：
在0℃下，向17ya(75mg，0.2mmol)在无水THF(20ml)中的溶液中加入氢化钠(在矿物油中的60％分散液，20mg，0.5mmol)，并搅拌20min。加入碘甲烷(70mg，0.5mmol)，并将反应混合物搅拌1h。用20mL饱和NaHCO3溶液(水性)稀释后，将反应混合物用乙酸乙酯(60ml)萃取。将有机层用硫酸镁干燥并浓缩。将残渣从水和甲醇重结晶，得到白色固体。75％收率。Mp 164-166℃。1H NMR(CDCl3，500MHz)δ8.30(d，J＝7.5Hz，1H)，8.01(s，1H)，7.87(s，1H)，7.41(t，J＝8.5Hz，1H)，7.39(s，1H)，7.35(t，J＝7.0Hz，1H)，7.23(t，J＝7.0Hz，1H)，3.98(s，6H)，3.95(s，3H)，3.91(s，3H)，3.89(s，3H)。MS(ESI)C23H23N3O4的计算值为405.2，实测值为406.4[M+H]+。HPLC：tR 4.80min，纯度＞99％。
实施例4
选择的本发明的ABI化合物的抗增殖活性
细胞培养物细胞毒性测定法
材料和方法
研究了ABI化合物在三种黑色素瘤细胞系(A375和WM-164，人黑色素瘤细胞系；B16-F1，小鼠黑色素瘤细胞系)和四种人***癌细胞系(LNCaP、DU 145、PC-3和PPC-1)中的抗增殖活性。除了PPC-1细胞系之外，所有这些细胞系均购自ATCC(美国模式培养物保藏所，Manassas，VA)。华盛顿的Georgetown University School of Medicine的RobertClarke友情提供了MDA-MB-435和MDA-MB-435/LCCMDR1细胞。在DMEM(Cellgro Mediatech公司，Herndon，VA)中培养黑色素瘤细胞，并在补充有10％FBS(Cellgro Mediatech)的RPMI1640(Cellgro Mediatech公司，Herndon，VA)中培养***癌细胞。将培养物维持在37℃下和含有5％CO2的潮湿气氛中。根据生长速率，将1000至5000个细胞铺板到96孔板的各孔中，并使其暴露于不同浓度的测试化合物48小时(生长快速的黑色素瘤细胞)和96小时(生长缓慢的***癌细胞)，一式三份或一式五份。通过磺基罗丹明B(SRB)测定法测量药物处理结束时的细胞数。简单地说，将细胞用10％三氯乙酸固定并用0.4％SRB染色，并使用读板仪(DYNEX Technologies，Chantilly，VA)测量540nm下的吸光度。绘出相对于药物浓度，细胞存活率％，并使用GraphPad Prism(GraphPad Software，San Diego，CA)通过非线性回归分析获得IC50值(抑制未处理对照的50％细胞生长的浓度)。
结果
表8-10总结了使用三种黑色素瘤细胞系(一种鼠黑色素瘤细胞系，B16-F1；以及两种人转移性黑色素瘤细胞系，A375和WM-164)和四种人***癌细胞系(LNCaP、PC-3、Du145和PPC-1)的本发明的化合物的体外抗增殖活性的结果。
根据表8，化合物12aa-12ai表现出中等活性，IC50值在μM范围内(所有七种细胞系的平均值)。该系列中最有效的化合物是12aa，平均IC50值为160nM。从C环的3，4，5-三甲氧基移除其中一个甲氧基(12ad、12ae)导致显著的活性损失(对于12ae，IC50＞10μM；12ad的平均IC50＝3.1μM)。C环上具有4-氟的化合物(12af)也表现出相对较好的活性(IC50＝0.91μM)，这是一个具有重要暗示的发现，因为用4-氟基代替三甲氧基部分可提供良好的活性以及改善的代谢稳定性。C环上氟的位置对于活性至关重要，因为由4-氟换成3-氟导致活性完全丧失(与12af的0.91μM相比，12ag的IC50＞10μM)。该结果表明，存在靠近该环的4位的潜在氢键供体。
如表8中所清楚表明，A环和C环的位置至关重要。C环部分由咪唑环(B环)中的4位到1位的简单变换导致活性完全丧失(12aba、12aaa、10a、10x、10j的IC50＞10μM)。
根据表9，在A环上有不同取代时，C环上具有3，4，5-三甲氧基和4-氟取代的化合物表现出良好的活性。这些化合物显示出优异的抗增殖活性，对WM164细胞系IC50值低至8.0nM(12da)。一般来说，如从12ca、12cb、12da、12db、12fa、12fb、12ga和12gb(IC50＝7.9-110nM)的活性可以看出的，A环对位引入单个取代基的化合物活性更强。与相应的游离碱12db(IC50＝109nM)相比，12db-HC1盐(IC50＝172nM)表现出活性略有下降。A环和C环对位具有单个卤素取代基并且没有甲氧基的化合物12fb(IC50＝63.7nM)显示出活性。A环上有3，4，5-三甲氧基取代基的化合物完全丧失活性(12ea、12eb的IC50＞10μM)，这表明A环和C环附近具有十分不同的结合环境。从A环上移除5-甲氧基取代基显著改善活性(12ha、12ea的IC50分别是330nM和大于10μM)。3，4，5-三甲氧基的脱甲基化会使活性从43nM(12fa)急剧下降至3.89μM(13fa)。对于13ea、12ka、12kb和13ha也观察到了由于A环或C环上取代基的脱甲基化导致的类似结果。A环上的供电子基团(4-甲氧基、4-二甲基氨基、4-甲基)和吸电子基团(4-氯、2-三氟甲基)没有表现出活性的实质差异。在A环的邻位引入三氟甲基导致活性完全丧失(12ia、12ib的IC50＞10μM)。与对羟基化合物12kb(IC50＝33μM)相比，A环对位存在苄氧基(12jb的IC50＝75nM)导致活性增加440倍。值得注意的是，C环具有4-氟的化合物12jb比对应的在C环上具有3，4，5-三甲氧基的12ja具有更好的活性(12jb的IC50＝75nM，12ja的IC50＝7.3μM)。
根据表10，咪唑环的氮连接有苯基磺酰基保护基的化合物(11cb、11db、11fb、11ga、11gb、11ha、11jb)也具有很强的活性，IC50在nM范围内(表10)。一般来说，这些化合物的活性与其对应的未保护的相应化合物相当，这通过比较11cb(43nM)、11db(111nM)、11fb(72nM)、11ga(285nM)、11gb(87nM)、11ha(268nM)和11jb(61nM)与其对应的未保护的相应化合物12cb(36nM)、12db(109nM)、12fb(64nM)、12ga(131nM)、12gb(72nM)、12ha(330nM)和12jb(75nM)的活性得出的。其它化合物(11ab-11ag、11ea、11eb、11hb、11ia和11ib，1-50μM)的活性一般要低很多，同样与其相应化合物(12ab-12ag、12ea、12eb、12hb、12ia和12ib，1-50μM)一致。
本发明的化合物的PC3细胞周期分布在图15中呈现。
细胞周期分析。
通过碘化丙啶(PI)染色测定细胞周期分布。将处理过的细胞用PBS洗涤，并用70％冰冷乙醇固定过夜。然后，在37℃下在RNA酶A(300μg/mL)存在下，用20μg/mL PI将固定的细胞染色30分钟。在University of Tennessee Health Science Center，TN通过荧光激活细胞分选(FACS)分析核心服务来分析细胞周期分布。
结果
通过细胞周期分析证实，反向ABI(RABI)使细胞停滞在G2/M期。将PC3细胞用化合物12q、70a、70f和70m处理24h(图15)，并通过FACS分析研究PI染色细胞的分布。对于每种化合物，选择四个不同浓度-1nM、10nM、50nM和100nM以检查剂量效果。在媒介物处理组中，约18％的PC3细胞分布在G2/M期。RABI大约以浓度依赖性方式将处于G2/M期的细胞的比例增加到高达70％。不同的浓度使细胞停滞在G2/M期的效力与体外细胞生长抑制活性正相关。RABI的抗增殖报告于表10A和表10B中。一些RABI表现出相当强效的抗增殖(例如参见70a)。
实施例5
芳基-苯甲酰基-咪唑(ABI)化合物在耐药性黑色素瘤细胞中的活性
P-糖蛋白(Pgp)介导的药物外排是癌细胞防止抗癌药物在细胞内积累到有效浓度的主要机制。比较ABI化合物针对多药耐药性(MDR)黑色素瘤细胞(MDA-MB-435/LCCMDR1)及其亲代非耐药性癌细胞(MDA-MB-435)的活性。尽管MDA-MB-435最初命名为乳腺癌细胞系，但己明确表明它源自M14黑色素瘤细胞系。在MDR黑色素瘤细胞系及其亲代黑色素瘤细胞系二者上测试了化合物12da、12fb、12cb、11cb和11fb以及其它靶向微管蛋白的药剂(包括秋水仙碱、紫杉醇和长春碱)(表11A)。紫杉醇和长春碱是临床使用的己知靶向细胞微管蛋白的抗癌药物。尽管秋水仙碱不是FDA批准的用于癌症治疗的药物，但其前药ZD6126已经处于用于实体肿瘤的临床试验阶段。硼替佐米是第一种治疗性蛋白酶体抑制剂，FDA在2003年批准将其用于多发性骨髓瘤。己知ABT-751靶向微管蛋白秋水仙碱结合位点。它在临床试验中是很有前途的用于儿童复发性或顽固性神经母细胞瘤的药物候选物。化合物12da、12fb、12cb、11cb、11fb具有比秋水仙碱(65.8)、紫杉醇(69.3)和长春碱(27.5)好得多的耐药性指数(12da为3.0、12fb为0.9、12cb为1.3、11cb为0.8、11fb为0.7)。尽管秋水仙碱、紫杉醇和长春碱在非耐药性黑色素瘤细胞系中表现出优异的活性(0.5-10nM)，但这些化合物对MDR黑色素瘤细胞系的效力显著降低(277-658nM)。与此相反，12cb、11cb、11fb对MDR黑色素瘤细胞系(12da、12fb、12cb、11cb和11fb的对应值分别为15nM、38nM、30nM、30nM、35nM)和非耐药性黑色素瘤细胞系(12da、12fb、12cb、11cb和11fb的对应值分别为5nM、41nM、24nM、38nM、50nM)的效力基本相当。与紫杉醇和秋水仙碱相比，化合物12da对A375和WM-164细胞的活性更强。
表11A.与其它抗癌药物相比，ABI化合物对多药耐药性黑色素瘤细胞系(MDR细胞)和相应的敏感性亲代细胞系(正常黑色素瘤细胞)的体外生长抑制效果。
*耐药性指数通过用对多药耐药性细胞系MDA-MB-435/LCC6MDR1的IC50值除以对相应敏感性亲代细胞系MDA-MB-435的IC50值来计算。缩写：N/A，未获得数值；ND，未测定。
表11B.ABI在不同癌和具有不同耐药性机制的MDR细胞系中的抗癌功效和秋水仙碱位点结合亲和力。ABI对包括高度转移性细胞系和多药耐药性细胞系在内的所有所测试的黑色素瘤细胞系表现出优异的效力。ABI对微管蛋白中的秋水仙碱结合位点的高结合亲和力证实其靶点在细胞内。
注：*：亲代细胞系到耐药性细胞亚系；MDR1在MDA-MB-435/LCC6MDR1和NCI/ADR-RES中过表达；MRP1、MRP2和BCRP在HEK293-MRP1、HEK293-MRP2和HEK293-482R2中过表达。耐药性指数(括号中的数字)通过将对耐药性细胞亚系的IC50值除以对相应亲代细胞系的IC50值来计算。+：对于微管蛋白结合的IC50由[3H]秋水仙碱竞争结合闪烁迫近测定法来计算。++：文献中报道的对于ABT-751的结合亲和力。缩写：N/A，不适用，因为其结合到微管蛋白的不同位点。
表11C：亚甲基连接化合物(芳基-苄基-咪唑)在黑色素瘤细胞中的抗增殖活性。
*N/A＝不适用
ND＝未测定
表11D：芳基-苯甲酰基-咪唑在黑色素瘤细胞中的抗增殖活性。
*N/A＝不适用
ND＝未测定
表11A的结果表明，细胞系MDA-MB-435/LCCMDR1对秋水仙碱、紫杉醇和长春碱的耐药性很强。但本发明的ABI对耐药性细胞系和敏感性亲代细胞系表现出同样的效力。这一结果有力地表明ABI不是P-gp的底物。因此，它们克服了在MDA-MB-435/LCCMDR1细胞中发现的多药耐药性。图16示出了12fb、12da和12cb的剂量反应曲线。表11B进一步探讨与ABI 12cb、12da和12fb相比，对紫杉醇、SN-38、长春碱和秋水仙碱的耐药性机制。MRP和BCRP赋予对紫杉醇(耐药性指数分别为4和6)、长春碱(耐药性指数分别为6和5)的中等耐药性，并且BCRP赋予对SN-38(耐药性指数为41)的显著耐药性。然而，ABI中没有一种易受MRP或BCRP介导的耐药性影响(耐药性指数为0.4-1.0)。ABT-751与ABI一样不易受MDR1、MRP或BCRP影响。
实施例6
体外微管聚合测定法
材料和方法
将牛脑微管蛋白(0.4mg)(Cytoskeleton，Denver，CO)与10μM测试化合物混合，并在110μl pH为6.9的通用微管蛋白缓冲液(80mM PIPES，2.0mM MgCl2，0.5mM EGTA和1mMGTP)中孵育。通过SYNERGY 4酶标仪(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)每1min监测一次340nm下的吸光度，持续15min。对于微管蛋白聚合，将分光光度计设定在37℃。
结果
检查了芳基-苯甲酰基-咪唑(ABI)化合物对微管蛋白聚合的抑制。将牛脑微管蛋白(纯度＞97％)与浓度为10μM的三种有效的ABI化合物12cb、12da和12db一起孵育，以测定这些ABI化合物对微管蛋白聚合的效果(图17)。化合物12da完全抑制了微管蛋白聚合，而在与化合物12cb和12db一起孵育期间，观察到约80％的抑制。
这种微管去稳定效果与秋水仙碱和长春碱类似，但与紫杉醇相反。这一结果不仅证实ABI能直接与微管蛋白相互作用，而且还表明它们可能与秋水仙碱(或长春碱)共享相同的结合位点。
实施例7
体外黑色素瘤抑制
材料和方法
将B16-F1黑色素瘤细胞以集落形成密度(每孔2000个细胞，在六孔板上)铺板在0.8％基础琼脂顶部。使细胞在0.4％琼脂和DMEM培养基中在37℃下在95％空气和5％CO2的气氛中生长，所述培养基补充有胎牛血清和抗生素-抗霉菌溶液。用不同浓度(20nM、100nM和500nM)的化合物12da、12cb和12fb处理细胞。将化合物由1mM DMSO储备溶液加入培养基中，并将对应的DMSO稀释液用作对照。使细胞生长14天。对板进行拍照，并用Artek880Automated Colony Counter(Artek Systems公司，Farmingdale，NY)测量集落数。
结果
图18示出四张代表性照片。在孵育14天后，在对照(未处理)中形成了约130个可检测的集落(直径大于100μm)。
即使在最低测试浓度20nM下，化合物12cb和12da也有效抑制B16-F1黑色素瘤集落的形成(与对照相比，p＜0.05)。12fb在100nM下表现出有效的抑制。在0.5μM下，所有三种测试化合物都表现出完全抑制集落形成，这进一步证明ABI的抗黑色素瘤功效。
实施例8
体内抗肿瘤活性
材料和方法
动物：4-6周龄的雌性C57/BL小鼠购自Harlan Laboratories(HarlanLaboratories公司，Indianapolis，IN)。动物居住条件符合Association for Assessmentand Accreditation and Laboratory Animal Care的规范。所有方法都根据Institutional Animal Care and Use Committee的指南来进行。
体内功效评价。在不含FBS的DMEM培养基(Cellgro Mediatech)中以5×106个活细胞/mL的浓度制备小鼠黑色素瘤B16-F1细胞。将细胞悬浮液(100μL)皮下注射到每只小鼠的右背侧胁腹。当接种细胞后约7天，肿瘤大小达到约100-150mm3时，根据肿瘤大小将所有荷瘤小鼠分为对照组和治疗组(每组n＝5)。各组有相似的平均肿瘤大小。每天一次向对照组的小鼠腹膜内注射仅50μL媒介物溶液(阴性对照)或60mg/kg的DTIC(阳性对照)。用可追踪式电子数显卡尺(Fisher Scientific公司，Pittsburgh，PA)每两天测量一次肿瘤体积，并使用公式a×b2×0.5进行计算，其中a和b分别表示较大和较小的直径。肿瘤体积以立方毫米表示。每组数据以平均值±SE表示，并绘制随时间的曲线。用公式100-100×[(T-T0)/(C-C0)]计算实验结束时(开始治疗后14天)的肿瘤减小百分比，其中T表示治疗组在某天的平均肿瘤体积，T0表示相同组在治疗第一天的平均肿瘤体积，C表示对照在某天的平均肿瘤体积，并且C0表示相同组在治疗第一天的平均肿瘤体积。在整个实验期间，监测各组的动物活动性和平均体重以评估化合物的毒性。在治疗结束时，使用CO2，然后进行颈脱位对所有小鼠实施安乐死，并收集肿瘤用于进一步研究。
结果
为评价ABI类似物的体内功效，我们测试了化合物12cb对小鼠黑色素瘤B16-F1异种移植物的抗肿瘤活性。将恶性黑色素瘤治疗的金标准DTIC用作阳性对照(图19A)。将二十只雌性C57/BL小鼠分为四组：媒介物对照组、DTIC(60mg/kg)治疗组、12cb(10mg/kg)治疗组和12cb(30mg/kg)治疗组。向每只小鼠皮下注射50万个B16-F1黑色素瘤细胞。接种肿瘤后7天，每天腹膜内注射各化合物开始进行治疗(图19)。对于12cb(10mg/kg)、DTIC(60mg/kg)和12cb(30mg/kg)，在治疗14天后，肿瘤体积分别显著(p＜0.05)减小了47％、51％和73％。在实验期间，任何治疗组均未观察到显著的体重下降。
选择了12fb的两个剂量水平：15mg/kg和45mg/kg。将60mg/kg的DTIC用作阳性对照。首先选择C57BL/6小鼠的B16-F1黑色素瘤同种异体移植物模型用于研究。治疗13天后(图19B)，15mg/kg的化合物12fb抑制了32％的黑色素瘤肿瘤生长(TGI值)，在45mg/kg下为82％。与对照相比，45mg/kg时，12fb的Student′s t检验p值小于0.001，表明存在显著差异。与对照相比，15mg/kg时，12fb的t检验p值为0.08，表明该剂量没有效果。将45mg/kg的12fb与60mg/kg的DTIC(TGI为51％)进行比较，t检验p值约为0.001，表明12fb具有比DTIC实质上更好的活性。对于对照和12fb 15mg/kg治疗组，在整个实验期间平均体重稍有增加。
为进一步证实ABI的体内活性，使用SHO小鼠的A375人黑色素瘤异种移植物模型，并测试了25mg/kg的12fb。再次将60mg/kg的DTIC用作阳性对照。治疗31天后(图19C)，12fb抑制了69％的黑色素瘤肿瘤生长(TGI值)，而DTIC抑制了52％的生长。12fb治疗与对照相比，t检验p值小于0.001，表明25mg/kg的12fb显著抑制了黑色素瘤肿瘤生长。12fb治疗与DTIC相比，t检验p值小于0.05，再次表明12fb具有比DTIC实质上更好的活性。在整个实验期间，所有组的平均体重均稍有增加。小鼠的身体活动也看起来正常，这表明25mg/kg是SHO小鼠良好耐受的剂量。
实施例9
化合物17ya、12fa和55的体外和体内药理学
材料和方法
***癌的细胞培养和细胞毒性测定法。所有***癌细胞系(LNCaP、PC-3和DU145、PPC-1)都从ATCC(美国模式培养物保藏所，Manassas，VA，USA)获得。人PC-3_TxR对紫杉醇具有耐药性，并使用MDR模型与PC-3进行比较。细胞培养用品购自Cellgro Mediatech(Herndon，VA，USA)。将所有细胞系用于通过磺基罗丹明B(SRB)测定法测试化合物17ya、12fa和55的抗增殖活性。所有癌细胞系都维持在具有2mM谷氨酰胺和10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中。
体外微管聚合测定法。将猪脑微管蛋白(0.4mg)(Cytoskeleton，Denver，CO)与1μM和5μM测试化合物或媒介物(DMSO)混合，并在100μL缓冲液(80mM PIPES，2.0mM MgCl2，0.5mM EGTA，pH 6.9和1mM GTP)中孵育。每分钟检测一次340nm波长下的吸光度，持续15分钟(SYNERGY 4酶标仪，Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)。对于微管蛋白聚合，将分光光度计维持在37℃。
代谢孵育。在37℃下在振荡水浴中，通过将0.5μM测试化合物在1mL总反应体积中孵育来进行代谢稳定性研究，所述反应体积含有在反应缓冲液[0.2M磷酸盐缓冲液(pH7.4)，1.3mM NADP+，3.3mM葡萄糖-6-磷酸和0.4U/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶]中的1mg/mL微粒体蛋白。NADPH再生***(溶液A和B)从BD Biosciences(Bedford，MA)获得。对于葡糖醛酸化研究，将去离子水中的2mM UDP-葡糖醛酸(Sigma，St.Louis，MO)辅助因子与去离子水中的8mM MgCl2、25μg丙甲菌素(Sigma，St.Louis，MO)和如上文所述的NADPH再生溶液(BDBiosciences，Bedford，MA)孵育。反应溶液中的总DMSO浓度为约0.5％(v/v)。在第5、10、20、30、60和90分钟时，对用于测定代谢稳定性的反应混合物的等分试样(100μL)进行采样。加入含有200nM内标的乙腈(150μL)以猝灭反应并使蛋白质沉淀。然后，将样品在RT下在4,000g下离心30分钟，并通过LC-MS/MS直接分析上清液。
分析方法。将样品溶液(10μL)注入Agilent系列HPLC***(Agilent 1100系列Agilent 1100化学工作站，Agilent Technology有限公司)中。将所有分析物在C18细孔柱(AlltechAlltima HP，2.1×100mm，3μm，Fisher，Fair Lawn，NJ)上进行分离。使用两种梯度模式。对于代谢稳定性研究，使用流动相A[含有0.1％甲酸的ACN/H2O(5％/95％，v/v)]和流动相B[含有0.1％甲酸的ACN/H2O(95％/5％，v/v)]的混合物，以300μL/min的流速，使用梯度模式实现分析物的分离。在0至1分钟以10％使用流动相A，然后在4分钟内线性程序化梯度至100％的流动相B，保持100％的流动相B 0.5分钟，然后快速改变至10％流动相A。继续流动相A 10分钟，直至分析结束。
使用用TurboIonSpray源操作的三重四极杆质谱仪API Qtrap 4000TM(AppliedBiosystems/MDS SCIEX，Concord，Ontario，Canada)。对于正离子模式，喷雾针电压设为5kV。气帘气设为10；气体1和气体2设为50。碰撞辅助解离(CAD)气体为中等，并且离子源加热器探头温度为500℃。使用多反应监测(MRM)模式，扫描m/z 378→210(17ya)、m/z 373→205(12fa)、m/z 410→242(55)和m/z 309→171(内标)，以获得最敏感的信号。用1.4.1版本的AnalystTM软件(Applied Biosystems)完成数据采集和量化处理。
水溶性。通过MultiScreen Solubility Filter Plate(Millipore Corporate，Billerica，MA)结合LC-MS/MS来测定药物的溶解性。简单地说，将198μL磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液(pH 7.4)装入96孔板中，分配2μL 10mM测试化合物(在DMSO中)，并在RT下在轻轻摇动(200-300rpm)下混合1.5小时(N＝3)。将板在800g下离心10分钟，并如上文所述使用滤液通过LC-MS/MS测定其浓度和测试化合物的溶解性。
药物代谢动力学研究。6至8周龄的雄性ICR小鼠(每组n＝3)购自Harlan公司，并用于检查17ya、12fa和55的药物代谢动力学(PK)。将所有化合物(10mg/kg)在DMSO/PEG300(1/9)中溶解，并通过单次静脉内(i.v.)注射(50μL)至尾静脉中进行给药。在静脉内给药后5、15、30分钟以及1、1.5、2、3、4、8、12和24小时采集血样。通过口服管饲法将20mg/kg的各测试化合物(在2/2/6的Tween80/DMSO/H2O中)给予(p.o.)小鼠，以评价其口服生物利用度。在p.o.给药后0.5、1、1.5、2、3、4、8、12和24小时采集血样。
雌性Sprague-Dawley大鼠(n＝3；254±4g)购自Harlan公司(Indianapolis，IN)。大鼠胸颈静脉导管购自Braintree Scientific公司(Braintree，MA)。到达动物设施之后，在任何处理之前，将动物在控温室(20-22℃)中适应环境3天，光/暗周期为12小时。将化合物17ya、12fa和55以5mg/kg的剂量(在1/9的DMSO/PEG300中)静脉内给药到胸颈静脉中。注入等体积的肝素化盐水代替取出的血液，并在第10、20、30分钟以及第1、2、4、8、12、24小时通过颈静脉导管采集血样(250μL)。通过口服管饲法将10mg/kg(在2/2/6的Tween80/DMSO/H2O中)的各测试化合物给予(p.o.)大鼠，以评价其口服生物利用度。在第30、60、90、120、150、180、210、240分钟和第8、12、24小时通过颈静脉导管采集口服给药后的所有血样(250μL)。在采集血液之前准备肝素化注射器和小瓶。通过将血样在8,000g下离心5分钟来制备血浆样品。立即将所有血浆样品储存在-80℃下直至分析。
用200μL含有200nM内标的乙腈从100μL血浆中提取分析物。将样品充分混合，离心，并将有机提取物转移至自动进样器进行LC-MS/MS分析。
PC-3_TxR异种移植物研究。在含有10％FBS的RPMI 1640生长培养基中制备PC-3_TxR细胞(10×107个/mL)，并以1∶1的比率与Matrigel(BD Biosciences，San Jose，CA)混合。向6-8周龄的雄性无胸腺裸小鼠的胁腹中皮下注射(s.c.)100μL所述混合物(5×106个细胞/动物)以建立肿瘤。测量肿瘤的长度和宽度，并根据公式π/6×L×W2计算肿瘤体积(mm3)，其中长度(L)和宽度(W)以mm测定。当肿瘤体积达到300mm3时，用媒介物[Tween80/DMSO/H2O(2/2/6)]或17ya(10mg/kg)口服治疗负荷PC-3_TxR肿瘤的动物。给药方案为每周3次，持续4周。
结果
17ya和55在包括多药耐药性细胞在内的细胞中表现出广泛细胞毒性。
使用SRB测定法来评估17ya和55抑制癌细胞系生长的能力(表12)。两种化合物抑制包括五种***癌细胞系和一种神经胶质瘤癌细胞系在内的数种人癌细胞系的生长，其具有低纳摩尔范围的IC50值。在这些细胞系中17ya表现出比55高1.7-4.3倍的效力。使用过表达P-糖蛋白(P-gp)的紫杉醇耐药性PC-3(PC-3/TxR)细胞系来研究对17ya和55的耐药性作用以及与其亲代PC-3细胞系进行比较。在PC-3和PC-3/TxR细胞中，多西他赛的IC50值分别为1.2±0.1nM和17.7±0.7nM。17ya和55对亲代PC-3和PC-3/TxR等效，而紫杉醇和多西他赛分别表现出85倍和15倍的相对耐药性。这些数据表明17ya和55均防止P-gp介导的耐药性。
表12. 17ya和55的细胞毒性数据。
在96h处理之后测定IC50值(平均值±SD)(N＝3)。使用紫杉醇作为阳性对照。括号中的数据表示当比较在PC-3和PC-3/TxR中的IC50值时的耐药性因子。NR，未报告。
17ya和55结合到微管蛋白上的秋水仙碱结合位点、抑制微管蛋白聚合并诱导细胞 凋亡(图20)。
研发竞争性重量结合测定法以研究小分子抑制剂与微管蛋白的相互作用。在该研究中，使用不同浓度的17ya或55与秋水仙碱微管蛋白结合竞争。两种化合物均有效地与秋水仙碱竞争微管蛋白结合(图20A)；然而，当与已知的强效秋水仙碱位点结合配体鬼臼毒素(podophylltoxin)比较时，在较高浓度下它们的竞争性结合曲线基本上偏离零。这表明17ya和55表现出比鬼臼毒素更低的亲和力或者它们部分结合到秋水仙碱结合位点。阴性对照长春碱未抑制秋水仙碱微管蛋白结合，这成功地证实该竞争性重量结合测定法的特异性。
将猪脑微管蛋白(纯度＞97％)与17ya或55(5μM)一起孵育以测试其对微管蛋白聚合的效果(图20B)。在15min，17ya和55分别抑制47％和40％的微管蛋白聚合。将5μM的秋水仙碱用作阳性对照，并且抑制32％的微管蛋白聚合。这些数据表明，17ya和55具有比秋水仙碱稍微更高的对微管蛋白聚合的抑制。因此，这些化合物的分子机制是结合到秋水仙碱结合位点，抑制微管蛋白聚合，并诱导细胞毒性。
将PC-3和PC-3/TxR细胞暴露于0.8-600nmol/L的17ya、55或多西他赛24h。使用DNA-组蛋白复合物的水平来表示细胞凋亡。17ya和55在24h中对在PC-3(图20C)和PC-3/TxR(图20D)中诱导细胞凋亡等效。虽然多西他赛强效诱导PC-3细胞的细胞凋亡，但由于P-gp的过表达，其对PC-3/TxR细胞作用较弱。
17ya和55表现出有利的类药(drug-like)性。
检查17ya和55的例如代谢稳定性、通透性、水溶性和药物-药物相互作用的类药性(表13A)。17ya表现出比55更高的代谢稳定性和水溶性。两种化学物质均表现出足够大的通透性值，这表明它们可以口服使用。另外，在CYP酶抑制测定法中17ya和55均表现出微摩尔范围的高IC50值，这表明两种化合物均可避免通过主要CYP肝酶的药物-药物相互作用。总之，两种化合物均表现出有利的类药性。
表13A.化合物17a和55的类药性。评估代谢稳定性、通透性、溶解性和可能的药物-药物相互作用。各值表示重复研究的平均值。
如表13B中所示，17ya通过I相反应具有80min的半衰期，这表明17ya在I相代谢过程中稳定。在UDP-葡糖醛酸存在下的半衰期(90min)与在其不存在下所观察到的半衰期类似。这些数据表明17ya在人肝微粒体中稳定，并且其有望在人类中获得低清除率和长半衰期。另一方面，当存在和不存在UDP-葡糖醛酸时，55分别表现出30min和43min的半衰期。化合物12fa在I相中表现出44min的半衰期。这些数据表明，所有三种化合物均在人肝微粒体中表现出可接受的稳定性，并且17ya比12fa和55的稳定性更高。当研究其代谢时，发现12fa和55表现出更高水平的酮还原(数据未示出)，这表明12fa和55比17ya更加不稳定。
化合物17ya表现出高的水溶性，12fa和55表现出可接受的溶解性。
化合物17ya含有咪唑环，并且该环改善水溶性，这导致＞75μg/mL的水溶性(表13A)。化合物12fa和55表现出较差的水溶性，并且分别表现为12μg/mL和19μg/mL。总之，17ya显示高水溶性，12fa和55表现出可接受的水溶性，并且改善远超过1h。12fa的较大溶解性转化为相比1h的极大改善的口服生物利用度(在大鼠中35％相对于3.3％)。对于17ya和55，类似地，水溶性与如下文讨论的极大改善的口服生物利用度相关(表14)。
17ya和55在小鼠、大鼠和犬中的药物代谢动力学研究。
在ICR小鼠、Sprague-Dawley大鼠和比格犬中单次(i.v.或p.o.)给药的17ya和55的药物代谢动力学参数概述在表14中。17ya在小鼠和大鼠中表现出低清除率，这表明17ya在这些种属中表现出代谢稳定性和最低首过代谢。另外，17ya在小鼠和大鼠中具有中等分布容积，这表明其可适当分布到包括肿瘤在内的组织中。令人惊讶的是，不同于在小鼠和大鼠中，在犬中17ya的总清除率较高。在犬血浆中的两种大量代谢物(羟基化代谢物和具有母体的+34m/z的未知代谢物(数据未示出))与在犬肝微粒体中发现的那些一致。总之，与55相比，17ya在犬中获得较高清除率和较低口服暴露，但在小鼠和大鼠中并非如此。另外，17ya仅在犬肝微粒体中产生大量代谢物，而在小鼠、大鼠或人肝微粒体中则没有(数据未示出)。17ya在大鼠、小鼠和犬中分别表现出可接受的21％、36％和50％的口服生物利用度。同时，55在大鼠中具有低清除率，并且在小鼠和犬中具有中等清除率。与17ya类似，55在这些种属中具有中等分布容积。55在三个种属中具有恒定的口服生物利用度(24％-36％)。这些性质表明17ya和55均为潜在可口服利用的微管蛋白抑制剂。
表14.化合物17ya和55在小鼠、大鼠和犬中的药物代谢动力学研究。
17ya和55抑制紫杉醇耐药性***(PC-3/TxR)异种移植物生长。
将PC-3细胞(图21A)和紫杉醇耐药性***癌细胞(PC-3/TxR)(图21B)接种在裸小鼠中，并使肿瘤体积达到约150-300mm3。将临床用于***癌的多西他赛(10mg/kg或20mg/kg)用于体内评估其在P-gp介导的耐药性模型中的效力。发现PC-3/TxR肿瘤快速生长，并且在研究终止时体积达到1500-2500mm3。虽然10mg/kg和20mg/kg静脉内给药的多西他赛在两种模型中均表现出剂量反应(图21A和21B)，但当以10mg/kg静脉内给药时，肿瘤生长抑制(TGI)效果由在PC-3肿瘤中的84％TGI降低至在PC-3/TxR肿瘤中的14％TGI(表15)。另外，在较高剂量(20mg/kg)下，多西他赛引起PC-3肿瘤的部分消退(＞100％TGI)，但在PC-3/TxR肿瘤中仅56％TGI。多西他赛在PC-3/TxR肿瘤中的效力与在PC-3肿瘤中的效力相比明显降低，这表明通过P-gp介导的耐药性降低功效，并且这些结果与我们的体外细胞毒性或细胞凋亡数据非常一致。与多西他赛在PC-3/TxR肿瘤中缺乏功效相反，口服给药的17ya(6.7mg/kg)显示超过100％TGI，而对其体重没有作用(图21B和表15)。另外，4只具有PC-3/TxR肿瘤的裸小鼠中有2只在第19天没有肿瘤(数据未示出)。
进一步利用PC-3/TxR异种移植物模型来评估17ya(以其它给药时间表)和55的功效。当每天一次持续四天口服给药时，发现17ya的最大耐受剂量(体重降低＞20％)为10mg/kg；或者每天两次(b.i.d.)持续五天给药时为3.3mg/kg(数据未示出)。如图21C中所示，在第一周第一个连续四天内每天两次给药3.3mg/kg 17ya，然后将时间表改变为在第2至4周内每天一次。结果显示，在4-19天中获得部分消退，并且TGI为97％，并且在第26天时七只小鼠中有一只小鼠没有肿瘤。较低给药频率(q2d)下较高剂量(10mg/kg)的17ya(图21D)在第13至29天引起部分消退。这些数据表明，具有最佳剂量和给药时间表的方案会有利于17ya成功地抑制PC-3/TxR肿瘤。在第1至4周每周五次将55以10mg/kg或30mg/kgb.i.d.向裸小鼠口服给药。如图21C中所示，抑制曲线表现出在PC-3/TxR肿瘤中的剂量反应。对于具有较低剂量(10mg/kg)的治疗组，TGI值为59％。而且，较高剂量(30mg/kg)在第19天至研究终止(第26天)开始显示部分消退(＞100％TGI)。部分由于癌症恶病质，媒介物组中的一些小鼠在结束时体重降低。相反，用17ya(3.3mg/kg)或55(30mg/kg)治疗的小鼠增重(表15)，这表明这些最佳剂量的17ya或55可得到较好耐受并且预防癌症恶病质。
表15.化合物17ya和55相对于伴随评价的多西他赛的体内抗肿瘤活性。
给药时间表：qd×5/w＝每周连续五天给药一次；b.i.d.×5/w＝每周连续五天给药两次；或者q2d×3/w＝每隔一天或者一周三次给药。
a给药时间表为第一周连续四天给药两次，并在第二至四周将给药时间表改变(因为毒性)为每周连续五天给药一次。
在裸小鼠中17ya和55的脑渗透。
测定在口服给药20mg/kg 17ya或55后1h和4h时裸小鼠中的全脑浓度(表16)。测定脑与血浆浓度的比率并与多西他赛在裸小鼠中的情况进行比较。55表现出比17ya和多西他赛更高的脑渗透。17ya仅在1h和4h时表现出比多西他赛稍微更高的脑/血浆浓度比率。在1h和4h时55的脑浓度分别达到14-19％的血浆浓度，这显示与多西他赛相比在1h和4h时高3.2倍的脑/血浆比率。这些数据表明，55表现出治疗神经胶质瘤的潜在有利性质，这是由于它在神经胶质瘤细胞中具有更高脑渗透和高效能(22nM，表12)。
表16.化合物17ya和55的血脑屏障(BBB)研究。测定在给药多西他赛(IP，10mpk)、17ya(PO，20mpk)和55(PO，20mpk)后1h和4h时裸小鼠中的脑和血浆浓度。各值均表示3只裸小鼠的平均值±SD。
实施例10
在白血病(HL60)异种移植物中的体内功效(图22)。
在含有10％FBS的RPMI 1640生长培养基中制备HL60细胞(10×107个/mL)，并以1∶1的比率与Matrigel(BD Biosciences，San Jose，CA)混合。向6-8周龄的雄性无胸腺裸小鼠的胁腹中皮下注射100μL所述混合物(5×106个细胞/动物)以建立肿瘤。测量肿瘤的长度和宽度，并根据公式π/6×L×W2计算肿瘤体积(mm3)，其中长度(L)和宽度(W)以mm测定。当肿瘤体积达到约200mm3时，用媒介物[Tween80/DMSO/H2O(2/2/6)]或17ya(20mg/kg)口服治疗负荷HL60肿瘤的动物。给药时间表为每周一次，持续两周。长春新碱(1mg/mL)经由腹膜内注射每周给药一次。
结果
将人前髓细胞性白血病细胞，即HL60细胞接种在裸小鼠中，并使肿瘤体积达到约200mm3。将临床用于血液癌症(包括白血病)的长春新碱(1mg/kg)用于评估相对于阳性对照药物该体内模型的反应。将肿瘤体积(mm3)对时间绘制曲线，并且所述肿瘤体积是4-5只动物的平均值±SD。发现HL60肿瘤生长快速，并且体积在两周内达到2000-3000mm3。但是，腹膜内注射1mg/kg长春新碱表现出非常强的肿瘤生长抑制效果(图22)，并且肿瘤生长抑制(TGI)为84％。口服给药的17ya(20mg/kg)表现出40％的肿瘤生长抑制。HL60肿瘤的尺寸在17ya治疗后长达5天维持不变没有明显增加，但在接下来的两天内肿瘤尺寸显著增加(60-100％)。这表明更频繁的给药时间表可增强17ya的肿瘤生长抑制效果。
实施例11
靶向旁路途径的BRAFi和微管蛋白抑制剂的组合可延迟或预防维罗非尼耐药性的 进展。
该研究的治疗具体目标总结于图27中。
多西他赛(批准的微管蛋白抑制剂)与BRAFi(维罗非尼或达拉非尼)或MEKi(曲美 替尼)的组合可遏制黑色素瘤患者源性异种移植物(PDX或“异种患者(xenopatient)”)肿瘤 模型中的获得性维罗非尼耐药性。
任何新的治疗策略的有用性最终取决于其表现持续临床功效的能力。黑色素瘤是公知的响应于微环境或表观遗传因素展示高表型和功能可塑性的异质肿瘤。事实上，最近的报道指出，维罗非尼耐药性肿瘤可在一个患者内或者甚至在从单一转移部位采集的相同肿瘤活检内进展出多重耐药性机制。与患者中的黑色素瘤肿瘤不同，从建立的细胞系(例如A375)生长的肿瘤具有两个主要限制：(a)它们失去了其原有的可显著影响药物功效的肿瘤异质性；以及(b)它们常常由于其适应不同于天然肿瘤微环境的细胞培养条件而进展出不可逆的遗传变化。大量研究已表明，早期传代PDX肿瘤(≤5代)维持患者肿瘤的遗传保真度，保留原有肿瘤形态和异质性，并且具有与临床中所观察到的类似的对治疗的反应模式。因此，必须确认在A375RF21肿瘤中观察到的强的协同作用和功效(参见图6和7)在PDX肿瘤中仍然有效。同样重要的是，使用PDX肿瘤而不是从建立的细胞系生长的肿瘤来评估耐药性的可能进展以用于更直接的实验室到病床的转化(bench-to-bedside translation)。
由于存在已批准的微管蛋白抑制剂，因此，为促进这一创新组合的研发以迅速使患者受益，首先建立多西他赛与目前已批准的三种BRAFi/MEKi的组合功效的评估，以确定最佳组合。此外，如果新的组合策略用于治疗两组具有BRAFV600E突变的黑色素瘤患者，则其具有更高的影响力。第一组是未服用BRAFi和/或MEKi的BRAFi初治患者。如果组合可显著延迟或者甚至阻止可能的BRAFi耐药性的产生，则这样的患者受益最大。第二组是在临床现实中已经用BRAFi和/或MEKi治疗的BRAFi耐药性患者。如果组合能有效克服获得性耐药性，则这些患者受益。
测定在维罗非尼敏感性PDX肿瘤中的体内组合功效和可能的耐药性的进展，从而模仿临床用途(例如，在维罗非尼耐药性产生之前组合治疗的先期使用)以治疗BRAFi初治黑色素瘤患者。因为最好的克服获得性耐药性的策略是显著延迟或者甚至阻止其进展出来。
基于负荷PDX肿瘤的小鼠建立早期PDX肿瘤。
在该领域中，最近已努力将用于建立成功的PDX模型的一些方案标准化。现在可从商业来源获得多种PDX模型。使用购买的植入小的二代(P2)PDX肿瘤的NSG小鼠(通常为1-2只小鼠)。使肿瘤生长到约1,500mm3，并繁殖到至多五只新的NSG小鼠中以提供足够的P3肿瘤。对五个随机挑选的P3肿瘤的遗传图谱和组织学进行表征，并用来自原始P0肿瘤的数据 进行验证，以确保总体的遗传和组织学保真度，然后将肿瘤块植入大量小鼠中以进行后续研究(图27)。进行组织学分析，以确保这些验证分析的明确性。
a.测定在用多西他赛与维罗非尼、达拉非尼或曲美替尼的组合治疗的维罗非尼敏 感性PDX肿瘤中的体内功效。
对目前已批准的三种BRAFi或MEKi进行测试，以将其组合功效分等级，以用于将来的临床优化。尽管NSG小鼠是用于肿瘤繁殖的优选小鼠，但它们有毛皮并且比裸小鼠更昂贵(2-3倍)。大量研究表明，在PDX研究中，与使用更昂贵和困难的NSG小鼠相比，使用裸小鼠的终端实验结果同样良好。因此，在终端功效研究中使用裸小鼠。包括达拉非尼+曲美替尼的标准组合作为参比组合治疗。另外，在该步骤中使用的所有药物都是已批准的药物，并且其药物代谢动力学性质是已知的。本研究遵循由此建立的剂量和给药途径。具体地，将维罗非尼(45mg/kg)、达拉非尼(30mg/kg)和曲美替尼(0.3mg/kg)通过口服管饲法给予小鼠。将多西他赛(10mg/kg)经尾静脉进行静脉内注射，因为它不能口服利用。
每组7只小鼠用于评估是否在三个独立的维罗非尼敏感性PDX肿瘤中达到持续肿瘤消退。进行统计分析和样本量计算，以确保这些重要的动物研究中的统计显著性。
简单地说，6周龄雄性无胸腺裸小鼠购自Charles River。将P3维罗非尼敏感性PDX黑色素瘤肿瘤切碎成小块(约3mm3)，然后，按照文献中报道的既定方法，将其以手术方式皮下植入到63只麻醉裸小鼠的胁腹中。当植入2-3周后肿瘤达到约100-200mm3时，将小鼠随机分为9组(n＝7)，以最小化重量和肿瘤尺寸的差异：仅用媒介物的阴性对照组(组1)；四个单一药剂治疗组(组2-5)，其使用维罗非尼、达拉非尼、曲美替尼或多西他赛(i.v.)连续每天口服治疗；以及四个组合治疗组(组6-9)，其使用达拉非尼+曲美替尼(参比组合)、多西他赛+维罗非尼、多西他赛+达拉非尼和多西他赛+曲美替尼，使用与单一药剂相同的剂量和给药途径连续每天治疗。
由于PDX的性质，连接任何体内发光探针用于肿瘤监测是不切实际的。因此，每三天用卡尺测量肿瘤，并且使用下式计算其体积：(宽度2×长度)/2。基于先前的报道，维罗非尼敏感性肿瘤在60天内在小鼠中明确进展出对单一药剂维罗非尼治疗的获得性耐药性。因此，肿瘤监测长达90天，或者直至肿瘤完全消退。通过肿瘤生长动力学密切监测可能的耐药性的进展。另外，按照报道的方法用细针每两周从各肿瘤采集一系列肿瘤活检。通过蛋白质印迹法测定这些活检中BRAF和pERK/tERK的水平，以监测可能的对BRAFi和MEKi的耐药性的进展。针对潜在毒性密切监测小鼠的体重、活动和外观。
在实验结束时，通过心脏穿刺采集终端血样(0.8-1mL/小鼠)，以进行由CharlesRiver实验室提供的综合临床病理分析。采集血液后立即将所有动物通过CO2吸入然后颈脱位处死，并收集各小鼠的主要器官(脑、心脏、肺、肝、脾、肾)，并将其分别储存在10％缓冲***磷酸盐溶液中。仔细检查这些器官并针对潜在药物毒性(例如肝毒性)和转移迹象进行分析。将肿瘤仔细收集，称重，并处理，以测定药物对细胞增殖、抗血管生成和细胞凋亡的关键指标的作用，以及固定和处理以用于组织病理学检查。使用两个另外的维罗非尼敏感性PDX肿瘤模型重复上述实验以确保功效不与特定的PDX肿瘤模型相关，因此，在这个步骤中使用的全部小鼠估计多达63×3＝189只。
b.测定在用多西他赛与维罗非尼、达拉非尼或曲美替尼的组合治疗的维罗非尼耐 药性PDX肿瘤中的体内功效。
克服获得性维罗非尼耐药性的理想策略是先期使用非常有效的疗法来阻止其产生。遗憾的是，用现有疗法这是不现实的，并且大多数患者快速产生维罗非尼耐药性。Stuart等人最近提出，单一药剂维罗非尼的间歇性高剂量给药时间表与连续给药时间表相比可减弱耐药性的进展。然而，这种“药物假期”策略对患者的心理影响和长期临床功效仍有待观察。由于耐药性黑色素瘤肿瘤常常嗜好活化的MEK-ERK途径，因此，微管蛋白抑制剂与BRAFi/MEKi的合适的组合仍然非常有效地遏制肿瘤生长，然而使用单一药剂可能不足够(图6和7)。因此，确认多西他赛与BRAFi/MEKi的组合对于维罗非尼耐药性肿瘤而言诱导实质性肿瘤消退是重要的。这样的结果即使在肿瘤变成维罗非尼耐药性时也可转化为延长的患者存活期。
与上述实验方法类似，在基于负荷维罗非尼耐药性PDX肿瘤的小鼠建立早期PDX肿瘤后，使用分为9组(一个仅媒介物组、四个单一药剂治疗组和四个组合治疗组)的63只小鼠来测定多西他赛与已批准的BRAFi或MEKi药物的组合是否在维罗非尼耐药性PDX模型中有效。测量或收集肿瘤尺寸、一系列肿瘤活检、终端血样和主要器官，以类似于先前部分中所述评估功效和潜在毒性。在两个另外的维罗非尼耐药性PDX肿瘤模型中重复所述组合测试；因此，在这个步骤中使用63×3＝189只小鼠。
尽管预计这些维罗非尼耐药性PDX肿瘤会如临床试验和上文用A375RF21异种移植物模型呈现的结果中所示对单一药剂BRAFi/MEKi或达拉非尼+曲美替尼的组合具有耐药性，但认为这些对于客观评估含有多西他赛的组合的潜在功效是有价值的参考。类似于使用维罗非尼敏感性PDX模型的实验，测定肿瘤尺寸、潜在急性毒性、临床病理学和肿瘤活检中pERK/ERK的水平以将这些组合的功效分等级。
测定潜在毒性并进行聚焦蛋白质印迹法分析以评估治疗功效并识别用于临床疾 病监测的潜在生物标记。
测定组合治疗在PDX模型中的潜在毒性：
除在治疗过程中密切监测负荷PDX肿瘤的小鼠的体重和活动以外，将在终点采集的血样在采集后24小时内送往进行综合临床病理分析(血液化学)。检测完整的病理学、化学和血液学(利用微分进行完全血细胞计数)性质，并提供详细结果。类似于上文所述针对潜在毒性指示迹象对结果进行分析。对于病理分析，将***固定的肿瘤组织处理成石蜡块，并将切片用苏木精和曙红染色。使用XT(Aperio Technologies公司，CA)以0.25像素/μm扫描载玻片，以创建玻璃显微镜载玻片上的整个组织的数字复型。所述扫描处理使得能够以不同的放大倍数展示和分析组织图像，从而密切模拟用常规显微镜传统观察组织。
PDX肿瘤切片中的细胞增殖和细胞凋亡的病理学评估。
为评估药物组合是否保持增强的功效，将收获的PDX肿瘤处理成肿瘤切片并进行免疫组织化学分析。
对于抗增殖评估，按照标准免疫组织化学方法，针对其降低的pERK水平和Ki67染色(其为肿瘤细胞增殖的标记)对肿瘤切片进行检查。使用黑色素瘤特异性标记，即S100和HMB-45结合H&E染色来测定肿瘤切片内黑色素瘤细胞的比例。
对于细胞凋亡评估，通过固定肿瘤切片、将切片用Hoechst 33342染色并计数显示碎裂或正常形态的细胞核，针对细胞核碎裂的证据对细胞核形态进行评估。或者，通过TUNEL，随后分析细胞凋亡途径来评估细胞核的变化。使用流式细胞MitoScreen试剂盒测量线粒体跨膜电位的变化。细胞色素c的浓度和亚细胞分布(从线粒体易位到胞质溶胶)通过蛋白质印迹法进行评估。抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达；促凋亡蛋白Bax和Noxa的表达；以及促凋亡蛋白Bad的磷酸化状态通过蛋白质印迹法进行评估。引发剂半胱天冬酶9和效应物半胱天冬酶3的活化通过测量荧光生成底物Ac-LEHD-AFC(半胱天冬酶9)和Ac-DEVD-AMC(半胱天冬酶3)的特定蛋白水解裂解进行评估。
进行聚焦蛋白质印迹法分析以评估组合治疗功效并识别用于临床疾病监测的潜 在生物标记。
对于最初维罗非尼敏感性的PDX肿瘤，使用在实验过程中采集的一系列肿瘤活检进行聚焦蛋白质印迹法分析，以测定已知赋予BRAFi或MEKi耐药性的重要蛋白质水平的变化并识别可用于将来监测治疗功效的潜在生物标记。具体地，基于上文给出的数据，集中于检查MAPK、PDGFβ、PI3K/AKT和细胞凋亡途径中的元件，因为已知它们与维罗非尼耐药性有关。类似于使用A375RF21模型进行的工作，对RAS、RAF、RAF、MEK1/2、磷酸-MEK1/2(Ser217/221)、ERK1/2、磷酸-ERK1/2(Thr202/Tyr204)、AKT、磷酸-AKT(Ser473)、PDGFβ、裂解PARP或半胱天冬酶-3的蛋白质的表达水平进行分析。对于维罗非尼耐药性PDX肿瘤，获得其P0肿瘤的基因图谱以测定基线耐药性机制，并通过负责初始基线耐药性的蛋白质的聚焦蛋白质印迹法分析监测治疗功效。
另外，包括多西他赛在内的紫杉烷的使用仅给出中等存活优势，大多数患者由于固有的获得性耐药性最终进展。一种重要的耐药性机制由可降低多西他赛的细胞内浓度的ABC转运蛋白介导。因此，除了监测负责BRAFi/MEKi耐药性的蛋白质的水平以外，还通过使用与上述研究中所述类似的方法检查包括P-糖蛋白(Pgp)、多药耐药性蛋白(MRP)和乳腺癌耐药蛋白(BCRP)在内的重要ABC转运蛋白的表达来监测可能的多西他赛的产生。按照标准方案，根据目标抗原有所改变进行蛋白质提取、蛋白质印迹法和抗原检测。通过光密度分析准确地定量蛋白质水平(来自三次重复实验的平均值)。
预期结果、缺陷和其它供选择的方法。
多西他赛与BRAFi或MEKi的组合预计可有效地对抗维罗非尼敏感性PDX模型和维罗非尼耐药性PDX模型。由于这项研究中所用的所有药物都已被批准，因此，如果证明是有效的，则这一目标的结果会非常易于转化，并且可以快速进行临床测试，以作为一线组合疗法立即使患者受益。
ABI(新型微管蛋白抑制剂)与BRAFi或MEKi的组合遏制PDX肿瘤中的获得性BRAFi耐药性和继发性紫杉烷耐药性。
表17.ABI对包括高度转移性细胞系和多药耐药性细胞系在内的所有测试的黑色素瘤细胞系表现出优异的效力。
注：*：亲代细胞系到耐药性细胞亚系；MDR1在MDA-MB-435/LCC6MDR1和NCI/ADR-RES中过表达；MRP1、MRP2和BCRP在HEK293-MRP1、HEK293-MRP2和HEK293-482R2中过表达。耐药性指数(括号中的数字)通过用对耐药性细胞亚系的IC50值除以对相应亲代细胞系的IC50值来计算。缩写：N/A，不适用，因为其结合到微管蛋白的不同位点。ND，未测定。
多西他赛的临床使用可能在多西他赛与BRAFi/MEKi的组合治疗中导致继发性紫杉烷耐药性。与已批准的微管蛋白抑制剂相比，ABI结合到微管蛋白的不同位点，并且具有独特的优点，包括高效力、可接受的口服生物利用度、优异的药物代谢动力学性质以及克服ABC转运蛋白介导的多药耐药性的效力(表17)。初步毒性研究表明，与现有的微管蛋白抑制剂例如多西他赛或长春碱相比，ABI具有显著较低的毒性。因此，为了研发新一代组合治疗以克服对含有多西他赛的一线组合的潜在继发性耐药性，在PDX模型中测定BRAFi/MEKi与两种先进的ABI(化合物12da和化合物17ya)的组合的功效。ABI和已批准的BRAFi/MEKi均为口服活性药剂。未报道微管蛋白抑制剂与BRAFi/MEKi之间的不利药物-药物相互作用。因此，基于A375RF21异种移植物模型，口服共给药ABI与维罗非尼、达拉非尼或曲美替尼可在遏制PDX肿瘤中的黑色素瘤肿瘤生长中保持强的协同作用。
遵循上述相同方法，简要描述如下：
c.测定在用ABI(化合物12da和17ya)与维罗非尼、达拉非尼或曲美替尼的组合治 疗的维罗非尼敏感性PDX肿瘤中的体内功效。
植入小的二代(P2)PDX肿瘤的NSG小鼠(通常为1-2只小鼠)用于这项研究。使肿瘤生长到约1,500mm3，并繁殖到至多五只新的NSG小鼠中以提供足够的P3肿瘤。对五个随机挑选的P3肿瘤的遗传图谱和组织学进行表征，并用来自原始P0肿瘤的数据进行验证，以确保总体的遗传和组织学保真度，然后将肿瘤块植入大量小鼠中以进行后续研究(图27)。
由于ABI和BRAFi/MEKi的药物代谢动力学性质已经确立，因此，类似于上文所述，在三个独立的维罗非尼敏感性PDX模型中测定组合功效、潜在毒性和可能的疾病监测生物标记。由于标准单一药剂维罗非尼、达拉非尼或曲美替尼治疗的结果已如上所述获得，因此，当含有多西他赛的组合的评价完成时，通过包括在多西他赛组合以及参比组合(达拉非尼+曲美替尼)中所确定的最佳功效对组合治疗继续进行研究。因此，对于化合物12da，将小块(约3mm3)维罗非尼敏感性P3肿瘤以手术方式皮下植入到49只麻醉裸小鼠(6周龄雄性无胸腺裸小鼠)的胁腹中。当植入2-3周后肿瘤达到约100-200mm3时，将小鼠随机分为7组(n＝7)(以最小化重量和肿瘤尺寸的差异)：仅用媒介物的阴性对照组(组1)；一个单一药剂化合物12da(15mg/kg53，组2)；以及五个组合治疗组，其包括使用以下连续每天治疗：达拉非尼+曲美替尼(参比组合，组3)，上文确定的最有效的含有多西他赛的组合(组4)，以及化合物12da与维罗非尼、达拉非尼或曲美替尼的组合(组5-7)。每三天用卡尺测量肿瘤，并且使用下式计算其体积：(宽度2×长度)/2。肿瘤监测长达90天，或者直至肿瘤完全消退。通过肿瘤生长动力学密切监测可能的耐药性的进展。针对潜在毒性密切监测小鼠的体重、活动和外观。将终端血样送往进行血液化学分析，并处理肿瘤切片以进行临床病理学分析。另外，按照报道的方法用细针每周从各肿瘤采集一系列肿瘤活检。进行检查MAPK、PDGFβ-PI3K/AKT和细胞凋亡途径中的元件的聚焦蛋白质印迹法分析，以监测获得性耐药性和用于评估治疗功效的潜在生物标记。使用两个另外的维罗非尼敏感性PDX肿瘤重复所述实验，因此，对于用化合物12da进行测试，使用多达49×3＝147只小鼠。为了完成用化合物17ya进行的测试，使用多达147×2＝294只小鼠。
d.测定在用ABI(12da或17ya)与维罗非尼、达拉非尼或曲美替尼的组合治疗的维 罗非尼耐药性PDX肿瘤中的体内功效。
类似于上文部分中简要描述的实验方法，使用三个维罗非尼耐药性PDX肿瘤模型重复所述实验，并使用多达294只小鼠来测定ABI(化合物12da或17ya)与维罗非尼、达拉非尼或曲美替尼的组合的功效。测量或收集肿瘤尺寸、一系列肿瘤活检、终端血样和主要器官，以类似于先前部分中所述评估功效和潜在毒性。潜在毒性通过监测实验过程中以及病理分析后的体重下降来测定。如上文详述进行聚焦蛋白质印迹法分析，以评估治疗功效和识别潜在生物标记。
预期结果、缺陷和其它供选择的方法
ABI与BRAFi或MEKi的组合预计可有效地对抗维罗非尼敏感性PDX模型和维罗非尼耐药性PDX模型。预期这样的组合的功效会与含有多西他赛的那些组合相当或更高，但具有克服与使用多西他赛有关的潜在继发性耐药性的益处。
微管蛋白抑制剂与BRAFi或MEKi的组合在黑色素瘤转移模型中有效。
为黑色素瘤患者提供延长的存活期的主要挑战是找到黑色素瘤转移的有效治疗。由于皮下性质，PDX模型很少发生转移。因此，除了如上所述评价***给药的药物组合在这些皮下PDX模型中对抗黑色素瘤肿瘤的功效以外，还使用裸小鼠测定在实验性肺转移模型中的组合功效。选择肺转移模型是因为其为恶性黑色素瘤的主要转移部位之一，并且在所有黑色素瘤转移中具有最差的5年存活率。PI的实验室具有完善的用以评估黑色素瘤肺转移的方案(图28)，并且已指出作为单一药剂的ABI可有效地遏制黑色素瘤肺转移(化合物17ya作为实例示出)。类似模型已广泛地用于文献中。另外，与从长期建立的细胞系(例如A375)培养的细胞不同，早期传代的单细胞悬浮液直接从PDX肿瘤分离从未在塑料中生长。因此，它们可保留肿瘤异质性、遗传保真度，以及对原始患者肿瘤中的细胞所预期的对药物治疗的反应。
从早期传代PDX肿瘤分离单细胞悬浮液。
单细胞悬浮液按照标准方案从PDX肿瘤制备。简单地说，在购买NSG小鼠(通常为1-2只小鼠)并植入小的二代(P2)PDX肿瘤后，使肿瘤生长到约2,000mm3。在从NSG小鼠手术移除1小时内，将新鲜肿瘤用DMEM培养基洗涤3次以避免污染(在冰上，每次5分钟)。将无坏死和***的PDX肿瘤在无菌条件下使用无菌交叉刀片切碎成小块(1×1mm或更小)。将肿瘤块与在DMEM培养基中的浓度为1mg/mL的超纯IV型胶原酶(Gibco，17104-019)溶液混合，并在37℃下在轻轻摇动下孵育1小时。消化后，将所得混合物通过尼龙网细胞粗滤器(BDBiosciences，70μm孔，352340)过滤，以获得单细胞悬浮液。用AutoT4细胞计数器计数细胞数，成颗粒，并再悬浮于DMEM中用于尾静脉注射。在锥虫蓝测试中，通过这种方法获得的细胞的生存力通常超过95％。
使用维罗非尼敏感性或维罗非尼耐药性单细胞悬浮液遏制肺转移。
由于在上述的先前研究中已排列出最佳组合，因此对最佳组合进行测试。已批准的达拉非尼+曲美替尼组合总是包括在内作为参比组合。简单地说，将从维罗非尼敏感性或维罗非尼耐药性PDX肿瘤模型产生的悬浮在100μL DMEM中的7.5万个单细胞通过其尾静脉注射到50只裸小鼠(6周龄，任意性别)中的每只小鼠中，并将小鼠分为5组(n＝10)：仅用媒介物的阴性对照组(组1)；用达拉非尼+曲美替尼的参比组合治疗组(组2)；上文确定的多西他赛与BRAFi/MEKi的最佳组合(组3)；上文确定的化合物12da或17ya与BRAFi/MEKi的最佳组合(组4和5)。各组中小鼠的数量从7增加到10以确保统计显著性，因为预期用这种实验性肺转移模型会有较大的变动。在肿瘤细胞注射7-10天后，将小鼠用媒介物或药物组合每天口服治疗(多西他赛除外，其不能口服利用，并且通过i.v.途径给药)，持续四周。在治疗结束时，将所有小鼠通过CO2吸入然后颈脱位处死。解剖小鼠以取出肺。准确计数肺中的肿瘤结节数，并基于肺中的肿瘤结节的不存在或肿瘤结节数的减小来评估治疗功效。还在固定和处理石蜡包埋切片，接着H&E染色后检查了结节的黑色素瘤性质和肿瘤形态。为使用来自三个维罗非尼敏感性PDX模型和三个维罗非尼耐药性PDX模型的细胞进行这项实验，预期使用多达50×3×2＝300只裸小鼠。
预期结果、缺陷和其它供选择的方法
预期这些组合可有效地减少维罗非尼敏感性肿瘤中的肺转移数，并且以较低程度减少维罗非尼耐药性肿瘤中的肺转移数。含有微管蛋白抑制剂(多西他赛、化合物12da或17ya)的组合可能比达拉非尼+曲美替尼的参比组合更有效，特别是对于维罗非尼耐药性肿瘤转移而言。在其中从PDX肿瘤分离的单细胞悬浮液不能形成肺转移的不太可能的情况下，作为其它供选择的办法，使用建立的早期传代BRAFV600E人黑色素瘤细胞系(YUGEN8、YUSAC2、YUKOLI和YUSIK)。
本文中所述的所有特征(包括任何所附权利要求、摘要和附图)和/或所公开的任何方法或处理的所有步骤均可与任何上述方面以任何组合进行组合，其中这样的特征和/或步骤中的至少一些相互排斥的组合除外。尽管本文中详细描绘和描述了优选的实施方案，但对相关领域技术人员来说，显然在不违背本发明的精神下可进行各种修改、添加、替代等，并且因此将其认定为在如所附权利要求中所限定的本发明的范围内。

Claims (15)

1.药物组合物，其包含(a)微管蛋白抑制剂，其为由以下结构表示的化合物：
或其药学上可接受的盐、水合物或互变异构体，或者其组合；
(b)BRAF抑制剂维罗非尼；以及(c)药学上可接受的载体。
2.包含BRAF抑制剂维罗非尼和至少一种式17ya或12da的化合物的组合物在制备用于治疗个体的BRAF突变型癌症的药物中的用途，其中所述化合物具有以下结构：
或其药学上可接受的盐、水合物或互变异构体。
3.权利要求2的用途，其中所述BRAF突变型癌症为BRAF抑制剂耐药性癌症。
4.包含BRAF抑制剂维罗非尼以及至少一种由式17ya或12da的结构表示的化合物的组合物在制备用于治疗黑色素瘤的药物中的用途，其中所述式17ya或12da的化合物具有下式：
或其药学上可接受的盐、水合物或互变异构体。
5.权利要求4的用途，其中所述黑色素瘤为耐药性黑色素瘤。
6.权利要求3的用途，其中所述药物延迟或预防BRAF抑制剂耐药性癌症。
7.包含BRAF抑制剂维罗非尼以及至少一种由式17ya或12da的结构表示的化合物的组合物在制备用于治疗患有癌症的个体的癌症转移的药物中的用途，其中所述式17ya或12da的化合物具有下式：
或其药学上可接受的盐、水合物或互变异构体。
8.包含BRAF抑制剂维罗非尼以及至少一种由式17ya或12da的结构表示的化合物的组合物在制备用于治疗患有癌症的之前用紫杉烷药物治疗的个体的对紫杉烷药物的继发性癌症耐药性的药物中的用途，其中所述式17ya或12da的化合物具有下式：
或其药学上可接受的盐、水合物或互变异构体。
9.权利要求8的用途，其中所述紫杉烷是多西他赛。
10.权利要求2、3或6-9中任一项的用途，其中所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、乳腺癌、结肠癌、胆道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)或卵巢癌。
11.权利要求2、3或6-9中任一项的用途，其中所述癌症是黑色素瘤、甲状腺癌、结直肠癌或卵巢癌。
12.权利要求2、3或6-9中任一项的用途，其中所述癌症是黑色素瘤。
13.权利要求4的用途，其中所述黑色素瘤是耐药性黑色素瘤。
14.权利要求10的用途，其中所述黑色素瘤是V600E阳性黑色素瘤。
15.权利要求2、3或6-9中任一项的用途，其中所述癌症是耐药性癌症。
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Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3289876T3 (da) * 2008-06-16 2022-10-10 Univ Tennessee Res Found Forbindelser til behandling af cancer
US9447049B2 (en) 2010-03-01 2016-09-20 University Of Tennessee Research Foundation Compounds for treatment of cancer
US9029408B2 (en) * 2008-06-16 2015-05-12 Gtx, Inc. Compounds for treatment of cancer
US11084811B2 (en) 2010-03-01 2021-08-10 Oncternal Therapeutics, Inc. Compounds for treatment of cancer
WO2014138279A1 (en) 2013-03-05 2014-09-12 University Of Tennessee Research Foundation Compounds for treatment of cancer
CN111253336B (zh) 2014-05-06 2023-11-21 Gtx公司 治疗癌症的化合物
CN104434924B (zh) * 2014-11-10 2016-09-14 暨南大学 曲美替尼在制备逆转肿瘤多药耐药性药物中的应用
CA2972189A1 (en) * 2014-12-23 2016-06-30 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Combination of raf inhibitors and taxanes
US10792284B2 (en) 2015-02-12 2020-10-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Synergistic cancer treatment
CA2987340C (en) * 2015-06-05 2024-04-02 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Pac-1 combination therapy
AR105483A1 (es) 2015-06-30 2017-10-11 Exelixis Inc Sal de fumarato cristalina de (s)-[3,4-difluoro-2-(2-fluoro-4-yodofenilamino)fenil][3-hidroxi-3-(piperidin-2-il)azetidin-1-il]-metanona
WO2017024207A1 (en) * 2015-08-06 2017-02-09 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Combination therapies targeting mitochondrial biogenesis for cancer therapy
CA3017963A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Dicerna Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of a beta-catenin-associated disease or disorder
WO2017200826A1 (en) * 2016-05-16 2017-11-23 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Assays and compounds for treatment of cancer
CA3049926A1 (en) 2017-01-17 2018-07-26 Heparegenix Gmbh Protein kinase inhibitors for promoting liver regeneration or reducing or preventing hepatocyte death
JP7140103B2 (ja) * 2017-03-10 2022-09-21 コニカミノルタ株式会社 治療有効性の予測方法
KR20200090771A (ko) 2017-11-17 2020-07-29 더 보오드 오브 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 일리노이즈 이중 mek 신호 전달 분해를 통한 암 치료
CN108218855A (zh) * 2018-03-12 2018-06-29 桑文军 一种新型微管蛋白抑制剂及其在抗肿瘤药物中的应用
CN112512522A (zh) * 2018-05-15 2021-03-16 田纳西大学研究基金会 用于三阴性乳腺癌和卵巢癌的治疗的化合物
KR20210021982A (ko) * 2018-05-15 2021-03-02 유니버시티 오브 테네시 리서치 파운데이션 췌장암 치료용 화합물
GB201913124D0 (en) 2019-09-11 2019-10-23 Seald As Compositions and methods for treatment of cholangiocarcinoma
CN113440616A (zh) * 2020-03-25 2021-09-28 上海科州药物研发有限公司 Ras或raf突变型癌症的联合疗法
WO2022006512A1 (en) * 2020-07-02 2022-01-06 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods of treatment for melanoma
WO2022067185A1 (en) * 2020-09-27 2022-03-31 Veru Inc. Methods of treating prostate cancer with minimal side effects
WO2022131667A1 (ko) * 2020-12-18 2022-06-23 경희대학교 산학협력단 Oligodendrocyte transcription factor 2 억제제를 유효성분으로 포함하는 흑색종 치료 효과 증진용 약학적 조성물
CN115504964A (zh) * 2022-04-12 2022-12-23 海创药业股份有限公司 氘代杂环酮类化合物及其用途
WO2024036114A2 (en) * 2022-08-08 2024-02-15 The Regents Of The University Of California Combination therapy including cox-2 inhibitor for the treatment of cancer

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102655753A (zh) * 2009-10-16 2012-09-05 葛兰素史密丝克莱恩有限责任公司 组合药
CN102883607A (zh) * 2010-03-01 2013-01-16 Gtx公司 用于治疗癌的化合物

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2601675B1 (fr) * 1986-07-17 1988-09-23 Rhone Poulenc Sante Derives du taxol, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
DE69133471T2 (de) 1990-11-30 2006-05-11 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Azolderivate und ihre Verwendung als Inhibitoren von Superoxidradikalen
US5120749A (en) 1991-02-20 1992-06-09 Abbott Laboratories Platelet activating antagonists
JP2550915B2 (ja) 1994-06-21 1996-11-06 日本電気株式会社 印刷配線板の表面保護剤および表面保護膜の形成方法
HUP0303538A2 (hu) 2000-12-21 2005-02-28 Bristol-Myers Squibb Co. Tirozin kinázok Tec családjának tiazolil-vegyület inhibitorai és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények
WO2003027107A1 (en) 2001-09-26 2003-04-03 Bayer Pharmaceuticals Corporation Substituted 3-pyridyl oxazoles as c17,20 lyase inhibitors
US20040267017A1 (en) 2001-09-26 2004-12-30 Bierer Donald E 3-pyridyl or 4-isoquinolinyl thiazoles as c17, 20 lyase inhibitors
FR2831536A1 (fr) 2001-10-26 2003-05-02 Aventis Pharma Sa Nouveaux derives de benzimidazoles, leur procede de preparation, leur application a titre de medicament, compositions pharmaceutiques et nouvelle utilisation notamment comme inhibiteurs de kdr
AU2002352706A1 (en) 2001-11-15 2003-06-10 Maxia Pharmaceuticals, Inc. N-substituted heterocycles for the treatment of hypercholesteremia, dyslipidemia and other metabolic disorders, cancer, and other diseases
CN1747936A (zh) 2003-02-12 2006-03-15 特兰斯泰克制药公司 作为治疗试剂的取代吡咯衍生物
WO2004093873A1 (en) 2003-04-17 2004-11-04 Janssen Pharmaceutica, N.V. 2-phenyl-benzimidazol and 2-phenyl-imidazo-`4,5!-pyridine derivatives as checkpoint kinase cds1 (chk2) inhibitors for the treatment of cancer
WO2004110998A1 (en) 2003-05-16 2004-12-23 Ambit Biosciences Corporation Pyrrole compounds and uses thereof
JP2007513090A (ja) 2003-11-18 2007-05-24 ユニバーシティ オブ テネシー リサーチ ファウンデーション チアゾリジノンアミド、チアゾリジンカルボン酸アミド、その製造方法、およびその使用方法
PA8619901A1 (es) 2003-12-12 2005-11-25 Wyeth Corp Quinolinas utiles en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares
CN1938023A (zh) 2004-03-08 2007-03-28 惠氏公司 离子通道调节剂
CA2584493A1 (en) * 2004-06-18 2006-01-05 Gpc Biotech, Inc. Kinase inhibitors for treating cancers
US7538113B2 (en) 2005-02-18 2009-05-26 Wyeth 4-substituted imidazo[4,5-c]pyridine antagonists of gonadotropin releasing hormone receptor
JP5007304B2 (ja) * 2005-06-22 2012-08-22 プレキシコン，インコーポレーテッド キナーゼ調節のための化合物および方法，およびその適応症
US7612212B2 (en) * 2006-02-22 2009-11-03 Hoffmann-La Roche Inc. Substituted hydantoins
EP2025347A4 (en) * 2006-05-15 2010-08-11 Takeda Pharmaceutical PROPHYLACTIC AND THERAPEUTIC AGENTS AGAINST CANCER
US7464893B2 (en) * 2006-06-30 2008-12-16 Per Spjut Method of using a cord holder
KR100932093B1 (ko) 2006-09-27 2009-12-16 주식회사종근당 미세소관 형성 저해제로서 유용한 벤조페논 유도체
US8822513B2 (en) * 2010-03-01 2014-09-02 Gtx, Inc. Compounds for treatment of cancer
DK3289876T3 (da) 2008-06-16 2022-10-10 Univ Tennessee Res Found Forbindelser til behandling af cancer
US9029408B2 (en) * 2008-06-16 2015-05-12 Gtx, Inc. Compounds for treatment of cancer
US9447049B2 (en) * 2010-03-01 2016-09-20 University Of Tennessee Research Foundation Compounds for treatment of cancer
WO2012027716A1 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Collabrx, Inc. Method to treat melanoma in braf inhibitor-resistant subjects
US9348332B2 (en) 2011-03-29 2016-05-24 Mitsubishi Electric Corporation Abnormality diagnosis device and abnormality diagnosis system for servo control device
MX351892B (es) 2011-04-01 2017-11-01 Genentech Inc Combinaciones de compuestos inhibidores de akt y abiraterona y metodos de uso.
WO2012136776A1 (en) 2011-04-07 2012-10-11 Bayer Intellectual Property Gmbh Imidazopyridazines as akt kinase inhibitors
WO2014138279A1 (en) * 2013-03-05 2014-09-12 University Of Tennessee Research Foundation Compounds for treatment of cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102655753A (zh) * 2009-10-16 2012-09-05 葛兰素史密丝克莱恩有限责任公司 组合药
CN102883607A (zh) * 2010-03-01 2013-01-16 Gtx公司 用于治疗癌的化合物

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anna Tesei et al..Low-dose taxotere enhances the ability of sorafenib to induce apoptosis in gastric cancer models.《J. Cell. Mol. Med.》.2011,第15卷(第2期),316-326. *
Jianjun Chen et al..Discovery of Novel 2‑Aryl-4-benzoyl-imidazole (ABI-III) Analogues Targeting Tubulin Polymerization As Antiproliferative Agents.《Journal of Medicinal Chemistry》.2012,第55卷(第16期),7285-7289. *
Low-dose taxotere enhances the ability of sorafenib to induce apoptosis in gastric cancer models;Anna Tesei et al.;《J. Cell. Mol. Med.》;20110201;第15卷(第2期);316-326 *
Nikolas K. Haass et al..TheMitogen-Activated Protein/Extracellular Signal-Regulated Kinase Kinase InhibitorAZD6244 (ARRY-142886) Induces Growth Arrest in Melanoma Cells and Tumor Regression When Combined with Docetaxel.《Clin Cancer Res》.2008,第14卷(第1期),230-239. *
Sapna P. Patel, MD et al..Clinical Responses to Selumetinib (AZD6244;ARRY-142886)-Based Combination Therapy Stratified by Gene Mutations in Patients With Metastatic Melanoma.《Cancer》.2012,第119卷(第4期),799-805. *
The Safety, Tolerability, Pharmacokinetics, and Pharmacodynamics of Single Oral Doses of RO5068760, an MEK Inhibitor, in Healthy Volunteers: Assessment of Target Suppression;Lucy Lee et al.;《J Clin Pharmacol》;20101231(第50期);1397-1405 *
TheMitogen-Activated Protein/Extracellular Signal-Regulated Kinase Kinase InhibitorAZD6244 (ARRY-142886) Induces Growth Arrest in Melanoma Cells and Tumor Regression When Combined with Docetaxel;Nikolas K. Haass et al.;《Clin Cancer Res》;20080101;第14卷(第1期);230-239 *
Therapeutic options in cutaneous melanoma: latest developments;245-251;《Therapeutic Advances in Medical Oncology》;20110901;第3卷(第5期);245-251 *

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Publication number Publication date
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IL241232B (en) 2021-02-28
KR102246652B1 (ko) 2021-04-29
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CA2904338A1 (en) 2014-09-12
KR20150123328A (ko) 2015-11-03
US10022356B2 (en) 2018-07-17
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EP2964028A1 (en) 2016-01-13
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US10525037B2 (en) 2020-01-07
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JP6835472B2 (ja) 2021-02-24
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