CN110072528B - ***的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于***的药物组合物，该药物组合物用于乐伐替尼和(6S,9aS)‑N‑苄基‑8‑({6‑[3‑(4‑乙基哌嗪‑1‑基)氮杂环丁烷‑1‑基]吡啶‑2‑基}甲基)‑6‑(2‑氟‑4‑羟基苄基)‑4,7‑二氧代‑2‑(丙‑2‑烯‑1‑基)六氢‑2H‑吡嗪并[2,1‑c][1,2,4]三嗪‑1(6H)‑甲酰胺的组合疗法中。

Description

***的药物组合物
技术领域
本发明涉及一种用于***的药物组合物，该药物组合物用于乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的组合疗法中。
背景技术
乐伐替尼是一种口服酪氨酸激酶抑制剂，具有血管生成抑制作用(专利文献1)，并靶向血管内皮生长因子受体(VEGFR)1至3、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1至4，转染期间重排(RET)、KIT和血小板源性生长因子受体(PDGFR)α(专利文献2至5)，并已知乐伐替尼为针对如甲状腺癌、肺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、肾细胞癌、神经胶质瘤、肝细胞癌和卵巢癌等各种肿瘤的治疗剂。乐伐替尼的化合物名称是4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-喹啉甲酰胺。
已知(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺(下文也被称为E7386)为具有Wnt通路调制作用的化合物(专利文献6)。
先前没有关于乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的组合疗法是否表现出任何抗肿瘤作用的报道。
总体而言，肿瘤治疗剂在单独使用时经常并非对所有患者都有效。因此，迄今为止已经进行了尝试来通过使用组合的多种肿瘤治疗剂并达到抗肿瘤作用的增强或不良反应的缓和提高治疗率(专利文献7至9)。
引证文献清单
专利文献
专利文献1：美国专利号7253286
专利文献2：美国专利申请公开号2004-253205
专利文献3：美国专利申请公开号2010-105031
专利文献4：美国专利申请公开号2009-209580
专利文献5：美国专利申请公开号2009-264464
专利文献6：美国专利号9174998
专利文献7：国际公开号WO2009/140549
专利文献8：美国专利申请公开号2004-259834
专利文献9：美国专利号6217866
发明内容
技术问题
在此类情况下，预期肿瘤治疗剂的新的组合疗法的进一步发展。
问题的解决方案
诸位发明人已经进行了努力的研究并因此通过发现乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的组合给予表现出意想不到的抗肿瘤作用而完成了本发明。
具体地，本发明提供以下[1]至[33]。
[1]一种药物组合物，该药物组合物包含(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺，其中(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺与乐伐替尼或其药学上可接受的盐联合给予。
[2]一种药物组合物，该药物组合物包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐，其中乐伐替尼或其药学上可接受的盐与(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺联合给予。
[3]一种用于***的药物组合物，该药物组合物包含(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺，其中(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺与乐伐替尼或其药学上可接受的盐联合给予。
[4]一种用于***的药物组合物，该药物组合物包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐，其中乐伐替尼或其药学上可接受的盐与(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺联合给予。
[5]一种肿瘤治疗剂，该肿瘤治疗剂包含(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺，其中(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺与乐伐替尼或其药学上可接受的盐联合给予。
[6]一种肿瘤治疗剂，该肿瘤治疗剂包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐，其中乐伐替尼或其药学上可接受的盐与(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺联合给予。
[7]一种用于***的方法，该方法包括向有需要的患者给予乐伐替尼或其药学上可接受的盐、和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺。
[8](6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺用于制造用于***的药物组合物的用途，其中(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺与乐伐替尼或其药学上可接受的盐联合给予。
[9]乐伐替尼或其药学上可接受的盐用于制造用于***的药物组合物的用途，其中乐伐替尼或其药学上可接受的盐与(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺联合给予。
[10]用于***的(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺，其中该(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺与乐伐替尼或其药学上可接受的盐联合给予。
[11]用于***的乐伐替尼或其药学上可接受的盐，其中该乐伐替尼或其药学上可接受的盐与(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺联合给予。
[12]一种试剂盒，该试剂盒包含含有乐伐替尼或其药学上可接受的盐的配制品、和含有(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的配制品。
[13]根据[12]所述的试剂盒，其中该试剂盒是用于***的试剂盒。
[14]一种药物组合物，该药物组合物包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐、和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺。
[15]一种用于***的药物组合物，该药物组合物包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐、和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺。
[16]一种肿瘤治疗剂，该肿瘤治疗剂包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐、和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺。
[17]乐伐替尼或其药学上可接受的盐、和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺，用于在***中使用。
[18](6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺，用于与乐伐替尼或其药学上可接受的盐联合进行的肿瘤治疗。
[19]乐伐替尼或其药学上可接受的盐，用于与(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺联合进行的肿瘤治疗。
[20]乐伐替尼或其药学上可接受的盐、和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺用于制造用于***的药物组合物的用途。
[21]该药物组合物或该肿瘤治疗剂，进一步包含赋形剂。
[22]该药物组合物、该肿瘤治疗剂、该治疗方法、该用途、该化合物或该试剂盒，其中该乐伐替尼或其药学上可接受的盐是乐伐替尼甲磺酸盐。
[23]该药物组合物、该肿瘤治疗剂、该治疗方法、该用途、该化合物或该试剂盒，其中该乐伐替尼或其药学上可接受的盐、和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺同时地、分开地、连续地、或按时间间隔给予。
[24]该药物组合物、该肿瘤治疗剂、该治疗方法、该用途、该化合物或该试剂盒，其中该肿瘤是乳腺癌、甲状腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、肾细胞癌、头颈癌、子宫内膜癌或黑色素瘤。
[25]根据[24]所述的药物组合物、肿瘤治疗剂、治疗方法、用途、化合物或试剂盒，其中该肿瘤是乳腺癌。
[26]根据[24]所述的药物组合物、肿瘤治疗剂、治疗方法、用途、化合物或试剂盒，其中该肿瘤是甲状腺癌。
[27]根据[26]所述的药物组合物、肿瘤治疗剂、治疗方法、用途、化合物或试剂盒，其中该甲状腺癌是甲状腺未分化癌。
[28]根据[24]所述的药物组合物、肿瘤治疗剂、治疗方法、用途、化合物或试剂盒，其中该肿瘤是肝细胞癌。
[29]根据[24]所述的药物组合物、肿瘤治疗剂、治疗方法、用途、化合物或试剂盒，其中该肿瘤是结直肠癌。
[30]根据[24]所述的药物组合物、肿瘤治疗剂、治疗方法、用途、化合物或试剂盒，其中该肿瘤是肾细胞癌。
[31]根据[24]所述的药物组合物、肿瘤治疗剂、治疗方法、用途、化合物或试剂盒，其中该肿瘤是头颈癌。
[32]根据[24]所述的药物组合物、肿瘤治疗剂、治疗方法、用途、化合物或试剂盒，其中该肿瘤是子宫内膜癌。
[33]根据[24]所述的药物组合物、肿瘤治疗剂、治疗方法、用途、化合物或试剂盒，其中该肿瘤是黑色素瘤。
发明的有利效果
本发明提供了一种用于***的药物组合物，该药物组合物用于乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的组合疗法中。该用于***的药物组合物对于有需要的患者表现出意想不到的抗肿瘤作用。
附图说明
[图1]是显示在转基因小鼠(MMTV-Wnt-1)自发性乳腺癌的连续移植模型中组合使用12.5mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，*和***显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，***：p＜0.001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’stype multiple comparison))。
[图2]是显示在转基因小鼠(MMTV-Wnt-1)自发性乳腺癌的连续移植模型中组合使用25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s typemultiple comparison))。
[图3]是显示在转基因小鼠(MMTV-Wnt-1)自发性乳腺癌的连续移植模型中组合使用50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，***和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(***：p＜0.001，****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[图4]是显示在小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，*和**显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，**：p＜0.01；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
[图5]是显示在人乳腺癌MDA-MB-231移植模型中组合使用25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，*和***显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，***：p＜0.001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
[图6]是显示在人黑色素瘤细胞系SEKI移植模型中组合使用12.5mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，*和**显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，**：p＜0.01；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
[图7]是显示在人黑色素瘤细胞系SEKI移植模型中组合使用25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，*和***显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，***：p＜0.001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s typemultiple comparison))。
[图8]是显示在人甲状腺未分化癌细胞系HTC/C3移植模型中组合使用12.5mg/kgE7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，**和***显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(**：p＜0.01，***：p＜0.001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s typemultiple comparison))。
[图9]是显示在人甲状腺未分化癌细胞系HTC/C3移植模型中组合使用25mg/kgE7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，***和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(***：p＜0.001，****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’stype multiple comparison))。
[图10]是显示在人甲状腺未分化癌细胞系HTC/C3移植模型中组合使用50mg/kgE7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，**和***显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(**：p＜0.01，***：p＜0.001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s typemultiple comparison))。
[图11]是显示在人肝细胞癌系SNU398移植模型中组合使用12.5mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，*和**显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，**：p＜0.01；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
[图12]是显示在人肝细胞癌系SNU398移植模型中组合使用25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，**显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(**：p＜0.01；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[图13]是显示在人肝细胞癌系SNU398移植模型中组合使用50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
[图14]是显示在人肝细胞癌系HepG2移植模型中组合使用50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，**和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(**：p＜0.01，****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
[图15]是显示在人结直肠癌系Colo-205移植模型中组合使用50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，**和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(**：p＜0.01，****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s typemultiple comparison))。
[图16]是显示在人肾细胞癌系A-498皮下移植模型中组合使用50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用的图。在该图中，****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
[图17]是显示在通过免疫染色(其中进行了CD31/α-SMA共染色)的小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的微血管抑制作用的10×放大照片。图17(a)是对照组的照片，图17(b)是单独给予E7386(25mg/kg)组的照片，图17(c)是单独给予乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg)组的照片，以及图17(d)是E7386(25mg/kg)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg)组合给予组的照片。
[图18]是显示在通过免疫染色(其中进行了CD31/α-SMA共染色)的小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的周细胞覆盖(血管周细胞对血管的覆盖)抑制作用的200×放大照片。图18(a)是对照组的照片，图18(b)是单独给予E7386(25mg/kg)组的照片，图18(c)是单独给予乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg)组的照片，以及图18(d)是E7386(25mg/kg)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg)组合给予组的照片。用黑色箭头指示用CD31染色的微血管。用空心箭头指示CD31/α-SMA均为阳性的血管。
[图19]是显示在小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的微血管抑制作用的图。在该图中，*和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制微血管(*：p＜0.05，****：p＜0.0001；邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[图20]是显示在小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的周细胞覆盖(血管周细胞对血管的覆盖)抑制作用的图。在该图中，*和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制周细胞覆盖(*：p＜0.05，****：p＜0.0001；邓尼特多重比较(Dunnett’s typemultiple comparison))。
[图21]是显示在人肝细胞癌HepG2皮下移植模型中组合使用50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的微血管抑制作用的图。在该图中，**和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制微血管(**：p＜0.01，****：p＜0.0001；邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[图22]是显示在人肝细胞癌HepG2皮下移植模型中组合使用50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐的周细胞覆盖(血管周细胞对血管的覆盖)抑制作用的图。在该图中，****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制周细胞覆盖(****：p＜0.0001；邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
具体实施方式
下面描述了本发明的实施例。以下的实施例是仅用于说明本发明的实例，并不旨在将本发明仅限定于这些实施例。本发明可以在不脱离本发明的主题的情况下以各种模型实施。
注意，将在本说明书中引用的文件、出版物、专利出版物、和其他专利文献通过引用结合在此。
乐伐替尼是指4-(3-氯-4-(环丙基氨基羰基)氨基苯氧基)-7-甲氧基-6-喹啉甲酰胺，并且其结构式显示于下式：
Figure BDA0002093177620000121
乐伐替尼或其药学上可接受的盐可以通过在专利文献1中描述的方法产生。乐伐替尼的药学上可接受的盐的一个实例是乐伐替尼甲磺酸盐。乐伐替尼甲磺酸盐也被称为E7080或乐卫玛(R)(Lenvima(R))。
(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的结构式显示于下式。
Figure BDA0002093177620000131
可以通过专利文献6中描述的方法产生(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺。(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺也被称为E7386。
尽管“药理学上可接受的盐”不限于盐的具体类型，其实例包括无机酸的盐、有机酸的盐、无机碱的盐、有机碱的盐、以及酸性或碱性氨基酸的盐。
无机酸的盐的实例包括盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐和磷酸盐。有机酸的盐的实例包括乙酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、硬脂酸盐、苯甲酸盐、甲基磺酸(甲磺酸)盐、乙基磺酸盐、对甲苯磺酸盐。
无机碱的盐的实例包括碱金属盐，例如钠盐和钾盐；碱土金属盐，例如钙盐和镁盐；铝盐和铵盐。有机碱的盐的实例包括二乙胺盐、二乙醇胺盐、葡甲胺盐、和N，N-二苄基乙二胺盐。
酸性氨基酸的盐的实例包括天冬氨酸盐和谷氨酸盐。碱性氨基酸的盐的实例包括精氨酸盐、赖氨酸盐、和鸟氨酸盐。
乐伐替尼的药理学上可接受的盐的实例包括有机酸盐，并且其一个实施例是甲基磺酸盐(methanesulfonate)(甲磺酸盐(mesylate))。
当在本发明的乐伐替尼或(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的溶剂化物和旋光异构体存在的情况下，这些溶剂化物和旋光异构体包括于其中。溶剂化物的实例包括水合物和脱水物。溶剂化物的实例包括水、醇(例如，甲醇、乙醇和正丙醇)、以及二甲基甲酰胺。
此外，本发明的乐伐替尼或(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺可以是结晶的或非晶形的。当多态性晶体存在的情况下，可以使用单晶型或任何这些晶型的混合物。
取决于症状的程度、不良反应的发展、年龄、性别、体重、以及患者的敏感性差异、给予途径、给予时间、给予间隔、药物配制品的类型等，可以适当地选择乐伐替尼或其药理学上可接受的盐的剂量。
乐伐替尼或其药理学上可接受的盐的剂量不受具体限制，但是当口服给予至成人(体重：60kg)或儿童时，通常是每天0.1mg至500mg、0.5mg至300mg、或1mg至100mg、或是每天0.1mg/m2至500mg/m2(体表面积，下文相同)、0.5mg/m2至300mg/m2、或1.0mg/m2至100mg/m2。该剂量通常可以一天给予一次、或一天给予二至三次。如果患者经受过度的毒性，有必要减少剂量。除了本发明的组合疗法之外，当使用一种或多种另外的化学治疗剂时，可以改变剂量和剂量方案。剂量方案可以由正在治疗具体患者的医师确定。
(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的剂量和剂量方案可以根据患者的具体疾病症状和总体症状而改变。取决于年龄、性别、症状、不良反应的发展等，可以适当地减少剂量。
(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的剂量不受具体限制，但在口服给予至成人(体重：60kg)或儿童的情况下，通常是每天0.1至5000mg、0.5至3000mg、或1.0至1000mg。通常可以每天或每几天以一个部分或二到六个分部分进行给予。当使用一种或多种另外的化学治疗剂时，可以改变剂量和剂量方案。剂量方案可以由正在治疗具体患者的医师确定。
在本发明的组合给予中的乐伐替尼或(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的剂量通常可以设定为等于或低于当它们单独给予时的剂量。考虑到年龄、性别和患者的症状、不良反应的发展等，适当地确定具体的剂量、给予途径、给予频率、给予周期等。
根据本发明的乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的给予模式不受具体限制，并且乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺可以在给予时以组合的形式进行给予。例如，将乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺同时地、单独地、连续地、或按时间间隔给予至患者。因此，术语“同时地”意指将这些成分各自以相同的时期或精确地在相同的时间给予，或者通过相同的途径给予。术语“单独地”意指将这些成分各自以不同的间隔或用不同的频率给予、或者通过不同的途径给予。术语“连续地”意指将这些成分各自通过相同的或不同的途径以任意的顺序在预定的时期内给予。术语“按时间间隔”意指将这些成分各自通过相同的或不同的途径按各自成分的间隔给予。在乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的组合给予中，当在以上描述的(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的给予的一个周期期间或在重复该周期的时间段期间给予乐伐替尼时，确定组合给予乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺。在用于本发明的组合给予的一种给予模式中，口服给予乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺。此外，本发明的组合给予可以与除了乐伐替尼和(6S，9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4，7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2，1-c][1，2，4]三嗪-1(6H)-甲酰胺以外的肿瘤治疗剂的给予一起同时地、单独地、连续地、或按时间间隔进行。
本发明的用于***的药物组合物可以通过描述于例如the JapanesePharmacopoeia 16th edition(JP)[《日本药典》第16版(JP)]、the United Statespharmacopoeia(USP)[美国药典(USP)]、或the European pharmacopoeia(EP)[欧洲药典(EP)]中的方法来配制。
本发明中，靶向的肿瘤具体为例如乳腺癌、甲状腺癌、肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、肾细胞癌(RCC)、头颈癌、子宫内膜癌或黑色素瘤，但不具体限于这些。在本发明的一个方面中，靶向的肿瘤是甲状腺癌。而且，在本发明的一个方面中，靶向的甲状腺癌是甲状腺未分化癌(ATC)。在本发明的另一个方面中，靶向的肿瘤是肝细胞癌。
实例
下面提供了本发明的具体实例；然而，本发明并不局限于此。
[实例1]在转基因小鼠(MMTV-Wnt-1)自发性乳腺癌的连续移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
收集导致在乳腺上皮细胞中局部表达Wnt-1的转基因小鼠(MMTV-Wnt-1，杰克逊实验室(The Jackson Laboratory))的自发性乳腺癌，通过使用套管针移植到背景品系的小鼠中(C57BL/6J，日本查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories Japan，Inc.)，并传代。这样移植和传代的肿瘤在达到约1.5g时被切除，并制备成约30mg的小块，将该小块皮下移植到对照组、单独给予E7386 12.5、25或50mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及12.5、25或50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的五只小鼠(C57BL/6J)的身体侧面。在确认肿瘤移植后，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(12.5、25或50mg/kg，b.d.s.，14天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，14天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。向对照组给予0.1mol/L盐酸(b.d.s.，14天)。
当给予开始日定义为第1天时，然后使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))在第4天、第8天、第11天和第15天测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
关于RTV的结果显示于表1和图1、图2和图3中。表1中的数字表示RTV的平均±标准偏差(SD)。结果是，在转基因小鼠(MMTV-Wnt-1)自发性乳腺癌的连续移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的抗肿瘤作用。图1、2和3中的*、***和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，***：p＜0.001，****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[表1]
Figure BDA0002093177620000181
[实例2]在小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养小鼠乳腺癌4T1细胞(ATCC)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过添加汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution)制备悬浮液，以便成为1.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液移植到对照组、单独给予E7386 25mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的五只小鼠(C57BL/6J，日本查尔斯河实验室公司(Charles River LaboratoriesJapan，Inc.))的右侧第三个乳腺脂肪垫中。从移植后第9天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(25mg/kg，b.d.s.，14天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，14天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。对照组不给予任何药物。
当给予开始日定义为第1天时，然后使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))在第3天、第6天、第9天和第14天测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
关于RTV的结果显示于表2和图4中。表2中的数字表示RTV的平均±标准偏差(SD)。结果是，在小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的抗肿瘤作用。图4中的*和**显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，**：p＜0.01；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[表2]
Figure BDA0002093177620000191
[实例3]在人乳腺癌MDA-MB-231移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人乳腺癌MDA-MB-231细胞(ATCC)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加含有50％的人工基膜(Matrigel)的汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balanced saltsolution)制备悬浮液，以便成为10.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386 25mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的五只裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories Japan，Inc.))的身体侧面。从移植后第6天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(25mg/kg，b.d.s.，10天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，10天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。对照组不给予任何药物。
当给予开始日定义为第1天时，然后使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))在第4天、第7天和第10天测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
关于RTV的结果显示于表3和图5中。表3中的数字表示RTV的平均±标准偏差(SD)。结果是，在人乳腺癌MDA-MB-231移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的抗肿瘤作用。图5中的*和***显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，***：p＜0.001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple com3arison))。
[表3]
Figure BDA0002093177620000211
[实例4]在人黑色素瘤细胞系SEKI移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人黑色素瘤细胞系SEKI(JCRB细胞库)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加含有50％的人工基膜(Matrigel)的汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balanced saltsolution)制备悬浮液，以便成为5.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386 12.5或25mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及12.5或25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的六只裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles River LaboratoriesJapan，Inc.))的身体侧面。从移植后第13天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(12.5或25mg/kg，b.d.s.，14天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，14天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。向对照组给予0.1mol/L盐酸(b.d.s.，14天)。
当给予开始日定义为第1天时，然后使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))在第4天、第8天、第11天和第15天测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
关于RTV的结果显示于表4和图6和图7中。表4中的数字表示RTV的平均±标准偏差(SD)。结果是，在人黑色素瘤细胞系SEKI移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的抗肿瘤作用。图6和7中的*、**和***显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，**：p＜0.01，***：p＜0.001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
[表4]
Figure BDA0002093177620000221
[实例5]在人甲状腺未分化癌细胞系HTC/C3移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的D-MEM高葡萄糖培养基(瓦科纯化工有限公司(Wako PureChemical Industries，Ltd.))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人甲状腺未分化癌细胞系HTC/C3(JCBR细胞库)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加含有50％的人工基膜(Matrigel)的汉克斯平衡盐溶液(Hank’sbalanced salt solution)制备悬浮液，以便成为1.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386 12.5、25或50mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及12.5、25或50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的五只裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles RiverLaboratories Japan，Inc.))的身体侧面。从移植后第11天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(12.5、25或50mg/kg，b.d.s.，14天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，14天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。向对照组给予0.1mol/L盐酸(b.d.s.，14天)。
当给予开始日定义为第1天时，然后使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))在第4天、第8天、第11天和第15天测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
关于RTV的结果显示于表5和图8、图9和图10中。表5中的数字表示RTV的平均±标准偏差(SD)。结果是，在人甲状腺未分化癌细胞系HTC/C3移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的抗肿瘤作用。图8、9和10中的**、***和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(**：p＜0.01，***：p＜0.001，****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[表5]
Figure BDA0002093177620000241
[实例6]在人肝细胞癌SNU398移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人肝细胞癌SNU398(ATCC)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加含有50％的人工基膜(Matrigel)的汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balanced saltsolution)制备悬浮液，以便成为5.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐组、以及组合给予组E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的每个组的裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories Japan，Inc.))的身体侧面。在肿瘤发生后，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(口服给予)。
从给予开始日开始，通过使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))定期测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。根据关于RTV的结果，可以评估组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
[实例6-1]在人肝细胞癌系SNU398移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(瓦科纯化工有限公司(Wako PureChemical Industries，Ltd.))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人肝细胞癌系SNU398细胞(ATCC)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加含有50％的人工基膜(Matrigel)的汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balancedsalt solution)制备悬浮液，以便成为5.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386 50mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及12.5、25或50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的八只裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles River LaboratoriesJapan，Inc.))的身体侧面。从移植后第9天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(12.5、25或50mg/kg，b.d.s.，14天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，14天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。对照组不给予任何药物。
当给予开始日定义为第1天时，然后使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))在第6天、第9天、第12天和第15天测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
关于RTV的结果显示于表6和图11、图12和图13中。表6中的数字表示RTV的平均±标准偏差(SD)。结果是，在人肝细胞癌系SNU398移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的抗肿瘤作用。图11、12和13中的*、**和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(*：p＜0.05，**：p＜0.01，****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s typemultiple comparison))。
[表6]
Figure BDA0002093177620000261
[实例7]在人肝细胞癌系HepG2皮下移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的DMEM低葡萄糖培养基(瓦科纯化工有限公司(Wako PureChemical Industries，Ltd.))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人肝细胞癌系HepG2细胞(JCRB细胞库)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加含有50％的基质凝胶的磷酸盐缓冲盐水制备悬浮液，使其为10.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386 50mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的五只裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories Japan，Inc.))的身体侧面。从移植后第12天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(50mg/kg，b.d.s.，14天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，14天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。对照组不给予任何药物。
当给予开始日定义为第1天时，然后使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))在第4天、第7天、第9天、第13天和第15天测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
关于RTV的结果显示于表7和图14中。表7中的数字表示RTV的平均±标准偏差(SD)。结果是，在人肝细胞癌系HepG2移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的抗肿瘤作用。图14中的**和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(**：p＜0.01，****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[表7]
Figure BDA0002093177620000281
[实例8]在人结直肠癌系Colo-205移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(瓦科纯化工有限公司(Wako PureChemical Industries，Ltd.))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人结直肠癌系Colo-205细胞(ATCC)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution)制备悬浮液，以便成为5.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386 50mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的五只裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories Japan，Inc.))的身体侧面。从移植后第8天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(50mg/kg，q.d.，11天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，11天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。对照组不给予任何药物。
当给予开始日定义为第1天时，然后使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))在第4天、第8天和第12天测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
关于RTV的结果显示于表8和图15中。表8中的数字表示RTV的平均±标准偏差(SD)。结果是，在人结直肠癌系Colo-205移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的抗肿瘤作用。图15中的**和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(**：p＜0.01，****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[表8]
Figure BDA0002093177620000291
[实例9]在人肾细胞癌系A-498皮下移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(瓦科纯化工有限公司(Wako PureChemical Industries，Ltd.))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人肾细胞癌系A-498细胞(ATCC)。当细胞达到约100％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加含有50％的基质凝胶的RPMI1640培养基制备悬浮液，使其为5.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386 50mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的六只裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles RiverLaboratories Japan，Inc.))的身体侧面。从移植后第27天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(50mg/kg，q.d.，14天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，14天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。对照组不给予任何药物。
当给予开始日定义为第1天时，然后使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))在第5天、第8天、第12天和第15天测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
关于RTV的结果显示于表9和图16中。表9中的数字表示RTV的平均±标准偏差(SD)。结果是，在人肾细胞癌系A-498皮下移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的抗肿瘤作用。图16中的****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制肿瘤生长(****：p＜0.0001；重复测量ANOVA，然后进行邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
[表9]
Figure BDA0002093177620000301
[实例10]在人头颈癌SCC15移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人头颈癌SCC15细胞(ATCC)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加含有50％的人工基膜(Matrigel)的汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balanced saltsolution)制备悬浮液，以便成为5.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐组、以及E7386和乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories Japan，Inc.))的身体侧面。在肿瘤发生后，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(口服给予)。
从给予开始日开始，通过使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))定期测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。根据关于RTV的结果，可以评估组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
[实例11]在人子宫内膜癌HEC-151移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养人子宫内膜癌HEC-151细胞(JCRB细胞库)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过向细胞中添加含有50％的人工基膜(Matrigel)的汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balancedsalt solution)制备悬浮液，以便成为5.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐组、以及E7386和乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles River Laboratories Japan，Inc.))的身体侧面。在肿瘤发生后，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(口服给予)。
从给予开始日开始，通过使用数显卡尺(Digimatic Caliper)(三丰株式会社(Mitutoyo Corp.))定期测量每只小鼠中发展的肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。根据关于RTV的结果，可以评估组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的抗肿瘤作用。
根据以下表达式计算肿瘤体积和相对肿瘤体积(RTV)。
肿瘤体积(mm3)＝肿瘤长轴(mm)×肿瘤短轴2(mm2)/2
相对肿瘤体积(RTV)＝测量日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积
[实例12]在小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的肿瘤血管抑制作用
通过使用含有10％FBS的RPMI1640培养基(西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC))在5％CO2培养箱中在37℃的条件下培养小鼠乳腺癌4T1细胞(ATCC)。当细胞达到约80％融合状态时，通过使用胰蛋白酶-EDTA回收细胞。通过添加汉克斯平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution)制备悬浮液，以便成为1.0×107个细胞/mL。将0.1mL获得的细胞悬浮液移植到对照组、单独给予E7386 25mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及25mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的五只小鼠(C57BL/6J，日本查尔斯河实验室公司(Charles River LaboratoriesJapan，Inc.))的右侧第三个乳腺脂肪垫中。从移植后第9天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(25mg/kg，b.d.s.，14天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，14天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。对照组不给予任何药物。
在给予14天后，从小鼠中收集肿瘤组织，对这些肿瘤组织进行***固定，并将这些肿瘤组织包埋在石蜡中。然后，将石蜡包埋的肿瘤组织以4μm的厚度切片并置于载玻片上，并用二甲苯/乙醇进行去石蜡化处理。通过使用针对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的抗体(由西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC)制造)(其为一种血管周细胞的标记物)和针对CD31的抗体(由Dianova股份有限公司(Dianova GmbH)制造)(其为一种血管内皮细胞标记物)进行免疫染色。
将CD31/α-SMA共染色的制备物在载玻片扫描仪(Aperio，徕卡生物***股份有限公司(Leica Biosystems Nussloch GmbH))中转化为数字图像，并且对微血管密度(MVD)进行测量并通过使用图像分析软件(Aperio ImageScope版本12.3.0.5056，徕卡生物***股份有限公司(Leica Biosystems Nussloch GmbH))分析为整个肿瘤中每单位面积(1mm2)CD31阳性血管的量。
图17中显示了10×放大的免疫染色图像(彩色照片，由棕色(CD31)和红色(α-SMA)指示)，其中进行了CD31/α-SMA共染色。图17(a)、17(b)、17(c)和17(d)分别是对照组、单独给予E7386组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐组、以及E7386和乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的免疫染色图像。结果是，对于组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐，与对照组和单独给予它们的情况相比，观察到MVD显著降低。
在200×放大图像上，确定每个肿瘤切片的具有高微血管密度的五个0.2mm×0.2mm正方形区域作为血管特性分析的热点。在用于分析的热点中测量并通过使用图像分析软件(Aperio ImageScope版本12.3.0.5056，徕卡生物***股份有限公司(LeicaBiosystems Nussloch GmbH))分析PCI(周细胞覆盖指数)，即CD31/α-SMA均为阳性的血管的量相对于CD31阳性血管的量。PCI表示血管周细胞覆盖的血管与所有血管的比率。用于分析的五个热点的平均PCI被认为是肿瘤切片的典型值。
图18中显示了200×放大的免疫染色图像(彩色照片，由棕色(CD31)和红色(α-SMA)指示)，其中进行了CD31/α-SMA共染色。图18(a)、18(b)、18(c)和18(d)分别是对照组、单独给予E7386组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐组、以及E7386和乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的免疫染色图像。用黑色箭头指示用CD31染色的微血管。用空心箭头指示CD31/α-SMA均为阳性的血管。结果是，对于组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐，与对照组和单独给予它们的情况相比，观察到PCI显著降低。
关于MVD的结果显示于图19中。该图显示每个给予组的五个肿瘤切片的平均值，并且误差条显示标准偏差。在小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的微血管抑制作用。图19中的*和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制微血管(*：p＜0.05，****：p＜0.0001；邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
关于PCI的结果显示于图20中。该图显示每个给予组的五个肿瘤切片的平均值，并且误差条显示标准偏差。在小鼠乳腺癌4T1原位移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的周细胞覆盖(血管周细胞对血管的覆盖)抑制作用。图20中的*和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制周细胞覆盖(*：p＜0.05，****：p＜0.0001；邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。
[实例13]在人肝细胞癌HepG2皮下移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐的肿瘤血管抑制作用
将如上述实例7中描述的通过使用人肝细胞癌系HepG2细胞(JCRB细胞库)制备的0.1mL的细胞悬浮液皮下移植到对照组、单独给予E7386 50mg/kg组、单独给予乐伐替尼甲磺酸盐10mg/kg组、以及50mg/kg E7386和10mg/kg乐伐替尼甲磺酸盐组合给予组的每个组的五只裸鼠(CAnN.Cg-Foxn1nu/CrlCrlj，日本查尔斯河实验室公司(Charles RiverLaboratories Japan，Inc.))的身体侧面。从移植后第12天开始，向单独给予组或组合给予组单独或组合给予E7386(50mg/kg，q.d.，14天，口服给予)和乐伐替尼甲磺酸盐(10mg/kg，q.d.，14天，口服给予)。给予时，将E7386溶于0.1mol/L盐酸中，并将乐伐替尼甲磺酸盐溶于3mmol/L盐酸中。对照组不给予任何药物。
在给予14天后，将从小鼠中收集的肿瘤组织分开并用作肿瘤样品用于血管分析。对分开的肿瘤组织进行***固定并包埋在石蜡中。然后，将石蜡包埋的肿瘤组织以4μm的厚度切片并置于载玻片上，并用二甲苯/乙醇进行去石蜡化处理。通过使用针对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的抗体(由西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.LLC)制造)(其为一种血管周细胞的标记物)和针对CD31的抗体(由Dianova股份有限公司(DianovaGmbH)制造)(其为一种血管内皮细胞标记物)进行免疫染色。
将CD31/α-SMA共染色的制备物在载玻片扫描仪(Aperio，徕卡生物***股份有限公司(Leica Biosystems Nussloch GmbH))中转化为数字图像，并且对微血管密度(MVD)进行测量并通过使用图像分析软件(HALO v2.0.1145.38)分析为整个肿瘤中每单位面积(1mm2)CD31阳性血管的量。结果是，对于组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐，与对照组和单独给予它们的情况相比，观察到MVD显著降低。
在200×放大图像上，确定每个肿瘤切片的具有高微血管密度的六个0.5mm×0.5mm正方形区域作为血管特性分析的热点。在用于分析的热点中测量并通过使用图像分析软件(HALO v2.0.1145.38)分析PCI(周细胞覆盖指数)，即CD31/α-SMA均为阳性的血管的量相对于CD31阳性血管的量。PCI表示血管周细胞覆盖的血管与所有血管的比率(％)。用于分析的六个热点的平均PCI被认为是肿瘤切片的典型值。结果是，单独给予乐伐替尼甲磺酸盐显著增加PCI，而组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐可以抑制PCI增加至与对照组相当的水平。
关于MVD的结果显示于图21中。通过测量每个给予组的五个肿瘤切片的平均值制备该图，并且然后用对照组的值作为参考值计算比率(％)。误差条显示标准偏差。在人肝细胞癌HepG2皮下移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的微血管抑制作用。图21中的**和****显示组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予它们的情况相比在统计学上显著抑制微血管(**：p＜0.01，****：p＜0.0001；邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiple comparison))。
关于PCI的结果显示于图22中。该图显示每个给予组的五个肿瘤切片的PCI平均值，并且误差条显示标准偏差。在人肝细胞癌HepG2皮下移植模型中组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐表现出优异的周细胞覆盖(血管周细胞对血管的覆盖)抑制作用。图22中的****显示单独给予乐伐替尼甲磺酸盐与对照组相比在统计学上显著增加了周细胞覆盖，并且组合使用E7386和乐伐替尼甲磺酸盐与单独给予乐伐替尼甲磺酸盐的情况相比在统计学上显著抑制周细胞覆盖(****：p＜0.001；邓尼特多重比较(Dunnett’s type multiplecomparison))。

Claims (25)

1.乐伐替尼或其药学上可接受的盐与(6S,9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4,7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2,1-c][1,2,4]三嗪-1(6H)-甲酰胺的组合在制造用于***的药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其中该乐伐替尼或其药学上可接受的盐是乐伐替尼甲磺酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的用途，该药物进一步包含赋形剂。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中该乐伐替尼或其药学上可接受的盐、和该(6S,9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4,7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2,1-c][1,2,4]三嗪-1(6H)-甲酰胺同时地、分开地、连续地、或按时间间隔给予。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其中该肿瘤是乳腺癌、甲状腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、肾细胞癌、头颈癌、子宫内膜癌或黑色素瘤。
6.根据权利要求5所述的用途，其中该肿瘤是乳腺癌。
7.根据权利要求5所述的用途，其中该肿瘤是甲状腺癌。
8.根据权利要求7所述的用途，其中该甲状腺癌是甲状腺未分化癌。
9.根据权利要求5所述的用途，其中该肿瘤是肝细胞癌。
10.根据权利要求5所述的用途，其中该肿瘤是结直肠癌。
11.根据权利要求5所述的用途，其中该肿瘤是肾细胞癌。
12.根据权利要求5所述的用途，其中该肿瘤是头颈癌。
13.根据权利要求5所述的用途，其中该肿瘤是子宫内膜癌。
14.根据权利要求5所述的用途，其中该肿瘤是黑色素瘤。
15.根据权利要求4所述的用途，其中该肿瘤是乳腺癌、甲状腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、肾细胞癌、头颈癌、子宫内膜癌或黑色素瘤。
16.根据权利要求15所述的用途，其中该肿瘤是乳腺癌。
17.根据权利要求15所述的用途，其中该肿瘤是甲状腺癌。
18.根据权利要求17所述的用途，其中该甲状腺癌是甲状腺未分化癌。
19.根据权利要求15所述的用途，其中该肿瘤是肝细胞癌。
20.根据权利要求15所述的用途，其中该肿瘤是结直肠癌。
21.根据权利要求15所述的用途，其中该肿瘤是肾细胞癌。
22.根据权利要求15所述的用途，其中该肿瘤是头颈癌。
23.根据权利要求15所述的用途，其中该肿瘤是子宫内膜癌。
24.根据权利要求15所述的用途，其中该肿瘤是黑色素瘤。
25.一种用于***的药物组合物，该药物组合物包含乐伐替尼或其药学上可接受的盐、和(6S,9aS)-N-苄基-8-({6-[3-(4-乙基哌嗪-1-基)氮杂环丁烷-1-基]吡啶-2-基}甲基)-6-(2-氟-4-羟基苄基)-4,7-二氧代-2-(丙-2-烯-1-基)六氢-2H-吡嗪并[2,1-c][1,2,4]三嗪-1(6H)-甲酰胺。
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