CN105131112A - 治疗用dll4结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

描述了改进的DLL4结合蛋白，即治疗用DLL4结合蛋白，其包括抗体、CDR-嫁接的抗体、人抗体及其DLL4结合片段、具有高亲和力的结合DLL4的蛋白以及中和DLL4活性的DLL4结合蛋白。所述DLL4结合蛋白用于治疗或预防癌症和肿瘤以及特别用于治疗或预防肿瘤血管发生和/或其他血管发生依赖性疾病例如眼部新生血管化或血管发生非依赖性疾病(其特征在于异常DLL4表达或活性)例如自身免疫病其包括多发性硬化症。

Description

治疗用DLL4结合蛋白
本申请是申请日为2010年8月27日的中国专利申请201080049088.6“治疗用DLL4结合蛋白”的分案申请。
与相关申请的参考
本申请要求2009年8月29日提交的美国临时申请号61/238,152和2009年11月16日提交的美国临时申请号61/261,728的优先权。
技术领域
本发明涉及改进的DLL4结合蛋白的开发和用途及其在抑制、预防和/或治疗癌症、肿瘤和/或其他血管发生依赖性疾病例如眼部新生血管化，或血管发生非依赖性疾病(其特征在于异常DLL4表达或活性)例如自身免疫病中的用途。
背景技术
细胞与细胞之间的通讯是许多生物过程例如分化、增殖和动态平衡所需的。由真核生物广泛使用的一个***是Notch信号通路。这一途径，尤其是Notch受体，对于功能肿瘤血管发生也是关键的。因此，抑制对Notch受体的功能，阻止Notch受体和/或阻止Notch信号通路是抗癌组合物和治疗的潜在策略。Notch受体的小分子抑制剂已证明是有毒的，因为它们抑制Notch受体在全身的野生型(正常)组织的表达。因此，Notch信号通路的不同成员应被视为疗法的潜在靶向。
Notch受体的血管配体是Delta4或Delta样4(DLL4)。DLL4大部分表达在血管中，对血管发育是关键的(Yan等人，Clin.CancerRes.，13(24)：7243-7246(2007)；Shutter等人，GenesDev.，14(11)：1313-1318(2000)；Gale等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101(45)：15949-15954(2004)；Krebs等人，GenesDev.，14(11)：1343-1352(2000))。DLL4杂合小鼠是胚胎致死的，原因在于血管发育的主要缺陷(Gale等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101(45)：15949-15954(2004)；Duarte等人，GenesDev.，18(20)：2474-2478(2004)；Krebs等人，GenesDev.，18(20)：2469-2473(2004))。DLL4的表达被VEGF诱导(Liu等人，Mol.CellBiol.，23(1)：14-25(2003)；Lobov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，104(9)：3219-3224(2007))。反过来，DLL4可负调节VEGF信号通路，部分通过抑制VEGFR2和诱导VEGR1(Harrington等人，Microvasc.Res.，75(2)：144-154(2008)；Suchting等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，104(9)：3225-3230(2007))。DLL4和VEGF之间的精妙配合对功能性血管发生是必需的。
除了它的生理学功能，DLL4在肿瘤血管中被上调(Gale等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，101(45)：15949-15954(2004)；Mailhos等人，Differentiation，69(2-3)：135-144(2001)；Patel等人，CancerRes.，65(19)：8690-8697(2005)；Patel等人，Clin.CancerRes.，12(16)：4836-4844(2006)；Noguera-Troise等人，Nature，444(7122)：1032-1037(2006))。DLL4的阻止有效地在多种模型中抑制原发性肿瘤生长(Noguera-Troise等人，Nature，444(7122)：1032-1037(2006)；Ridgway等人，Nature，444(7122)：1083-1087(2006)；Scehnet等人，Blood，109(11)：4753-4760(2007))。DLL4抑制甚至针对对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤有效。DLL4和VEGF的组合抑制提供了增强的抗肿瘤活性。有趣的是，不像VEGF的抑制减少肿瘤血管形成，DLL4阻止(blockade)导致肿瘤血管密度的增加，其中所述血管是异常的，不能支持有效的血液输送并且不起有效作用。因此，DLL4为治疗癌症提供了潜在靶向。
在本领域中存在这样的需要，即能够靶向DLL4-Notch通路并且从而抑制、或甚至预防肿瘤血管发生和生长的治疗剂。
发明内容
本发明提供结合DLL4的蛋白质，其包括抗体、CDR-嫁接的抗体和其能够结合DLL4的结合片段。优选地，本文所述的结合蛋白以高亲和力结合DLL4。更优选地，根据本发明的结合蛋白能够中和DLL4。本发明还提供制备和使用DLL4结合蛋白，包括人DLL4结合蛋白的方法。有利地，本发明消除了对制备人源化DLL4结合蛋白的需要，从而消除了与人源化DLL4结合蛋白的并发症。
本发明的一方面涉及包括能够结合人DLL4的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括选自下述的至少一个或多个CDR：
CDR-H1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQIDNO：99)，其中；
X1是S或N；
X2是S、G或N；
X3是S、N、T、G或R；
X4是Y；
X5是Y或H；
X6是W；和
X7是G；
CDR-H2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16(SEQIDNO：100)，其中；
X1是D；
X2是I；
X3是Y、N或S；
X4是Y；
X5是T、N、A、I、S或R；
X6是G；
X7是S、N、T或G；
X8是T；
X9是Y；
X10是Y；
X11是N；
X12是P；
X13是S；
X14是L；
X15是K；和
X16是S、N、D或G；
CDR-H3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQIDNO：101)，其中；
X1是E、Y、F、Q、W、L或A；
X2是D、A、S、G、V、E或N；
X3是V、M、L、P或A；
X4是I、A、P、R、S、K、Q、V、G、M或E；
X5是L、Y、F或M；
X6是R、G、S、Q或A；
X7是G；
X8是G、A或S；
X9是S、A、L、V、R或G；
X10是D；和
X11是Y、D、S、N、H、E、R、L、P、C、I、M、T、Q或K；
CDR-L1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQIDNO：102)，其中；
X1是S；
X2是G；
X3是Q、E或D；
X4是R、S、G、M、K、L或T；
X5是L；
X6是G；
X7是D或E；
X8是K；
X9是Y；
X10是A或V；和
X11是S；
CDR-L2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQIDNO：103)，其中；
X1是E或Q；
X2是D；
X3是S、L、T、A、E或F；
X4是K、T、E、N、Q、S或M；
X5是R；
X6是P；和
X7是S；
和
CDR-L3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO：104)，其中；
X1是Q；
X2是A；
X3是W；
X4是D；
X5是R、S、M、E、N、G或K；
X6是D或E；
X7是T、V、A、S或M；
X8是G、A或C；和
X9是V。
优选地，本发明的DLL4结合蛋白的抗体结合结构域包括至少一个CDR，其包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：1的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：1的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：1的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：111的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：111的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：111的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：117(CDR-H1)；SEQIDNO：118(CDR-H2)；SEQIDNO：119(CDR-H3)；
SEQIDNO：121(CDR-H1)；SEQIDNO：122(CDR-H2)；SEQIDNO：123(CDR-H3)；
SEQIDNO：125(CDR-H1)；SEQIDNO：126(CDR-H2)；SEQIDNO：127(CDR-H3)；
SEQIDNO：129(CDR-H1)；SEQIDNO：130(CDR-H2)；SEQIDNO：131(CDR-H3)；
SEQIDNO：133(CDR-H1)；SEQIDNO：134(CDR-H2)；SEQIDNO：135(CDR-H3)；
SEQIDNO：137(CDR-H1)；SEQIDNO：138(CDR-H2)；SEQIDNO：139(CDR-H3)；
SEQIDNO：141(CDR-H1)；SEQIDNO：142(CDR-H2)；SEQIDNO：143(CDR-H3)；
SEQIDNO：145(CDR-H1)；SEQIDNO：146(CDR-H2)；SEQIDNO：147(CDR-H3)；
SEQIDNO：149(CDR-H1)；SEQIDNO：150(CDR-H2)；SEQIDNO：151(CDR-H3)；
SEQIDNO：153(CDR-H1)；SEQIDNO：154(CDR-H2)；SEQIDNO：155(CDR-H3)；
SEQIDNO：157(CDR-H1)；SEQIDNO：158(CDR-H2)；SEQIDNO：159(CDR-H3)；
SEQIDNO：161(CDR-H1)；SEQIDNO：162(CDR-H2)；SEQIDNO：163(CDR-H3)；
SEQIDNO：165(CDR-H1)；SEQIDNO：166(CDR-H2)；SEQIDNO：167(CDR-H3)；
SEQIDNO：169(CDR-H1)；SEQIDNO：170(CDR-H2)；SEQIDNO：171(CDR-H3)；
SEQIDNO：173(CDR-H1)；SEQIDNO：174(CDR-H2)；SEQIDNO：175(CDR-H3)；
SEQIDNO：177(CDR-H1)；SEQIDNO：178(CDR-H2)；SEQIDNO：179(CDR-H3)；
SEQIDNO：181(CDR-H1)；SEQIDNO：182(CDR-H2)；SEQIDNO：183(CDR-H3)；
SEQIDNO：185(CDR-H1)；SEQIDNO：186(CDR-H2)；SEQIDNO：187(CDR-H3)；
SEQIDNO：189(CDR-H1)；SEQIDNO：190(CDR-H2)；SEQIDNO：191(CDR-H3)；
SEQIDNO：193(CDR-H1)；SEQIDNO：194(CDR-H2)；SEQIDNO：195(CDR-H3)；
SEQIDNO：197(CDR-H1)；SEQIDNO：198(CDR-H2)；SEQIDNO：199(CDR-H3)；
SEQIDNO：201(CDR-H1)；SEQIDNO：202(CDR-H2)；SEQIDNO：203(CDR-H3)；
SEQIDNO：205(CDR-H1)；SEQIDNO：206(CDR-H2)；SEQIDNO：207(CDR-H3)；
SEQIDNO：209(CDR-H1)；SEQIDNO：210(CDR-H2)；SEQIDNO：211(CDR-H3)；
SEQIDNO：213(CDR-H1)；SEQIDNO：214(CDR-H2)；SEQIDNO：215(CDR-H3)；
SEQIDNO：217(CDR-L1)；SEQIDNO：218(CDR-L2)；SEQIDNO：219(CDR-L3)；
SEQIDNO：221(CDR-L1)；SEQIDNO：222(CDR-L2)；SEQIDNO：223(CDR-L3)；
SEQIDNO：225(CDR-L1)；SEQIDNO：226(CDR-L2)；SEQIDNO：227(CDR-L3)；
SEQIDNO：229(CDR-L1)；SEQIDNO：230(CDR-L2)；SEQIDNO：231(CDR-L3)；
SEQIDNO：233(CDR-L1)；SEQIDNO：234(CDR-L2)；SEQIDNO：235(CDR-L3)；
SEQIDNO：237(CDR-L1)；SEQIDNO：238(CDR-L2)；SEQIDNO：239(CDR-L3)；
SEQIDNO：241(CDR-L1)；SEQIDNO：242(CDR-L2)；SEQIDNO：243(CDR-L3)；
SEQIDNO：245(CDR-L1)；SEQIDNO：246(CDR-L2)；SEQIDNO：247(CDR-L3)；
SEQIDNO：249(CDR-L1)；SEQIDNO：250(CDR-L2)；SEQIDNO：251(CDR-L3)；
SEQIDNO：253(CDR-L1)；SEQIDNO：254(CDR-L2)；SEQIDNO：255(CDR-L3)；
SEQIDNO：257(CDR-L1)；SEQIDNO：258(CDR-L2)；SEQIDNO：259(CDR-L3)；
SEQIDNO：261(CDR-L1)；SEQIDNO：262(CDR-L2)；SEQIDNO：263(CDR-L3)；
SEQIDNO：265(CDR-L1)；SEQIDNO：266(CDR-L2)；SEQIDNO：267(CDR-L3)；
SEQIDNO：269(CDR-L1)；SEQIDNO：270(CDR-L2)；SEQIDNO：271(CDR-L3)；
SEQIDNO：273(CDR-L1)；SEQIDNO：274(CDR-L2)；SEQIDNO：275(CDR-L3)；
SEQIDNO：277(CDR-L1)；SEQIDNO：278(CDR-L2)；SEQIDNO：279(CDR-L3)；
SEQIDNO：281(CDR-L1)；SEQIDNO：282(CDR-L2)；SEQIDNO：283(CDR-L3)；
SEQIDNO：285(CDR-L1)；SEQIDNO：286(CDR-L2)；SEQIDNO：287(CDR-L3)；
SEQIDNO：289(CDR-L1)；SEQIDNO：290(CDR-L2)；SEQIDNO：291(CDR-L3)；
SEQIDNO：293(CDR-L1)；SEQIDNO：294(CDR-L2)；SEQIDNO：295(CDR-L3)；
SEQIDNO：297(CDR-L1)；SEQIDNO：298(CDR-L2)；SEQIDNO：299(CDR-L3)；
SEQIDNO：301(CDR-L1)；SEQIDNO：302(CDR-L2)；SEQIDNO：303(CDR-L3)；
SEQIDNO：305(CDR-L1)；SEQIDNO：306(CDR-L2)；SEQIDNO：307(CDR-L3)；
SEQIDNO：309(CDR-L1)；SEQIDNO：310(CDR-L2)；SEQIDNO：311(CDR-L3)；
SEQIDNO：313(CDR-L1)；SEQIDNO：314(CDR-L2)；SEQIDNO：315(CDR-L3)；
SEQIDNO：334的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：334的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：334的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：335的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：335的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：335的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：336的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：336的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：336的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：337的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：337的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：337的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：338的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：338的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：338的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：339的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：339的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：339的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：340的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：340的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：340的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：341的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：341的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：341的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：342的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：342的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：342的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：343的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：343的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：343的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：344的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：344的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：344的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：345的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：345的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：345的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：346的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：346的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：346的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：347的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：347的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：347的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：348的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：348的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：348的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：349的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：349的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：349的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：350的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：350的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：350的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：351的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：351的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：351的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：352的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：352的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：352的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：353的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：353的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：353的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：354的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：354的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：354的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：355的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：355的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：355的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：356的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：356的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：356的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：357的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：357的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：357的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：358的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：358的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：358的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：359的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：359的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：359的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：360的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：360的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：360的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：361的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：361的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：361的残基88-96(CDR-L3)。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括至少3个上述CDR。
优选地，根据本发明的DLL4结合蛋白包含一个或多个上述CDR。更优选地，结合蛋白包含三个或多个上述CDR。最优选地，根据本发明的DLL4结合蛋白包含六个上述CDR，即，上述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在优选的实施方案中，结合蛋白包含至少3个CDR选自上述序列。
更优选地，结合蛋白包含3个CDR，所述3个CDR选自下述的可变结构域CDR组。
VHE9CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：1的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：1的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：1的残基100-110
VLE9CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：111的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：111的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：111的残基88-96
VHE9.4CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：117
CDR-H2：SEQIDNO：118
CDR-H3：SEQIDNO：119
VLE9.4CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：229
CDR-L2：SEQIDNO：230
CDR-L3：SEQIDNO：231
VHE9.11CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：121
CDR-H2：SEQIDNO：122
CDR-H3：SEQIDNO：123
VLE9.11CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：233
CDR-L2：SEQIDNO：234
CDR-L3：SEQIDNO：235
VHE9.14CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：125
CDR-H2：SEQIDNO：126
CDR-H3：SEQIDNO：127
VLE9.14CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：237
CDR-L2：SEQIDNO：238
CDR-L3：SEQIDNO：239
VHE9.17CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：129
CDR-H2：SEQIDNO：130
CDR-H3：SEQIDNO：131
VLE9.17CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：241
CDR-L2：SEQIDNO：242
CDR-L3：SEQIDNO：243
VHE9.18CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：133
CDR-H2：SEQIDNO：134
CDR-H3：SEQIDNO：135
VLE9.18CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：245
CDR-L2：SEQIDNO：246
CDR-L3：SEQIDNO：247
VHE9.19CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：137
CDR-H2：SEQIDNO：138
CDR-H3：SEQIDNO：139
VLE9.19CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：249
CDR-L2：SEQIDNO：250
CDR-L3：SEQIDNO：251
VHE9.22CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：141
CDR-H2：SEQIDNO：142
CDR-H3：SEQIDNO：143
VLE9.22CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：253
CDR-L2：SEQIDNO：254
CDR-L3：SEQIDNO：255
VHE9.48CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：145
CDR-H2：SEQIDNO：146
CDR-H3：SEQIDNO：147
VLE9.48CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：257
CDR-L2：SEQIDNO：258
CDR-L3：SEQIDNO：259
VHE9.65CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：149
CDR-H2：SEQIDNO：150
CDR-H3：SEQIDNO：151
VLE9.65CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：261
CDR-L2：SEQIDNO：262
CDR-L3：SEQIDNO：263
VHE9.66CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：153
CDR-H2：SEQIDNO：154
CDR-H3：SEQIDNO：155
VLE9.66CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：265
CDR-L2：SEQIDNO：266
CDR-L3：SEQIDNO：267
VHE9.71CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：157
CDR-H2：SEQIDNO：158
CDR-H3：SEQIDNO：159
VLE9.71CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：269
CDR-L2：SEQIDNO：270
CDR-L3：SEQIDNO：271
VHE9.13CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：161
CDR-H2：SEQIDNO：162
CDR-H3：SEQIDNO：163
VLE9.13CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：217
CDR-L2：SEQIDNO：218
CDR-L3：SEQIDNO：219
VHE9.16CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：165
CDR-H2：SEQIDNO：166
CDR-H3：SEQIDNO：167
VLE9.16CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：221
CDR-L2：SEQIDNO：222
CDR-L3：SEQIDNO：223
VHE9.38CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：169
CDR-H2：SEQIDNO：170
CDR-H3：SEQIDNO：171
VLE9.38CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：225
CDR-L2：SEQIDNO：226
CDR-L3：SEQIDNO：227
VHE9.2BCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：173
CDR-H2：SEQIDNO：174
CDR-H3：SEQIDNO：175
VLE9.2BCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：273
CDR-L2：SEQIDNO：274
CDR-L3：SEQIDNO：275
VHE9.1FCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：177
CDR-H2：SEQIDNO：178
CDR-H3：SEQIDNO：179
VLE9.1FCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：277
CDR-L2：SEQIDNO：278
CDR-L3：SEQIDNO：279
VHE9.10HCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：181
CDR-H2：SEQIDNO：182
CDR-H3：SEQIDNO：183
VLE9.10HCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：301
CDR-L2：SEQIDNO：302
CDR-L3：SEQIDNO：303
VHE9.5ECDR组
CDR-H1：SEQIDNO：185
CDR-H2：SEQIDNO：186
CDR-H3：SEQIDNO：187
VLE9.5ECDR组
CDR-L1：SEQIDNO：293
CDR-L2：SEQIDNO：294
CDR-L3：SEQIDNO：295
VHE9.10CCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：189
CDR-H2：SEQIDNO：190
CDR-H3：SEQIDNO：191
VLE9.10CCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：281
CDR-L2：SEQIDNO：282
CDR-L3：SEQIDNO：283
VHE9.7ECDR组
CDR-H1：SEQIDNO：193
CDR-H2：SEQIDNO：194
CDR-H3：SEQIDNO：195
VLE9.7ECDR组
CDR-L1：SEQIDNO：289
CDR-L2：SEQIDNO：290
CDR-L3：SEQIDNO：291
VHE9.12BCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：197
CDR-H2：SEQIDNO：198
CDR-H3：SEQIDNO：199
VLE9.12BCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：297
CDR-L2：SEQIDNO：298
CDR-L3：SEQIDNO：299
VHE9.10ECDR组
CDR-H1：SEQIDNO：201
CDR-H2：SEQIDNO：202
CDR-H3：SEQIDNO：203
VLE9.10ECDR组
CDR-L1：SEQIDNO：285
CDR-L2：SEQIDNO：286
CDR-L3：SEQIDNO：287
VHE9.6ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：205
CDR-H2：SEQIDNO：206
CDR-H3：SEQIDNO：207
VLE9.6ACDR组
CDR-L1：SEQIDNO：305
CDR-L2：SEQIDNO：306
CDR-L3：SEQIDNO：307
VHE9.7ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：209
CDR-H2：SEQIDNO：210
CDR-H3：SEQIDNO：211
VLE9.7ACDR组
CDR-L1：SEQIDNO：309
CDR-L2：SEQIDNO：310
CDR-L3：SEQIDNO：311
VHE9.8HCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：213
CDR-H2：SEQIDNO：214
CDR-H3：SEQIDNO：215
VLE9.8HCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：313
CDR-L2：SEQIDNO：314
CDR-L3：SEQIDNO：315
VHE9.1CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：334的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：334的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：334的残基100-110
VLE9.1CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：335的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：335的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：335的残基88-96
VHE9-SE1CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：336的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：336的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：336的残基100-110
VLE9-SE1CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：337的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：337的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：337的残基88-96
VHE9-SE2CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：338的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：338的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：338的残基100-110
VLE9-SE2CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：339的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：339的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：339的残基88-96
VHE9-SE3CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：340的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：340的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：340的残基100-110
VLE9-SE3CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：341的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：341的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：341的残基88-96
VHE9-SE4CDR组
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VLE9-SE4CDR组
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VHE9-SE5CDR组
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VLE9-SE5CDR组
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VHE9-SE6CDR组
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VLE9-SE8CDR组
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CDR-H1：SEQIDNO：354的残基31-37
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VLE9-FR2CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：355的残基24-34
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CDR-L3：SEQIDNO：355的残基89-97
VHE9.71CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：356的残基31-37
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CDR-H3：SEQIDNO：356的残基100-110
VLE9.71CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：357的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：357的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：357的残基88-96
VHE9.71(M)CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：358的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：358的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：358的残基100-110
VLE9.71(M)CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：359的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：359的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：359的残基88-96
VHE9.71(L)CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：360的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：360的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：360的残基100-110
VLE9.71(L)CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：361的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：361的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：361的残基88-96
在另一个实施方案中，结合蛋白包含由3个CDR组成的可变重链(VH)组(其选自上述由3个CDR组成的任意VH组)和由3个CDR组成的可变轻链(VL)组(其选自上述由3个CDR组成的任意VL组)。
在还另一个实施方案中，结合蛋白包含下述中命名的由3个CDR组成的VH组和相应命名的由3个CDR组成的VL组。优选地，根据本发明的结合蛋白包含至少两个可变结构域CDR组，其选自下述可变结构域CDR组：
VHE9CDR组和VLE9CDR组，
VHE9.4CDR组和VLE9.4CDR组，
VHE9.11CDR组和VLE9.11CDR组，
VHE9.14CDR组和VLE9.14CDR组，
VHE9.17CDR组和VLE9.17CDR组，
VHE9.18CDR组和VLE9.18CDR组，
VHE9.19CDR组和VLE9.19CDR组，
VHE9.22CDR组和VLE9.22CDR组，
VHE9.48CDR组和VLE9.48CDR组，
VHE9.65CDR组和VLE9.65CDR组，
VHE9.66CDR组和VLE9.66CDR组，
VHE9.71CDR组和VLE9.71CDR组，
VHE9.13CDR组和VLE9.13CDR组，
VHE9.16CDR组和VLE9.16CDR组，
VHE9.38CDR组和VLE9.38CDR组，
VHE9.2BCDR组和VLE9.2BCDR组，
VHE9.1FCDR组和VLE9.1FCDR组，
VHE9.10HCDR组和VLE9.10HCDR组，
VHE9.5ECDR组和VLE9.5ECDR组，
VHE9.10CCDR组和VLE9.10CCDR组，
VHE9.7ECDR组和VLE9.7ECDR组，
VHE9.12BCDR组和VLE9.12BCDR组，
VHE9.10ECDR组和VLE9.10ECDR组，
VHE9.6ACDR组和VLE9.6ACDR组，
VHE9.7ACDR组和VLE9.7ACDR组，
VHE9.8HCDR组和VLE9.8HCDR组，
VHE9-SE1CDR组和VLE9-SE1CDR组，
VHE9-SE2CDR组和VLE9-SE2CDR组，
VHE9-SE3CDR组和VLE9-SE3CDR组，
VHE9-SE4CDR组和VLE9-SE4CDR组，
VHE9-SE5CDR组和VLE9-SE5CDR组，
VHE9-SE6CDR组和VLE9-SE6CDR组，
VHE9-SE7CDR组和VLE9-SE7CDR组，
VHE9-SE8CDR组和VLE9-SE8CDR组，
VHE9-FR1CDR组和VLE9-FR1CDR组，
VHE9-FR2CDR组和VLE9-FR2CDR组，
VHE9.71CDR组和VLE9.71CDR组，
VHE9.71(M)CDR组和VLE9.71(M)CDR组，和
VHE9.71(L)CDR组和VLE9.71(L)CDR组。
在还另一个实施方案中，上述结合蛋白进一步包括人接纳体构架。优选地，所述人接纳体构架包括选自下述的氨基酸序列：
重链接纳体构架序列SEQIDNO：6-22，
重链接纳体序列SEQIDNO：35-62，
轻链接纳体序列SEQIDNO：23-34，和
轻链接纳体序列SEQIDNO：63-98。
在另一个实施方案中，上述结合蛋白包含人接纳体构架，其包含至少一个构架区氨基酸取代，其中所述构架的氨基酸序列与所述人接纳体构架的序列至少65％等同，并且包括与所述人接纳体构架等同的至少70个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本文所述结合蛋白包含人接纳体构架，其包括在关键残基处的至少一个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
与CDR接近的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与人DLL4相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
在Vernier区内的残基；和
在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
优选地，所述关键残基选自：2H、4H、24H、26H、27H、29H、34H、35H、37H、39H、44H、45H、47H、48H、49H、50H、51H、58H、59H、60H、63H、67H、69H、71H、73H、76H、78H、91H、93H、94H、2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、49L、55L、58L、62L、64L、71L、87L、89L、90L、91L、94L、95L。
在另一个实施方案中，本文所述结合蛋白包含共有人可变结构域。
在优选的实施方案中，上述结合蛋白包含具有选自下述的氨基酸序列的至少一个可变结构域：
SEQIDNO：1、111、116、228、120、232、124、236、128、240、132、244、136、248、140、252、144、256、148、260、152、264、156、268、160、216、164、220、168、224、172、272、176、276、180、300、184、292、188、280、192、288、196、296、200、284、204、304、208、308、212、312、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360和361。
在另一个实施方案中，根据本发明的结合蛋白包含2个可变结构域，其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：1和111、SEQIDNO：116和228、SEQIDNO：120和232、SEQIDNO：124和236、SEQIDNO：128和240、SEQIDNO：132和244、SEQIDNO：136和248、SEQIDNO：140和252、SEQIDNO：144和256、SEQIDNO：148和260、SEQIDNO：152和264、SEQIDNO：156和268、SEQIDNO：160和216、SEQIDNO：164和220、SEQIDNO：168和224、SEQIDNO：172和272、SEQIDNO：176和276、SEQIDNO：180和300、SEQIDNO：184和292、SEQIDNO：188和280、SEQIDNO：192和288、SEQIDNO：196和296、SEQIDNO：200和284、SEQIDNO：204和304、SEQIDNO：208和308、SEQIDNO：212和312、SEQIDNO：334和335、SEQIDNO：336和337、SEQIDNO：338和339、SEQIDNO：340和341、SEQIDNO：342和343、SEQIDNO：344和345、SEQIDNO：346和347、SEQIDNO：348和349、SEQIDNO：350和351、SEQIDNO：352和353、SEQIDNO：354和355、SEQIDNO：356和357、SEQIDNO：358和359、SEQIDNO：360和361。
在一个实施方案中，根据本发明的结合蛋白包含重链可变结构域(VH)，优选地其中所述VH包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358和360。
在还另一个实施方案中，根据本发明的结合蛋白包含轻链可变结构域(VL)，优选地其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359和361。
在优选的实施方案中，根据本发明的结合蛋白包含VH和VL，优选地其中VH和VL是上述序列中的任意。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够结合人DLL-4的结合蛋白，所述结合蛋白包括：
Ig恒定重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：2和SEQIDNO：3；
Ig恒定轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：4和SEQIDNO：5；
Ig可变重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358和360；和
Ig可变轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359和361。
本发明的另一方面涉及一种包括能够结合人DLL4的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括选自下述的至少一个或多个CDR：
CDR-H1：X1-X2-X3-X4-X5(SEQIDNO：105)，其中；
X1是S、N或D；
X2是H或Y；
X3是W；
X4是M；
X5是S或H；
CDR-H2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQIDNO：106)，其中；
X1是I、D、M或T；
X2是I；
X3是S；
X4是Y、N、S、Q、V、T、H或D；
X5是D；
X6是G；
X7是S、R、I、T、G、K、H或N；
X8是N、Y、S、I或T；
X9是K、M、N、Q、E、T、R、S、A或L；
X10是Y、D或E；
X11是S或Y；
X12是A；
X13是D；
X14是S；
X15是V；
X16是K；和
X17是G；
CDR-H3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQIDNO：107)，
其中；
X1是A；
X2是G、A或R；
X3是G；
X4是G、S或A；
X5是N；
X6是V或M；
X7是G；
X8是F、L、Y或M；
X9是D；和
X10是I、S或L；
CDR-L1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQIDNO：108)，
其中，
X1是S；
X2是A或G；
X3是D；
X4是K、N、L、Q、M、E、S、T、G或D；
X5是L；
X6是G；
X7是T、S、N、A、G或E；
X8是K、Q、N或R；
X9是Y；
X10是V或I；和
X11是S；
CDR-L2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQIDNO：109)，其中；
X1是Q；
X2是D；
X3是A、G、W、S或D；
X4是K、M、Q、N、L、T、I或E；
X5是R；
X6是P；和
X7是S；
和
CDR-L3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO：110)，其中；
X1是Q；
X2是S或A；
X3是W；
X4是D；
X5是R、S、Q、P、A、V、W或M；
X6是S、G、I、N、R或T；
X7是D或G；
X8是V、A、P或E；和
X9是V.
优选地，本发明的DLL4结合蛋白的抗体结合结构域包括至少一个CDR，所述至少一个CDR包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：112的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：112的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：112的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：113的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：113的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：113的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：316的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：316的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：316的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：317的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：317的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：317的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：318的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：318的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：318的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：319的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：319的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：319的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：320的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：320的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：320的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：321的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：321的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：321的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：322的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：322的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：322的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：323的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：323的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：323的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：324的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：324的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：324的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：325的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：325的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：325的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：326的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：326的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：326的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：327的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：327的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：327的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：328的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：328的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：328的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：329的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：329的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：329的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：330的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：330的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：330的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：331的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：331的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：331的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：332的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：332的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：332的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：333的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：333的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：333的残基88-96(CDR-L3)。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括至少3个上述公开的CDR。
优选地，根据本发明的DLL4结合蛋白包含一个或多个上述CDR。更优选地，结合蛋白包含三个或多个上述CDR。最优选地，根据本发明的DLL4结合蛋白包含六个上述CDR即：上述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在优选的实施方案中，结合蛋白包含至少3个选自上述序列的CDR。
在另一个优选的实施方案中，结合蛋白包含3个CDR，所述3个CDR选自下述的可变结构域CDR组：
VHA10CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：112的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：112的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：112的残基99-108
VLA10CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：113的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：113的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：113的残基88-96
VHA10.3CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：316的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：316的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：316的残基99-108
VLA10.3CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：327的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：327的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：327的残基88-96
VHA10.K30CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：317的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：317的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：317的残基99-108
VHA10.K42CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：318的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：318的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：318的残基99-108
VHA10.9ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：319的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：319的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：319的残基99-108
VHA10.8ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：320的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：320的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：320的残基99-108
VHA10.1ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：321的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：321的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：321的残基99-108
VHA10.5DCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：322的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：322的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：322的残基99-108
VHA10.3ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：323的残基31-35
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VLA10.3ACDR组
CDR-L1：SEQIDNO：330的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：330的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：330的残基88-96
VHA10.6BCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：324的残基31-35
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VLA10.6BCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：331的残基23-33
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VHA10.3DCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：325的残基31-35
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CDR-H3：SEQIDNO：325的残基99-108
VLA10.3DCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：332的残基23-33
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CDR-L3：SEQIDNO：332的残基88-96
VHA10.4CCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：326的残基31-35
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CDR-H3：SEQIDNO：326的残基99-108
VLA10.4CCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：333的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：333的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：333的残基88-96
VLA10.L45CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：328的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：328的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：328的残基88-96
VLA10.L73CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：329的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：329的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：329的残基88-96。
在另一个实施方案中，结合蛋白包含由3个CDR组成的可变重链(VH)组(其选自上述由3个CDR组成的任意VH组)和由3个CDR组成的可变轻链(VL)组(其选自上述由3个CDR组成的任意VL组)。
在还另一个实施方案中，结合蛋白包含下述中命名的由3个CDR组成的VH组和相应命名的由3个CDR组成的VL组。优选地，根据本发明的结合蛋白包含至少两个可变结构域CDR组，其选自下述可变结构域CDR组：
VHA10CDR组和VLA10CDR组；
VHA10.3CDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.3ACDR组和VLA10.3A组；
VHA10.6BCDR组和VLA10.6B组；
VHA10.3DCDR组和VLA10.3DCDR组；
VHA10.4CCDR组和VLA10.4CCDR组；
VHA10.K30CDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.K42CDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.3CDR组和VLA10.L45CDR组；
VHA10.3CDR组和VLA10.L73CDR组；
VHA10.9ACDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.8ACDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.1ACDR组和VLA10.3CDR组；和
VHA10.5DCDR组和VLA10.3CDR组。
在还另一个实施方案中，上述结合蛋白进一步包括人接纳体构架。优选地，所述人接纳体构架包括选自下述的氨基酸序列：
重链接纳体构架序列SEQIDNO：6-22，
重链接纳体序列SEQIDNO：35-62，
轻链接纳体序列SEQIDNO：23-34，和
轻链接纳体序列SEQIDNO：63-98。
在另一个实施方案中，上述结合蛋白包含人接纳体构架，其包含至少一个构架区氨基酸取代，其中所述构架的氨基酸序列与所述人接纳体构架的序列至少65％等同，并且包括与所述人接纳体构架等同的至少70个氨基酸残基。
在另一个实施方案中，本文所述结合蛋白包含人接纳体构架，其包括在关键残基处的至少一个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
与CDR接近的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与人DLL4相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
在Vernier区内的残基；和
在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
优选地，所述关键残基选自：2H、4H、24H、26H、27H、29H、34H、35H、37H、39H、44H、45H、47H、48H、49H、50H、51H、58H、59H、60H、63H、67H、69H、71H、73H、76H、78H、91H、93H、94H、2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、49L、55L、58L、62L、64L、71L、87L、89L、90L、91L、94L、95L。
在另一个实施方案中，本文所述结合蛋白包含共有人可变结构域。
在优选的实施方案中，上述结合蛋白包含具有选自下述的氨基酸序列的至少一个可变结构域：
SEQIDNO：112，113，316，327，317，318，319，320，321，322，323，330，324，331，325，332，326，333，328和329.
在另一个实施方案中，上述结合蛋白包含2个可变结构域，其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：112和113、SEQIDNO：316和327、SEQIDNO：323和330、SEQIDNO：324和331、SEQIDNO：325和332和SEQIDNO：326和333。
在一个实施方案中，根据本发明的结合蛋白包含重链可变结构域(VH)，优选地其中所述VH包括选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和326。
在还另一个实施方案中，根据本发明的结合蛋白包含轻链可变结构域(VL)，优选地其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：113、327、328、329、330、331、332和333。
在另一个实施方案中，本发明提供一种能够结合人DLL-4的结合蛋白，所述结合蛋白包括：
Ig恒定重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：2和SEQIDNO：3；
Ig恒定轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：4和SEQIDNO：5；
Ig可变重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和326；和
Ig可变轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：113、327、328、329、330、331、332和333。
根据本发明，本文所述的DLL4结合蛋白的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域可使用本领域可用的重组技术组合(shuffled)已产生和选自另外的DLL4结合蛋白，包括本文所述的VH和VL结构域的各种组合。
在优选的实施方案中，根据本发明的DLL4结合蛋白结合人DLL4(huDLL4)和至少一种其他物种的DLL4。更优选地，本文所述的DLL4结合蛋白结合人DLL4和选自小鼠DLL4(muDLL4)、食蟹猴DLL4(cynomologusDLL4，cynoDLL4)大鼠DLL4及其组合的DLL4。
在另一个实施方案中，DLL4结合蛋白是完全人抗体或其抗原结合部分。
在另一个实施方案中，DLL4结合蛋白是CDR嫁接的抗体。更优选地，DLL4结合蛋白是CDR-嫁接的抗体或其抗原结合部分，其包括一个或多个上述CDR。
还更优选地，所述CDR嫁接的抗体或其抗原结合部分包括上述可变结构域。更优选地，CDR嫁接的抗体或其抗原结合部分包括2个上述可变结构域。优选地，CDR嫁接的抗体或其抗原结合部分包括人接纳体构架。更优选地，人接纳体构架上述人接纳体构架的任意一个。
更优选地，结合蛋白能够中和选自人DLL4、小鼠DLL4、食蟹猴DLL4、大鼠DLL4及其组合的DLL4的活性。评价中和DLL4活性可通过本领域已知的若干体外和体内测定来评估。用于评估中和DLL4活性的示例性参数包括但不限于抑制DLL4与Notch受体和/或Notch信号通路的相互作用的抗体，其具有约至少10-6M、至少10-7M或至少10-8M的IC50值。
在一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有对于DLL4的结合速率(onrate)常数(Kon)为：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1；或至少约106M-1s-1。优选地，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有对于DLL4的结合速率常数(Kon)为102M-1s-1至103M-1s-1之间；103M-1s-1至104M-1s-1之间；104M-1s-1至105M-1s-1之间或105M-1s-1至106M-1s-1之间。
在另一个实施方案中，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有对于DLL4的解离速率常数(Koff)为：至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1；或至多约10-6s-1。优选地，如通过表面等离振子共振测量的，本发明的结合蛋白具有对于DLL4的解离速率常数(Koff)为10-3s-1至10-4s-1；10-4s-1至10-5s-1；或10-5s-1至10-6s-1。
在另一个实施方案中，本发明的结合蛋白具有对于DLL4的解离常数(KD)为至多约10-7M；至多约10-8M；至多约10-9M；至多约10-10M；至多约10-11M；至多约10-12M；或至多10-13M。优选地，本发明的结合蛋白具有对于DLL4的解离常数(KD)为10-7M至10-8M；10-8M至10-9M；10-9M至10-10M；10-10至10-11M；10-11M至10-12M；或of10-12M至10-13M。
本发明的一个实施方案提供抗体构建体，其包括上述任意一种DLL4结合蛋白和接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。在优选的实施方案中，根据本发明的抗体构建体选自：免疫球蛋白分子，单克隆抗体，嵌合抗体，CDR嫁接的抗体，人源化抗体，Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv，二硫键连接的Fv，scFv，单结构域抗体，双抗体，多特异性抗体，双重特异性抗体和双特异性抗体。
在优选的实施方案中，本发明的抗体构建体包括重链免疫球蛋白恒定结构域，其选自：人IgM恒定结构域，人IgG1恒定结构域，人IgG2恒定结构域，人IgG3恒定结构域，人IgG4恒定结构域，人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域，和可改变Fcγ受体结合、FcRn结合、C1q结合并可改变药物动力学性质和/或Fc效应物功能的上述Ig同种型突变体。
在另一个实施方案中，抗体构建体是糖基化的。优选地，所述糖基化是人糖基化模式。
在另一个实施方案中，本文所述的DLL4结合蛋白与试剂缀合。本发明的结合蛋白缀合物包括抗体缀合物，其中本文所述的的抗体构建体与试剂缀合。优选地，所述试剂选自：免疫粘附分子、显像剂、治疗剂和细胞毒剂。在优选的实施方案中，所述显像剂选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。更优选地，所述显像剂是放射性标记，其选自：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。在优选的实施方案中，所述治疗剂或细胞毒剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝***剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
在另一个实施方案中，以上公开的DLL4结合蛋白、抗体构建体或结合蛋白缀合物(其包括抗体缀合物)以晶体存在。优选地，所述晶体是无载体的药学控释结晶。在优选的实施方案中，此类结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶抗体缀合物具有比其可溶性配对物更长的体内半衰期。在另一个优选的实施方案中，结晶结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶结合蛋白缀合物(其包括抗体缀合物)在结晶后保留生物学活性。
本发明的一个方面涉及分离的核酸，其编码DLL4结合蛋白、抗体构建体、DLL4结合抗体缀合物或其DLL4结合部分。特别优选的是分离的核酸，其编码选自下述的多肽：包括重链可变结构域的多肽，其中所述重链可变结构域包括上述CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3；包括轻链可变结构域的多肽，其中所述轻链可变结构域包括上述CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3；或两种多肽的组合。
另一个实施方式提供载体，其包括分离的核酸上述。在优选的实施方案中，所述载体选自pcDNA、pTT(Durocher等人，Nucl.AcidsRes.，30(2e9)：1-9(2002))、pTT3(具有另外的多克隆位点的pTT)、pEFBOS(Mizushima等人，Nucl.Acids.Res.，18(17)：5322(1990))、pHybE、pBV、pJV和pBJ和适于原核或真核细胞的任何其他表达载体。
在本发明的另一方面，提供了用上述载体转化宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。优选的原核宿主细胞是大肠杆菌(Escherichiacoli)。优选地，真核细胞选自：原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞，包括但不限于CHO和COS细胞。优选的真菌细胞是但不限于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。优选的昆虫细胞是Sf9细胞。
本发明的另一方面提供产生结合人DLL4的结合蛋白的方法，其包括在足以产生结合人DLL4的结合蛋白的条件下，在培养基中培养以上公开的任一种宿主细胞的步骤。另一个实施方案提供根据上述方法产生的结合蛋白。
一个实施方案提供用于释放根据本发明的DLL4结合蛋白的组合物，其中所述组合物包括：制剂，其进一步包括结晶如上公开的DLL4结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶结合蛋白缀合物(其包括抗体缀合物)和成分，和进一步至少一种聚合载体。优选地，聚合载体是选自下述中的一种或多种的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、掺合物及其共聚物。优选地所述成分选自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
另一个实施方案提供用于治疗哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的组合物的步骤，所述组合物包括上述结晶DLL4结合蛋白、结晶抗体构建体或结晶蛋白缀合物(其包括抗体缀合物)。
本发明还提供药物组合物，其包括如上公开的DLL4结合蛋白、抗体构建体或结合蛋白缀合物(其包括抗体缀合物)和药学可接受的载体。在另一个实施方案中，药物组合物包括至少一种另外的试剂。所述另外的试剂可以是用于治疗其中DLL4是有害的病症的治疗剂。优选地，药物组合物包括另外的试剂，其选自：治疗剂；显像剂；抗肿瘤剂；化疗剂(例如DNA烷化剂、顺铂、卡铂、抗-微管蛋白剂、紫杉醇、多烯紫杉醇、多柔比星、吉西他滨、健择、蒽环类、阿霉素、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、leucovorin、伊立替康)和受体酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼，吉非替尼)、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)、激酶抑制剂，和血管发生抑制剂(其包括但不限于抗-VEGF抗体或VEGF-trap)；共刺激分子阻断剂(其包括但不限于抗-B7.1抗体、抗-B7.2抗体、CTLA4-Ig、抗-CD20抗体)；粘附分子阻断剂(其包括但不限于抗-LFA-1抗体、抗-E/L选择素抗体，和小分子抑制剂)；抗细胞因子抗体或其功能片段(其包括但不限于抗-IL-18，抗-TNF和抗-IL-6/细胞因子受体抗体)；氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂，***，非类固醇消炎药(NSAID)，止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻断剂，抗微生物剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，促蛋白合成类固醇，***，免疫接种，免疫球蛋白，免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剂，哮喘药物治疗，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物，细胞因子和细胞因子拮抗剂。
另一方面，本发明提供用于抑制人DLL4活性的方法，其包括使人DLL4与以上公开的结合蛋白接触从而使得人DLL4被抑制或中和。在一个相关方面，本发明提供用于患有其中DLL4是有害的病症的人受试者中抑制DLL4活性的方法，其包括给所述人受试者施用以上公开的结合蛋白从而使得所述人受试者中的人DLL4被抑制并且获得治疗。优选地，所述病症选自原发性和转移性癌症，其包括乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊和胆管癌、小肠癌、尿道癌(其包括肾癌、膀胱癌和尿道上皮癌)、女性生殖道癌(其包括子***、子宫癌和卵巢癌以及绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病)，男性生殖道癌(其包括***癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤)，内分泌腺体癌(其包括甲状腺癌、肾上腺癌和脑垂体腺癌)，和皮肤癌，以及血管瘤、黑色素瘤、肉瘤(其包括骨和软组织发生的肉瘤以及卡波西氏肉瘤)、脑瘤、神经癌、眼部肿瘤、脑膜癌(其包括星形胶质细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤，神经鞘瘤和脑膜瘤)，造血恶性肿瘤的实体肿瘤例如白血病和淋巴瘤(霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤)，肿瘤转移，眼部新生血管化(其包括糖尿病失明、视网膜病变、年龄引起的黄斑变性和虹膜发红)，水肿、类风湿关节炎、多发性硬化症，动脉硬化斑块、克罗恩病、炎症性肠病、顽固性腹水、牛皮癣、结节病、动脉血管硬化、败血症、消化道溃疡、烧伤和胰腺炎、多囊性卵巢疾病(POD)、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、良性***增生和其他独立于和依赖于血管生成的疾病，其特征在于异常DLL4活性。
另一方面，本发明提供治疗患有其中人DLL4是有害的病症的患者的方法，其包括如上讨论，在第二种试剂施用之前、同时或之后，施用以上公开的任一种结合蛋白的步骤。在优选的实施方案中，所述第二种试剂选自：放疗剂；抗肿瘤剂；化疗剂(例如DNA烷化剂，顺铂，卡铂，抗-微管蛋白剂，紫杉醇，多烯紫杉醇，紫杉醇(taxol)，多柔比星，吉西他滨，健择，蒽环类，阿霉素，拓扑异构酶I抑制剂，拓扑异构酶II抑制剂，5-氟尿嘧啶(5-FU)，leucovorin，伊立替康)，受体酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼，吉非替尼)，COX-2抑制剂(例如塞来昔布)，激酶抑制剂和血管发生抑制剂(其包括但不限于抗-VEGF抗体或VEGF-trap)；共刺激分子阻断剂(其包括但不限于抗-B7.1，抗-B7.2，CTLA4-Ig，抗-CD20)；粘附分子阻断剂(其包括但不限于抗-LFA-1抗体，抗-E/L选择素抗体，小分子抑制剂)；抗-细胞因子抗体或其功能片段(其包括但不限于抗-IL-18，抗-TNF，抗-IL-6/细胞因子受体抗体)；氨甲蝶呤；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；可检测标记或报道分子；TNF拮抗剂；抗风湿剂；肌肉弛缓剂，***，非类固醇消炎药(NSAID)，止痛剂，麻醉剂，镇静剂，局部麻醉剂，神经肌肉阻断剂，抗微生物剂，抗牛皮癣剂，皮质类固醇，促蛋白合成类固醇，***，免疫接种，免疫球蛋白；免疫抑制剂，生长激素，激素替代药物，放射性药物，抗抑郁药，抗精神病药，刺激剂，哮喘药物治疗，β激动剂，吸入类固醇，肾上腺素或类似物，细胞因子和细胞因子拮抗剂。
在优选的实施方案中，以上公开的药物组合物通过选自下述的至少一种模式施用给受试者：肠胃外、皮下、肌内、静脉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、***内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、快速灌注(bolus)、***、直肠、口腔含化、舌下、鼻内和经皮。
本发明的另一方面提供针对本发明的至少一种DLL4结合蛋白的至少一种DLL4抗-独特型抗体。所述抗-独特型抗体包括任意含有蛋白或肽的分子，其包括至少一部分的免疫球蛋白分子，例如但不限于重链或轻链或其配体结合部分DE至少一种互补决定区(CDR)、重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、构架区和其任意部分，其可并入本发明的结合蛋白。
任意的各种免疫检测测定方式的可以适用于应用本发明的DLL4结合蛋白来检测混合物、溶液或生物样品中的DLL4。此类疫检测测定方式包括但不限于放射免疫测定(RIA)，免疫沉淀，酶联免疫测定(ELISA)，免疫印迹(例如Western)，包括吸附或固定化到底物上的本发明的DLL4结合蛋白的免疫试纸条(例如immunodipsticks)，FACS等等。使用本发明的DLL4结合蛋白检测DLL4可以是在混合物上、溶液或生物样品中在体外进行。可以与本发明的结合蛋白接触以检测或测量样品中的DLL4的生物样品包括但不限于，尿液，唾液，口腔拭子(颊、舌，或喉拭子)、皮肤拭子、皮肤刮、直肠拭子、***拭子、全血样品、血浆样品、血清样品、组织活检和由本领域已知方法从个体获得的任意其他样品。在另一个实施方案中，DLL4结合蛋白可以应用于体内检测DLL4例如各种断层摄影术和扫描方法，其包括但不限于X-射线计算机辅助断层摄影术(CT)，磁共振成像(MRI)和正电子发射断层摄影术(PET)。
具体实施方式
本发明涉及DLL4结合蛋白，特别是抗-DLL4抗体，或其结合DLL4的抗原-结合部分。本发明的各个方面涉及抗体和抗体片段及其药物组合物，以及用于制备此种抗体和抗体片段的核酸、重组表达载体和宿主细胞。使用本发明的抗体以检测人DLL4或鼠DLL4的方法，在体外或体内抑制人或小鼠DLL4和/或人或小鼠VEGFR2或VEGR1活性的方法和调节基因表达的方法也由本发明包含。
除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。此外，除非上下文另有要求，单数术语应包括复数，且复数术语应包括单数。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。同样，除非另有具体说明，术语例如“元件”或“组分”涵盖包含一个单位的元件和组分以及包含超过一个亚单位的元件和组分。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。使用标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者治疗。
为了本发明可以更容易地理解，选择的术语在下文定义。
如本文使用的，术语“多肽”指氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白”可与术语多肽互换使用，且同样指氨基酸的聚合链。术语“多肽”包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽类似物。多肽可以是单体或聚合的。除非另外与上下文矛盾，此处使用“多肽”意在包含多肽和其片段及变体(包括变体的片段)。对于抗原多肽，多肽片段任选含有至少一个邻接或非线性多肽表位。可以使用本领域普通方法确定至少一个表位片段的精确边界。该片段包含至少约5个邻接氨基酸，例如至少约10个邻接氨基酸、至少约15个邻接氨基酸、或至少约20个邻接氨基酸。多肽变体如此处所述。
术语“分离的蛋白”或“分离的多肽”是这样的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或来源不与天然结合的组分结合，所述天然结合的组分在其天然状态下与其伴随；基本上不含来自相同物种的其他蛋白；由来自不同物种的细胞表达；或在自然界中不存在。因此，化学合成或在不同于其天然起源的细胞的细胞***中合成的多肽将是与其天然结合的组分“分离的”。还可以通过分离，使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得蛋白基本上不含天然结合的组分。
如本文使用的，术语“回收”指通过分离，例如使用本领域众所周知的蛋白纯化技术，使得化学种类例如多肽基本上不含天然结合的组分的过程。
如本文使用的，术语“人DLL4”(本文缩写为“hDLL4”或“huDLL4”)包括若干EGF样结构域和受体结合所需的DSL结构域。术语包括蛋白，所述蛋白包括约74-75kDa。人DLL4的结构和推导的DNA以及蛋白序列在例如Shutter等人，Genes&Dev.，4：1313-1318(2000)中进一步描述。术语“人DLL4”意图包括重组人DLL4(rhDLL4)，其可以通过标准重组表达法制备。
如本文使用的，对于DLL4，“生物学活性”指DLL4的所有固有生物学特性。DLL4的生物学特性包括但不限于结合Notch受体，激活Notch受体，负调节VEGF信号，抑制VEGFR2和诱导VEGR1。
如本文使用的，关于抗体、蛋白、或肽与第二种化学种类相互作用的术语“特异性结合”或“特异地结合”，意指相互作用取决于化学种类上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别且与特定蛋白结构结合而不是一般地与蛋白结合。如果抗体对表位“A”特异，那么在包含标记的“A”和抗体的反应中，包含表位A的分子(或游离的，未标记的A)的存在将减少与抗体结合的标记的A的量。
如本文使用的，术语“抗体”广泛地指包含4条多肽链-2条重(H)链和2条轻(L)链的任何免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子的基本表位结合特征的任何功能片段、突变体、变体或衍生。此种突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。其非限制性实施方案在下文讨论。
在全长抗体中，每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分成称为互补性决定区(CDR)的高变区，用称为构架区(FR)的较保守区域点缀。每个VH和VL由3个CDR和4个FR组成，以下列顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区域，它可以通过完整抗体的木瓜蛋白酶消化来产生。Fc区可以是天然序列Fc区或变体Fc区。免疫球蛋白的Fc区一般包含2个恒定结构域-CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域。Fc部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(Winter等人，美国专利号5,648,260和5,624,821)。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些效应子功能对于治疗用抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，经由分别与FcγRs和补体C1q结合介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。在另外一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗体恒定区例如抗体Fc区中进行替换，从而使得抗体的效应子功能被改变。免疫球蛋白的2条相同重链的二聚化由CH3结构域的二聚化来介导，且通过铰链区内的二硫键来稳定(Huber等人，Nature；264：415-420(1976；Thies等人，JMolBiol；293：67-79(1999))。铰链区内的半胱氨酸残基突变以阻止重链-重链二硫键将使CH3结构域的二聚化不稳定。负责CH3二聚化的残基已得到鉴定(Dall’Acqua，Biochemistry37：9266-9273(1998))。因此，可能产生单价半-Ig。有趣的是，已在自然界中发现关于IgG和IgA亚类的这些单价半Ig分子(Seligman，AnnImmunol129：855-70(1978)；Biewenga等人，ClinExpImmunol51：395-400(1983))。FcRn：IgFc区的化学计量已测定为2∶1(West等人，Biochemistry39：9698-708(2000))，且半Fc足以介导FcRn结合(Kim等人，EurJImmunol；24：542-548(1994))。破坏CH3结构域二聚化的突变可能对其FcRn结合没有更大的不利作用，因为对于CH3二聚化重要的残基位于CH3b折叠结构的内界面上，而负责FcRn结合的区域位于CH2-CH3结构域的外界面上。然而，由于其比常规抗体的那种更小的尺寸，半Ig分子可以在组织穿透中具有某些优点。在一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在本发明的结合蛋白的恒定区例如Fc区中进行替换，从而使得重链的二聚化被破坏，从而产生半DVDIg分子。IgG的抗炎症活性完全取决于IgGFc片段N-联聚糖的唾液酸化作用。已经确定了对抗炎症活性准确的聚糖要求，这样就可以生成合适的IgG1Fc片段，从而生成具有大大增强的能力的完全重组的唾液酸化IgG1Fc(Anthony，R.M.，等人，Science320：373-376(2008))。
如本文使用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)，指保留与抗原(即，对于抗原的具体表位，例如hDLL4的表位)特异性结合的能力的一种或多种抗体片段。已显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。此种抗体实施方案也可以是双特异性、双重特异性、或多特异性形式；与2种或更多不同抗原(或相同抗原的2种或更多不同表位)特异性结合。包含在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含由铰链区的二硫键连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，Nature，341：544-546(1989)；PCT公开号WO90/05144A1，它包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补性决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，所述合成接头使得它们能够作为单条蛋白链制备，在所述单条蛋白链中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人Science，242：423-426(1988)；和Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：5879-5883(1988))。此种单链抗体也预期包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。也包含其他形式的单链抗体例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单条多肽链上表达，但使用的接头太短而不允许相同链上的2个结构域之间的配对，从而促使结构域与另一条链的互补结构域配对且产生2个抗原结合部位(参见例如，Holliger，等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)；Poljak等人Structure，2：1121-1123(1994))。此种抗体结合部分是本领域已知的(参见Kontermann和Dubel编，AntibodyEngineering(2001)(Springer-Verlag.NewYork.第790页(ISBN3-540-41354-5))。此外，单链抗体还包括包含一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)的“线性抗体”，所述串联Fv区段连同互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区域(Zapata等人，ProteinEng.8(10)：1057-1062(1995)；和美国专利号5,641,870)。
如本文使用的，术语“抗体构建体”(或“DLL4抗体构建体”)指包括与接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域连接的本发明的一个或多个抗原结合部分的多肽。接头多肽包含通过肽键连接的2个或更多氨基酸残基，且用于连接一个或多个抗原结合部分。此种接头多肽是本领域众所周知的(参见例如，Holliger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：6444-6448(1993)；PoljakR.J.，Structure，2：1121-1123(1994))。免疫球蛋白恒定结构域指重或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的且在表1中表示。
表1：人IgG重链恒定结构域和轻链恒定结构域的序列
更进一步地，其抗体或抗原-结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其他蛋白质或肽的共价或非共价结合形成的较大免疫粘附分子的部分。此种免疫粘附分子的例子包括链霉抗生物素蛋白核心区的使用，以制备四聚scFv分子(Kipriyanov等人，HumanAntibodiesandHybridomas6：93-101(1995))，以及半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标签的使用，以制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov等人，Mol.Immunol.，31：1047-1058(1994))。抗体部分例如Fab和F(ab′)2片段可以使用常规技术由完整抗体制备，例如完整抗体分别地木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化。此外，抗体、抗体部分和免疫粘附分子可以使用标准重组DNA技术获得，如本文描述的且是本领域已知的。
如本文使用的，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如特异性结合hDLL4的分离的抗体基本上不含特异性结合除hDLL4外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hDLL4的分离的抗体可以与其他抗原例如来自其他物种的DLL4分子(例如muDLL4)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学试剂。
如本文使用的，术语“单克隆抗体”和缩写“MAb”或“mAb”指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即构成群体的个别抗体是相同的，除了可以少量存在的可能天然存在的突变。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原。此外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对照，每种mAb针对抗原上的单一决定簇。修饰语“单克隆”不应解释为需要通过任何具体方法生产抗体。
如本文使用的，术语“人抗体”预期包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括例如在CDRs且特别是CDR3中，不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点专一诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。然而，如本文使用的，术语“人抗体”不预期包括其中来源于另一种哺乳动物物种例如小鼠种系的CDR序列已嫁接到人构架序列上的抗体。
如本文使用的，术语“重组人抗体”预期包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体，从重组、组合人抗体文库中分离的抗体(Hoogenboom，TrendsBiotechnol.，15：62-70(1997)；Azzazy和Highsmith，Clin.Biochem.，35：425-445(2002)；Gavilondo和Larrick，BioTechniques，29：128-145(2000)；Hoogenboom和Chames，Immunol.Today，21：371-378(2000))，从对于人免疫球蛋白基因是转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体(参见，Taylor等人，Nucl.AcidsRes.，20：6287-6295(1992)；Kellermann和Green，Curr.Opin.Biotechnol.，13：593-597(2002)；Little等人，Immunol.Today，21：364-370(2000))或通过包括使人免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。此种重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。然而，在某些实施方案中，对此种重组人抗体实施体外诱变(或，当使用对于人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是，尽管来源于人种系VH和VL序列且与人种系VH和VL序列相关，但可能在体内的人抗体种系谱内非天然存在的序列。
术语“嵌合抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列以及来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠重和轻链可变区的抗体。
如本文使用的，术语“CDR”指在抗体可变序列内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在3个CDR，所述CDR对于每个可变区命名为CDR1、CDR2和CDR3。如本文使用的，术语“CDR组”指在能够结合抗原的单个可变区中出现的3个CDR的组。这些CDR的确切边界已根据不同***不同地限定。由Kabat(Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1987)和(1991))描述的***，不仅提供了可应用于抗体的任何可变区的明确残基编号***，还提供了限定3个CDRs的精确残基边界。这些CDRs可以被称为KabatCDRs。Chothia和同事(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)以及Chothia等人，Nature，342：877-883(1989))发现KabatCDRs内的某些亚部分采取几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有大的多样性。这些亚部分命名为“L1”、“L2”和“L3”或“H1”、“H2”和“H3”，其中“L”和“H”分别指轻链和重链区域。这些区域可以被称为“ChothiaCDR”，所述ChothiaCDR具有与KabatCDR重叠的边界。与KabatCDR重叠的限定CDR的其他边界已由PadlanFASEBJ.，9：133-139(1995)和MacCallumJ.Mol.Biol.，262(5)：732-45(1996)描述。再其他的CDR边界定义可能不严格地遵循上文***之一，但仍将与KabatCDR重叠，尽管按照特定残基或残基组或甚至整个CDR并不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以缩短或加长。本文使用的方法可以利用根据这些***中的任何一种限定的CDR，尽管优选实施方案使用Kabat或Chothia限定的CDR。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语指氨基酸残基编号***，所述氨基酸残基比DLL4结合蛋白的重和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变)(Kabat等人Ann.NYAca.，Sci.，190：382-391(1971)和Kabat，E.A.，等人SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，NIH公开号91-3242(1991))。对于重链可变区(VH)，高变区对于CDR1为氨基酸位置31-35，对于CDR2为氨基酸位置50-65，且对于CDR3为氨基酸位置95-102。对于轻链可变区(VL)，高变区对于CDR1为氨基酸位置24-34，对于CDR2为氨基酸位置50-56，且对于CDR3为氨基酸位置89-97。
在过去二十年，可变重链和轻链区氨基酸序列的广泛公共数据库的发展和分析已使得理解在可变区序列中构架区(FR)和CDR序列之间的通常边界并使得本领域技术人员根据Kabat编号、Chothia编号或其他***准确测定CDR。参见，例如Martin，“ProteinSequenceStructureAnalysisofAntibodyVariableDomains，”InKontermann和Dübel，eds.，AntibodyEngineering(Springer-Verlag，Berlin，2001)，chapter31，pages432-433.在可变重链(VH)和可变轻链(VL)区的氨基酸序列中测定KabatCDR的氨基酸序列的有用方法提供如下：
为鉴定CDR-L1氨基酸序列：
从VL区氨基端约24个氨基酸残基起始；
CDR-L1序列之前的残基通常是半胱氨酸(C)；
残基之后CDR-L1序列通常是色氨酸(W)残基，一般地Trp-Tyr-Gln(W-Y-Q)，也有Trp-Leu-Gln(W-L-Q)，Trp-Phe-Gln(W-F-Q)和Trp-Tyr-Leu(W-Y-L)；
长度一般为10-17个氨基酸残基。
为鉴定CDR-L2氨基酸序列：
CDR-L1末端之后通常16个残基起始；
CDR-L2序列之前的残基一般是Ile-Tyr(I-Y)，也有Val-Tyr(V-Y)，Ile-Lys(I-K)和Ile-Phe(I-F)；
长度通常是7个氨基酸残基。
为鉴定CDR-L3氨基酸序列：
CDR-L2的末端之后通常33个氨基酸起始；
CDR-L3氨基酸序列之前的残基通常是半胱氨酸(C)；
之后的残基通常是Phe-Gly-X-Gly(F-G-X-G)(SEQIDNO：374)，其中X是任意氨基酸；
长度一般为7-11个氨基酸残基。
为鉴定CDR-H1氨基酸序列：
从VH区的氨基端约31个氨基酸残基和通常半胱氨酸(C)之后9个残基起始；
之前的残基通常是Cys-X-X-X-X-X-X-X-X(SEQIDNO：375)，其中X是任意氨基酸；
之后的残基通常是Trp(W)，一般地Trp-Val(W-V)，也有Trp-Ile(W-I)和Trp-Ala(W-A)；
长度一般为5-7个氨基酸残基。
为鉴定CDR-H2氨基酸序列：
CDR-H1的末端之后通常15个氨基酸残基起始；
之前的残基一般为Leu-Glu-Trp-Ile-Gly(L-E-W-I-G)(SEQIDNO：376)，但也有其他变化；
之后的残基是Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala(K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I/A)；
长度一般为16-19个氨基酸残基。
为鉴定CDR-H3氨基酸序列：
CDR-H2的末端之后通常33个氨基酸残基和通常半胱氨酸(C)′之后3个残基起始
之前的残基通常为Cys-X-X(C-X-X)，其中X是任意氨基酸，一般地Cys-Ala-Arg(C-A-R)；
之后的残基通常为Trp-Gly-X-Gly(W-G-X-G)(SEQIDNO：377)，其中X是任意氨基酸；
长度一般为3-25个氨基酸残基。
术语“CDR嫁接的抗体”指包含来自一个物种的重和轻链可变区序列的抗体，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列用另一个物种的CDR序列替换，例如具有鼠重和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDRs(例如，CDR3)已用人CDR序列替换。
术语“人源化抗体”指包含来自非人物种(例如，小鼠)的重和轻链可变区序列的抗体，但其中至少部分VH和/或VL序列已改变成更“人样”，即更类似于人种系可变序列。“人源化抗体”是抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，其与目的抗原免疫特异性结合，且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的构架(FR)区、和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如此处使用的，在CDR上下文中的术语“基本上”指具有的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％等同于非人抗体CDR的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包含基本上所有至少一个、且一般为2个可变结构域(Fab、Fab′、F(ab′)2、FabC、Fv)，其中所有或基本上所有CDR区对应非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些，且所有或基本上所有构架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一个实施方案中，人源化抗体也包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般为人免疫球蛋白的那种。在一些实施方案中，人源化抗体包含轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的CH1、铰链、CH2、CH3、和CH4区。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化轻链。在一些实施方案中，人源化抗体只包含人源化重链。在具体实施方案中，人源化抗体只包含轻链的人源化可变结构域和/或人源化重链。
人源化抗体可以选自任何种类的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包括来自超过一个种类或同种型的序列，并且可以使用本领域众所周知的技术选择特定恒定结构域，以最佳化所需效应子功能。
人源化抗体的构架和CDR区无需精确对应于亲本序列，例如供体抗体CDR，或共有构架可以通过至少一个氨基酸残基的取代、***和/或缺失进行诱变，从而使得在那个位点上的CDR或构架残基不对应于供体抗体或共有构架。然而，在优选实施方案中，此种突变将不是广泛的。通常，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％且最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文使用的，术语“共有构架”指在共有免疫球蛋白序列中的构架区。如本文使用的，术语“共有免疫球蛋白序列”指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见，例如Winnaker，FromGenestoClones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，1987))。“共有免疫球蛋白序列”因此可包括“共有构架区(一个或多个)”和/或“共有CDR(一个或多个)”。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置由家族中在那个位置上最频繁出现的氨基酸占据。如果2个氨基酸同样频繁出现，那么任一个可以包括在共有序列中。
“亲和力成熟的”抗体是在其一个或多个CDRs中具有一种或多种改变的抗体，与没有这些改变的亲本抗体相比较，所述改变导致抗体对靶抗原的亲和力改善。示例性的亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔的亲和力。用于产生亲和力成熟的抗体的多种程序是本领域已知的。例如，Marks等人，Bio/Technology10：779-783(1992)描述了通过VH和VL结构域改组的亲和力成熟。CDR和/或构架残基的随机诱变由下述描述：Barbas等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，91：3809-3813(1994)；Schier等人，Gene，169：147-155(1995)；Yelton等人，J.Immunol.，155：1994-2004(1995)；Jackson等人，J.Immunol.，154(7)：3310-3319(1995)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)。在美国专利号6,914,128B1中描述了由活性增强氨基酸残基在选择性诱变位置及在接触或高变位置的选择性突变。
术语“多价结合蛋白”指包含2个或更多抗原结合部位(在本文也称为“抗体结合结构域”)的结合蛋白。多价结合蛋白优选经工程改造为具有3个或更多抗原结合部位，且一般不是天然存在的抗体。术语“多特异性结合蛋白”指能够结合2种或更多相关或无关靶的结合蛋白，其包括能够结合同一靶分子的2种或更多不同表位的结合蛋白。
如本文使用的，术语“双特异性抗体”指通过下述产生的全长抗体，四源杂交瘤技术(参见Milstein等人，Nature，305(5934)：537-540(1983))，2种不同单克隆抗体的化学缀合(参见Staerz等人，Nature，314(6012)：628-631(1985))，或结进孔(knob-in-hole)或在Fc区中引入突变的类似方法(参见Holliger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(14)：6444-6448(1993))，从而导致其中只有一种是功能性双特异性抗体的多种不同免疫球蛋白种类。通过分子功能，双特异性抗体结合其2个结合臂之一(1对HC/LC)上的一种抗原(或表位)，且结合其第二个臂(不同对的HC/LC)上的不同抗原(或表位)。通过这个定义，双特异性抗体具有2个不同的抗原结合臂(在特异性和CDR序列中)，且对于其结合的每种抗原是单价的。
如本文使用的，术语“双重特异性抗体”指可以在其2个结合臂的每一个中(一对HC/LC)结合2种不同抗原(或表位)的全长抗体(参见PCT公开WO02/02773)。因此，双重特异性结合蛋白具有2个相同的抗原结合臂，具有相同的特异性和相同的CDR序列，且对于其与之结合的每种抗原是二价的。
本发明的“双重可变结构域”(“DVD”)结合蛋白包含2个或更多抗原结合部位，且可以是二价(两个抗原结合部位)、四价(四个抗原结合部位)或多价结合蛋白。DVD可以是单特异性的，即能够结合一种抗原(或一个特异性表位)，或多特异性的，即能够结合2种或更多抗原(即同一靶抗原分子的两个或多个表位或不同靶抗原的两个或多个表位)。包含2条重链DVD多肽和2条轻链DVD多肽的优选DVD结合蛋白称为“DVD免疫球蛋白”或“DVD-Ig”。此类DVD-Ig结合蛋白因此是四聚体的并象IgG分子一样，但提供比IgG分子更多的抗原结合部位。因此，每一半的四聚体DVD-Ig分子象IgG分子的一半，并且包含重链DVD多肽和轻链DVD多肽，但是不象提供单个抗原结合结构域的IgG分子的一对重链和轻链，DVD-Ig的一对重链和轻链提供两个或多个抗原结合部位。
DVD-Ig结合蛋白的每个抗原结合部位源自供体(“亲本”)单克隆抗体并因此包括重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，具有总共6个CDR，涉及每个抗原结合部位的抗原结合。因此，结合两个不同表位(即，两个不同抗原分子的两个不同表位或同一抗原分子的两个不同表位)的DVD-Ig结合蛋白包括源自第一亲本单克隆抗体的抗原结合部位和第二亲本单克隆抗体的抗原结合部位。
DVD-Ig结合分子的设计、表达和表征的描述在PCT公开号WO2007/024715，美国专利号7,612,181和Wu等人，NatureBiotech.，25：1290-1297(2007)中提供。此种DVD-Ig分子的优选例子包括包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的重链，其中VD1是第一个重链可变结构域，VD2是第二个重链可变结构域，C是重链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，X2是Fc区，和n是0或1，但优选1；和包含结构式VD1-(X1)n-VD2-C-(X2)n的轻链，其中VD1是第一个轻链可变结构域，VD2是第二个轻链可变结构域，C是轻链恒定结构域，X1是接头，条件是它不是CH1，和X2不包含Fc区；和n是0或1，但优选1。此种DVD-Ig可以包括2条此种重链和2条此种轻链，其中每条链包括串联连接的可变结构域，而在可变区之间没有间插恒定区，其中重链和轻链结合以形成串联功能性抗原结合部位，并且一对重和轻链可以与另一对重和轻链结合，以形成具有4个功能性抗原结合部位的四聚结合蛋白。在另一个例子中，DVD-Ig分子可以包括重和轻链，其各自包括串联连接的3个可变结构域(VD1、VD2、VD3)，而在可变结构域之间没有间插恒定区，其中一对重和轻链可以结合以形成3个抗原结合部位，并且其中一对重和轻链可以与另一对重和轻链结合，以形成具有6个抗原结合部位的四聚结合蛋白。
在优选的实施方案中，根据本发明的DVD-Ig结合蛋白不但结合其亲本单克隆抗体结合的相同靶分子，还具有它的一种或多种亲本单克隆抗体的一种或多种期望的性质。优选地，这种另外的性质是一种或多种亲本单克隆抗体的抗体参数。可以赋予来自其一种或多种亲本单克隆抗体的DVD-Ig结合蛋白的抗体参数包括但不限于抗原特异性、抗原亲和力、效力、生物学功能、表位识别、蛋白稳定性、蛋白溶解性、产生效率、免疫原性、药物动力学、生物利用性、组织交叉反应性和同源抗体结合。
根据本发明的DVD-Ig结合蛋白结合人DLL4蛋白的至少一种表位。根据本发明的DVD-Ig结合蛋白的非限制性实例包括结合人DLL4一个或多个表位的DVD-Ig结合蛋白，结合人DLL4的表位和另一物种DLL4(例如小鼠)的表位的DVD-Ig结合蛋白和结合人DLL4的表位和另一靶分子(例如VEGFR2或VEGFR1)的表位的DVD-Ig结合蛋白。
结合蛋白的“功能性抗原结合部位”是能够结合靶抗原的结合部位。抗原结合部位的抗原结合亲和力不必与抗原结合部位由其衍生的亲本抗体一样强，但结合抗原的能力必须是可使用已知用于评价与抗原结合的抗体的多种方法中的任何一种测量的。此外，本文的多价抗体的每个抗原结合部位的抗原结合亲和力无需在量上相同。
如本文使用的，术语“接纳体”和“接纳体抗体”指提供或编码一个或多个构架区的至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列的抗体或核酸序列。在一些实施方案中，术语“接纳体”指提供或编码一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另外一个实施方案中，术语“接纳体”指提供或编码一个或多个构架区和一个或多个恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在具体实施方案中，术语“接纳体”指这样的人抗体氨基酸或核酸序列，其提供或编码一个或多个构架区的至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％氨基酸序列。依照这个实施方案，接纳体可以包含至少1、至少2、至少3、至少4、至少5或至少10个氨基酸残基，其不在人抗体的一个或多个特定位置上出现。接纳体构架区和/或一个或多个接纳体恒定区可以例如衍生自或得自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能抗体(例如本领域众所周知的抗体、开发中的抗体或可通过商业途径获得的抗体)。
如本文使用的，术语“规范”残基指在CDR或构架中限定特定规范CDR结构的残基，如通过Chothia等人(J.Mol.Biol.196：901-907(1987)；Chothia等人，J.Mol.Biol.227：799(1992)，两者都引入本文作为参考)限定的。根据Chothia等人，许多抗体的CDRs的关键部分具有几乎等同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上的大多样性。每个规范结构主要为形成环的氨基酸残基的邻接区段限定了一组肽主链扭转角。
如本文使用的，术语“供体”和“供体抗体”指提供一个或多个CDR的抗体。在优选实施方案中，供体抗体是来自与由其获得或衍生构架区的抗体不同的物种的抗体。在人源化抗体的背景中，术语“供体抗体”指提供一个或多个CDR的非人抗体。
如本文使用的，术语“构架”或“构架序列”指减去CDR的可变区的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以由不同***来决定，所以对构架序列的含义进行相应不同的解释。6个CDRs(轻链的CDR-L1、-L2和-L3，以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)也将轻链和重链上的构架区分成在每条链上的4个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，且CDR3位于FR3和FR4之间。不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4，如其他人提及的，构架区代表单条天然存在的免疫球蛋白链可变区内的组合FR′s。如本文使用的，FR代表4个亚区之一，且FR代表构成构架区的4个亚区中的2个或更多。
人重链和轻链接纳体序列是本领域已知的。在本发明的一个实施方案中，人重链和轻链接纳体序列选自表2和表3中所述的序列。
表2.重链接纳体序列
表3.轻链接纳体序列
如本文使用的，术语“种系抗体基因”或“基因片段”指由非淋巴样细胞编码的免疫球蛋白序列，所述非淋巴样细胞尚未经历成熟过程，所述成熟过程导致用于表达特定免疫球蛋白的遗传重排和突变(参见，例如，Shapiro等人，Crit.Rev.Immunol.，22(3)：183-200(2002)；Marchalonis等人，Adv.Exp.Med.Biol.，484：13-30(2001))。由本发明的各种实施方案提供的优点之一源于下述认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种中个体特有的基本氨基酸序列结构，因此当在那个物种中治疗上使用时，更不可能被识别为来自外来来源。
如本文使用的，术语“关键残基”指在可变区内对抗体特别是人源化抗体的结合特异性和/或亲和力具有更多影响的某些残基。关键残基包括但不限于下述中的一个或多个：与CDR接近的残基、潜在糖基化位点(可以是N或O-糖基化位点)、稀有残基、能够与抗原相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范残基、在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、在Vernier区内的残基、和在可变重链CDR1的Chothia定义和第一个重链构架的Kabat定义之间重叠的区域中的残基。
如本文使用的，“Vernier”区指可以调整CDR结构且精调与抗原的配合(fit)的构架残基的亚群，如通过Foote和Winter描述的(J.Mol.Biol.224：487-499(1992))。Vernier区残基形成CDRs基础层，并且可以影响CDRs的结构和抗体的亲和力。
如本文使用的，术语“中和”指当结合蛋白特异性结合抗原时，中和抗原的生物学活性。在一个实施方案中，中和结合蛋白结合抗原使其生物学活性减少至少约20％、40％、60％、80％、85％或更多。
术语“活性”包括活性例如抗体对于抗原的结合特异性/亲和力，例如与DLL4抗原结合的抗hDLL4抗体和/或抗体的中和能力，或其与hDLL4的结合抑制hDLL4的生物学活性的抗hDLL4抗体，例如，在配体-受体结合测定中抑制受体结合或在人Notch报告物测定中抑制受体激活，或在内皮细胞出芽测定中刺激内皮细胞增殖。
术语“表位”包括与免疫球蛋白或T细胞受体特异性结合的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子例如氨基酸、糖侧链、磷酰基、或磺酰基的化学活性表面定组(grouping)，且在某些实施方案中，可以具有具体三维结构特征、和/或具体电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。表位因此由抗原(或其片段)的区域的氨基酸残基组成，所述氨基酸残基已知结合特异性结合配偶体上的互补部位。抗原或抗原性片段可含有多余一个表位。因此，本领域技术人员理解的是抗体分子的每个“抗原结合部位”结合抗原分子的表位并且每个抗原分子可具有一个、两个、几个或许多个表位。另外，本领域技术人员理解的是对于抗原分子的两个独立分离的抗体可在抗原分子的相同表位或两个不同表位结合。
在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子复杂混合物中识别其靶抗原时，它被说成特异性结合抗原。如果抗体交叉竞争(一个阻止另一个的结合或调谐作用)，则将抗体称为“结合相同表位”。另外，表位的结构性定义(重叠、类似、同一)是提供信息的，但是功能性定义往往更加相关，因为它们包含了结构性(结合)和功能性(调谐、竞争)参数。
如本文使用的，术语“表面等离振子共振”指通过检测生物传感器基质内的蛋白浓度改变，例如使用***(BIAcoreInternationalAB，aGEHealthcarecompany，Uppsala，Sweden和Piscataway，NewJersey，US)，允许分析实时生物特异性相互作用的光学现象。关于进一步的描述，参见等人，Ann.Biol.Clin.，51：19-26(1993)；等人BioTechniques，11：620-627(1991)；Johnsson等人，J.Mol.Recognit.，8：125-131(1995)；和Johnsson等人，Anal.Biochem.，198：268-277(1991)。
如本领域已知的，如本文使用的术语“Kon”意指结合蛋白(例如抗体)与相关配偶体(例如抗原)结合以形成配偶体/相关配偶体(例如抗体/抗原)复合物的结合速率常数。也将“Kon”称为术语“结合速率常数”或“Ka”，如此处可互换使用的。该值指示抗体与其靶抗原的结合速率、或抗体与抗原之间的复合物形成速率，还由下列等式表示：
抗体(“Ab”)+抗原(“Ag”)→Ab-Ag。
如本领域已知的，如本文使用的术语“Koff”意指结合蛋白(例如抗体)从例如抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数。“Koff”还称为术语“解离速率常数”或“kd”，如此处可互换使用的。该值指示抗体从其靶抗原的解离速率、或Ab-Ag复合物随时间过去分离为游离抗体和抗原的解离速率，其表示为下列等式：
Ab+Ag←Ab-Ag。
如本文可互换使用的，术语“平衡解离常数”或“KD”指在滴定测量中在平衡时、或者通过将解离速率常数(Koff)除以结合速率常数(Kon)所获得的值。使用结合速率常数、解离速率常数和平衡解离常数表示抗体对抗原的结合亲和力。确定结合和解离速率常数的方法为本领域熟知。使用基于荧光的技术提供了高灵敏度以及在生理缓冲液中在平衡时检查样品的能力。可以使用其他实验途径和仪器例如表面等离振子共振生物分子相互作用分析)测定(例如，可以从BIAcoreInternationalAB，aGEHealthcarecompany，Uppsala，瑞典获得的仪器)。另外，也可以使用可以从SapidyneInstruments(Boise，Idaho)获得的(动态排阻测定(KineticExclusionAssay))测定。
“标记”和“可检测标记”指附着在特异性结合配偶体例如抗体或被抗体结合的分析物的部分，以例如使特定结合对的成员例如抗体和分析物之间的反应可以检测。将这样标记的特异性结合配偶体例如抗体或分析物称为“可检测地标记的”。因而，如本文使用的术语“标记的结合蛋白”指具有标记掺入的蛋白，所述标记为结合蛋白的鉴定作准备。在一个实施方案中，标记是可检测标记，其可以产生能通过目视或仪器工具检测的信号，例如，掺入放射性标记的氨基酸或使生物素化(biotinyl)部分与多肽附着，所述生物素化部分可以通过标记的抗生物素蛋白(例如包含可以通过光学或比色法检测的荧光标记或酶促活性的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)进行检测。关于多肽的标记例子包括但不限于下述：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm)，色原、荧光标记(例如，FITC、罗丹明和镧系磷光体)，酶促标记(例如，辣根过氧化物酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)，化学发光标记，生物素化基团，由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、关于第二抗体的结合位点、金属结合结构域和表位标签)，和磁性试剂(例如钆螯合物)。免疫测定一般采用的代表性标记实例包括产生光的部分，例如吖啶(acridinium)化合物，以及产生荧光的部分，例如荧光素。其他标记是本领域已知的或如此处所述。在这点上，部分自身可能不是可检测地标记的，但是与另一个部分反应后，可能变得可检测。使用“可检测地标记的”意指包含后一种类型的可检测标记。
术语“抗体缀合物”指与第二化学部分，例如治疗剂或细胞毒剂化学连接的结合蛋白例如抗体。术语“试剂”在本文中用于指化合物、化合物混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。优选地，治疗剂或细胞毒剂包括但不限于，百日咳毒素、紫素、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、心得安、和嘌呤霉素及其类似物或同源物。
如本文使用的，术语“晶体”和“结晶的”指以晶体形式存在的结合蛋白(例如抗体)或其抗原结合部分。晶体是物质固态的一种形式，它不同于其他形式例如无定形固态或液晶态。晶体由规则、重复、三维排列的原子、离子、分子(例如，蛋白例如抗体)、或分子组合(assembly)(例如，抗原/抗体复合物，包括Fab/抗原复合物)组成。这些三维排列根据本领域充分了解的特定数学关系排列。晶体中重复的基本单位或构件被称为不对称单位。符合给定、明确的晶体学对称性的排列中的不对称单位重复提供了晶体的“晶胞”。通过在所有3个维度中规则平移的晶胞重复提供了晶体。参见Giegé等人，InCrystallizationofNucleic AcidsandProteins，aPracticalApproach，第2版，(Ducruix和Giegé，编)(OxfordUniversityPress，NewYork，1999)第一章第1-16页。
术语“多核苷酸”意指2个或更多核苷酸的聚合形式，所述核苷酸为核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括单和双链形式的DNA。
术语“分离的多核苷酸”应意指下述多核苷酸(例如，基因组的、cDNA、或合成来源的，或其某一组合)，由于其来源，“分离的多核苷酸”不与在自然界中发现“分离的多核苷酸”与之结合的全部或部分多核苷酸结合；与在自然界中它不与之连接的多核苷酸可操作地连接；或在自然界中不作为较大序列的部分存在。
术语“载体”意指能够运输它已与之连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，它指另外的DNA区段可以连接到其内的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中另外的DNA区段可以连接到病毒基因组内。某些载体能够在它们已引入其内的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞内后可以整合到宿主细胞基因组内，且因此连同宿主基因组一起进行复制。此外，某些载体能够指导它们与之可操作地连接的基因表达。此种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简单地，“表达载体”)。一般而言，在重组DNA技术中使用的表达载体通常为质粒的形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明预期包括此种其他形式的表达载体，例如提供等价功能的病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。载体的RNA形式(其包括RNA病毒载体)也可在本发明中发现用途。
术语“可操作地连接的”指其中所述组分处于允许它们以其预期方式起作用的关系中的并列。与编码序列“可操作地连接的”控制序列以这样的方式连接，从而使得编码序列的表达在与控制序列相容的条件下完成。“可操作地连接的”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列，反式(即位于与目的基因不同的核酸分子上)表达控制序列，以及位于与与目的基因相同的核酸分子上但在远处的表达控制序列。如本文使用的，术语“表达控制序列”指实现它们与之连接的编码序列表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和需要时，增强蛋白分泌的序列。此种控制序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此种控制序列一般包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序列；在真核生物中，此种控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”预期包括其存在是表达和加工必需的组分，且还可以包括其存在是有利的另外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。
“转化”指外源核酸(即DNA分子)通过其进入宿主细胞的任何方法。转化可以使用本领域众所周知的各种方法在天然或人工条件下发生。转化可以依赖于用于将外来核酸序列***原核或真核宿主细胞内的任何已知方法。该方法基于待转化的宿主细胞进行选择，且可以包括但不限于，吸收质粒穿过细胞膜、病毒感染、电穿孔、脂质转染、和粒子轰击。此种“转化的”细胞包括其中***的DNA能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体部分复制的稳定转化的细胞。它们还包括瞬时表达***的DNA或RNA有限时间段的细胞。
术语“重组宿主细胞”(或简单地“宿主细胞”)意指其中已引入外源DNA的细胞。在一个实施方案中，宿主细胞包括编码抗体的2种或更多(例如多种)核酸，例如，通过非限定性实例的方式，美国专利号7,262,028中所述的宿主细胞。此种术语不仅意指特定的受试细胞，还意指此种细胞的后代。因为由于突变或环境影响可能在随后世代中出现某些修饰，所以此种后代实际上可能不等同于亲本细胞，但仍包括在如本文使用的术语“宿主细胞”的范围内。在一个实施方案中，宿主细胞包括选自任何生物界的原核和真核细胞。在另一个实施方案中，真核细胞包括原生生物、真菌、植物和动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞包括但不限于原核物种，例如大肠杆菌(Escherichiacoli)；哺乳动物细胞系，例如CHO、HEK293、COS、NS0、SP2和PER.C6；昆虫细胞系Sf9和真菌细胞物种，例如酿酒酵母。
标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成、以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明书或如本领域通常完成的或如本文所述的来进行。前述技术和程序一般可以根据本领域众所周知以及如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。参见例如，Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第2版(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1989)。
如本领域已知的，“转基因生物”指具有包含转基因的细胞的生物，其中引入生物(或生物祖先)内的转基因表达在该生物中非天然表达的多肽。“转基因”是DNA构建体，所述DNA构建体稳定且可操作地整合到转基因生物由其发育的细胞的基因组内，从而指导编码的基因产物在转基因生物的一种或多种细胞类型或组织中表达。
术语“调节”和“调谐”可互换使用，且如本文使用的，指目的分子活性(例如，hDLL4的生物学活性)中的变化或改变。调谐可以是目的分子的某一活性或功能量级中的增加或减少。分子的示例性活性和功能包括但不限于，结合特征、酶促活性、细胞受体激活、和信号转导。
相应地，如本文使用的，术语“调节剂”是能够改造或改变目的分子活性或功能(例如，hDLL4的生物学活性)的化合物。例如，与在不存在调节剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，调节剂可以引起分子某一活性或功能量级中的增加或减少。在某些实施方案中，调节剂是减少分子至少一种活性或功能量级的抑制剂。示例性抑制剂包括但不限于，蛋白、肽、抗体、肽体(peptibodies)、碳水化合物或小有机分子。肽体已在参加例如PCT公开号WO01/83525中描述。
如本文使用的，术语“激动剂”指当与目的分子接触时，与在不存在激动剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的增加的调节剂。具体目的激动剂可以包括但不限于，Notch-信号通路的成员、DLL4多肽和核酸、碳水化合物、或与DLL4结合的任何其他分子。
如本文使用的，术语“拮抗剂”或“抑制剂”指当与目的分子接触时，与在不存在拮抗剂的情况下观察到的活性或功能量级相比较，引起分子某一活性或功能量级中的减少的调节剂。具体目的拮抗剂包括阻断或调节DLL4特别是人DLL4(hDLL4)的生物学或免疫学活性的那些。hDLL4的拮抗剂和抑制剂可以包括但不限于，蛋白、核酸、碳水化合物、或与hDLL4和/或啮齿类DLL4结合的任何其他分子。
如本文使用的，术语“有效量”指疗法的量，其足以减少或改善病症或其一种或多种症状的严重性和/或持续时间，抑制或预防病症进展，引起病症消退，抑制或预防与病症相关的一种或多种症状复发、发展、发作或进展，检测病症，或增强或改善另一种疗法(例如，预防或治疗剂)的预防或治疗作用。
在本文中“患者”和“受试者”可以互换使用，以指动物，例如哺乳动物，包括灵长类动物(例如人、猴和黑猩猩)、非灵长类动物(例如牛、猪、骆驼、美洲驼(llama)、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠和鲸)、鸟(例如鸭或鹅)和鲨鱼。优选的，患者或受试者为人，例如对疾病、病症或状况进行治疗或评估的人，处于疾病、病症或状况危险中的人，患有疾病、病症或状况的人，和/或对疾病、病症或状况进行治疗的人。更优选地，治疗或评估患者或受试者的癌症或其他疾病，其中存在的异常DLL4表达支持所述癌症或其他疾病并抑制或破坏DLL4活性是治疗癌症或其他疾病所期望的。
如本文使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文使用的，“生物学样品”包括但不限于，来自生物(livingthing)或从前生物的任何量的物质。此种生物包括但不限于，人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他动物。此种物质包括但不限于，血液(例如全血)、血浆、血清、尿、羊膜液、滑液、内皮细胞、白细胞、单核细胞、其他细胞、器官、组织、骨髓、***和脾。
“组分”、“多种组分”和“至少一种组分”一般指捕获抗体、检测或缀合抗体、对照、校准物(calibrator)、一系列校准物、灵敏度实验对象组(sensitivitypanel)、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测试剂、预处理试剂/溶液、底物(例如作为溶液)、终止液等，依照此处所述方法和其他本领域已知方法，其可以包括于用于测试样品(例如患者尿、血清或血浆样品)测定的试剂盒中。因此，在本公开内容上下文中，“至少一种组分”、“组分”和“多种组分”可以包括如上的多肽或其他分析物，例如包含分析物比如多肽的组合物，其任选地固定在固体支持物上，例如通过与抗分析物(例如，抗多肽)抗体结合。一些组分可以在溶液中或者被冻干以重构用于测定。
“风险”指特定事件目前或将来某时刻发生的可能性或概率。“风险分层”指已知临床风险因子的排列，它允许医师将患者划分为发展特定疾病、病症或状况的低、中、高或最高风险。
在特异性结合对(例如抗原或其片段和抗体或其抗原结合片段)成员之间相互作用的上下文中，“特异的”和“特异性”指相互作用的选择性反应性。短语“特异性结合”和类似短语指抗体(或其抗原结合片段)特异性结合目的分子(或其片段)而不对其他实体特异性结合的能力。
“特异性结合配偶体”是特异性结合对的成员。特异性结合对包含两个不同的分子，它们通过化学或物理方式彼此特异性结合。因此，除了抗原和抗体特异性结合对，其他特异性结合对可以包括生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)、碳水化合物和凝集素、互补核苷酸序列、效应物与受体分子、辅因子和酶、酶抑制物和酶等。另外，特异性结合对可以包括作为最初特异性结合成员类似物的成员，例如分析物类似物。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、抗原片段和抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体及其复合物、片段和变体(包括变体的片段)，无论是分离的还是重组产生的。
此处使用的“变体”指这样的多肽，该多肽通过氨基酸的添加(例如***)、缺失或保守取代而在氨基酸序列上不同于给定多肽(例如DLL4多肽或抗DLL4抗体)，但保持该给定多肽生物学活性(例如变体DLL4可以与野生型DLL4竞争结合抗-DLL4抗体，如果变体DLL4保持野生型DLL4的原始抗体结合部位(表位))。氨基酸保守取代，即，将氨基酸用具有相似特性(例如，亲水性和带电区域的程度和分布)的不同氨基酸替换，被本领域认可为一般涉及小改变。如本领域所理解的，可以部分通过考虑氨基酸的亲水指数而鉴定这些小改变(见，例如Kyte等人，J.Mol.Biol.，157：105-132(1982))。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知，可以取代具有相似亲水指数的氨基酸，而仍然保持蛋白功能。一方面，取代具有亲水指数±2的氨基酸。也可以使用氨基酸亲水性来揭示将引起保持生物学功能的蛋白的取代。在肽的上下文中，考虑氨基酸的亲水性允许对该肽的最大局部平均亲水性的计算，这是据报道与抗原性和免疫原性良好关联的有用的量度(参见，例如，美国专利号4,554,101)。如本领域所理解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保持生物学活性的肽，所述生物学活性例如免疫原性。一方面，用彼此具有±2以内的亲水性值的氨基酸来实施取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值都受该氨基酸的具体侧链影响。与那个观察一致，将与生物学功能相容的氨基酸取代理解为取决于氨基酸、且尤其是那些氨基酸的侧链的相对相似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。“变体”也可用于描述已经经过不同加工(例如蛋白酶解、磷酸化或其他翻译后修饰)而仍然保持其生物学活性或抗原反应性(例如结合DLL4的能力)的多肽或其片段。除非另外与上下文相矛盾，此处使用“变体”意在包含变体的片段。
如本文使用的，术语“样品”以其最广泛的含义使用。如本文使用的，“生物学样品”包括但不限于，来自生物(livingthing)或从前生物的任何量的物质。此种生物包括但不限于，人、小鼠、大鼠、猴、狗、兔和其他动物。此种物质包括但不限于，血液、血浆、尿液、滑液、细胞、器官、组织、骨髓、***和脾。
I.结合人DLL4的抗体。
本发明的一个方面提供了分离的人单克隆DLL4结合蛋白，其以高亲和力、慢解离速率和/或高中和能力与DLL4结合。有利地，此种人抗体或其结合DLL4的抗原-结合部分发现作为人治疗剂的用途，其可施用给人患者，伴随患者免疫***针对施用的治疗用DLL4结合蛋白产生最低应答或没有应答。因此，患者可在重复的施用过程中获得此种完全人DLL4结合蛋白的益处。本发明的其它方面提供结合DLL4的嵌合抗体和结合DLL4的CDR嫁接的抗体或其抗原-结合部分。优选地，抗体或其部分是分离的抗体。优选地，本发明的抗体是中和人抗-DLL4抗体。
A.制备抗DLL4抗体的方法
本发明的抗体可以通过本领域已知的大量技术中的任意制备。优选的方法是PROfusionmRNA展示技术，如本文实施例2所示例的。另一方法是用人DLL4或其抗原性部分免疫携带人免疫球蛋白基因功能性互补体的转基因啮齿类动物(例如转基因小鼠)，随后通过标准杂交瘤技术产生表达结合人DLL4的完全人单克隆抗体的杂交瘤。此类方法获得的重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变和恒定区。此类方法提供完全人DLL4结合蛋白并消除另外进行一轮或多轮人源化以降低单克隆DLL4抗体分子非人免疫原性来源的需要。因此，利用来自多种物种的材料的技术不是较优选的，但可以使用。
还应注意的是如本文所用的术语“单克隆抗体“不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指这样的抗体，其源自单个克隆，包括任意真核、原核或噬菌体克隆，而不是指产生它的方法。
可用于获得根据本发明的DLL4单克隆抗体分子的各种技术的另外方面在下文描述。
1.使用杂交瘤技术的抗DLL4单克隆抗体
单克隆抗体可以使用本领域已知的广泛多样的技术来制备，包括使用杂交瘤、重组体、和噬菌体展示技术，或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来生产，包括本领域已知和例如Harlow等人，Antibodies：ALaboratoryManual，第2版(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1988)；Hammerling，等人：Monoclonal AntibodiesandT-CellHybridomas第563-681页(Elsevier，NewYork，1981)(所述参考文献以其整体引入作为参考)中教导的那些。关于使用杂交瘤技术产生且筛选特异性抗体的方法是本领域常规且众所周知的。在一个实施方案中，本发明提供了生成单克隆抗体的方法以及通过该方法产生的抗体，所述方法包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞，其中优选地，通过使分离自用本发明的抗原免疫接种的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，且随后就分泌能够结合本发明多肽的抗体的杂交瘤克隆筛选由融合而造成的杂交瘤，而生成杂交瘤。简言之，小鼠可以用DLL4抗原进行免疫接种。在优选实施方案中，DLL4抗原与佐剂一起施用以刺激免疫应答。此种佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。此种佐剂可以通过使多肽隔绝在局部沉积物而保护其不受快速分散，或它们可以包含刺激宿主分泌对于巨噬细胞和免疫***的其他组分是趋化性的因子的物质。优选地，如果待施用多肽，那么免疫接种时间表将涉及在几周内展开的多肽的2次或更多施用；但是，多肽的单一施用也可使用。
在用DLL4抗原免疫接种动物后，可以从动物获得抗体和/或抗体产生细胞。通过使动物放血或处死动物，从动物获得含抗DLL4抗体的血清。血清可以如其得自动物那样使用，可以从血清中获得免疫球蛋白级分，或可以从血清中纯化抗DLL4抗体。以这种方式获得的血清或免疫球蛋白是多克隆的，从而具有特性的异质阵列。
一旦检测到免疫应答，例如在小鼠血清中检测到对于抗原DLL4特异性的抗体，就收获小鼠脾且分离脾细胞。脾细胞随后通过众所周知的技术与任何合适的骨髓瘤细胞融合，例如来自可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，Virginia，US)获得的细胞系SP20的细胞。通过有限稀释选择且克隆杂交瘤。随后通过本领域已知的方法就分泌能够结合DLL4的抗体的细胞测定杂交瘤克隆。一般包含高水平抗体的腹水可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫接种小鼠生成。
在另一个实施方案中，可以由免疫接种的动物制备抗体产生性无限增殖化杂交瘤。如本领域众所周知的，在免疫接种后，处死动物且使脾B细胞与无限增殖化骨髓瘤细胞融合。参见例如，Harlow和Lane，同上。在优选实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞系)。在融合和抗生素选择后，使用DLL4或其部分或表达DLL4的细胞筛选杂交瘤。在优选实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或放射免疫测定(RIA)优选ELISA执行最初筛选。ELISA筛选的例子在引入本文作为参考的PCT公开号WO00/37504中提供。
如下文进一步讨论的，抗DLL4抗体产生性杂交瘤被选择、克隆和进一步筛选所需特征，包括强杂交瘤生长、高抗体产生和所需抗体特征。杂交瘤可以在同系动物体内、在缺乏免疫***的动物例如裸鼠、或在体外细胞培养中培养和扩增。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法是本领域普通技术人员众所周知的。
在优选实施方案中，如上所述，杂交瘤是小鼠杂交瘤。在另一个实施方案中，杂交瘤在非人、非小鼠物种，例如大鼠、绵羊、猪、山羊、牛或马中生产。在还另一个优选实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌性骨髓瘤与表达抗DLL4抗体的人细胞融合。
识别特异性表位的抗体片段可以通过已知技术生成。例如，本发明的Fab和F(ab′)2片段可以通过免疫球蛋白分子的蛋白酶剪切产生，其中使用酶例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab′)2片段)。F(ab′)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CHl结构域。
2.使用SLAM的抗DLL4单克隆抗体
在本发明的另一个方面，重组抗体使用本领域中称为选择淋巴细胞抗体法(SLAM)的程序从单个、分离的淋巴细胞中产生，所述SLAM如美国专利号5,627,052；PCT公开号WO92/02551和Babcock等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：7843-7848(1996)中所述。在这种方法中，使用抗原特异性溶血噬斑测定筛选分泌目的抗体的单个细胞，例如衍生自在章节I.A.1(如上)中所述的任何一种免疫接种的动物的淋巴细胞，其中使用接头例如生物素使抗原DLL4、DLL4的亚单位或其片段与绵羊红细胞偶联，且用于鉴定分泌对于DLL4具有特异性的抗体的单个细胞。在鉴定目的抗体分泌性细胞后，通过逆转录酶PCR(RT-PCT)从细胞中拯救重和轻链可变区cDNA，随后可以在合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)背景中，在哺乳动物宿主细胞例如COS或CHO细胞中表达这些可变区。用扩增的免疫球蛋白序列转染的、来源于体内选择的淋巴细胞的宿主细胞，随后可以经历进一步的体外分析和选择，例如通过淘选转染的细胞以分离表达针对DLL4的抗体的细胞。扩增的免疫球蛋白序列进一步可以进行体外处理，例如通过体外亲和力成熟法。参加，例如PCT公开号WO97/29131和PCT公开号WO00/56772。
3.使用转基因动物的抗DLL4单克隆抗体
在本发明的另一个实施方案中，抗体通过用DLL4抗原免疫接种非人动物来生产，所述非人动物包含一些或全部人免疫球蛋白基因座。在优选实施方案中，非人动物是转基因小鼠，包含人免疫球蛋白基因座大片段且在小鼠抗体产生方面有缺陷的工程改造的小鼠品系。参见，例如，Green等人，NatureGenetics7：13-21(1994)和美国专利号5,916,771；5,939,598；5,985,615；5,998,209；6,075,181；6,091,001；6,114,598和6,130,364。还参见于PCT公开号WO91/10741；WO94/02602；WO96/34096；WO96/33735；WO98/16654；WO98/24893；WO98/50433；WO99/45031；WO99/53049；WO00/09560和WO00/37504。转基因小鼠生产全人抗体的成体样人谱，且产生抗原特异性人单克隆抗体。通过引入兆碱基大小的、人重链基因座和x轻链基因座的种系构型YAC片段，转基因小鼠包含约80％人抗体谱。参见Mendez等人，NatureGenetics15：146-156(1997)，Green和Jakobovits，J.Exp.Med.，188：483-495(1998)，其公开内容在此引入作为参考。
4.使用重组抗体文库的抗DLL4单克隆抗体
体外方法也可以用于制备本发明的抗体，其中筛选抗体文库以鉴定具有所需DLL4结合特异性的抗体。关于重组抗体文库的此种筛选的方法是本领域众所周知的，且包括在下述参考文献中描述的方法：例如，美国专利号5,223,409(Ladner等人)；PCT公开号WO92/18619(Kang等人)；PCT公开号WO91/17271(Dower等人)；PCT公开号WO92/20791(Winter等人)；PCT公开号WO92/15679(Markland等人)；PCT公开号WO93/01288(Breitling等人)；PCT公开号WO92/01047(McCafferty等人)；PCT公开号WO92/09690(Garrard等人)；Fuchs等人，Bio/Technology，9：1369-1372(1991)；Hay等人，Hum.Antibod.Hybridomas，3：81-85(1992)；Huse等人，Science，246：1275-1281(1989)；McCafferty等人，Nature，348：552-554(1990)；Griffiths等人，EMBOJ.，12：725-734(1993)；Hawkins等人，J.Mol.Biol.，226：889-896(1992)；Clackson等人，Nature，352：624-628(1991)；Gram等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：3576-3580(1992)；Garrard等人，Bio/Technology，9：1373-1377(1991)；Hoogenboom等人，Nucl.AcidsRes.，19：4133-4137(1991)；Barbas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：7978-7982(1991)；美国专利申请公开号2003/0186374；和PCT公开号WO97/29131，其各自公开内容在此引入作为参考。
重组抗体文库可以来自用DLL4或DLL4的部分免疫接种的受试者。可替代地，重组抗体文库可以来自首次用于实验的受试者，即尚未用DLL4免疫接种的受试者，例如来自尚未用DLL4免疫接种的人受试者的人抗体文库。通过用包括人DLL4的肽筛选重组抗体文库来选择本发明的抗体，以从而选择识别DLL4的那些抗体。用于执行此种筛选和选择的方法是本领域众所周知的，例如先前段落中在参考文献中描述的。为了选择对于DLL4具有特定结合亲和力的本发明的抗体，例如以特定Koff速率常数与人DLL4解离的那些，领域已知的表面等离振子共振法可以用于选择具有所需Koff速率常数的抗体。为了选择对于hDLL4具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特定IC50的那些，可以使用本领域已知的用于评估DLL4活性抑制的方法。
在一个方面，本发明涉及结合人DLL4的分离的DLL4结合蛋白。优选地，抗体是中和抗体。在各种实施方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。
例如，本发明的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法来产生。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域在噬菌体颗粒表面上展示，所述噬菌体颗粒携带编码其的多核苷酸序列。此种噬菌体可以用于展示由谱或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。表达结合目的抗原的抗原结合结构域的噬菌体可以用抗原进行选择或鉴定，例如使用标记的抗原或被固体表面或珠结合或捕获的抗原。这些方法中使用的噬菌体一般是包括fd和M13结合结构域的丝状噬菌体，所述结合结构域由具有Fab、Fv或dsFv抗体结构域的噬菌体表达，所述抗体结构域与噬菌体基因III或基因VIII蛋白重组融合。可以用于制备本发明抗体的噬菌体展示方法的例子包括下述参考文献中公开的那些：Brinkmann等人，J.Immunol.Methods，182：41-50(1995)；Ames等人，J.Immunol.Methods，184：177-186(1995)；Kettleborough等人，Eur.J.Immunol.，24：952-958(1994)；Persic等人，Gene，187：9-18(1997)；Burton等人，AdvancesinImmunology，57：191-280(1994)；PCT公开号WO92/01047；PCT公开号WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；和5,969,108；其各自在此整体引入作为参考。
如上文参考文献中所述，噬菌体选择后，来自噬菌体的抗体编码区可以进行分离并用于产生完整抗体，且在任何所需宿主中表达，所述完整抗体包括人抗体或任何其他所需抗原结合片段，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌，例如，如下文详细描述的。例如，也可以采用重组生产Fab、Fab′和F(ab′)2片段的技术，其中使用本领域已知的方法，例如下述参考文献中公开的那些：PCT公开号WO92/22324；Mullinax等人，BioTechniques，12(6)：864-869(1992)；Sawai等人，Am.J.Reprod.Immunol.，34：26-34(1995)；和Better等人，Science，240：1041-1043(1988)(所述参考文献在此整体引入作为参考)。可以用于生产单链Fvs和抗体的技术例子包括下述参考文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；Huston等人，MethodsinEnzymology，203：46-88(1991)；Shu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：7995-7999(1993)；以及Skerra等人，Science，240：1038-1041(1988)。
作为通过噬菌体展示筛选重组抗体文库的替代，本领域已知的用于筛选大组合文库的其他方法可以应用于本发明的抗体的鉴定。如PCT公开号WO98/31700(Szostak和Roberts)，以及Roberts和Szostak，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：12297-12302(1997)中描述的，一类可替代的表达***是其中重组抗体文库作为RNA-蛋白融合物表达的表达***。在这种***中，通过在其3’末端上携带嘌呤霉素-肽基接纳体抗生素的合成mRNAs的体外翻译，在mRNA及其编码的肽或蛋白之间产生共价融合。因此，基于编码的肽或蛋白例如抗体或其部分的性质，例如抗体或其部分与双重特异性抗原的结合，特定mRNA可以从mRNAs的复杂混合物(例如，组合文库)中富集。由此种文库筛选回收的编码抗体或其部分的核酸序列，可以通过上文所述的重组方法(例如，在哺乳动物宿主细胞中)表达，且此外可以通过mRNA-肽融合物的另外筛选循环，或通过上文所述用于重组抗体体外亲和力成熟的其他方法实施进一步的亲和力成熟，在所述mRNA-肽融合物中已将突变引入最初选择的序列内。该方法的优选实例是实施例中使用的PROfusion展示技术(下文)。
在另一种方法中，本发明的抗体也可以使用本领域已知的酵母展示方法来产生。在酵母展示方法中，使用遗传方法以使抗体结构域束缚于酵母细胞壁，且将它们显示在酵母表面上。具体地，此种酵母可以用于展示由谱或组合抗体文库(例如，人或鼠)表达的抗原结合结构域。可以用于制备本发明的抗体的酵母展示方法的例子包括在此引入作为参考的美国专利号6,699,658(Wittrup等人)公开的那些。
B.重组DLL4抗体的产生
本发明的抗体可以通过本领域已知的许多技术中的任何一种来生产。例如，来自宿主细胞的表达，其中编码重和轻链的一种或多种表达载体通过标准技术转染到宿主细胞内。术语“转染”的各种形式预期包含通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞内的广泛多样的技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE葡聚糖转染等。尽管可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但在真核细胞中表达抗体是优选的，且最优选在哺乳动物宿主细胞中，这是因为此种真核细胞(且特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能装配和分泌正确折叠和免疫学活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括在Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216-4220(1980)中描述，与DHFR选择标记一起使用的dhfr-CHO细胞，例如，如Kaufman和Sharp，J.Mol.Biol.，159：601-621(1982)中描述的)、NS0骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。当编码抗体基因的重组表达载体被引入哺乳动物宿主细胞内时，抗体通过将宿主细胞培养足够时间段来生产，以允许抗体在宿主细胞中表达，或更优选地抗体分泌到其中宿主细胞生长的培养基内。抗体可以使用标准蛋白纯化法从培养基中回收。
宿主细胞也可以用于产生功能抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。将理解关于上述程序的变化在本发明的范围内。例如，可以希望用编码本发明抗体的轻链和/或重链的功能片段的DNA转染宿主细胞。重组DNA技术还可以用于去除对于与目的抗原的结合不是必需的编码轻和重链中任一个或两者的一些或全部DNA。由此种截短的DNA分子表达的分子也由本发明的抗体包含。此外，通过经由标准化学交联法使本发明的抗体与第二种抗体交联可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链是本发明的抗体，并且另一条重链和轻链对于除目的抗原外的抗原是特异性的。
在用于重组表达本发明的DLL4结合蛋白的优选***中，编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体通过磷酸钙介导的转染引入dhfr-CHO细胞内。在重组表达载体内，抗体重和轻链基因各自与CMV增强子/AdMLP启动子调节元件可操作地连接，以驱动基因的高水平转录。重组表达载体还携带DHFR基因，所述DHFR基因允许使用氨甲蝶呤选择/扩增选择已用载体转染的CHO细胞。培养所选转化体宿主细胞以允许表达抗体重和轻链，且从培养基中回收完整的抗体。使用标准分子生物学技术以制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞和从培养基中回收抗体。更进一步地，本发明提供了合成本发明的重组抗体的方法，其通过在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞直至本发明的重组抗体被合成实现。该方法可以进一步包括从培养基中分离重组抗体。
1.抗-DLL4抗体.
对于克隆E9和A10，VH和VL区softhat结合人DLL4的分离的完全人抗体的VH和VL区的氨基酸序列显示于表4(参见，下文实施例)。依照本发明分离的，E9和A10抗体的分离的抗-DLL4抗体CDR序列建立两个新的DLL4结合蛋白家族，并且其包括包含源自E9和其亲和力成熟克隆或源自A10和其亲和力成熟克隆的CDR序列的多肽。E9单克隆抗体和其亲和力成熟的衍生物的可变区和CDR列于表4，8，14，18和19。A10单克隆抗体和其亲和力成熟的衍生物可变区和CDR列于表4，9和10。为了产生和选择相对于人DLL4具有优选DLL4结合和/或中和活性的根据本发明的结合蛋白的CDR，可以使用本领域已知的用于产生本发明的结合蛋白和评估那些结合蛋白的DLL4结合和/或中和特征的标准方法，其包括但不限于本文具体所述的那些。
基于本文所述的抗-DLL4抗体E9克隆的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区的CDR的氨基酸序列比对，本发明提供了包括能够结合人DLL4的抗原结合结构域的DLL4结合蛋白，所述抗原结合结构域包括选自下述的至少一个或多个CDR：
CDR-H1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQIDNO：99)，其中：
X1是S或N；
X2是S、G或N；
X3是S、N、T、G或R；
X4是Y；
X5是Y或H；
X6是W；和
X7是G；
CDR-H2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16(SEQIDNO：100)，其中：
X1是D；
X2是I；
X3是Y、N或S；
X4是Y；
X5是T、N、A、I、S或R；
X6是G；
X7是S、N、T或G；
X8是T；
X9是Y；
X10是Y；
X11是N；
X12是P；
X13是S；
X14是L；
X15是K；和
X16是S、N、D或G；
CDR-H3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQIDNO：101)，其中：
X1是E、Y、F、Q、W、L或A；
X2是D、A、S、G、V、E或N；
X3是V、M、L、P或A；
X4是I、A、P、R、S、K、Q、V、G、M或E；
X5是L、Y、F或M；
X6是R、G、S、Q或A
X7是G；
X8是G、A或S；
X9是S、A、L、V、R或G；
X10是D；和
X11是Y、D、S、N、H、E、R、L、P、C、IM、T、Q或K；
CDR-L1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQIDNO：102)，其中：
X1是S；
X2是G；
X3是Q、E或D；
X4是R、S、G、M、K、L或T；
X5是L；
X6是G；
X7是D或E；
X8是K；
X9是Y；
X10是A或V；和
X11是S；
CDR-L2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQIDNO：103)，其中：
X1是E或Q；
X2是D；
X3是S、L、T、A、E或F；
X4是K、T、E、N、Q、S或M；
X5是R；
X6是P；和
X7是S；
以及
CDR-L3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO：104)，其中：
X1是Q；
X2是A；
X3是W；
X4是D；
X5是R、S、M、E、N、G或K；
X6是D或E
X7是T、V、A、S或M；
X8是G、A或C；和
X9是V。
优选地，包括一个或多个上述CDR的DLL4结合蛋白结合人(“hu”、“h”)DLL4以及一个或多个选自：小鼠(“murine”、“mu”)DLL4、食蟹猴(“cynomolgus”、“cyno”)DLL4和大鼠DLL4的DLL4蛋白。
基于本文所述的抗-DLL4抗体A10克隆的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区的CDR的氨基酸序列比对，本发明提供了包括能够结合人DLL4的抗原结合结构域的DLL4结合蛋白，所述抗原结合结构域包括选自下述的至少一个或多个CDR：
CDR-H1：X1-X2-X3-X4-X5(SEQIDNO：105)，其中：
X1是S、N或D；
X2是H或Y；
X3是W；
X4是M；和
X5是S或H；
CDR-H2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQIDNO：106)，其中：
X1是I、D、M或T；
X2是I；
X3是S；
X4是Y、N、S、Q、V、T、H或D；
X5是D；
X6是G；
X7是S、R、I、T、G、K、H或N；
X8是N、Y、S、I或T；
X9是K、M、N、Q、E、T、R、S、A或L；
X10是Y、D或E；
X11是S或Y；
X12是A；
X13是D；
X14是S；
X15是V；
X16是K；和
X17是G；
CDR-H3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQIDNO：107)，其中：
X1是A；
X2是G、A或R；
X3是G；
X4是G、S或A；
X5是N；
X6是V或M；
X7是G；
X8是F、L、Y或M；
X9是D；和
X10是I、S或L；
CDR-L1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQIDNO：108)，其中：
X1是S；
X2是A或G；
X3是D；
X4是K、N、L、Q、M、E、S、T、G或D；
X5是L；
X6是G；
X7是T、S、N、A、G或E；
X8是K、Q、N或R；
X9是Y；
X10是V或I；和
X11是S；
CDR-L2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQIDNO：109)，其中：
X1是Q；
X2是D；
X3是A、G、W、S或D；
X4是K、M、Q、N、L、T、I或E；
X5是R；
X6是P；和
X7是S；
以及
CDR-L3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO：110)，其中：
X1是Q；
X2是S或A；
X3是W；
X4是D；
X5是R、S、Q、P、A、V、W或M；
X6是S、G、I、N、R或T
X7是D或G；
X8是V、A、P或E；和
X9是V。
优选地，包括一个或多个上述CDR的DLL4结合蛋白结合人(“hu”)DLL4以及食蟹猴(“cynomolgus”，“cyno”)DLL4。
2.抗-DLL4嵌合抗体
嵌合抗体是其中抗体的不同部分衍生自不同动物物种的分子，例如具有衍生自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。参见例如，Morrison，Sclence，229：1202-1207(1985)；Oi等人，BioTechniques，4：214-221(1986)；Gillies等人，J.Immunol.Methods，125：191-202(1989)；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397，其整体引入本文作为参考。此外，可以使用开发用于产生“嵌合抗体”的技术，其通过剪接来自具有合适抗原特异性的小鼠抗体分子的基因连同来自具有合适生物学活性的人抗体分子的基因实现。参见，例如Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855(1984)；Neuberger等人，Nature，312：604-608(1984)；Takeda等人，Nature，314：452-454(1985)，其整体引入本文作为参考。
3.抗-DLL4CDR嫁接的抗体.
本发明的分离的抗-DLL4抗体CDR序列可用于制备CDR嫁接的抗体以调谐原始抗体的性质。此类性质包括但不限于结合动力学、亲和力、生物学活性、物种交叉反应性、分子交叉反应性、表位、物理化学性质、药物动力学性质、药代动力学性质或药学性质。CDR嫁接的抗体包含来自人抗体或非人灵长类抗体的重链和轻链可变区序列，其中VH和/或VL的一个或多个CDR区替换为原始抗-DLL4抗体的CDR序列。来自任何人或非人灵长类抗体的构架序列可以充当用于CDR嫁接的模板。然而，在此种构架上的直接链替换通常导致与抗原的结合亲和力的一些丧失。人或其他物种抗体与最初人抗体越同源，使CDR与新的人构架或非人灵长类构架组合将在CDR中引入可减小亲和力或其他性质的变形的可能性越小。因此，优选选择替换除CDR外的人可变区构架的可变构架与人抗体可变区构架具有至少30％的序列同一性。更优选选择替换除CDR外的人可变区构架的可变构架与人抗体可变区构架具有至少40％的序列同一性。更优选选择替换除CDR外的人可变构架的可变区构架与人抗体可变区构架具有至少50％的序列同一性。更优选选择替换除CDR外的人可变构架的可变区构架与人抗体可变区构架具有至少60％的序列同一性。更优选除CDR外的新的人或非人灵长类与原始可变区具有至少70％的序列同一性。甚至更加优选除CDR外的新的人或非人灵长类与原始可变区具有至少75％的序列同一性。最优选除CDR外的新的人或非人灵长类与原始可变区具有至少80％的序列同一性。即使使用高度同源的人或非人灵长类构架以嫁接原始人抗-DLL4抗体的CDR，得到的嫁接的抗体可能仍在某种程度上丧失与抗原的结合亲和力。在这种情况中，为了重获亲和力，必需的是包括原始抗体的至少一个或多个关键构架残基置换至新的嫁接的抗体的相应位置。此类关键残基可以是选自
与CDR接近的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与人DLL4相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
在Vernier区内的残基；和
在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
4.抗-DLL4人源化抗体.
尽管本发明的组合物消除制备人源化抗体的需要，但是可以使用本发明的组合物制备人源化DLL4抗体。人源化抗体是衍生自结合所需抗原的非人物种抗体的抗体分子，具有来自非人物种抗体的一个或多个互补性决定区(CDR)和来自人免疫球蛋白分子的构架区。已知的人Ig序列在例如下述万维网网站(www.)中公开，例如：
ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi；atcc.org/phage/hdb.html；sciquest.com/；
abcam.com/；antibodyresource.com/onlinecomp.html；
public.iastate.edu/.about.pedro-/research_tools.html；
mgen.uniheidelberg.de/SD/IT/IT.html；
whfreeman.com/immunology-/CH05/kuby05.htm；
library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html；
hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/；
path.-cam.ac.uk/.about.mrc7/mikeimages.html；antibodyresource.com/；
mcb.harvard.edu/BioLinks-/Immunology.html；immunologylink.com/；
pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html；biotech.ufl.edu/.about.hcl/；
pebio.com/pa/340913-/340913.html；nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/；
m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito/Elisa.html；biodesign.com/table.asp；
icnet.uk/axp/facs/davies/links.html；
biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html；isac-net.org/sites_geo.html；
aximtl.imt.unimarburg.de/.about.rek/AEP-Start.html；
baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html；
recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/；
mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html；
ibt.unam.mx/-vir/V_mice.html；imgt.cnusc.fr：8104/；
biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html；anti-body.bath.ac.uk/；
abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html；
unizh.ch/.about.honegger/AHO-seminar/Slide01.html；
cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/；nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm；
path.cam.ac.uk/.about.mrc7/humanisation/TAHHP.html；
ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html；
biosci.missouri.edu/smithgp/index.html；
cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages-/Pept/spottech.html；
jerini.de/frroducts.htm；patents.ibm.com/ibm.html。Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，U.S.Dept.Health(1983)，各自在此整体引入作为参考。如本领域已知的，此种输入的序列可以用于减少免疫原性，或减少、增强或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、抗体亲抗原性、特异性、半衰期、或任何其他合适的特征。
人构架区中的构架残基可以用来自CDR供体抗体的相应残基取代，以改变优选改善抗原结合。这些构架取代通过本领域众所周知的方法鉴定，例如通过对CDR和构架残基的相互作用建模以鉴定对抗原结合重要的构架残基，和序列比较以鉴定在特定位置上的罕见构架残基。(参见，例如，美国专利号5,585,089(Queen等人)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)，在此将其整体引入作为参考。)三维免疫球蛋白模型通常是可获得的且是本领域技术人员熟悉的。举例说明且展示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可获得的。这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列功能发挥中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可以选择FR残基且从共有和输入序列组合，从而使得达到所需抗体特征，例如对一种或多种靶抗原的亲和力增加。一般而言，CDR残基直接且最重要地与影响抗原结合有关。抗体可以使用本领域已知的多种技术进行人源化，例如但不限于下述参考文献中描述的那些：Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988)；Sims等人，J.Immunol.，151：2296-2308(1993)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.，196：901-917(1987)，Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285-4289(1992)；Presta等人，J.Immunol.，151：2623-2632(1993)；PadlanE.A.，MolecularImmunology，28(4/5)：489-498(1991)；Studnicka等人，ProteinEngineering，7(6)：805-814(1994)；Roguska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91：969-973(1994)；PCT公开号WO91/09967；WO99/06834(PCT/US98/16280)，WO97/20032(PCT/US96/18978)，WO92/11272(PCT/US91/09630)，WO92/03461(PCT/US91/05939)，WO94/18219(PCT/US94/01234)，WO92/01047(PCT/GB91/01134)，WO93/06213(PCT/GB92/01755)，WO90/14443，WO90/14424和WO90/14430；；欧洲公开号EP0592106；EP0519596和EP0239400；美国专利号5,565,332；5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；和4,816,567，各自在此整体引入作为参考，包括其中引用的参考文献。
C.抗体和产生抗体的细胞系的产生
优选地，本发明的抗-DLL4抗体显示出减少或中和肿瘤血管发生活性的高能力，例如如通过本领域已知的几种体外和体内测定中的任何一种评估的。评价中和DLL4活性可通过本领域已知的几种体外和体内测定评估。用于评估中和DLL4活性的示例性参数包括但不限于抑制DLL4与Notch受体和/或Notch-信号通路相互作用的抗体，具有IC50值为约至少10-6M；至少10-7M，或至少10-8M。
优选地，本发明的抗-DLL4抗体还显示出减少或中和DLL4活性的高能力。
在优选实施方案中，分离的抗体或其抗原-结合部分结合人DLL4，其中如通过表面等离振子共振测量的，所述抗体或其抗原-结合部分以约0.1s-1或更少的koff速率常数与人DLL4解离，或或以约1x10-6M或更少的IC50抑制DLL4和/或人DLL4活性。可替代地，如通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10-2s-1或更少的koff速率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10-7M或更少的IC50抑制人DLL4和/或人DLL4活性。可替代地，如通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10-3s-1或更少的koff速率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10-8M或更少的IC50抑制人DLL4。可替代地，如通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10-4s-1或更少的koff速率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10-9M或更少的IC50抑制DLL4活性。可替代地，如通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10-5s-1或更少的koff速率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10-10M或更少的IC50抑制DLL4和/或人DLL4活性。可替代地，如通过表面等离振子共振测量的，抗体或其抗原结合部分可以以约1x10-5s-1或更少的koff速率常数与人DLL4解离，或可以以约1x10-11M或更少的IC50抑制DLL4和/或人DLL4活性。
在某些实施方案中，抗体包括重链恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。进一步地，抗体可以包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包括κ轻链恒定区。可替代地，抗体部分可以是例如Fab片段或单链Fv片段。
Fc部分中改变抗体效应子功能的氨基酸残基替换是本领域已知的(参见美国专利号5,648,260和5624821(Winter等人))。抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导、ADCC、吞噬作用、依赖补体的细胞毒性(CDC)以及抗体和抗原-抗体复合物的半衰期/清除率。取决于治疗目的，在一些情况下这些效应子功能对于治疗用抗体是所需的，但在其他情况下可能是不必要的或甚至有害的。某些人IgG同种型，特别是IgG1和IgG3，经由分别与FcγRs和补体C1q结合介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体循环半衰期的关键组分。在还另一个实施方案中，至少一个氨基酸残基在抗体恒定区例如抗体Fc区中进行替换，从而使得抗体的效应子功能被改变。
一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的结合蛋白用另一种功能分子(例如，另一种肽或蛋白)衍生化或连接。例如，本发明的标记的结合蛋白可以通过使本发明的结合蛋白与一种或多种其他分子实体功能性连接(通过化学偶联、遗传融合、非共价结合或其他方式)来衍生，所述其他分子实体例如另一种抗体(例如，双特异性抗体或双抗体)、可检测试剂、细胞毒剂、药学试剂、和/或可以介导结合蛋白与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核心区或聚组氨酸标签)结合的蛋白或肽。
本发明的抗体或抗体部分可以由之衍生化的有用的可检测试剂包括荧光化合物。示例性荧光可检测试剂包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯、藻红蛋白等。抗体也可以用可检测酶衍生化，例如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶等。当抗体用可检测酶衍生化时，它通过添加酶用于生产可检测反应产物的另外的试剂进行检测。例如，当可检测试剂辣根过氧化物酶存在时，添加过氧化氢和二氨基联苯胺导致可检测的有色反应产物。抗体也可以用生物素衍生化，且通过抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白结合的间接测量进行检测。
本发明的另一个实施方案提供了结晶DLL4结合蛋白。优选地，本发明涉及如本文公开的DLL4结合蛋白(其包括完整抗DLL4抗体及其片段，以及抗体构建体和结合蛋白缀合物(包括抗体缀合物))的晶体，以及包含此种晶体的制剂和组合物。在一个实施方案中，结晶结合蛋白具有比结合蛋白的可溶性配对物更长的体内半衰期。在另一个实施方案中，结合蛋白在结晶化后保留生物学活性。本发明的结晶结合蛋白可以根据本领域已知的和如在此引入作为参考的PCT公开号WO02/72636中公开的方法来生产。
本发明的另一个实施方案提供了糖基化的结合蛋白，其中DLL4结合蛋白包含一个或多个碳水化合物残基。新生体内蛋白生产可以经历称为翻译后修饰的进一步加工。特别地，糖(糖基)残基可以酶促添加，这个过程称为糖基化。所得到的具有共价连接的寡糖侧链的蛋白被称为糖基化蛋白或糖蛋白。蛋白糖基化取决于目的蛋白的氨基酸序列，以及在其中表达蛋白的宿主细胞。不同生物可以产生不同的糖基化酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，且具有不同的可用底物(核苷酸糖)。由于此种因素，蛋白糖基化模式和糖基残基组成可以依赖于在其中表达特定蛋白的宿主***而不同。在本发明中有用的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、n-乙酰葡糖胺和唾液酸。优选地，糖基化的结合蛋白包含糖基残基，从而使得糖基化模式是人的。
不同的蛋白糖基化可以导致不同的蛋白特征，这是本领域技术人员已知的。例如，与哺乳动物细胞例如CHO细胞系中表达的相同蛋白的那种相比较，在微生物宿主例如酵母中生产，和利用酵母内源性途径糖基化的治疗用蛋白的功效可能是减少的。此种糖蛋白在人中也可以是免疫原性的，且在施用后显示减少的体内半衰期。人和其他动物中的特定受体可以识别特定糖基残基且促进蛋白从血流中快速清除。其他不利效应可以包括蛋白折叠、可溶性、对蛋白酶的易感性、运输、转运、区室化、分泌、由其他蛋白或因子识别、抗原性、或变应原性中的变化。因此，从业者可能更喜欢具有特定糖基化组成和模式的治疗用蛋白，例如等同于或至少类似于在人细胞或预期受试动物的物种特异性细胞中生产的那种的糖基化组成和模式。
表达不同于宿主细胞那种的糖基化蛋白可以通过遗传修饰宿主细胞以表达异源糖基化酶来完成。使用本领域已知的技术，从业者可以生成显示人蛋白糖基化的DLL4结合蛋白。例如，酵母菌株已进行遗传修饰以表达非天然存在的糖基化酶，从而使得在这些酵母菌株中生产的糖基化蛋白(糖蛋白)显示等同于动物细胞特别是人细胞那种的蛋白糖基化(美国专利申请公开号20040018590和20020137134)。
此外，本领域技术人员将认识到，目的蛋白可以使用宿主细胞文库来表达，所述宿主细胞进行基因工程改造以表达各种糖基化酶，从而使得文库的成员宿主细胞生产具有变体糖基化模式的目的蛋白。从业者随后可以选择并分离具有特定新糖基化模式的目的蛋白。优选地，具有特定选择的新糖基化模式的蛋白显示改善或改变的生物学性质。
D.DLL4结合蛋白的用途
已知其与人DLL4和鼠DLL4结合的能力，本文所述的DLL4结合蛋白(包括抗体和其部分)可以用于检测样品中(例如，在混合物、溶液或生物样中，例如血液、血清或血浆)的DLL4，其中使用本领域已知的常规免疫测定，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或组织免疫组织化学。本发明提供了用于检测样品中的人DLL4和/或鼠DLL4的方法，其包括使样品与DLL4结合蛋白接触，且检测与人DLL4和/或鼠DLL4结合的DLL4结合蛋白或未结合的结合蛋白，以从而检测样品中的人DLL4和/或鼠DLL4。本文所述的DLL4结合蛋白可用可检测物质直接或间接标记，以促进结合或未结合的DLL4结合蛋白的检测。合适的可检测物质包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料和放射性材料。合适酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺(dichlorotriazinylamine)荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；且合适放射性材料的例子包括3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho或153Sm。
可以用于DLL4测定的生物样品包括尿液、粪便、血液、血清、血浆、汗液、唾液、口腔拭子(颊、舌，或喉拭子)、***拭子、直肠拭子、皮肤拭子、皮肤刮、组织活检和由本领域已知方法可获得的任意其他组织样品。
作为标记结合蛋白的替代方案，人DLL4可以通过竞争免疫测定在生物学流体中进行测定，其中利用本文所述的由可检测物质标记的重组人(rh)DLL4标准物和未标记的DLL4结合蛋白。在这种测定中，组合生物学样品、标记的rhDLL4标准和DLL4结合蛋白，并且测定与未标记的结合蛋白结合的标记的rhDLL4标准的量。在生物学样品中人DLL4的量与和DLL4结合蛋白结合的标记的rhDLL4标准的量成反比。类似地，人DLL4还可以通过竞争免疫测定在生物学流体中进行测定，其中利用本文所述的由可检测物质标记的rhDLL4标准和未标记的DLL4结合蛋白。
本发明的DLL4结合蛋白优选能够在体外和体内中和DLL4活性，特别是人DLL4活性。因此，本发明的此种结合蛋白可以例如，在包含DLL4的细胞培养物中、在人受试者中或在表达本发明的结合蛋白与其交叉反应的DLL4的其他哺乳动物受试者中用于抑制DLL4活性。在一个实施方案中，本发明提供了用于抑制DLL4活性的方法，其包括使DLL4与本发明的DLL4抗体或其抗体部分接触，从而使得DLL4活性被抑制。例如，在包含或怀疑包含DLL4的细胞培养物中，本发明的抗体或其抗体部分可以添加到培养基中，以抑制培养物中的DLL4活性。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于减少受试者中的DLL4活性的方法，有利地来自患有其中DLL4或DLL4活性是有害的疾病或病症的受试者。本发明提供了用于减少患有此种疾病或病症的受试者中的DLL4或DLL4活性的方法，所述方法包括给受试者施用本发明的DLL4结合蛋白，从而使得受试者中的DLL4或DLL4活性减少。优选地，DLL4是人DLL4，并且受试者是人受试者。可替代地，受试者可以是表达本发明的或DLL4结合蛋白能够与之结合的DLL4的哺乳动物。更进一步地，受试者可以是DLL4已引入其内的哺乳动物(例如通过施用DLL4和/或通过表达DLL4转基因)。本发明的抗体或其他DLL4结合蛋白可以施用于人受试者用于治疗目的。此外，本发明的DLL4结合蛋白可以施用于表达结合蛋白能够与之结合的DLL4的非人哺乳动物，用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。关于后者，此种动物模型可以用于评价本发明的抗体和其他DLL4结合蛋白的治疗功效(例如测试施用剂量和时程)。
如本文使用的，术语“其中DLL4和/或Notch信号活性是有害的病症”预期包括疾病例如癌症和其他病症，其中患有该病症的受试者中DLL4和/或Notch信号活性的存在已显示或怀疑负责病症的病理生理学或是或怀疑是促进病症恶化的因素。因此，其中DLL4和/或Notch信号活性是有害的病症是其中DLL4和/或Notch信号活性的改变预期减轻病症症状和/或进展(例如肿瘤生长)的病症。此种病症可以例如由患有病症的受试者血管发生的增加(例如在肿瘤生长和形成过程中受试者血清、血浆、滑液等中本领域已知的多种蛋白浓度的增加)来证实，这可以例如使用如上所述的抗DLL4抗体进行检测。可以用本发明的抗体治疗的病症的非限制性例子包括下文关于本发明抗体的药物组合物部分中讨论的那些病症。
II.药物组合物
本发明还提供了包含本发明的DLL4结合蛋白和药学可接受的载体的药物组合物。包含本发明的DLL4结合蛋白的药物组合物用于在下述方面使用，但不限于下述方面，病症诊断、检测或监控，病症或其一种或多种症状的预防、治疗、管理或改善和/或研究。在具体实施方案中，组合物包含本发明的一种或多种抗体。在具体实施方案中，组合物包含本发明的一种或多种DLL4结合蛋白，以及除本发明结合蛋白外用于治疗其中DLL4和/或DLL4活性是有害的病症的一种或多种预防或治疗剂。优选地，预防或治疗剂已知在病症例如癌症或肿瘤或其一种或多种症状的预防、治疗、管理或改善中有用，或已在其中使用或目前正在其中使用。依照这些实施方案，组合物可以进一步包含载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的结合蛋白可以掺入适合于给受试者施用的药物组合物内。一般地，药物组合物包含本发明的DLL4结合蛋白(或其DLL4结合部分)和药学可接受的载体。如本文使用的，“药学可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。药学可接受的载体的例子包括下述一种或多种：水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化钠。药学可接受的载体可以进一步包含少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、防腐剂或缓冲液，所述辅助物质增强结合蛋白的保存期限或效力。
各种递送***是已知的，且可以用于施用本发明的一种或多种DLL4结合蛋白或本发明的一种或多种结合蛋白与预防剂或治疗剂的组合，用于预防、管理、治疗或改善病症或其一种或多种症状，例如降低肿瘤血管发生，被囊化在脂质体中、微粒、微胶囊、能够表达DLL4结合蛋白的重组细胞、受体介导的胞吞(参见，例如，Wu和Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))、作为逆转录病毒或其他载体部分的核酸构建等等。施用本发明的预防或治疗剂的方法包括但不限于，肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)，硬膜外施用，瘤内施用和粘膜施用(例如，鼻内和经口途径)。此外，可以使用肺施用，例如利用吸入器或喷雾器，和含气溶胶化剂(aerosolizingagent)的制剂。参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540、和4,880,078；以及PCT公开号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346、和WO99/66903，其各自在此整体引入作为参考。在一个实施方案中，本发明的DLL4结合蛋白、组合疗法、或本发明的组合物使用Alkermes肺药物递送技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Massachusetts，US)来施用。在具体实施方案中，本发明的预防或治疗剂肌内、静脉内、瘤内、经口、鼻内、肺、或皮下施用。预防或治疗剂可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或单次快速静脉注射，通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，且可以连同其他生物学活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。
在具体实施方案中，可能需要使本发明的预防或治疗剂局部施用在需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于局部输注、注射、或通过植入物来完成，所述植入物为多孔或无孔材料，包括膜和基质，例如硅橡胶(sialastic)膜、聚合物、纤维基质(例如，)、或胶原基质。在一个实施方案中，有效量的本发明拮抗剂的一种或多种DLL4结合蛋白局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、和/或改善病症或其症状。在另一个实施方案中，有效量的本发明的一种或多种DLL4结合蛋白，与有效量的除本发明DLL4结合蛋白外的一种或多种疗法(例如，一种或多种预防或治疗剂)组合，局部施用于受试者的受累区域，以预防、治疗、管理、和/或改善病症或其一种或多种症状。
在另一个实施方案中，预防或治疗剂可以在控释或持续释放***中递送。在一个实施方案中，可以使用泵以达到控释或持续释放(参见Langer(Science，249：1527-1533(1990))；Sefton，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.，14：201-240(1987)；Buchwald等人，Surgery，88：507-516(1980)；Saudek等人，N.Engl.J.Med.，321：574-579(1989))。在另一个实施方案中，聚合材料可以用于达到本发明疗法的控释或持续释放。参见例如，Goodson，J.M，InMedicalApplicationsofControlledRelease，Vol.II， Applications和Evaluations，(Langer和Wise，eds.)，(CRCPressInc.，BocaRaton，1984)，第6章，第115-138页；ControlledDrugBiovailability，Drug ProductDesignandPerformance，Smolen和Ball(eds.)(Wiley，NewYork，1984)；Langer和Peppas，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.Phys.，C23：61-126(1983)；seealso，Levy等人，Science，228：190-192(1985)；During等人，Ann.Neurol.，25：351-356(1989)；Howard等人，J.Neurosurg.，71：105-112(1989)；美国专利号5,679,377；5,916,597；5,912,015；5,989,463；和5,128,326；和PCT公开号WO99/15154和WO99/20253。在持续释放制剂中使用的聚合物的例子包括但不限于，聚甲基丙烯酸2-羟乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙烯酸、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、聚甲基丙烯酸、聚乙醇酸交酯(PLG)、聚酐、聚N-乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙二醇、聚丙交酯(PLA)、丙交酯-乙醇酸交酯共聚物(PLGA)、和聚原酸酯。在优选实施方案中，持续释放制剂中使用的聚合物是惰性的、不含可沥滤杂质、贮藏稳定、无菌和生物可降解的。在另外一个实施方案中，控释或持续释放***可以接近预防或治疗靶放置，从而只需要全身剂量的部分(参见，例如，Goodson，InMedical ApplicationsofControlledRelease，(1984)第115-138页)。
控释***在Langer(Science，249：1527-1533(1990))的综述中讨论。本领域技术人员已知的任何技术都可以用于生产包含本发明的一种或多种治疗剂的持续释放制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938，PCT公开号WO91/05548和WO96/20698，Ning等人，″IntratumoralRadioimmunotherapyofaHumanColonCancerXenograftUsingaSustained-ReleaseGel，″Radiother.Oncol.，39：179-189(1996)；Song等人，″AntibodyMediatedLungTargetingofLong-CirculatingEmulsions，″PDAJ.Pharm.Sci.Tech.，50：372-377(1996)；Cleek等人，″BiodegradablePolymericCarriersforabFGFAntibodyforCardiovascularApplication，″Proceed.Intl.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.，24：853-854(1997)，和Lam等人，″MicroencapsulationofRecombinantHumanizedMonoclonalAntibodyforLocalDelivery，″Proceed.Intl.Symp.ControlRel.Bioact.Mater.：24：759-760(1997)，其各自在此整体引入作为参考。
在具体实施方案中，当本发明的组合物是编码预防或治疗剂的核酸时，核酸可以体内施用以促进其编码的预防或治疗剂的表达，这通过下述实现，将其构建为合适的核酸表达载体的部分且施用，从而使得其成为细胞内的，例如利用逆转录病毒载体(参见美国专利号4,980,286)，或直接注射，或使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂包被，或与已知进入核的同源异型框样肽连接施用(参见，例如，Joliot等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：1864-1868(1991))。可替代地，核酸可以细胞内引入且通过同源重组整合入宿主细胞DNA内用于表达。
本发明的药物组合物配制为与其预期施用途径相容。施用途径的例子包括但不限于，肠胃外(例如静脉内)、皮内、皮下、经口、鼻内(例如，吸入)、经皮(例如，局部)、跨粘膜、和直肠施用。在具体实施方案中，组合物依照常规程序配制为药物组合物，所述药物组合物适合于静脉内、皮下、肌内、经口、鼻内或局部施用于人类。一般地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利多卡因(lignocamne)，以减轻注射部位处的疼痛。
如果本发明的组合物将局部施用，那么组合物可以配制为软膏、乳膏、经皮贴剂、洗剂、凝胶、洗发剂、喷雾剂、气溶胶、溶液、乳剂形式或本领域技术人员众所周知的其他形式。参见，例如Remington′s PharmaceuticalSciences和IntroductiontoPharmaceuticalDosageForms， 19thed.，(MackPublishingCo.，Easton，Pennsylavania，1995)。对于不可喷雾的局部剂型，一般采用包含与局部应用相容的载体或一种或多种赋形剂，且具有优选大于水的动态粘度的粘性至半固体或固体形式。合适的制剂包括但不限于，溶液、悬浮液、乳剂、乳膏、软膏、粉末、搽剂、油膏等，必要时进行灭菌或与助剂(例如防腐剂、稳定剂、湿润剂、缓冲液或盐)混合用于影响各种性质，例如，渗透压。其他合适的局部剂型包括可喷雾的气溶胶制剂，其中活性成分，优选与固体或液体惰性载体组合，与加压挥发物(例如，气体推进剂，例如)在混合物中包装或包装在挤压瓶中。必要时保湿剂(moisturizer)或湿润剂也可以加到药物组合物和剂型中。此种另外成分的例子是本领域众所周知的。
如果本发明的方法包括组合物的鼻内施用，那么组合物可以配制为气溶胶形式、喷雾剂、雾或滴剂形式。特别地，用于根据本发明使用的预防或治疗剂可以以从加压包或喷雾器呈递的气溶胶喷雾剂形式方便地递送，使用合适的推进剂(例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀来确定，以递送计量的量。可以配制包含化合物和合适粉末基例如乳糖或淀粉的粉末混合物的胶囊和药液筒(由例如明胶组成)，用于在吸入器或吹入器中使用。
如果本发明的方法包括经口施用，那么组合物可以配制为片剂、胶囊、扁胶剂、粒状胶囊(gelcaps)、溶液、悬浮液等经口形式。片剂或胶囊可以通过常规方法用药学可接受的赋形剂制备，所述赋形剂例如粘合剂(例如，预凝胶玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、或羟丙基甲基纤维素)；充填剂(例如，乳糖、微晶纤维素、或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或硅石)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，十二烷基硫酸钠)。片剂可以通过本领域众所周知的方法进行包被。用于经口施用的液体制剂可以采取下述形式，但不限于下述形式，溶液、糖浆或悬浮液，或它们可以呈现为干燥产品，用于在使用前用水或其他合适的载体构建。此种液体制剂可以通过常规方法用药学可接受的添加剂制备，所述添加剂例如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物、或氢化食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或***胶)；非水载体(例如，杏仁油、油酯、乙醇、或分馏植物油)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯或山梨酸)。适当时制剂还可以包含缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。用于经口施用的制剂可以适当地配制，用于缓慢释放、控释、或持续释放一种或多种预防或治疗剂。
本发明的方法可以包括用气溶胶化剂(aerosolizingagent)配制的组合物的肺施用，例如利用吸入器或喷雾器。参见，例如，美国专利号6,019,968；5,985,320；5,985,309；5,934,272；5,874,064；5,855,913；5,290,540；和4,880,078；和PCT公开号WO92/19244、WO97/32572、WO97/44013、WO98/31346、和WO99/66903，其各自在此整体引入引用作为参考。在具体实施方案中，本发明的抗体、组合疗法、和/或本发明的组合物使用Alkermes肺药物递送技术(Alkermes，Inc.，Cambridge，Massachusetts，US)来施用。
本发明的方法可以包括配制用于通过注射(例如通过单次快速静脉注射或连续输注)肠胃外施用的组合物的施用。用于注射的制剂可以与添加的防腐剂一起以单位剂型(例如，在安瓿或多剂容器中)呈递。组合物可以采取此种形式，如在油性或水性载体中的悬浮液、溶液或乳剂，且可以包含配制试剂例如悬浮、稳定和/或分散剂。可替代地，活性成分可以为粉末形式用于在使用前用合适的载体(例如，无菌无致热原水)构建。
本发明的方法可以另外包括配制为积存(depot)制剂的组合物的施用。此种长效制剂可以通过植入(例如皮下或肌内)或通过肌内注射来施用。因此，例如，组合物可以用合适的聚合或疏水材料(例如，作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制，或配制为微溶衍生物(例如，作为微溶盐)。
本发明的方法包括配制为中性或盐形式的组合物的施用。药学可接受的盐包括由阴离子形成的那些，例如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些，以及由阳离子形成的那些，例如来源于钠、钾、铵、钙、铁氢氧化物，异丙胺，三乙胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等的那些。
一般地，组合物的成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在密封容器中的干冷冻干燥粉末或无水浓缩剂，所述密封容器例如安瓿或小药囊(Sachette)，其指示活性剂的量。当施用方式是输注时，组合物可以用包含无菌药物级别的水或盐水的输注瓶分配。当施用方式是注射时，可以提供无菌注射用水或盐水安瓿，从而使得成分可以在施用前进行混合。
特别地，本发明还提供了包装在密封容器中的本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，所述密封容器例如安瓿或小药囊，其指示试剂的量。在一个实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末或无水浓缩剂提供，且可以重构(例如，用水或盐水)至合适浓度以用于给受试者施用。优选地，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，作为在密封容器中的干无菌冷冻干燥粉末提供，其单位剂量为至少5mg、更优选至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少75mg、或至少100mg。冷冻干燥的本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在其原容器中贮存于2℃-8℃，并且本发明的预防或治疗剂或药物组合物应在重构后1周内施用，优选5天内、72小时内、48小时内、24小时内、12小时内、6小时内、5小时内、3小时内、或1小时内。在可替代的实施方案中，本发明的一种或多种预防或治疗剂或药物组合物，以液体形式在指示试剂的量和浓度的密封容器中提供。优选地，液体形式的施用的组合物在密封容器中提供，其量为至少0.25mg/ml，更优选至少0.5mg/ml、至少1mg/ml、至少2.5mg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/kg、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml或至少100mg/ml。液体形式应在其原容器中贮存于2℃-8℃。
本发明的DLL4结合蛋白可以掺入适用于肠胃外施用的药物组合物内。优选地，结合蛋白将制备为包含0.1-250mg/ml抗体的可注射溶液。可注射溶液可以由在燧石或琥珀色小瓶、安瓿或预装注射器中的液体或冷冻干燥剂型组成。缓冲液可以是L-组氨酸(1-50mM)，最佳5-10mM，pH5.0-7.0(最佳pH6.0)。其他合适的缓冲液包括但不限于，琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可以用于修饰浓度0-300mM(对于液体剂型最佳150mM)的溶液的毒性。对于冷冻干燥剂型可以包括冷冻保护剂，主要为0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的冷冻保护剂包括海藻糖和乳糖。对于冷冻干燥剂型可以包括膨胀剂，主要为1-10％甘露糖醇(最佳2-4％)。稳定剂可以在液体和冷冻干燥剂型中使用，主要为1-50mML-甲硫氨酸(最佳5-10mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸、精氨酸，可以作为0-0.05％聚山梨醇酯80(最佳0.005-0.01％)包括。另外的表面活性剂包括但不限于，聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性剂。
本发明的组合物可以为多种形式。这些包括例如，液体、半固体和固体剂型，例如液体溶液(例如，可注射和可输注溶液)、分散体或悬浮液、片剂、丸剂、粉末、脂质体和栓剂。优选形式取决于预期施用方式和治疗应用。一般的优选组合物为可注射或可输注溶液形式，例如类似于由其他抗体被动免疫接种人使用的那些的组合物。优选施用方式是肠胃外的(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内)。在优选实施方案中，本文所述的DLL4结合蛋白通过静脉内输注或注射来施用。在另一个优选实施方案中，DLL4结合蛋白通过肌内或皮下注射来施用。
治疗组合物一般必须是无菌且在制备和贮存条件下是稳定的。组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散体、脂质体、或适合于高药物浓度的其他有序结构。无菌可注射溶液可以通过下述制备：将需要量的活性化合物(即，结合蛋白)与上文列举的一种成分或成分组合一起掺入合适的溶剂中，必要时随后进行过滤灭菌。一般地，分散体通过将活性化合物掺入无菌载体内来制备，所述无菌载体包含基本分散介质和来自上文列举那些的必需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌、冷冻干燥粉末的情况下，优选制备方法是由其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外所需成分的粉末的真空干燥和喷雾干燥。溶液的正确流动性可以通过下述来维持，例如利用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需颗粒大小和利用表面活性剂。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂来引起，所述试剂例如单硬脂酸盐和明胶。
本发明的DLL4结合蛋白可以通过本领域已知的多种方法来施用，尽管对于许多治疗应用，优选施用途径/模式是皮下注射、静脉内注射或输注。如技术人员将认识到的，施用途径和/或模式将依所需结果而变。在某些实施方案中，活性化合物可以与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于快速释放，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴剂、和微囊化递送***。可从而使得用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此种制剂的许多方法是获得专利保护的或是本领域技术人员一般已知的。参见，例如，Sustained和ControlledReleaseDrugDeliverySystems，J.R.Robinson，ed.，(MarcelDekker，Inc.，NewYork，1978)。
在某些实施方案中，本发明的结合蛋白可以例如，与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。化合物(和若需要，其他成分)也可以装入硬或软壳明胶胶囊中，压缩成片剂，或直接掺入受试者的饮食内。对于经口治疗施用，化合物可以与赋形剂掺合，且以可摄食片剂、口腔含化片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、薄片(wafer)等的形式使用。为了通过除肠胃外施用外施用本发明的化合物，可能必须用材料包被化合物、或将化合物与材料共施用，以防止其失活。
补充性活性化合物也可以掺入组合物内。在某些实施方案中，本发明的结合蛋白与一种或多种另外的治疗剂共配制和/或共施用，所述治疗剂用于治疗其中DLL4活性是有害的病症。例如，本发明的抗huDLL4抗体或抗体可以与结合其他靶的一种或多种另外的抗体(例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共配制和/或共施用。此外，本发明的一种或多种结合蛋白可以与2种或更多前述治疗剂组合使用。此种组合疗法可以有利地利用较低剂量的施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能毒性或并发症。
在某些实施方案中，本发明的DLL4结合蛋白与本领域已知的半衰期延长载体连接。此种载体包括但不限于，Fc结构域、聚乙二醇、和葡聚糖。此种载体在例如美国专利号6,660,843B1和公开的PCT公开号WO99/25044中描述，为了任何目的在此将其引入作为参考。
在具体实施方案中，施用包括编码本发明的结合蛋白或本发明的另一种预防或治疗剂的核苷酸序列的核酸序列，以经由基因疗法治疗、预防、管理、或改善病症或其一种或多种症状。基因疗法指通过给受试者施用表达的或可表达核酸来进行的疗法。在本发明的这个实施方案中，核酸生产其编码的结合蛋白或介导预防或治疗作用的本发明预防或治疗剂。
本领域可用的任何关于基因治疗的方法可以根据本发明使用。关于基因治疗方法的一般综述，参见Goldspiel等人，1993，ClinicalPharmacy，12：488-505；Wu等人，″Deliverysystemsforgenetherapy，″Biotherapy，3：87-95(1991)；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：573-596；Mulligan，Science，260：926-932(1993)；以及Morgan和Anderson，″HumanGeneTherapy，″Ann.Rev.Biochem.，62：191-217(1993)；Robinson，C.，TrendsBiotechnol.，11：155(1993)。可使用的重组DNA技术领域中通常已知的方法描述于Ausubel等人(eds.)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons，NewYork，1993)；和Kriegler，GeneTransferandExpression，ALaboratory Manual，(StocktonPress，NewYork，1990)。各种基因治疗方法的详细描述于在此引入作为参考的美国申请公开号US2005/0042664A1中公开。
本发明的另一方面提供治疗(例如治愈、抑制、缓解、延迟或预防发作、或预防重现或复发)或预防受试者中DLL4-相关肿瘤的方法。所述方法包括以足以治疗或预防DLL4-相关肿瘤或癌症的量，给受试者施用DLL4结合蛋白例如本文所述的抗-DLL4抗体或其片段。DLL4拮抗剂，即抗-DLL4抗体或其片段，可以单独或与本文所述的其他治疗形式组合施用给受试者。
DLL4在与涉及免疫和炎症元素的多种疾病特别是癌症和肿瘤血管发生相关的病理学中起关键作用。DLL4-相关病症的例子包括但不限于对下述生物过程起不利作用的病症：神经功能和发育；动脉内皮命运和血管发生的稳定化；在瓣膜原始和心室发育和分化过程中在心内膜和心肌之间期间关键细胞通信事件的调控；心脏瓣膜的平衡，以及在其他涉及心血管***的人病症中的情况；内分泌和外分泌胰腺的及时细胞谱系分类(specification)；在肠道中分泌和的吸收谱系之间必须选择的双向命运决定的影响；对于成骨细胞谱系在骨发育和参与过程中例如骨质疏松症造血干细胞区室的扩大；在几个不同的发育阶段在乳腺中细胞命运决定的调控；和某些非核的机制，例如通过酪氨酸激酶Abl的肌动蛋白细胞骨架的控制。更具体地说，DLL4的相关病症包括但不限于癌症，T-ALL(T细胞急性淋巴细胞性白血病)，CADASIL(伴有皮质下梗塞和脑白质病变的脑常染色体显性动脉病变)，MS(多发性硬化症)，法乐氏四联症和Alagille综合征。优选地，本文所述的抗体和抗原-结合部分用于治疗癌症和肿瘤。
根据本发明的结合蛋白可以单独或组合(即多余一种本文所述的DLL4-结合蛋白)使用以治疗癌症、肿瘤或其他病症，其中结合、抑制和/或中和DLL4被认为是期望的或另外对个体的健康是有益的。
应当理解本发明的DLL4结合蛋白可以单独或与另外的试剂例如治疗剂组合使用，所述另外的试剂由技术人员根据其预期目的进行选择。例如，另外的试剂可以是本领域公认的治疗剂，其治疗其中结合或抑制DLL4被认为是期望的或对治疗癌症、肿瘤或其他疾病或状况是有利的癌症、肿瘤或其他疾病或状况是有用的。另外的试剂也可以是赋予治疗组合物有利属性的试剂，例如影响组合物粘度的试剂。
应进一步理解将包括在本发明内的组合是对其预期目的有用的那些组合。下文所述试剂是举例说明性目的的且不希望是限制性的。作为本发明部分的组合可以是本发明的抗体和选自下列的至少一种另外的试剂。组合还可以包括超过一种另外的试剂，例如，2种或3种另外的试剂，如果组合是这样的，从而使得形成的组合物可以执行其预期功能的话。
优选组合是非类固醇消炎药，也称为NSAIDS，它包括药物如布洛芬。其他优选组合是皮质类固醇，包括强的松龙；当与本发明的抗DLL4抗体组合治疗患者时，通过逐渐减少所需的类固醇剂量，可以减少或甚至消除类固醇使用的众所周知的副作用。本发明的结合蛋白可以与之组合用于类风湿性关节炎的治疗剂的非限制性例子包括但不限于下述：细胞因子抑制性消炎药(CSAIDs)；针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-18、IL-21、干扰素、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的抗体或其抗原结合部分可以与针对细胞表面分子或其配体包括CD154(gp39或CD40L)的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA。
治疗剂的优选组合可在不同点干扰前肿瘤发生或前血管发生信号通路。用于本发明的方法和组合物的治疗剂的优选例子包括抗肿瘤剂、放疗剂和化疗剂例如DNA烷化剂、顺铂、卡铂、抗-微管蛋白剂、紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇、紫杉醇(taxol)、多柔比星，吉西他滨，健择、蒽环类、阿霉素、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、5-氟尿嘧啶(5-FU)、leucovorin、伊立替康、受体酪氨酸激酶抑制剂(例如埃罗替尼，吉非替尼)、COX-2抑制剂(例如塞来昔布)和激酶抑制剂。
本发明的DLL4结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、6-MP、硫唑嘌呤柳氮磺吡啶、美沙拉秦、奥沙拉嗪氯喹(chloroquinine)/羟氯喹、青霉胺、硫化苹果酸金(肌内和经口)、硫唑嘌呤、秋水仙碱、皮质类固醇(经口、吸入和局部注射)、β2肾上腺素受体激动剂(沙丁胺醇、特布他林、沙美特罗)、黄嘌呤(茶碱、氨茶碱)、色甘酸盐、萘多罗米、酮替芬、异丙托铵和乙东碱、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如IL-1的发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1bTNFα转换酶抑制剂(TACE)抑制剂、T细胞转换酶抑制剂、TNFα发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如，可溶性p55或p75TNF受体和衍生物p75TNFRIgG(EnbrelTM和p55TNFRIgG(Lenercept))、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)、抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)、塞来昔布、叶酸、硫酸羟氯喹、洛芬昔布、依那西普、英夫单抗、萘普生、伐地考昔、柳氮磺吡啶、甲基强的松龙、美洛昔康、乙酸甲基强的松龙、硫代苹果酸金钠、阿司匹林、曲安缩松、萘磺酸右丙氧芬/扑热息痛、叶酸盐、萘普酮、扶他林、吡罗昔康、依托度酸、双氯酚酸钠、奥沙普嗪、盐酸羟可酮、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、双氯酚酸钠/米索前列醇、芬太尼、阿那白滞素(anakinra)、人重组体、***马多、双水杨酸酯、舒林酸、氰钴胺素/fa/吡哆醇、扑热息痛、阿仑膦酸钠、强的松龙、硫酸***、盐酸利多卡因、吲哚美辛、硫酸葡糖胺(glucosaminesulf)/软骨素、盐酸阿米替林、磺胺嘧啶、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸奥洛帕定、米索前列醇、甲氧萘丙酸钠、奥美拉唑、环磷酰胺、利妥希玛、IL-1TRAP、MRA、CTLA4-IG、IL-18BP、抗IL-18、抗IL15、BIRB-796、SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、罗氟司特(Roflumilast)、IC-485、CDC-801和美苏帕玛(Mesopram)。优选组合包括氨甲蝶呤或来氟洛米，并且在中等或重度类风湿性关节炎的情况下，环孢菌素。
本发明的DLL4结合蛋白可以与之组合用于癌症治疗剂的非限制性例子包括下述：布***；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂肪加氧酶抑制剂；美沙拉秦；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β单克隆抗体；抗-IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；和针对其他人细胞因子或生长因子的抗体或拮抗剂，所述细胞因子或生长因子例如TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、DLL4、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF、和PDGF。本发明的DLL4结合蛋白可以与针对细胞表面分子或其配体的抗体组合，所述细胞表面分子例如CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、CD40、CD45、CD69、CD90。本发明的DLL4结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如氨甲蝶呤、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸酯、来氟洛米、NSAIDs例如布洛芬、皮质类固醇例如强的松龙、磷酸二酯酶抑制剂、腺苷激动剂、抗凝剂、补体抑制剂、肾上腺素能药、干扰经由促炎细胞因子例如TNFα或IL-1的发信号的试剂(例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制剂)、IL-1β转换酶抑制剂、TNFα转换酶抑制剂、T细胞发信号抑制剂例如激酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、柳氮磺吡啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、血管紧张素转换酶抑制剂、可溶性细胞因子受体及其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体、sIL-1RI、sIL-1RII、sIL-6R)和抗炎细胞因子(例如，IL-4、IL-10、IL-11、IL-13和TGFβ)抑制剂。
其中本发明的DLL4结合蛋白可以组合的治疗剂的其他例子包括下述：TNF拮抗剂，例如抗TNF抗体，D2E7(PCT公开号WO97/29131；)，CA2()，CDP571，TNFR-Ig构建体，(p75TNFRIgG()和p55TNFRIgG(LENERCEPT))和PDE4抑制剂。本发明的结合蛋白可以与皮质类固醇组合，例如布***和***。本发明的结合蛋白还可以与试剂组合，所述试剂例如柳氮磺吡啶、5-氨基水杨酸和奥沙拉嗪，以及干扰促炎细胞因子例如IL-1合成或作用的试剂，例如IL-1β转换酶抑制剂和IL-1ra。本发明的DLL4结合蛋白还可以与T细胞发信号抑制剂一起使用，例如，酪氨酸激酶抑制剂6-巯基嘌呤。本发明的DLL4结合蛋白可以与IL-11组合。本发明的结合蛋白或其抗原结合部分可以与下述试剂组合：美沙拉秦、强的松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英夫单抗、甲基强的松龙琥珀酸钠、地芬诺酯/硫酸阿托品、盐酸洛哌丁胺、氨甲蝶呤、奥美拉唑、叶酸盐、环丙沙星/葡萄糖-水、重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛、盐酸四环素、氟轻松、甲硝唑、硫柳汞/硼酸、消胆胺/蔗糖、盐酸环丙沙星、硫酸莨菪碱、盐酸哌替啶、盐酸咪达唑、盐酸羟可酮/扑热息痛、盐酸异丙嗪、磷酸钠、磺胺甲异唑/甲氧苄啶、塞来昔布、聚卡波非、萘磺酸右丙氧芬、氢化可的松、多种维生素、巴柳氮二钠、磷酸可待因/扑热息痛、盐酸考来维仑(colesevelamhcl)、氰钴胺素、叶酸、左氟沙星、甲基强的松龙、那他珠单抗和干扰素γ。
本发明的结合蛋白可以与之组合用于心绞痛的治疗剂的非限制性例子包括下述：阿司匹林、***、单硝酸异山梨酯、琥珀酸美托洛尔、阿替洛尔、酒石酸美托洛尔、阿罗地平磺酸盐、盐酸地尔硫硝酸异山梨酯、重硫酸氯吡格雷、硝苯地平、阿托伐他汀钙、氯化钾、呋塞米、斯伐他汀、盐酸维拉帕米、地高辛、盐酸***、卡维地洛、赖诺普利、螺内酯、氢***、马来酸依那普利、纳多洛尔、雷米普利、依诺肝素钠、肝素钠、缬沙坦、盐酸索他洛尔、非诺贝特、依泽替米贝(ezetimibe)、布美他尼、氯沙坦钾、赖诺普利/氢***、非洛地平、卡托普利和富马酸比索洛尔。
本发明的药物组合物可以包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明的结合蛋白。“治疗有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需治疗结果的量。结合蛋白的治疗有效量可以由本领域技术人员来确定，且可以根据下述因素而变，例如个体疾病状态、年龄、性别、和重量，以及结合蛋白在个体中引起所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有利作用大于结合蛋白的任何毒性或有害作用的量。“预防有效量”指在所需剂量和时间段有效达到所需预防结果的量。一般地，因为预防剂量在疾病前或疾病早期时在受试者中使用，所以预防有效量将小于治疗有效量。
剂量方案可以进行调整以提供最佳所需应答(例如，治疗或预防应答)。例如，可以施用快速灌注方式，几个分份剂量可以随着时间过去而施用，或剂量可以如治疗情形的紧急状态所指示的按比例减少或增加。为了易于施用和剂量一致，以单位剂型配制肠胃外组合物是特别有利的。如本文使用的，单位剂型指适合作为单一剂量用于待治疗的哺乳动物受试者的物理上不连续单位；每个单位包含与所需药学载体结合的计算为产生所需疗效的预定量的活性化合物。关于本发明的单位剂型的详细说明由下述指示且直接取决于下述：(a)活性化合物的独特特征和待达到的具体治疗或预防作用，和(b)配合这种用于治疗个体中敏感性的活性化合物的领域固有的局限性。
本发明的DLL4结合蛋白的治疗或预防有效量的示例性、非限制性范围是0.1-20mg/kg，更优选地1-10mg/kg。注意的是剂量值可随将被缓解的状况的类型和严重程度而变化。将进一步理解的是对于任何具体受试者，应根据个体需要和使用或监督组合物施用的人的专业判断随时间调节具体剂量方案，并且本文所述的这些剂量范围仅是示例性的，并不意图限制要求保护的组合物的范围和实践。
对于本领域技术人员将显而易见的是，本文描述的本发明方法的其他合适修改和适应是明显的，且无需背离本发明或本文公开的实施方案的范围使用合适的等同方案即可进行。尽管本发明目前已得到详细描述，但通过参考下述实施例将更清楚地理解本发明，所述实施例被包括仅用于举例说明性目的且不希望限制本发明。
此外，本发明还涉及以下实施方案：
1.一种包括能够结合人DLL4的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括选自下述的至少一个或多个CDR：
CDR-H1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQIDNO：99)，其中；
X1是S或N；
X2是S、G或N；
X3是S、N、T、G或R；
X4是Y；
X5是Y或H；
X6是W；和
X7是G；
CDR-H2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16(SEQIDNO：100)，其中；
X1是D；
X2是I；
X3是Y、N或S；
X4是Y；
X5是T、N、A、I、S或R；
X6是G；
X7是S、N、T或G；
X8是T；
X9是Y；
X10是Y；
X11是N；
X12是P；
X13是S；
X14是L；
X15是K；和
X16是S、N、D或G；
CDR-H3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQIDNO：101)，其中；
X1是E、Y、F、Q、W、L或A；
X2是D、A、S、G、V、E或N；
X3是V、M、L、P或A；
X4是I、A、P、R、S、K、Q、V、G、M或E；
X5是L、Y、F或M；
X6是R、G、S、Q或A；
X7是G；
X8是G、A或S；
X9是S、A、L、V、R或G；
X10是D；和
X11是Y、D、S、N、H、E、R、L、P、C、I、M、T、Q或K；
CDR-L1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQIDNO：102)，其中；
X1是S；
X2是G；
X3是Q、E或D；
X4是R、S、G、M、K、L或T；
X5是L；
X6是G；
X7是D或E；
X8是K；
X9是Y；
X10是A或V；和
X11是S；
CDR-L2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQIDNO：103)，其中；
X1是E或Q；
X2是D；
X3是S、L、T、A、E或F；
X4是K、T、E、N、Q、S或M；
X5是R；
X6是P；和
X7是S；
和
CDR-L3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO：104)，其中；
X1是Q；
X2是A；
X3是W；
X4是D；
X5是R、S、M、E、N、G或K；
X6是D或E；
X7是T、V、A、S或M；
X8是G、A或C；和
X9是V.
2.根据实施方案1的结合蛋白，其中所述至少一个CDR包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：1的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：1的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：1的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：111的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：111的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：111的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：117(CDR-H1)；SEQIDNO：118(CDR-H2)；SEQIDNO：119(CDR-H3)；
SEQIDNO：121(CDR-H1)；SEQIDNO：122(CDR-H2)；SEQIDNO：123(CDR-H3)；
SEQIDNO：125(CDR-H1)；SEQIDNO：126(CDR-H2)；SEQIDNO：127(CDR-H3)；
SEQIDNO：129(CDR-H1)；SEQIDNO：130(CDR-H2)；SEQIDNO：131(CDR-H3)；
SEQIDNO：133(CDR-H1)；SEQIDNO：134(CDR-H2)；SEQIDNO：135(CDR-H3)；
SEQIDNO：137(CDR-H1)；SEQIDNO：138(CDR-H2)；SEQIDNO：139(CDR-H3)；
SEQIDNO：141(CDR-H1)；SEQIDNO：142(CDR-H2)；SEQIDNO：143(CDR-H3)；
SEQIDNO：145(CDR-H1)；SEQIDNO：146(CDR-H2)；SEQIDNO：147(CDR-H3)；
SEQIDNO：149(CDR-H1)；SEQIDNO：150(CDR-H2)；SEQIDNO：151(CDR-H3)；
SEQIDNO：153(CDR-H1)；SEQIDNO：154(CDR-H2)；SEQIDNO：155(CDR-H3)；
SEQIDNO：157(CDR-H1)；SEQIDNO：158(CDR-H2)；SEQIDNO：159(CDR-H3)；
SEQIDNO：161(CDR-H1)；SEQIDNO：162(CDR-H2)；SEQIDNO：163(CDR-H3)；
SEQIDNO：165(CDR-H1)；SEQIDNO：166(CDR-H2)；SEQIDNO：167(CDR-H3)；
SEQIDNO：169(CDR-H1)；SEQIDNO：170(CDR-H2)；SEQIDNO：171(CDR-H3)；
SEQIDNO：173(CDR-H1)；SEQIDNO：174(CDR-H2)；SEQIDNO：175(CDR-H3)；
SEQIDNO：177(CDR-H1)；SEQIDNO：178(CDR-H2)；SEQIDNO：179(CDR-H3)；
SEQIDNO：181(CDR-H1)；SEQIDNO：182(CDR-H2)；SEQIDNO：183(CDR-H3)；
SEQIDNO：185(CDR-H1)；SEQIDNO：186(CDR-H2)；SEQIDNO：187(CDR-H3)；
SEQIDNO：189(CDR-H1)；SEQIDNO：190(CDR-H2)；SEQIDNO：191(CDR-H3)；
SEQIDNO：193(CDR-H1)；SEQIDNO：194(CDR-H2)；SEQIDNO：195(CDR-H3)；
SEQIDNO：197(CDR-H1)；SEQIDNO：198(CDR-H2)；SEQIDNO：199(CDR-H3)；
SEQIDNO：201(CDR-H1)；SEQIDNO：202(CDR-H2)；SEQIDNO：203(CDR-H3)；
SEQIDNO：205(CDR-H1)；SEQIDNO：206(CDR-H2)；SEQIDNO：207(CDR-H3)；
SEQIDNO：209(CDR-H1)；SEQIDNO：210(CDR-H2)；SEQIDNO：211(CDR-H3)；
SEQIDNO：213(CDR-H1)；SEQIDNO：214(CDR-H2)；SEQIDNO：215(CDR-H3)；
SEQIDNO：217(CDR-L1)；SEQIDNO：218(CDR-L2)；SEQIDNO：219(CDR-L3)；
SEQIDNO：221(CDR-L1)；SEQIDNO：222(CDR-L2)；SEQIDNO：223(CDR-L3)；
SEQIDNO：225(CDR-L1)；SEQIDNO：226(CDR-L2)；SEQIDNO：227(CDR-L3)；
SEQIDNO：229(CDR-L1)；SEQIDNO：230(CDR-L2)；SEQIDNO：231(CDR-L3)；
SEQIDNO：233(CDR-L1)；SEQIDNO：234(CDR-L2)；SEQIDNO：235(CDR-L3)；
SEQIDNO：237(CDR-L1)；SEQIDNO：238(CDR-L2)；SEQIDNO：239(CDR-L3)；
SEQIDNO：241(CDR-L1)；SEQIDNO：242(CDR-L2)；SEQIDNO：243(CDR-L3)；
SEQIDNO：245(CDR-L1)；SEQIDNO：246(CDR-L2)；SEQIDNO：247(CDR-L3)；
SEQIDNO：249(CDR-L1)；SEQIDNO：250(CDR-L2)；SEQIDNO：251(CDR-L3)；
SEQIDNO：253(CDR-L1)；SEQIDNO：254(CDR-L2)；SEQIDNO：255(CDR-L3)；
SEQIDNO：257(CDR-L1)；SEQIDNO：258(CDR-L2)；SEQIDNO：259(CDR-L3)；
SEQIDNO：261(CDR-L1)；SEQIDNO：262(CDR-L2)；SEQIDNO：263(CDR-L3)；
SEQIDNO：265(CDR-L1)；SEQIDNO：266(CDR-L2)；SEQIDNO：267(CDR-L3)；
SEQIDNO：269(CDR-L1)；SEQIDNO：270(CDR-L2)；SEQIDNO：271(CDR-L3)；
SEQIDNO：273(CDR-L1)；SEQIDNO：274(CDR-L2)；SEQIDNO：275(CDR-L3)；
SEQIDNO：277(CDR-L1)；SEQIDNO：278(CDR-L2)；SEQIDNO：279(CDR-L3)；
SEQIDNO：281(CDR-L1)；SEQIDNO：282(CDR-L2)；SEQIDNO：283(CDR-L3)；
SEQIDNO：285(CDR-L1)；SEQIDNO：286(CDR-L2)；SEQIDNO：287(CDR-L3)；
SEQIDNO：289(CDR-L1)；SEQIDNO：290(CDR-L2)；SEQIDNO：291(CDR-L3)；
SEQIDNO：293(CDR-L1)；SEQIDNO：294(CDR-L2)；SEQIDNO：295(CDR-L3)；
SEQIDNO：297(CDR-L1)；SEQIDNO：298(CDR-L2)；SEQIDNO：299(CDR-L3)；
SEQIDNO：301(CDR-L1)；SEQIDNO：302(CDR-L2)；SEQIDNO：303(CDR-L3)；
SEQIDNO：305(CDR-L1)；SEQIDNO：306(CDR-L2)；SEQIDNO：307(CDR-L3)；
SEQIDNO：309(CDR-L1)；SEQIDNO：310(CDR-L2)；SEQIDNO：311(CDR-L3)；
SEQIDNO：313(CDR-L1)；SEQIDNO：314(CDR-L2)；SEQIDNO：315(CDR-L3)；
SEQIDNO：334的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：334的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：334的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：335的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：335的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：335的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：336的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：336的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：336的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：337的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：337的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：337的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：338的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：338的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：338的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：339的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：339的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：339的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：340的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：340的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：340的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：341的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：341的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：341的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：342的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：342的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：342的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：343的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：343的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：343的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：344的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：344的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：344的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：345的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：345的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：345的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：346的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：346的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：346的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：347的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：347的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：347的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：348的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：348的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：348的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：349的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：349的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：349的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：350的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：350的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：350的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：351的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：351的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：351的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：352的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：352的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：352的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：353的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：353的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：353的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：354的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：354的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：354的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：355的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO：355的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO：355的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO：356的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：356的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：356的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：357的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：357的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：357的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：358的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：358的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：358的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：359的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：359的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：359的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：360的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO：360的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO：360的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO：361的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：361的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：361的残基88-96(CDR-L3)。
3.根据实施方案2的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括至少3个CDR。
4.根据实施方案3的结合蛋白，其中所述至少3个CDR包括选自下述的可变结构域CDR组：
VHE9CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：1的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：1的残基52-67
CDR-H3SEQIDNO：1的残基100-110
VLE9CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：111的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：111的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：111的残基88-96
VHE9.4CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：117
CDR-H2：SEQIDNO：118
CDR-H3：SEQIDNO：119
VLE9.4CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：229
CDR-L2：SEQIDNO：230
CDR-L3：SEQIDNO：231
VHE9.11CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：121
CDR-H2：SEQIDNO：122
CDR-H3：SEQIDNO：123
VLE9.11CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：233
CDR-L2：SEQIDNO：234
CDR-L3：SEQIDNO：235
VHE9.14CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：125
CDR-H2：SEQIDNO：126
CDR-H3：SEQIDNO：127
VLE9.14CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：237
CDR-L2：SEQIDNO：238
CDR-L3：SEQIDNO：239
VHE9.17CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：129
CDR-H2：SEQIDNO：130
CDR-H3：SEQIDNO：131
VLE9.17CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：241
CDR-L2：SEQIDNO：242
CDR-L3：SEQIDNO：243
VHE9.18CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：133
CDR-H2：SEQIDNO：134
CDR-H3：SEQIDNO：135
VLE9.18CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：245
CDR-L2：SEQIDNO：246
CDR-L3：SEQIDNO：247
VHE9.19CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：137
CDR-H2：SEQIDNO：138
CDR-H3：SEQIDNO：139
VLE9.19CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：249
CDR-L2：SEQIDNO：250
CDR-L3：SEQIDNO：251
VHE9.22CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：141
CDR-H2：SEQIDNO：142
CDR-H3：SEQIDNO：143
VLE9.22CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：253
CDR-L2：SEQIDNO：254
CDR-L3：SEQIDNO：255
VHE9.48CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：145
CDR-H2：SEQIDNO：146
CDR-H3：SEQIDNO：147
VLE9.48CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：257
CDR-L2：SEQIDNO：258
CDR-L3：SEQIDNO：259
VHE9.65CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：149
CDR-H2：SEQIDNO：150
CDR-H3：SEQIDNO：151
VLE9.65CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：261
CDR-L2：SEQIDNO：262
CDR-L3：SEQIDNO：263
VHE9.66CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：153
CDR-H2：SEQIDNO：154
CDR-H3：SEQIDNO：155
VLE9.66CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：265
CDR-L2：SEQIDNO：266
CDR-L3：SEQIDNO：267
VHE9.71CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：157
CDR-H2：SEQIDNO：158
CDR-H3：SEQIDNO：159
VLE9.71CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：269
CDR-L2：SEQIDNO：270
CDR-L3：SEQIDNO：271
VHE9.13CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：161
CDR-H2：SEQIDNO：162
CDR-H3：SEQIDNO：163
VLE9.13CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：217
CDR-L2：SEQIDNO：218
CDR-L3：SEQIDNO：219
VHE9.16CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：165
CDR-H2：SEQIDNO：166
CDR-H3：SEQIDNO：167
VLE9.16CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：221
CDR-L2：SEQIDNO：222
CDR-L3：SEQIDNO：223
VHE9.38CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：169
CDR-H2：SEQIDNO：170
CDR-H3：SEQIDNO：171
VLE9.38CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：225
CDR-L2：SEQIDNO：226
CDR-L3：SEQIDNO：227
VHE9.2BCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：173
CDR-H2：SEQIDNO：174
CDR-H3：SEQIDNO：175
VLE9.2BCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：273
CDR-L2：SEQIDNO：274
CDR-L3：SEQIDNO：275
VHE9.1FCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：177
CDR-H2：SEQIDNO：178
CDR-H3：SEQIDNO：179
VLE9.1FCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：277
CDR-L2：SEQIDNO：278
CDR-L3：SEQIDNO：279
VHE9.10HCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：181
CDR-H2：SEQIDNO：182
CDR-H3：SEQIDNO：183
VLE9.10HCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：301
CDR-L2：SEQIDNO：302
CDR-L3：SEQIDNO：303
VHE9.5ECDR组
CDR-H1：SEQIDNO：185
CDR-H2：SEQIDNO：186
CDR-H3：SEQIDNO：187
VLE9.5ECDR组
CDR-L1：SEQIDNO：293
CDR-L2：SEQIDNO：294
CDR-L3：SEQIDNO：295
VHE9.10CCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：189
CDR-H2：SEQIDNO：190
CDR-H3：SEQIDNO：191
VLE9.10CCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：281
CDR-L2：SEQIDNO：282
CDR-L3：SEQIDNO：283
VHE9.7ECDR组
CDR-H1：SEQIDNO：193
CDR-H2：SEQIDNO：194
CDR-H3：SEQIDNO：195
VLE9.7ECDR组
CDR-L1：SEQIDNO：289
CDR-L2：SEQIDNO：290
CDR-L3：SEQIDNO：291
VHE9.12BCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：197
CDR-H2：SEQIDNO：198
CDR-H3：SEQIDNO：199
VLE9.12BCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：297
CDR-L2：SEQIDNO：298
CDR-L3：SEQIDNO：299
VHE9.10ECDR组
CDR-H1：SEQIDNO：201
CDR-H2：SEQIDNO：202
CDR-H3：SEQIDNO：203
VLE9.10ECDR组
CDR-L1：SEQIDNO：285
CDR-L2：SEQIDNO：286
CDR-L3：SEQIDNO：287
VHE9.6ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：205
CDR-H2：SEQIDNO：206
CDR-H3：SEQIDNO：207
VLE9.6ACDR组
CDR-L1：SEQIDNO：305
CDR-L2：SEQIDNO：306
CDR-L3：SEQIDNO：307
VHE9.7ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：209
CDR-H2：SEQIDNO：210
CDR-H3：SEQIDNO：211
VLE9.7ACDR组
CDR-L1：SEQIDNO：309
CDR-L2：SEQIDNO：310
CDR-L3：SEQIDNO：311
VHE9.8HCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：213
CDR-H2：SEQIDNO：214
CDR-H3：SEQIDNO：215
VLE9.8HCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：313
CDR-L2：SEQIDNO：314
CDR-L3：SEQIDNO：315
VHE9.1CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：334的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：334的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：334的残基100-110
VLE9.1CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：335的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：335的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：335的残基88-96
VHE9-SE1CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：336的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：336的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：336的残基100-110
VLE9-SE1CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：337的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：337的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：337的残基88-96
VHE9-SE2CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：338的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：338的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：338的残基100-110
VLE9-SE2CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：339的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：339的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：339的残基88-96
VHE9-SE3CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：340的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：340的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：340的残基100-110
VLE9-SE3CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：341的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：341的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：341的残基88-96
VHE9-SE4CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：342的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：342的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：342的残基100-110
VLE9-SE4CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：343的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：343的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：343的残基88-96
VHE9-SE5CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：344的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：344的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：344的残基100-110
VLE9-SE5CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：345的残基24-34
CDR-L2：SEQIDNO：345的残基50-56
CDR-L3：SEQIDNO：345的残基89-97
VHE9-SE6CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：346的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：346的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：346的残基100-110
VLE9-SE6CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：347的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：347的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：347的残基88-96
VHE9-SE7CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：348的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：348的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：348的残基100-110
VLE9-SE7CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：349的残基24-34
CDR-L2：SEQIDNO：349的残基50-56
CDR-L3：SEQIDNO：349的残基89-97
VHE9-SE8CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：350的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：350的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：350的残基100-110
VLE9-SE8CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：351的残基24-34
CDR-L2：SEQIDNO：351的残基50-56
CDR-L3：SEQIDNO：351的残基89-97
VHE9-FR1CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：352的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：352的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：352的残基100-110
VLE9-FR1CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：353的残基24-34
CDR-L2：SEQIDNO：353的残基50-56
CDR-L3：SEQIDNO：353的残基89-97
VHE9-FR2CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：354的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：354的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：354的残基100-110
VLE9-FR2CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：355的残基24-34
CDR-L2：SEQIDNO：355的残基50-56
CDR-L3：SEQIDNO：355的残基89-97
VHE9.71CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：356的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：356的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：356的残基100-110
VLE9.71CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：357的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：357的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：357的残基88-96
VHE9.71(M)CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：358的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：358的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：358的残基100-110
VLE9.71(M)CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：359的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：359的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：359的残基88-96
VHE9.71(L)CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：360的残基31-37
CDR-H2：SEQIDNO：360的残基52-67
CDR-H3：SEQIDNO：360的残基100-110
VLE9.71(L)CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：361的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：361的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：361的残基88-96。
5.根据实施方案4的结合蛋白，其包括至少两个可变结构域CDR组。
6.根据实施方案5的结合蛋白，其中所述至少2个可变结构域CDR组选自：
VHE9CDR组和VLE9CDR组，
VHE9.4CDR组和VLE9.4CDR组，
VHE9.11CDR组和VLE9.11CDR组，
VHE9.14CDR组和VLE9.14CDR组，
VHE9.17CDR组和VLE9.17CDR组，
VHE9.18CDR组和VLE9.18CDR组，
VHE9.19CDR组和VLE9.19CDR组，
VHE9.22CDR组和VLE9.22CDR组，
VHE9.48CDR组和VLE9.48CDR组，
VHE9.65CDR组和VLE9.65CDR组，
VHE9.66CDR组和VLE9.66CDR组，
VHE9.71CDR组和VLE9.71CDR组，
VHE9.13CDR组和VLE9.13CDR组，
VHE9.16CDR组和VLE9.16CDR组，
VHE9.38CDR组和VLE9.38CDR组，
VHE9.2BCDR组和VLE9.2BCDR组，
VHE9.1FCDR组和VLE9.1FCDR组，
VHE9.10HCDR组和VLE9.10HCDR组，
VHE9.5ECDR组和VLE9.5ECDR组，
VHE9.10CCDR组和VLE9.10CCDR组，
VHE9.7ECDR组和VLE9.7ECDR组，
VHE9.12BCDR组和VLE9.12BCDR组，
VHE9.10ECDR组和VLE9.10ECDR组，
VHE9.6ACDR组和VLE9.6ACDR组，
VHE9.7ACDR组和VLE9.7ACDR组，
VHE9.8HCDR组和VLE9.8HCDR组，
VHE9-SE1CDR组和VLE9-SE1CDR组，
VHE9-SE2CDR组和VLE9-SE2CDR组，
VHE9-SE3CDR组和VLE9-SE3CDR组，
VHE9-SE4CDR组和VLE9-SE4CDR组，
VHE9-SE5CDR组和VLE9-SE5CDR组，
VHE9-SE6CDR组和VLE9-SE6CDR组，
VHE9-SE7CDR组和VLE9-SE7CDR组，
VHE9-SE8CDR组和VLE9-SE8CDR组，
VHE9-FR1CDR组和VLE9-FR1CDR组，
VHE9-FR2CDR组和VLE9-FR2CDR组，
VHE9.71CDR组和VLE9.71CDR组，
VHE9.71(M)CDR组和VLE9.71(M)CDR组，和
VHE9.71(L)CDR组和VLE9.71(L)CDR组。
7.根据实施方案1-6中任一项的结合蛋白，其进一步包括人接纳体构架。
8.根据实施方案7的结合蛋白，其中所述人接纳构架包括选自下述的氨基酸序列：
重链接纳体构架序列SEQIDNO：6-22，
重链接纳体序列SEQIDNO：35-62，
轻链接纳体序列SEQIDNO：23-34，和
轻链接纳体序列SEQIDNO：63-98。
9.根据实施方案7或8的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中所述构架的氨基酸序列与所述人接纳体构架的序列至少65％等同，并且包括与所述人接纳体构架等同的至少70个氨基酸残基。
10.根据实施方案8的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包括在关键残基处的至少一个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
与CDR接近的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与人DLL4相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
在Vernier区内的残基；和
在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
11.根据实施方案10的结合蛋白，其中所述关键残基选自：2H、4H、24H、26H、27H、29H、34H、35H、37H、39H、44H、45H、47H、48H、49H、50H、51H、58H、59H、60H、63H、67H、69H、71H、73H、76H、78H、91H、93H、94H、2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、49L、55L、58L、62L、64L、71L、87L、89L、90L、91L、94L、95L。
12.根据实施方案11的结合蛋白，其中所述结合蛋白是共有人可变结构域。
13.根据实施方案1的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列的至少一个可变结构域：SEQIDNO：1、111、116、228、120、232、124、236、128、240、132、244、136、248、140、252、144、256、148、260、152、264、156、268、160、216、164、220、168、224、172、272、176、276、180、300、184、292、188、280、192、288、196、296、200、284、204、304、208、308、212、312、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360和361。
14.根据实施方案13的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括2个可变结构域，其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：1和111、SEQIDNO：116和228、SEQIDNO：120和232、SEQIDNO：124和236、SEQIDNO：128和240、SEQIDNO：132和244、SEQIDNO：136和248、SEQIDNO：140和252、SEQIDNO：144和256、SEQIDNO：148和260、SEQIDNO：152和264、SEQIDNO：156和268、SEQIDNO：160和216、SEQIDNO：164和220、SEQIDNO：168和224、SEQIDNO：172和272、SEQIDNO：176和276、SEQIDNO：180和300、SEQIDNO：184和292、SEQIDNO：188和280、SEQIDNO：192和288、SEQIDNO：196和296、SEQIDNO：200和284、SEQIDNO：204和304、SEQIDNO：208和308、SEQIDNO：212和312、SEQIDNO：334和335、SEQIDNO：336和337、SEQIDNO：338和339、SEQIDNO：340和341、SEQIDNO：342和343、SEQIDNO：344和345、SEQIDNO：346和347、SEQIDNO：348和349、SEQIDNO：350和351、SEQIDNO：352和353、SEQIDNO：354和355、SEQIDNO：356和357、SEQIDNO：358和359、SEQIDNO：360和361。
15.根据实施方案11的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列的至少一个可变结构域：SEQIDNO：1、111、116、228、120、232、124、236、128、240、132、244、136、248、140、252、144、256、148、260、152、264、156、268、160、216、164、220、168、224、172、272、176、276、180、300、184、292、188、280、192、288、196、296、200、284、204、304、208、308、212、312、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360和361。
16.根据实施方案2的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括VH。
17.根据实施方案16的结合蛋白，其中所述VH包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358和360。
18.根据实施方案2的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VL.
19.根据实施方案18的结合蛋白，其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359和361。
20.根据实施方案2的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VH和VL.
21.根据实施方案19的结合蛋白，其进一步包括VH，其中所述VH包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358和360。
22.根据实施方案20的结合蛋白，其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359和361。
23.根据实施方案2的结合蛋白，其进一步包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域；人IgG1恒定结构域；人IgG2恒定结构域；人IgG3恒定结构域；人IgG4恒定结构域；人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。
24.根据实施方案23的结合蛋白，其中所述重链免疫球蛋白恒定结构域是人IgG1恒定结构域。
25.根据实施方案24的结合蛋白，其中所述人IgG1恒定结构域包括选自SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的氨基酸序列。
26.根据实施方案2的结合蛋白，其进一步包括轻链免疫球蛋白恒定结构域选自：人Igκ恒定结构域和人Igλ恒定结构域。
27.根据实施方案26的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区结构域是人Igκ恒定结构域，其包括氨基酸序列SEQIDNO：4。
28.根据实施方案26的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区结构域是人Igλ恒定结构域，其包括氨基酸序列SEQIDNO：5。
29.根据实施方案1的结合蛋白，其中所述结合蛋白选自：免疫球蛋白分子，scFv，单克隆抗体，人抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单结构域抗体，Fab片段，Fab′片段，F(ab′)2，Fv，二硫键连接的Fv，单结构域抗体，双抗体，多特异性抗体，双特异性抗体和双重特异性抗体。
30.根据实施方案29的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人抗体。
31.一种能够结合人DLL-4的结合蛋白，所述结合蛋白包括：
Ig恒定重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：2和SEQIDNO：3；
Ig恒定轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：4和SEQIDNO：5；
Ig可变重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：1、116、120、124、128、132、136、140、144、148、152、156、160、164、168、172、176、180、184、188、192、196、200、204、208、212、334、336、338、340、342、344、346、348、350、352、354、356、358和360；和
Ig可变轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：111、228、232、236、240、244、248、252、256、260、264、268、216、220、224、272、276、300、292、280、288、296、284、304、308、312、335、337、339、341、343、345、347、349、351、353、355、357、359和361。
32.根据实施方案31的结合蛋白，其中所述Ig恒定轻链区是SEQIDNO：5.
33.根据实施方案1-32中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch蛋白的相互作用，所述Notch蛋白选自Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4及其组合。
34.根据实施方案33的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-1和Notch-4的相互作用。
35.根据实施方案33的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-1的相互作用。
36.根据实施方案33的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-4的相互作用。
37.根据实施方案1-32中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够调节DLL4的生物学功能。
38.根据实施方案1-32中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够中和DLL4。
39.根据实施方案38的中和结合蛋白，其中所述DLL4选自：人DLL4、小鼠DLL4、食蟹猴DLL4和大鼠DLL4。
40.根据实施方案38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白减少DLL4与其受体结合的能力。
41.根据实施方案38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能够降低正常血管生成。
42.根据实施方案38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的解离常数(KD)选自：至多约10-7M；至多约10-8M；至多约10-9M；至多约10-10M；至多约10-11M；至多约10-12M和至多10-13M。
43.根据实施方案38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的结合速率选自：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1和至少约106M-1s-1。
44.根据实施方案38的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的解离速率选自：至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1和至多约10-6s-1。
45.一种包括实施方案1-32中任一项的结合蛋白的标记的结合蛋白，其中所述结合蛋白与可检测标记缀合。
46.实施方案45的标记的结合蛋白，其中所述可检测标记选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。
47实施方案46的标记的结合蛋白，其中所述标记是放射性标记，其选自：3H、14C、354、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
48.一种包括实施方案1-32中任一项所述的结合蛋白的抗体构建体，所述抗体构建体进一步包括接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。
49.根据实施方案48的抗体构建体，其选自
免疫球蛋白分子，
单克隆抗体，
嵌合抗体，
CDR嫁接的抗体，
人源化抗体，
Fab，
Fab′，
F(ab′)2，
FV，
二硫键连接的Fv，
scFv，
单结构域抗体，
双抗体，
多特异性抗体，
双重特异性抗体，和
双特异性抗体。
50.根据实施方案48的抗体构建体，其中所述抗体构建体包括重链免疫球蛋白恒定结构域，其选自：
人IgM恒定结构域，
人IgG1恒定结构域，
人IgG2恒定结构域，
人IgG3恒定结构域，
人IgG4恒定结构域，
人IgE恒定结构域，
人IgA恒定结构域，
和具有一个或多个突变、改变与Fc新生受体、Fcγ受体或C1q结合强度的IgG恒定结构域变体。
51.根据实施方案48的抗体构建体，其包括具有选自下述的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定结构域：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5及其组合。
52.一种包括如实施方案48中所述的抗体构建体的抗体缀合物，其中所述抗体构建体与治疗剂和细胞毒剂缀合。
53.根据实施方案52的抗体缀合物，其中所述治疗剂或细胞毒剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝***剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
54.一种分离的核酸，其编码选自下述的多肽：包括重链可变结构域的多肽，其中所述重链可变结构域包括一种或多种如实施方案1中所述的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3；包括轻链可变结构域的多肽，其中所述轻链可变结构域包括一种或多种如实施方案1中所述的CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3；或两种多肽的组合。
55.一种载体，其包括根据实施方案54的分离的核酸。
56.实施方案55的载体，其中所述载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE和pBJ。
57.一种宿主细胞，其包括根据实施方案55和56任一项的载体。
58.根据实施方案57的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
59.根据实施方案58的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
60.根据实施方案59的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
61.根据实施方案60的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。
62.根据实施方案61的宿主细胞，其中所述真核细胞是选自哺乳动物细胞、鸟类细胞和昆虫细胞的动物细胞。
63.根据实施方案62的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
64.根据实施方案62的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS细胞。
65.根据实施方案61的宿主细胞，其中所述真菌细胞是酿酒酵母。
66.根据实施方案62的宿主细胞，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。
67.一种产生结合人DLL4的结合蛋白的方法，其包括在足以产生结合人DLL4的结合蛋白的条件下，在培养基中培养实施方案57-66中任一项的宿主细胞。
68.一种结合蛋白，其根据实施方案67的方法产生。
69.一种结晶结合蛋白，其包括根据实施方案1-32任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白以晶体存在。
70.根据实施方案69的结晶结合蛋白，其中所述晶体是无载体的药学控释晶体。
71.根据实施方案69的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性配对物更长的体内半衰期。
72.根据实施方案69的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白保留生物学活性。
73.一种用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物包括：
(a)制剂，其中所述制剂包括根据实施方案69-72中任一项的结晶结合蛋白和成分；和
(b)至少一种聚合载体。
74.根据实施方案73的组合物，其中所述聚合载体是选自下述中的一种或多种的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、掺合物及其共聚物。
75.根据实施方案73的组合物，其中所述成分选自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
76.一种用于治疗哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的根据实施方案73的组合物的步骤。
77.一种药物组合物，其包含实施方案1-32中任一项的结合蛋白和药学可接受的载体。
78.实施方案77的药物组合物，其进一步包含用于治疗其中DLL4活性是有害的病症的至少一种另外的治疗剂。
79.实施方案78的药物组合物，其中所述另外的试剂选自：血管发生抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；粘附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506和非类固醇消炎药。
80.一种用于减少人DLL4活性的方法，其包括使人DLL4与实施方案1-32中任一项的结合蛋白接触，从而使得人DLL4活性减少。
81.一种用于减少患有其中DLL4活性是有害的病症的人受试者中的人DLL4活性的方法，其包括给所述人受试者施用实施方案1-32中任一项的结合蛋白，从而使得所述人受试者中的人DLL4活性减少。
82.一种用于治疗受试者的其中DLL4活性是有害的疾病或病症的方法，其通过下述实现：给所述受试者施用实施方案1-32中任一项的结合蛋白，从而实现治疗。
83.实施方案82的方法，其中所述病症选自：乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、尿道癌、女性生殖道癌、男性生殖道癌、内分泌腺体癌、皮肤癌、血管瘤、黑色素瘤、肉瘤、脑瘤、神经癌、眼部肿瘤、脑膜癌、造血恶性肿瘤的实体肿瘤、肿瘤转移、眼部新生血管化、水肿、类风湿关节炎、多发性硬化症、动脉硬化斑块、克罗恩病、炎症性肠病、顽固性腹水、牛皮癣、结节病、动脉血管硬化、败血症、消化道溃疡、烧伤和胰腺炎、多囊性卵巢疾病(POD)、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、良性***增生和其他独立于和依赖于血管生成的疾病，其特征在于异常DLL4活性。
84.实施方案83的方法，其中所述病症是原发性和转移性癌症。
85.实施方案83的方法，其中所述尿道癌选自肾癌、膀胱癌和尿道上皮癌。
86.实施方案83的方法，其中所述的女性生殖道癌选自子***、子宫癌、卵巢癌、绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病。
87.实施方案83的方法，其中所述男性生殖道癌选自***癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤。
88.实施方案83的方法，其中所述内分泌腺体癌选自甲状腺癌、肾上腺癌和脑垂体腺癌。
89.实施方案83的方法，其中所述肉瘤选自骨肉瘤/软组织肉瘤和卡波西氏肉瘤。
90.实施方案83的方法，其中所述脑膜癌选自星形胶质细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤，神经鞘瘤和脑膜瘤。
91.实施方案83的方法，其中所述造血恶性肿瘤的实体肿瘤是白血病、霍奇金氏白血病、非霍奇氏白血病、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。
92.实施方案83的方法，其中所述眼部新生血管化选自糖尿病失明、视网膜病变、年龄引起的黄斑变性和虹膜发红。
93.一种治疗患有其中DLL4是有害的病症的患者的方法，其包括在第二种试剂施用之前、同时或之后，施用实施方案1-32中任一项的结合蛋白的步骤，其中所述第二种试剂选自能够结合人VEGFR2的抗体或其片段；氨甲蝶呤；能够结合人TNF的抗体或其片段；皮质类固醇、环孢菌素、雷帕霉素、FK506和非类固醇消炎药。
94.一种包括能够结合人DLL4的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包括选自下述的至少一个或多个CDR：
CDR-H1：X1-X2-X3-X4-X5(SEQIDNO：105)，其中；
X1是S、N或D；
X2是H或Y；
X3是W；
X4是M；
X5是S或H；
CDR-H2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17(SEQIDNO：106)，其中；
X1是I、D、M或T；
X2是I；
X3是S；
X4是Y、N、S、Q、V、T、H或D；
X5是D；
X6是G；
X7是S、R、I、T、G、K、H或N；
X8是N、Y、S、I或T；
X9是K、M、N、Q、E、T、R、S、A或L；
X10是Y、D或E；
X11是S或Y；
X12是A；
X13是D；
X14是S；
X15是V；
X16是K；和
X17是G；
CDR-H3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQIDNO：107)，
其中；
X1是A；
X2是G、A或R；
X3是G；
X4是G、S或A；
X5是N；
X6是V或M；
X7是G；
X8是F、L、Y或M；
X9是D；和
X10是I、S或L；
CDR-L1：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11(SEQIDNO：108)，
其中；
X1是S；
X2是A或G；
X3是D；
X4是K、N、L、Q、M、E、S、T、G或D；
X5是L；
X6是G；
X7是T、S、N、A、G或E；
X8是K、Q、N或R；
X9是Y；
X10是V或I；和
X11是S；
CDR-L2：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQIDNO：109)，其中；
X1是Q；
X2是D；
X3是A、G、W、S或D；
X4是K、M、Q、N、L、T、I或E；
X5是R；
X6是P；和
X7是S；
和
CDR-L3：X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9(SEQIDNO：110)，其中；
X1是Q；
X2是S或A；
X3是W；
X4是D；
X5是R、S、Q、P、A、V、W或M；
X6是S、G、I、N、R或T；
X7是D或G；
X8是V、A、P或E；和
X9是V.
95.实施方案94的结合蛋白，其中所述至少一个CDR包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：112的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：112的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：112的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：113的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：113的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：113的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：316的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：316的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：316的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：317的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：317的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：317的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：318的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：318的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：318的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：319的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：319的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：319的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：320的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：320的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：320的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：321的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：321的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：321的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：322的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：322的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：322的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：323的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：323的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：323的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：324的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：324的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：324的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：325的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：325的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：325的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：326的残基31-35(CDR-H1)；SEQIDNO：326的残基50-66(CDR-H2)；SEQIDNO：326的残基99-108(CDR-H3)；
SEQIDNO：327的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：327的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：327的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：328的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：328的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：328的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：329的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：329的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：329的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：330的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：330的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：330的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：331的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：331的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：331的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：332的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：332的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：332的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO：333的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO：333的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO：333的残基88-96(CDR-L3)。
96.实施方案95的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括至少3个CDR。
97.实施方案96的结合蛋白，其中所述至少3个CDR包括选自下述的可变结构域CDR组：
VHA10CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：112的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：112的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：112的残基99-108
VLA10CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：113的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：113的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：113的残基88-96
VHA10.3CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：316的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：316的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：316的残基99-108
VLA10.3CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：327的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：327的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：327的残基88-96
VHA10.K30CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：317的残基31-35
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VHA10.K42CDR组
CDR-H1：SEQIDNO：318的残基31-35
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VHA10.9ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：319的残基31-35
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VHA10.8ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：320的残基31-35
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VHA10.1ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：321的残基31-35
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VHA10.5DCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：322的残基31-35
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VHA10.3ACDR组
CDR-H1：SEQIDNO：323的残基31-35
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VLA10.3ACDR组
CDR-L1：SEQIDNO：330的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：330的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：330的残基88-96
VHA10.6BCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：324的残基31-35
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VLA10.6BCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：331的残基23-33
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CDR-L3：SEQIDNO：331的残基88-96
VHA10.3DCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：325的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：325的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：325的残基99-108
VLA10.3DCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：332的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：332的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：332的残基88-96
VHA10.4CCDR组
CDR-H1：SEQIDNO：326的残基31-35
CDR-H2：SEQIDNO：326的残基50-66
CDR-H3：SEQIDNO：326的残基99-108
VLA10.4CCDR组
CDR-L1：SEQIDNO：333的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：333的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：333的残基88-96
VLA10.L45CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：328的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：328的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：328的残基88-96
VLA10.L73CDR组
CDR-L1：SEQIDNO：329的残基23-33
CDR-L2：SEQIDNO：329的残基49-55
CDR-L3：SEQIDNO：329的残基88-96
98.实施方案97的结合蛋白，其包括至少两个可变结构域CDR组。
99.实施方案98的结合蛋白，其中所述至少两个可变结构域CDR组选自：
VHA10CDR组和VLA10CDR组；
VHA10.3CDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.3ACDR组和VLA10.3A组；
VHA10.6BCDR组和VLA10.6B组；
VHA10.3DCDR组和VLA10.3DCDR组；
VHA10.4CCDR组和VLA10.4CCDR组；
VHA10.K30CDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.K42CDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.3CDR组和VLA10.L45CDR组；
VHA10.3CDR组和VLA10.L73CDR组；
VHA10.9ACDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.8ACDR组和VLA10.3CDR组；
VHA10.1ACDR组和VLA10.3CDR组；和
VHA10.5DCDR组和VLA10.3CDR组。
100.实施方案94-99中任一项的结合蛋白，其进一步包括人接纳体构架。
101.实施方案100的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包括选自下述的氨基酸序列：
重链接纳体构架序列SEQIDNO：6-22，
重链接纳体序列SEQIDNO：35-62，
轻链接纳体序列SEQIDNO：23-34，和
轻链接纳体序列SEQIDNO：63-98。
102.实施方案100或101的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中所述构架的氨基酸序列与所述人接纳体构架的序列至少65％等同，并且包括与所述人接纳体构架等同的至少70个氨基酸残基。
103.实施方案101的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包括在关键残基处的至少一个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
与CDR接近的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与人DLL4相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
在Vernier区内的残基；和
在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
104.实施方案103的结合蛋白，其中所述关键残基选自：2H、4H、24H、26H、27H、29H、34H、35H、37H、39H、44H、45H、47H、48H、49H、50H、51H、58H、59H、60H、63H、67H、69H、71H、73H、76H、78H、91H、93H、94H、2L、4L、25L、29L、27bL、33L、34L、36L、38L、43L、44L、46L、47L、48L、49L、55L、58L、62L、64L、71L、87L、89L、90L、91L、94L、95L.
105.实施方案104的结合蛋白，其中所述结合蛋白是共有人可变结构域。
106.实施方案94的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列的至少一个可变结构域：
SEQIDNO：112、113、316、327、317、318、319、320、321、322、323、330、324、331、325、332、326、333、328和329。
107.实施方案106的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括2个可变结构域，其中所述2个可变结构域具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：112和113、SEQIDNO：316和327、SEQIDNO：323和330、SEQIDNO：324和331、SEQIDNO：325和332、SEQIDNO：326和333。
108.实施方案104的结合蛋白，，其中所述结合蛋白包括具有选自下述的氨基酸序列的至少一个可变结构域：SEQIDNO：112、113、316、327、317、318、319、320、321、322、323、330、324、331、325、332、326、333、328和329。
109.实施方案95的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VH.
110.实施方案109的结合蛋白，其中所述VH包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和326。
111.实施方案95的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VL。
112.实施方案111的结合蛋白，其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：113、327、328、329、330、331、332和333。
113.实施方案95的结合蛋白，其中所述所述抗原结合结构域包括VH和VL。
114.实施方案112的结合蛋白，其进一步包括VH，其中所述VH包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和326。
115.根据实施方案20的结合蛋白，其中所述VL包括选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：113、327、328、329、330、331、332和333。
116.实施方案95的结合蛋白，其进一步包括选自下述的重链免疫球蛋白恒定结构域：人IgM恒定结构域；人IgG1恒定结构域；人IgG2恒定结构域；人IgG3恒定结构域；人IgG4恒定结构域；人IgE恒定结构域和人IgA恒定结构域。
117.实施方案117的结合蛋白，其中所述重链免疫球蛋白恒定结构域是人IgG1恒定结构域。
118.实施方案117的结合蛋白，其中所述人IgG1恒定结构域包括选自SEQIDNO：2和SEQIDNO：3的氨基酸序列。
119.实施方案95的结合蛋白，其进一步包括轻链免疫球蛋白恒定结构域选自：人Igκ恒定结构域和人Igλ恒定结构域。
120.实施方案119的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区结构域是人Igκ恒定结构域，其包括氨基酸序列SEQIDNO：4。
121.实施方案119的结合蛋白，其中所述轻链免疫球蛋白恒定区结构域是人Igλ恒定结构域，其包括氨基酸序列SEQIDNO：5。
122.实施方案94的结合蛋白其中所述结合蛋白选自：免疫球蛋白分子；scFv；单克隆抗体；人抗体；嵌合抗体；人源化抗体；单结构域抗体；Fab片段；Fab’片段；F(ab’)2；Fv；二硫键连接的Fv，单结构域抗体，双抗体，多特异性抗体，双特异性抗体和双重特异性抗体。
123.实施方案122的结合蛋白，其中所述结合蛋白是人抗体。
124.一种能够结合人DLL-4的结合蛋白，所述结合蛋白包括：
Ig恒定重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：2和SEQIDNO：3；
Ig恒定轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：SEQIDNO：4和SEQIDNO：5；
Ig可变重链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：112、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325和326；和
Ig可变轻链区，其具有选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO：113、327、328、329、330、331、332和333。
125.实施方案124的结合蛋白，其中所述Ig恒定轻链区是SEQIDNO：5。
126.根据实施方案94-125中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch蛋白的相互作用，所述Notch蛋白选自Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4及其组合。
127.实施方案126的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-1和Notch-4的相互作用。
128.实施方案126的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-1的相互作用。
129.实施方案126的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够阻止DLL4与Notch-4的相互作用。
130.实施方案94-125中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够调节DLL4的生物学功能。
131.实施方案94-125中任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白能够中和DLL4。
132.实施方案131的中和结合蛋白，其中所述DLL4选自：人DLL4、小鼠DLL4、食蟹猴DLL4和大鼠DLL4。
133.实施方案131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白减少DLL4与其受体结合的能力。
134.实施方案131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能够降低正常血管生成。
135.实施方案131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的解离常数(KD)选自：至多约10-7M；至多约10-8M；至多约10-9M；至多约10-10M；至多约10-11M；至多约10-12M和至多10-13M。
136.实施方案131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的结合速率选自：至少约102M-1s-1；至少约103M-1s-1；至少约104M-1s-1；至少约105M-1s-1和至少约106M-1s-1。
137.实施方案131的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白具有的解离速率选自：至多约10-3s-1；至多约10-4s-1；至多约10-5s-1和至多约10-6s-1。
138.一种包括实施方案94-137中任一项的结合蛋白的标记的结合蛋白，其中所述结合蛋白与可检测标记缀合。
139.实施方案138的标记的结合蛋白，其中所述可检测标记选自放射性标记、酶、荧光标记、发光标记、生物发光标记、磁性标记和生物素。
140.实施方案139的标记的结合蛋白，其中所述标记是放射性标记，其选自：3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho和153Sm。
141.一种抗体构建体，其包括实施方案94-137中任一项所述的结合蛋白和进一步包括接头多肽或免疫球蛋白恒定结构域。
142.根据实施方案141的抗体构建体，其选自：
免疫球蛋白分子，
单克隆抗体，
嵌合抗体，
CDR嫁接的抗体，
人源化抗体，
Fab，
Fab′，
F(ab′)2，
Fv，
二硫键连接的Fv，
scFv，
单结构域抗体，
双抗体，
多特异性抗体，
双重特异性抗体，和
双特异性抗体。
143.根据实施方案141的抗体构建体，其中所述抗体构建体包括重链免疫球蛋白恒定结构域，其选自：
人IgM恒定结构域，
人IgG1恒定结构域，
人IgG2恒定结构域，
人IgG3恒定结构域，
人IgG4恒定结构域，
人IgE恒定结构域，
人IgA恒定结构域，
和具有一个或多个突变、改变与Fc新生受体、Fcγ受体或C1q结合强度的IgG恒定结构域变体。
144.根据实施方案141的抗体构建体，其包括具有选自下述的氨基酸序列的免疫球蛋白恒定结构域：SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5及其组合。
145.一种包括如实施方案141中所述的抗体构建体的抗体缀合物，其中所述抗体构建体与治疗剂和细胞毒剂缀合。
146.根据实施方案145的抗体缀合物，其中所述治疗剂或细胞毒剂选自：抗代谢物、烷化剂、抗生素、生长因子、细胞因子、抗血管生成剂、抗有丝***剂、蒽环类、毒素和细胞凋亡剂。
147.一种分离的核酸，其编码选自下述的多肽：包括重链可变结构域的多肽，其中所述重链可变结构域包括一种或多种如实施方案94中所述的CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3；包括轻链可变结构域的多肽，其中所述轻链可变结构域包括一种或多种如实施方案94中所述的CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3；或两种多肽的组合。
148.一种载体，其包括根据实施方案147的分离的核酸。
149.实施方案148的载体，其中所述载体选自pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE和pBJ。
150.一种宿主细胞，其包括根据实施方案148和149任一项的载体。
151.根据实施方案150的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞。
152.根据实施方案151的宿主细胞，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
153.根据实施方案152的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
154.根据实施方案153的宿主细胞，其中所述真核细胞选自原生生物细胞、动物细胞、植物细胞和真菌细胞。
155.根据实施方案154的宿主细胞，其中所述真核细胞是选自哺乳动物细胞、鸟类细胞和昆虫细胞的动物细胞。
156.根据实施方案155的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞。
157.根据实施方案155的宿主细胞，其中所述宿主细胞是COS细胞。
158.根据实施方案154的宿主细胞，其中所述真菌细胞是酿酒酵母。
159.根据实施方案155的宿主细胞，其中所述昆虫细胞是Sf9细胞。
160.一种产生结合人DLL4的结合蛋白的方法，其包括在足以产生结合人DLL4的结合蛋白的条件下，在培养基中培养实施方案150-159中任一项的宿主细胞。
161.一种结合蛋白，其根据实施方案160的方法产生。
162.一种结晶结合蛋白，其包括根据实施方案94-137任一项的结合蛋白，其中所述结合蛋白以晶体存在。
163.根据实施方案162的结晶结合蛋白，其中所述晶体是无载体的药学控释晶体。
164.根据实施方案162的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白具有比所述结合蛋白的可溶性配对物更长的体内半衰期。
165.根据实施方案162的结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白保留生物学活性。
166.一种用于释放结合蛋白的组合物，所述组合物包括：
(a)制剂，其中所述制剂包括根据实施方案162-165中任一项的结晶结合蛋白和成分；和
(b)至少一种聚合载体。
167.根据实施方案166的组合物，其中所述聚合载体是选自下述中的一种或多种的聚合物：聚丙烯酸、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基酸、聚酐、聚酯肽、聚酯、聚乳酸、乳酸-乙醇酸共聚物或PLGA、聚b-羟基丁酸酯、聚己内酯、聚二氧杂环己酮、聚乙二醇、聚(羟丙基)甲基丙烯酰胺、聚有机磷腈、聚原酸酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、马来酐-烷基乙烯基醚共聚物、pluronic多元醇、清蛋白、藻酸盐、纤维素和纤维素衍生物、胶原、纤维蛋白、明胶、透明质酸、寡糖、糖胺聚糖、硫酸化多糖、掺合物及其共聚物。
168.根据实施方案166的组合物，其中所述成分选自清蛋白、蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明胶、羟丙基-β-环糊精、甲氧基聚乙二醇和聚乙二醇。
169.一种用于治疗哺乳动物的方法，其包括给哺乳动物施用有效量的根据实施方案166的组合物的步骤。
170.一种药物组合物，其包含实施方案94-137中任一项的结合蛋白和药学可接受的载体。
172.实施方案170的药物组合物，其进一步包含用于治疗其中DLL4活性是有害的病症的至少一种另外的治疗剂。
173.实施方案172的药物组合物，其中所述另外的试剂选自：血管发生抑制剂；激酶抑制剂；共刺激分子阻断剂；粘附分子阻断剂；抗细胞因子抗体或其功能片段；氨甲蝶呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506和非类固醇消炎药。
174.一种用于减少人DLL4活性的方法，其包括使人DLL4与实施方案94-137中任一项的结合蛋白接触，从而使得人DLL4活性减少。
175.一种用于减少患有其中DLL4活性是有害的病症的人受试者中的人DLL4活性的方法，其包括给所述人受试者施用实施方案94-137中任一项的结合蛋白，从而使得所述人受试者中的人DLL4活性减少。
176.一种用于治疗受试者的其中DLL4活性是有害的疾病或病症的方法，其通过下述实现：给所述受试者施用实施方案94-137中任一项的结合蛋白，从而实现治疗。
177.实施方案176的方法，其中所述病症选自：乳腺癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、口咽癌、下咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、小肠癌、尿道癌、女性生殖道癌、男性生殖道癌、内分泌腺体癌、皮肤癌、血管瘤、黑色素瘤、肉瘤、脑瘤、神经癌、眼部肿瘤、脑膜癌、造血恶性肿瘤的实体肿瘤、肿瘤转移、眼部新生血管化、水肿、类风湿关节炎、多发性硬化症、动脉硬化斑块、克罗恩病、炎症性肠病、顽固性腹水、牛皮癣、结节病、动脉血管硬化、败血症、消化道溃疡、烧伤和胰腺炎、多囊性卵巢疾病(POD)、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、良性***增生和其他独立于和依赖于血管生成的疾病，其特征在于异常DLL4活性。
178.实施方案177的方法，其中所述病症是原发性和转移性癌症。
179.实施方案177的方法，其中所述尿道癌选自肾癌、膀胱癌和尿道上皮癌。
180.实施方案177的方法，其中所述的女性生殖道癌选自子***、子宫癌、卵巢癌、绒毛膜癌和妊娠滋养细胞疾病。
181.实施方案177的方法，其中所述男性生殖道癌选自***癌、精囊癌、睾丸癌和生殖细胞肿瘤。
182.实施方案177的方法，其中所述内分泌腺体癌选自甲状腺癌、肾上腺癌和脑垂体腺癌。
183.实施方案177的方法，其中所述肉瘤选自骨肉瘤/软组织肉瘤和卡波西氏肉瘤。
184.实施方案177的方法，其中所述脑膜癌选自星形胶质细胞瘤、胶质瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、神经瘤、神经母细胞瘤，神经鞘瘤和脑膜瘤。
185.实施方案177的方法，其中所述造血恶性肿瘤的实体肿瘤是白血病、霍奇金氏白血病、非霍奇氏白血病、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。
186.实施方案83的方法，其中所述眼部新生血管化选自糖尿病失明、视网膜病变、年龄引起的黄斑变性和虹膜发红。
187.一种治疗患有其中DLL4是有害的病症的患者的方法，其包括在第二种试剂施用之前、同时或之后，施用实施方案94-137中任一项的结合蛋白的步骤，其中所述第二种试剂选自能够结合人VEGFR2的抗体或其片段；氨甲蝶呤；能够结合人TNF的抗体或其片段；皮质类固醇、环孢菌素、雷帕霉素、FK506和非类固醇消炎药。
实施例
实施例1：用于测定DLL4抗体功能活性的体外试验。
实施例1.1：使用表面等离子共振技术测定亲和力。
表面等离子共振试验(Biacore，Inc.，Piscataway，NewJersey，US)通过结合与解离常数的动力学测量来测定抗体的亲和力。通过基于表面等离子共振的测量方法，使用仪器(Biacore2000、Biacore3000、或BiacoreT100；GEHealthcare，Piscataway，NewJersey，US)，使用HBS-EPB运行缓冲液(10mMHEPES[pH7.4]、150mMNaCl、3mMEDTA、0.1mg/mlBSA和0.005％表面活性剂P20)在25℃下，测定DLL4抗体与纯化的重组DLL4细胞外结构域的结合，例如，根据制造商的说明书和操作流程，使用标准胺偶联试剂盒，将稀释在10mM乙酸钠(pH4.5)的大约9000RU的山羊抗-人Fc特异性多克隆抗体(ThermoFisherScientificInc.，Rockford，Illinois，US)以25μg/ml直接固定在CM5研究级生物传感芯片上，用乙醇胺封闭生物传感器表面的未反应部分。应用Scrubber2(BioLogicSoftware)、BiacoreBiaevaluation4.0.1软件或BiacoreT100评估软件(使用全局拟合分析)，1∶1朗缪尔结合模型衍生的速率方程同时适用于多个抗原注射，以进行动力学分析。在运行缓冲液中稀释纯化的抗体，用于在山羊抗-人Fc反应表面的捕获反应，待捕获的抗体作为配体(1μg/ml)，以10μl/min的流速注射到反应基质中。在测定过程中，所有的测量都以单独的捕获表面(即，未捕获抗-DLL4抗体)作为参照，在持续的80μl/min流速下测定结合与解离常数，Kon(M-1s-1)和Koff(s-1)。在不同的抗原浓度范围(从1.23-900nM，作为3倍稀释系列)并包括只有缓冲液的注射(用作双重参照)条件下，通过进行动力学结合测量产生速率常数。然后通过以下公式：KD＝Koff/Kon，从动力学速率常数计算抗体与目标抗原之间反应的平衡解离常数KD(M)。以时间函数来记录结合并计算动力学速率常数。在本试验中，可以测量到快至106M-1s-1的结以及慢至10-6s-1的解离。
实施例1.2：通过ELISA测定DLL4抗体与可溶性DLL4细胞外结构域的结合。
方法1(捕获ELISA)
用5μg/ml抗人IgG(Fcg片段特异的，JacksonImmunoResearch，#109-005-098，100μl/孔)抗体在D-PBS(Gibco#14190)中包被96孔Nunc-Immuno板(#439454)并在4℃温育过夜。用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)洗涤ELISA板3次，然后用200ml/孔封闭缓冲液(D-PBS，1％BSA，1mMCaCl2，0.05％Tween-20)在25℃封闭一小时。将板子洗涤3次后与100μl/孔DLL4抗体(0.0001-100nM，在封闭缓冲液中做10-倍系列稀释)在25℃温育1小时，然后再洗涤3次。含有捕获的DLL4抗体的板子与生物素标记的人DLL4细胞外结构域(10nMin封闭缓冲液，100μl/孔)在25℃温育1小时、洗涤3次、并与HRP缀合的链霉亲和素(streptavidin)(KPL#474-3000，在封闭缓冲液中1∶10,000稀释，100μl/孔)在25℃温育1小时。洗涤最后一次以后，板与100μl/孔ELISA底物(1-StepUltraTMB-ELISA，Pierce#340280)一起温育，在25℃温育2分钟后，用100μl/孔2NH2SO4终止反应并读取450nm下的光吸收值。使用GraphpadPrism软件分析数据并报告EC50值。
方法2(铜包被板)
在使用之前用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)洗涤96孔铜包被板(ThermoScientific#15143)3次，然后与100μl/孔人DLL4-his或小鼠DLL4-his或猴DLL4-his(1μg/ml在PBS中)在25℃振动温育1小时，然后洗板3次。然后在板中加入100μl/孔的重组大鼠/人嵌合抗体或重组人抗-DLL4抗体(0.00164-27nM，在ELISA缓冲液PBST，10％Superblock(Pierce#37515)中的4倍系列稀释)在25℃振动1小时，然后再洗涤3次。将板子与山羊抗-人HRP(Pierce#31412)(以1∶40,000在ELISA缓冲液中稀释，100μl/孔)在25℃下振动温育1小时，然后洗涤3次。洗涤最后一次以后，板子与100μl/孔ELISA底物(Sigma#T8665)一起温育，在25℃温育8分钟后，用100μl/孔1NHCl终止反应并读取450nm下的光吸收值。使用GraphpadPrism软件分析数据并报告EC50值。
实施例1.3：通过流式细胞术(FACS)评估DLL4单克隆抗体与人肿瘤细胞系表面的结合。
从组织培养瓶中收获过量表达细胞表面DLL4的稳定细胞系，洗涤四次并重新悬浮于含有1％牛血清蛋白和1mMCaCl2的磷酸盐缓冲液(PBS)(FACS缓冲液)中。1.5x105个细胞与不同浓度的抗体一起在FACS缓冲液中置冰上温育60分钟，洗涤细胞两次，并加入50μLR-藻红蛋白缀合的抗-鼠IgG，F(ab′)2片段(在FACS缓冲液中1∶200稀释)(JacksonImmunoResearch，WestGrove，Pennsylvania，US，Cat.#112-116-072)。在冰上温育(4℃，60分钟)后，洗涤细胞三次，并在FACS缓冲液中重新悬浮，使用BectonDickinsonFACSCalibur-HTS(BectonDickinson，SanJose，California，US)测量荧光。使用GraphpadPrism软件分析数据并报告EC50值，作为达到DLL4抗体与表达DLL4的细胞最大结合的50％时抗体的浓度。
实施例1.4：通过DLL4抗体对Notch-1与可溶性DLL4细胞外结构域相互作用的抑制(竞争ELISA)。
用16nM人Notch-1(R&D***s#3647-TK，于D-PBS中，100μl/孔)包被96孔Nunc-Immuno板(#439454用于huDLL4ELISA)和96孔Costar板(#9018用于muDLL4ELISA)并在4℃温育过夜，然后用洗涤缓冲液(PBS，0.05％Tween-20)洗板3次，并用200μl/孔封闭缓冲液(D-PBS，1％BSA，1mMCaCl2，0.05％Tween-20)在25℃封闭1小时，在封闭时，生物素标记的人DLL4细胞外结构域(14nM)与抗体(30pM-66nM，在封闭缓冲液中3-倍系列稀释)在25℃振动混合1小时。封闭后洗涤测定板，并与DLL4/抗体混合物一起温育(100μl/孔，在25℃振动1小时)。再次洗板并加入100μl/孔与HRP缀合的链霉亲和素(Fitzgerald#65R-S104PHRPx，在封闭缓冲液中1∶5,000稀释)在25℃振动1小时。洗涤最后一次以后，使用100μl/孔底物(TMBSigma#T8665)对板子进行显色，在25℃温育8分钟(对于muDLL4ELISA)和20分钟(对于huDLL4ELISA)后，用100μl/孔1NHCl终止反应并读取450nm下的光吸收值。使用GraphpadPrism软件分析数据并报告EC50值，作为达到DLL4与Notch1结合减少50％时抗体的浓度。
实施例1.5：通过抗-DLL4单克隆抗体阻断可溶性Notch与过量表达DLL4的293G细胞的结合并通过流式细胞术进行评估(竞争FACS)。
Notch阻断试验：简单地说，从组织培养瓶收获过量表达细胞表面DLL4的稳定细胞系，并重新悬浮于含有1％牛血清蛋白和1mMCaCl2的磷酸盐缓冲液(PBS)(FACS缓冲液)中。将HEK293-hDLL4或HEK293-mDLL4细胞以1.5x105细胞/孔分配到96孔板(v形底)的FACS缓冲液中。在将细胞轻甩下来并弃去上清液后，在每个孔中加入50μL适当稀释的纯化的IgG，并在冰上4℃温育60分钟，接着加入0.2μg/mL(对于hDLL4-293G)或2.0μg/mL(对于mDLL4-293G)的Notch1-生物素，50μL/孔(最终1.0或0.1μg/mL)，在冰上4℃再温育1小时。用FACS缓冲液洗涤细胞两次后，加入50μLR-藻红蛋白缀合的链霉亲和素(在FACS缓冲液1∶150稀释)(JacksonImmunoResearch，WestGrove，Pennsylvania，US，catalogno.016-110-084)。在冰上温育(4℃，60分钟)后，洗涤细胞三次并在FACS缓冲液中重新悬浮，使用BectonDickinsonFACSCalibur-HTS(BectonDickinson，SanJose，California，US)测量荧光。使用GraphpadPrism软件分析数据并报告EC50值，作为达到Notch1与表达DLL4的细胞结合减少50％时抗体的浓度。
实施例1.6：通过DLL4抗体，对EA.hy926细胞中依赖于DLL4的sVEGFR1(sFLT1)增加的抑制。
用100μl/孔人DLL4细胞外结构域(在D-PBS中浓度为1.67mg/ml)(Gibco#14190)包被96孔组织培养板，并在4℃温育过夜。用D-PBS洗板一次，并在抗体不存在或存在的条件下播种4000个EA.hy926细胞/孔，四天以后使用CyQUANT细胞增殖测定试剂盒(Invitrogen，#C35007)检测细胞增殖。使用制造商推荐的ELISA试剂盒(R&D***#DVR100B)检测sVEGFR1在条件培养基中的表达，以CyQUANT试验测定的RFU标准化处理VEGFR1的表达水平来解释细胞增殖中的差异。
实施例1.7：使用Notc报告物测定在EA.hy926细胞中DLL4抗体对DLL4-依赖的Notch活化的抑制
96孔黑色透明底组织培养板以7000个细胞/孔接种改造的表达由Notch应答启动子驱动的荧光素酶的EA.hy926细胞并过夜，将从200nM系列稀释的抗体与等体积的表达全长DLL4的HEK293G细胞(5000细胞/孔)混合15分钟，293G/DLL4细胞与EA.hy926Notchreporter细胞在测试抗体的存在下共培养24小时。使用Promega的底物(Promega#E2940)分析荧光素酶的活性。
实施例1.8：分子特性和理化性质表征的分析方法与技术
PEG沉淀法
根据体积排阻原理使用PEG诱导固体蛋白质的相分离代表了一种评估蛋白质溶解度的可行方法。PEG与其他沉淀剂相比具有几个优点，其包括在环境温度下蛋白质变性最小(不影响蛋白质的三级结构)并且在4℃至30℃温度范围内不需要控制，即，沉淀研究可以在环境温度下在实验台上进行。
通常，PEG诱导的蛋白质沉淀是基于体积排阻效应来解释的，根据这个理论，蛋白质从被PEG线性链所占据的溶剂区域空间中排除出来，结果，蛋白质被浓缩并最终在超过其溶解度时沉淀下来。在热力学术语中，空间排阻导致蛋白质化学势的增加，直至超出纯固体状态的化学势而导致蛋白质沉淀，这主要是因为PEG与蛋白质之间相互作用的大量不利的自由能而产生的，由于空间排阻效应而减少了蛋白质的优先水合作用。在水溶液中，优先水合有助于保持蛋白质的自然结构，通常，增加PEG的分子量使体积排阻表现为更加有效，即，增加PEG分子量时需要更少的PEG来沉淀蛋白。
选择分子量为3000的PEG来估计本专利所包括的抗体的溶解度。通过以1克PEG到1mL水的比例将PEG溶解在去离子水中，制备50％的PEG溶液，然后将PEG溶液加到抗体溶液中，此抗体溶液的初始浓度为小于或等于0.5mg/ml且体积为0.5mL，不断地加入PEG溶液并混匀，直到第一例浑浊能够持续。计算导致沉淀所需的PEG3000的百分比作为50x(加入的PEG3000溶液的体积/加入PEG前的抗体溶液初始体积)。
将沉淀所需PEG3000的百分比与已知水溶解度的蛋白沉淀所需的百分比相比较，例如，阿达木单抗(adalimumab)的水溶解度超过200mg/mL，因此，如果感兴趣的蛋白沉淀所需PEG3000的百分比与沉淀阿达木单抗所需的百分比相似，那么预测此蛋白的溶解度将会与阿达木单抗的溶解度相似。
实际溶解度方法
利用Amicon离心过滤器在溶液中浓缩蛋白质，直至观察到蛋白质从溶液中沉淀出来，或至蛋白在此过滤器单元中可以被浓缩的最小体积，来测定实际溶解度。对于后者，15mLAmicon离心过滤器的最小体积大约为50μl而4mLAmicon离心过滤器的最小体积大约为15μl。
首先将蛋白质透析至特定配方的溶液中，对于这些研究，抗体的量为10mg或更少。然后将蛋白质溶液加入Amicon离心过滤器的截留室中，此室由硝酸纤维素膜包围，膜上的孔允许低于10到30kd的分子在承受离心力时穿过。一般高于140kd的抗体会被截留下来而水、缓冲分子、小的赋形剂和盐会穿过。然后根据制造商的说明书将离心过滤器离心，直到观察到蛋白从溶液中沉淀出来，或者直到蛋白在此过滤器单元中可以被浓缩的最小体积。
离心后从截留室中取出蛋白质溶液并通过紫外吸收测量浓度，然后将溶液在25℃和5℃保持1至2天并监测沉淀的情况。
近紫外圆二色性技术(近UV-CDTechnique)
近紫外圆二色光谱学提供了蛋白质三级结构的重要信息，是此领域使用最多的技术之一。圆二色性(CD)是指平面偏振辐射的左右圆形偏振成分的差异吸收。蛋白质在近紫外CD区(250-320nm)的发色团是芳香族氨基酸，即色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，以及二硫键，当发色团存在于不对称环境(被埋起来)中就会发生CD效应。250-270nm区的信号是来自于苯丙氨酸残基、270-290nm的信号是来自于酪氨酸、280-300nm的信号是来自于色氨酸，二硫键在整个近紫外光谱区产生弱的信号。近紫外CD光谱可能对三级结构的微小改变(例如由于蛋白-蛋白相互作用和/或溶液配方环境的变化导致的改变)是敏感的。
还有很多其他因素可以影响芳香族氨基酸的CD光谱，其中有：(1)蛋白质的刚性，(2)氢键的性质和(3)多种芳香族氨基酸之间的相互作用。另外，由于消除了正负带，含有大量这些氨基酸的蛋白质可以具有更小的CD谱带。
简单地说，将蛋白以1mg/ml透析到期望的溶液配方中，并用Jasco800CD分光光度计从250-320nm或240-320nm进行扫描。同时也扫描相对应的不含蛋白质的溶液并从扫描蛋白质溶液的度数中减去此度数。近紫外-CD光谱就是摩尔椭圆率对250或240-320nm波长的作图。
通常对于抗体，具有半S形曲线分布近紫外-CD光谱指示其良好的三级结构折叠，而扁平的和无特征的曲线则指示更多未折叠的倾向。紧密折叠与良好的稳定性相关联，而折叠不好会暴露疏水的内部结构而可能导致蛋白分子间的疏水相互作用，引起不希望的聚集形成。
DSC技术
使用DSC仪器评估抗体的热稳定性。所用的DSC仪器是一台带有毛细管单元的自动化VP-DSC设备(Microcal，GEHealthcareLtd./Microcal，Buckinghamshire，UK)。在25℃-95℃温度范围内，对于1mg/mL的样品应用1℃/分钟的扫描速率研究分子的去折叠。另外应用的测量参数是16秒的调整期、10分钟预扫描等待时间，且测量以无反馈模式进行。对于每个单独的测量，按照如下提供的填板方案，填加420μL样品/空白到DSC测量样品容器内。将所获得的热分析图拟合到非双状态模型以获得中点温度和不同转换的焓。
对于成功的生物开发候选蛋白的一个额外的要求是，蛋白保持其天然状态和构象。水溶液中的蛋白质处于其天然构象(折叠的)与变性构象(未折叠的)的平衡之中，天然状态的稳定性是基于***吉布斯自由能(DG)的量级以及焓(DH)与熵(DS)的变化之间的热力学关系，正的DG指示此天然状态比变性状态更稳定-DG的正值越大越稳定性。蛋白质去折叠需要打破稳定力，构象的熵值超过稳定力使蛋白质去折叠，在此温度下熵值成为主导，DSC测量由于热变形导致去折叠的蛋白质的DH。作为一般规则，可以规定转换中点温度(Tm)越高蛋白质在较低温度下越稳定。在同一个实验期间，DSC还测量引起蛋白质变性的热容量(DCp)的变化。与蛋白质去折叠相关联的热容量变化主要是由于侧链水合作用的变化，即在天然状态是被埋藏起来，而在变性状态则暴露在溶剂中。已经表明DSC是一个有价值的蛋白质和其他生物大分子液体溶液稳定性的预测器(Remmele和Gombotz，BioPharm.，13：36-46(2000)和Remmele等人，Pharm.Res.，15：200-208(1998))。
SEC技术
使用大小排阻层析基于大小来分离蛋白质。在水流动相中运载蛋白质并穿过装在柱子里的多孔固定相树脂，在柱子里的保持时间是蛋白质的流体尺寸与所装载的树脂层的孔径尺寸的函数，较小分子可以渗透到树脂较小的孔隙中而比较大分子保持更长的时间，通过紫外吸收来检测从柱子中洗脱的蛋白质。SEC方法使用TSK凝胶guard(TOSOHBiosciences，Montgomeryville，Pennsylvania，US，cat.no.08543)和TSK凝胶G3000SWxL(TOSOHBiosciences，Montgomeryville，Pennsylvania，US，cat.no.08541).流动相为100mMNa2HPO4，200mMNa2SO4，pH6.8，流速为0.25mL/分钟，注射体积为20μL1mg/mL的样品，柱子的温度为室温，自动进样器的温度为2-8℃，全部运行时间为55分钟，检测是基于在214nm波长(带宽设在8nm)的紫外吸收，使用360nm参照波长(带宽100nm)。
冻融法
将所需制剂中的1mg/ml抗体溶液在-80℃冷冻至少4小时，然后在30℃水浴中融化，然后将溶液在-80℃再次冷冻，如此重复5个循环，在某个冻融循环，例如，第二和第四个循环之后，可以取出一部分溶液用于在重新冷冻之前做SEC分析。为了获得“更差情况的场景”，在低蛋白质浓度下完成冻融稳定性测试，这是由于蛋白质分子更大地暴露在引起变性的冰-水分界面。在较高浓度下，相应更少的蛋白质碰到冰-水分界面，反而与其他蛋白质分子相互作用。
加速稳定法
让所需制剂中的1mg/ml抗体溶液在无菌条件下穿过0.22μmPVDF过滤器并在40℃和/或50℃下温育至少21天，在第7天和21天，无菌条件下取出一部分并通过SEC来分析，然后溶液再放回温育。
实施例2：通过PRO融合mRNA展示技术产生与分离抗-DLL4的人单克隆抗体E9和A10。
使用PRO融合mRNA展示技术(见，Chung-MingHsieh等人，美国专利申请公开号2010/0099103)，对合并的人脾和***抗体文库用DLL4抗原进行七轮筛选：100nM生物素标记的人DLL4细胞外结构域(第1和2轮)，50nM生物素标记的人DLL4细胞外结构域与50nM生物素标记的小鼠DLL4细胞外结构域的混合物(第3轮)、100nM生物素标记的人DLL4细胞外结构域(第4和5轮)、稳定表达人DLL4和100nM生物素标记的人DLL4细胞外结构域的293G细胞(第6轮)、稳定表达人和小鼠DLL4的BAF3细胞(第7轮)。A10和E9都是从抗体文库的第7轮筛选中鉴定出来的(表4)。当被构建到野生型人IgG1中时分别重新命名分别为A10.1和E9.1。
表4.抗-DLL4PROfusion完全人抗体克隆E9和A10序列信息(Kabat编号的CDR由下划线指示)
实施例3：PROfusion抗体E9和A10的体外表征
E9和A10的DLL4抗原结合亲和力通过如实施例1.1所述BIACORE技术测定。如下表5所示，E9和A10具有类似的针对人DLL4的平衡解离常数值(KD分别为3.36和6.68nM)和食蟹猴DLL4(KD分别为4.2和7.8nM)。E9还与小鼠和大鼠DLL4交叉反应(KD分别为16和15nM)。
表5.抗-DLL4PROfusion抗体的Biacore动力学
MAb＝单克隆抗体；E＝乘以10的所示指数；Ka(M-1s-1)；
Kd(s-1)；KD(nM)；NB＝不结合(900nMDLL4)
还使用基于ELISA和FACS的测定(如实施例1.2、1.3所述和如表3报道的EC50值)评估抗体-抗原结合活性。除了结合重组DLL4胞外结构域(ECD)，E9和A10均可结合在细胞表面表达的DLL4(表6)。
抗体阻断DLL4与它的受体Notch1相互作用的能力使用基于ELISA和FACS的竞争测定评价，如实施例1.4和1.5所述。如表6所示，E9和A10有效阻断Notch1与DLL4(ECD和细胞结合形式)的相互作用。另外，基于细胞的功能测定发展为进一步测定抗体体外中和DLL4-介导的细胞活性的能力(如实施例1.6和1.7所述)。E9和A10均在EA.hy926细胞中抑制DLL4-诱导的Notch激活和sVEGFR1表达(表6)。
表6.PROfusionDLL4抗体体外效力。
MAb＝单克隆抗体；hu＝人；mu＝鼠；cyno＝食蟹猴
实施例4：PROfusion抗体E9和A10的亲和力成熟
抗-DLL4E9亲和力成熟。
序列比对显示DLL4抗体E9与人种系VH4-39/JH4和V2-1/JL6具有最高同一性。为了改进E9对DLL4的亲和力，从IgBLAST数据库中还与种系VH4-39和V2-1具有高度同一性的其它人抗体序列鉴定超突变的CDR残基。相应的E9CDR残基然后通过PCR用在这些位置具有低简并性的引物进行限制性突变发生，以产生三个抗体文库，其以scFv形式，适用于亲和力成熟步骤。第一文库含有在VHCDR1和2中残基30、31、32、33、50、54、56和65(Kabat编号)处的突变；第二文库含有在VHCDR3中残基95至100、100a、100b、100c和102处的突变；和第三文库含有在三个VLCDR中残基27、30、31、33、52、53、93至96处的突变。为了进一步增加E9与人种系构架序列的同一性，在VL位置103处的Arg突变为Lys并还在VL位置80(A/P)和100(S/Y)处将二元简并性引入第三文库(表7)。
表7.用于亲和力成熟在E9VH和VL氨基酸序列中的突变。
这些E9文库转化至细胞并在细胞表面上展示以通过磁力然后为荧光活化的细胞分选(FACS)针对低浓度的生物素化的DLL4胞外结构域选择。进行对于改进的结合速率、解离速率或二者的选择并且恢复亲和力-调谐的E9克隆的抗体蛋白序列(表8)用于转换回IgG形式，用于进一步表征。
表8.从对于抗-DLL4抗体E9大的亲和力成熟文库鉴定的抗体克隆蛋白序列。
抗-DLL4A10亲和力成熟。
以类似于上述，E9亲和力成熟的方式，序列比对显示DLL4抗体A10与人种系VH3-30和V2-1具有最高同一性。分别源自VH3-30和V2-1的人VH和Vλ序列从NCBIIgBlast数据库下载以产生序列标识(logo)。这些序列标识用于决定哪些位置将被预测以产生亲和力成熟的文库。
A10文库转化至细胞并在细胞表面上展示以通过磁力然后为荧光活化的细胞分选针对低浓度的生物素化的DLL4胞外结构域选择。进行对于改进的结合速率、解离速率或二者的选择并且恢复亲和力-调谐的A10克隆的抗体蛋白序列用于转换回IgG形式，用于进一步表征。亲和力成熟克隆的重链(VH)区显示于下表9和亲和力成熟克隆的轻链(VL)区亲和力成熟克隆显示于下表10。
表9.亲和力成熟的A10克隆的可变重链区(VH)。
表10.亲和力成熟的A10克隆的可变轻链区(VL)。
实施例5：构建CDR-嫁接的E9抗体。
E9VH的CDR嫁接到VH3共有构架上(嫁接的VH＝E9vh3g2)和E9VL的CDR嫁接到抗-DLL4A10抗体的VL2-1构架上(嫁接的VL＝E9a10vlg2)和嫁接到A10种系(在同源性上与E9VL最接近的种系)的VK构架上(嫁接的VL＝E9AVK)。可选地，构架(FW)的修复也与E9VH一起进行；其FW被保持但是可能引起抗体不稳定的氨基酸被取代，(修复的VH＝E9VH4r2)。构架的回复-突变掺入到CDR-嫁接和FW-修复中以维持抗体的结构和功能(表11和表14)。
E9的CDR还嫁接到抗-IL-18和抗-IL-12抗体的构架上，特别地，E9VH的CDR嫁接到抗-IL-18VH5-51构架上(嫁接的VH＝E9VH325)，和抗-IL-12的VH2-70构架上(嫁接的VH＝E9VH1D4.1)。E9VL的CDR嫁接到抗-IL-12的VKL2/L16构架上(嫁接的VL＝E9VL325)和抗-IL-12的VKB3构架上(嫁接的VL＝E9VL1D4.1)。构架的回复-突变掺入到CDR-嫁接中以维持抗体的结构和功能(表15和表18)。
在计算机里构建的上述嫁接CDR的抗体直接在BlueHeronBio技术所选的质粒中合成。可变重链区以符合读码框的方式插到编码野生型人IgG1恒定区的cDNA片段上和包含两个铰链-区氨基酸突变的人IgG1恒定区上，这些突变是位置234的亮氨酸到丙氨酸改变(EU编号)和在位置235的亮氨酸到丙氨酸改变(Lund等人，J.Immunol.，147：2657(1991))。可变轻链区的***与人λ恒定区和人κ恒定区的读码框一致。从BlueHeron收到合成的构建体后，扩增DNA并确认序列。与每个抗体相应的、适当的CDR-嫁接的重链和轻链(表11和14)(表15和18)被共转化到HEK-293-6E细胞中，瞬时地产生全长CDR-嫁接的抗-人DLL4抗体。表11总结了产生的所有E9抗体变体和HEK-293-6e表达数据。用蛋白ASepharose色谱方法纯化含有重组人抗体的细胞上清液，并且通过加入酸性缓冲液来洗脱结合的抗体。将抗体透析到PBS中。
使用不同类型的试验比如ELISA(实施例1.2，方法2)、Biacore(实施例1.2)和流式细胞术(FACS)(实施例1.3)，测定纯化的CDR嫁接的抗体结合DLL4或抑制DLL4活性的能力。表12和表16显示来自ELISA测定和FACS测定的EC50值，和通过Biacore测定的CDR嫁接的抗体的亲和力，所述抗体是分别在表11和表15中描述的人DLL4、鼠DLL4和食蟹猴DLL4抗体。表13和表17显示来自封闭ELISA(实施例1.4)和封闭FACS(实施例1.5)的IC50值，对应于分别在表11和表15中描述的CDR-嫁接的人DLL4和鼠DLL4抗体。
表11.生成的E9抗体变体和表达数据的总结
表12.通过ELISA、Biacore和FACS测定的人、小鼠和食蟹猴DLL4E9抗体变体的结合亲和力
*历史数据；nc＝未计算的
表13.通过ELISA和FACS测定的人和小鼠DLL4E9抗体变体的中和活性。
表14.人CDR-嫁接的E9抗体的VH和VL氨基酸序列
表15生成的E9抗体变体和表达数据的总结。
表16.通过ELISA、Biacore和FACS测定的人、小鼠和食蟹猴DLL4E9CDR-嫁接的抗体的结合亲和力。
表17.通过ELISA和FACS测定的人和小鼠DLL4E9CDR-嫁接的抗体的中和活性。
表18.人CDR-嫁接的E9抗体的VH和VL氨基酸序列。
实施例6：亲和力-成熟的抗体E9-7的进一步工程化。
E9-71(M)和E9-71(L)。
亲和力成熟的抗-DLL4抗体E9-71的重链和轻链被进一步工程化。通过设计含有突变的核苷酸的正向和反向重叠引物，E9-71重链CDR-H3中的甲硫氨酸(M)被突变为亮氨酸(L)。以两个连续步骤进行聚合酶链反应(PCR)以使用两条携带突变的核苷酸的引物和两条含有与接收载体互补的悬垂序列的最外侧引物扩增全部可变区基因。
用于E9-71(M)和E9-71(L)的轻链的信号肽称为λ1a信号肽。E9-71轻链的构架4(FW4)区hJL-1改变为与抗体的huCL2恒定区更相容的hJL2。正向和反向引物设计为含有突变的核苷酸。以两个连续步骤进行聚合酶链反应(PCR)以使用两条携带突变的核苷酸的引物和两条含有与接收载体互补的悬垂序列的最外侧引物扩增全部可变区基因。
源自每个cDNA组装的PCR产物在琼脂糖凝胶上分离并将对应于预测的可变区cDNA大小的带切割并纯化。通过细菌中的同源重组，可变重链区以符合读框***到编码含有两个铰链区氨基酸突变的人IgG1恒定区的cDNA片段上。这些突变是在位置234处(EU编号)亮氨酸到丙氨酸的改变和在位置235处亮氨酸到丙氨酸的改变(Lund等人，J.Immunol.，147：2657(1991))。通过同源重组，可变轻链区以符合读框***到人λ1a信号肽和人λ恒定区之间。分离细菌菌落和提取质粒DNA；cDNA***物以其完整性测序。对应于每个抗体的正确的重链和轻链(表19)共转染到HEK-293-6E细胞以瞬时产生全长E9-71(M)或E9-71(L)抗-人DLL4抗体。E9.71(M)和E9.71(L)二者具有相同轻链。含有重组人抗体的细胞上清液可以通过蛋白A葡聚糖层析纯化并且结合的抗体通过添加酸缓冲液洗脱。抗体中和并透析到PBS中。
表19.人E9.71工程化的抗体的VH和VL氨基酸序列
实施例7：E9-71(M)信号肽工程化。
信号肽λ1a用于产生抗-DLL4抗体E9-71(M)。还研究了可替代的信号肽。使用可在因特网上获得的SignalIP3.0服务器(例如万维网站cbs.dtu.dk/services/SignalP/)或众多其他等同软件，计算机模拟(insilico)构建的具有来自λ和κ信号肽家族不同信号肽的E9-71(M)N-末端可变区的氨基酸序列在哺乳动物表达过程中正确抗体切割的百分比预测是本领域已知的。具有最高预测百分比的正确切割的信号肽从每个家族中各选一个如下：λ家族的λ3p和κ家族的L23。还选择了原始λ1a信号肽的突变形式，其具有两个氨基酸改变(甘氨酸到精氨酸和丝氨酸到缬氨酸)。为了构建含有λ1a信号肽的轻链，以一步进行聚合酶链反应(PCR)以使用两条含有与接收载体互补的悬垂序列的最外侧引物(其中一条含有突变的核苷酸序列)扩增全部可变区基因。为了构建含有λ3p信号肽和κL23信号肽的轻链，设计两条重叠引物以构建信号肽区然后进行聚合酶链反应(PCR)以使用两条含有与接收载体互补的悬垂序列的最外侧引物扩增全部可变区基因。使用λ3p和κL23信号肽产生两种形式的E9-71可变区：一种具有全长可变区和另一种具有在可变区N-末端第一丝氨酸(S)缺失。仅产生具有λ1a信号肽的全长可变区。源自每个cDNA组装的PCR产物在琼脂糖凝胶上分离并将对应于预测的可变区cDNA大小的带切割并纯化。通过细菌中的同源重组，可变重链区以符合读框***到编码含有两个铰链区氨基酸突变的人IgG1恒定区的cDNA片段上。这些突变是在位置234处(EU编号)亮氨酸到丙氨酸的改变和在位置235处亮氨酸到丙氨酸的改变(Lund等人，J.Immunol.，147：2657(1991))。通过同源重组，可变轻链区以符合读框***到人λ恒定区。分离细菌菌落和提取质粒DNA；并将cDNA***物以其完整性测序。对应于每个抗体的正确的重链和轻链共转染到HEK-293-6E细胞以瞬时产生全长E9-71(M)抗-人DLL4抗体。含有重组人抗体的细胞上清液通过蛋白A葡聚糖层析纯化并且结合的抗体通过添加酸缓冲液洗脱。抗体透析到PBS中。通过质谱(MS)分析纯化的E9.71(M)抗体用于证实天然(intact)抗体序列。表20如下显示用于产生E9.71(M)的不同信号肽的氨基酸序列。表21如下显示通过质谱分析的E9.71(M)切割部位。
表20.用于产生E9.71(M)的信号肽的氨基酸序列
表21.通过质谱(MS)分析的E9.71(M)抗体切割部位
实施例8.体外表征工程化的PROfusion抗体。
如实施例1.1所述，通过BIACORE技术测定这些工程化的PROfusion抗体的抗原结合亲和力并显示于表22。代表性抗体的体外活性使用如实施例1所述的其他方法进一步评估，结果显示于表23。
表22.工程化的抗-DLL4PROfusion抗体的Biacore动力学。
MAb＝单克隆抗体；N/D＝未测定，NB＝无结合
表23.选择的工程化的PROfusionDLL4抗体的表征。
hu＝人；mu＝鼠；cyno＝食蟹猴；N/D＝未测定
实施例8：选择的PROfusion抗体的物理化学性质。
如下通过质谱测定对DLL4特异性的单克隆抗体的同一性。
E9-71的质谱分析。
轻链和重链分子量分析：用Milli-Q水将E9-71样品稀释为1mg/mL。将1μL的1MDTT加入20μL的稀释样品。样品在37℃孵育30分钟。1μL的还原样品注射到具有VarianDiphenyl柱的Agilent6510Q-TOFLC/MS***。缓冲液A是0.02％三氟乙酸(TFA)、0.08％甲酸(FA)的水溶液。缓冲液B是0.02％TFA，0.08％FA的乙腈溶液。梯度起始于5％B，在5分钟内增加到35％B并在15分钟内增加到38％B。然后梯度在1分钟内增加到95％B并在95％B稳定4分钟，在1分钟内降低到5％B。流速是50μL/min。质谱仪在5千伏喷雾电压运转和扫描范围是600至3200质量电荷比。轻链分子量22649道尔顿与具有氨基酸Y为N-末端的理论值匹配良好。在分子量22014道尔顿、22737道尔顿和22937道尔顿观察到三个次要峰。在22014道尔顿的峰与N-末端-6个氨基酸片段一致。该峰很可能由来自全长轻链的来源内(in-source)片段化引起，因为降低质谱仪“片段体值”(“fragmentorvalue”)可导致该峰的消失。22737道尔顿与具有氨基酸S为N-末端的理论值一致。22937道尔顿与具有在N-末端上氨基酸“LS”的信号肽延伸的轻链一致。重链分子量与理论值匹配良好。观察到的分子量是50263道尔顿、50426道尔顿和50588道尔顿，对应于162道尔顿的差异是不同糖基化的结果。
E9-71(M)的质谱分析。
如“E9-71的质谱分析”所述相同方法用于分析E9-71(M)样品。轻链分子量22645道尔顿与具有氨基酸S为N-末端的理论值匹配良好。观察到具有分子量22989道尔顿的小峰，对应于具有在N-末端上氨基酸“SWA”的信号肽延伸的轻链。还观察到具有分子量21923道尔顿的非常小的峰，虽然它很可能由来源内(片段化引起，因为降低质谱仪“片段体值”导致该峰的消失。重链分子量与理论值匹配良好。观察到的分子量是50263道尔顿、50426道尔顿和50588道尔顿，对应于162道尔顿的差异是不同糖基化的结果。
E9-71(L)的质谱分析。
如“E9-71的质谱分析”所述相同方法用于分析E9-71(L)样品。轻链分子量22645道尔顿与具有氨基酸S为N-末端的理论值匹配良好。观察到具有分子量22989道尔顿的小峰，对应于具有在N-末端上氨基酸“SWA”的信号肽延伸的轻链。还观察到具有分子量21923道尔顿的非常小的峰，虽然它很可能由来源内片段化引起，因为降低质谱仪“片段体值”导致该峰的消失。重链分子量与理论值匹配良好。观察到的分子量是50245道尔顿、50407道尔顿和50569道尔顿，对应于162道尔顿的差异是不同糖基化的结果。
E9-71(M)-3的质谱分析。
如“E9-71的质谱分析”所述相同方法用于分析E9-71(M)-3样品。轻链分子量22558道尔顿与理论值匹配良好。还观察到具有分子量21923道尔顿的非常小的峰，虽然它很可能由来源内片段化引起，因为降低质谱仪“片段体值”导致该峰的消失。重链分子量与理论值匹配良好。观察到的分子量是50263道尔顿、50426道尔顿和50588道尔顿，对应于162道尔顿的差异是不同糖基化的结果。
抗体的溶解性通过聚乙二醇(PEG)3000沉淀估测。通过用Amicon离心滤器在具体溶液和/或缓冲液中浓缩抗体和然后在25℃和5℃观察任何沉淀，还直接测定抗体的溶解性即实际溶解性。通过近紫外圆(UV-CD)和差示扫描量热法(DSC)干扰稳定性。通过尺寸排阻层析(SEC)评价冷冻和融化以及在升高的温度的稳定性(加速的稳定性)。具体技术如实施例1.8所述和结果描述如下：
通过PEG沉淀的溶解性估测结果。
表24和26显示对于一系列E9克隆需要诱导沉淀的PEG3000的百分比。克隆和阿达木单抗参考配置为0.2mg/ml。根据结果，克隆例如E9-4、E9-14、E9-22和E9-19估测具有类似于阿达木单抗的溶解性(约200mg/ml)，而克隆例如E9-11和E9-17估测具有低得多的溶解性。
表25显示对于一系列稳定性工程化的E9克隆需要诱导沉淀的PEG3000的百分比。克隆和阿达木单抗参考配置为0.2mg/ml。根据结果，克隆例如E9-SE1在系列中具有最高的溶解性但不预期具有类似于阿达木单抗的溶解性(约200mg/ml)，而克隆例如E9-SE5估测具有低得多的溶解性。
表24.对于一系列E9克隆需要诱导沉淀的PEG3000的百分比(抗体配置为0.2mg/ml.)
A-编号 批次# 抗体 ％PEG 3000
A-1242367.0 1718299 DLL4-E9-11hIgG1/L 3.00
A-1242368.0 1718300 DLL4-E9-17hIgG1/L 3.00
E9.1IgG2 3.00
A-1242369.0 1718301 DLL4-E9-18hIgG1/L 4.00
A-1242370.0 1718302 DLL4-E9-48hIgG1/L 4.00
E9.1IgG4 5.00
DLL4-E9-3hIgG/L 600
A-1242371.0 1718303 DLL4-E9-66hIgG1/L 8.00
A-1241120.0 1716682 DLL4-E9-16hIgG1/L 10.00
A-1242795.0 1718785 DLL4-E9-13hIgG1/L 10.00
A-1241121.0 1716683 DLL4-E9-38hIgG1/L 11.00
A-1242800.0 1718790 DLL4-E9-71hIgG1/L 11.00
A-1242794.0 1718784 DLL4-E9-4hIgG1/L 12.00
A-1242796.0 1718786 DLL4-E9-14hIgG1/L 12.00
A-1242798.0 1718788 DLL4-E9-22hIgG1/L 12.00
A-1242797.0 1718787 DLL4-E9-19hIgG1/L 14.00
阿达木单抗 14.00
表25.对于一系列稳定性工程化的E9克隆需要诱导沉淀的PEG3000的百分比。(抗体配置为0.2mg/ml。)
抗体 ％PEG 3000
E9-SE5 6.00
E9-SE7 7.00
E9-SE4 7.50
E9-SE8 7.50
E9-SE2 9.00
E9-SE3 9.00
E9-SE6 9.50
E9-SE1 10.00
(+)E9.1 9.00
(+)E9 10.50
阿达木单抗 13.00
表26.对于一系列E9抗体需要诱导沉淀的PEG3000的百分比。(抗体配置为0.2mg/ml.)
抗体 ％PEG 3000
E9-2B 8.00
E9-1F 8.00
E9 10
阿达木单抗 14
实际溶解性筛选结果：E9、E9-19、E9-71、E9-2B、E9-1F。
获得含有12mg的E9、E9-71、E9-1F和E9-19以及5.5mg的E9-2B的溶液。E9是IgG1突变体同种型。通过超速离心用Amicon30K15ml管将所有溶液的体积降低到1ml以下。
该步骤后，观察到如下：E9-2B和E9-19清澈。E9、E9-71和E9-1F轻微浑浊。
将在pH5.03的10ml的15mM组氨酸缓冲液加入每个管并将溶液重浓缩至1ml。然后将溶液转移至Amicon30K4ml管并浓缩至尽可能低的体积。
该步骤后，在室温观察到如下：
E9：163mg/ml；体积＝0.05ml；pH＝5.12
E9-19：132mg/ml；体积＝0.05ml；pH＝5.06
E9-71：193mg/ml；体积＝0.05ml；pH＝5.32
E9-2B：64mg/ml；体积＝0.1ml；pH＝5.29
E9-1F：100mg/ml；体积＝0.1ml；pH＝5.31
E9-2B和E9-1F均比其他三个需要长得多的时间浓缩。这可能表明它们的粘度在制剂条件下较高。
溶液然后置于5℃两天已在该温度评估溶解性。观察到如下：
E9：在5℃和当放回室温时保持清澈
E9-71：在5℃和当放回室温时保持清澈
E9-1F：在5℃显示极少量浑浊，当放回室温时之后20分钟变清澈
E9-2B：显示在5℃少量浑浊，当放回室温时之后20分钟变清澈
E9-19：显示在5℃明显浑浊，当放回室温时之后20分钟变清澈。
E9-71的实际溶解性筛选结果。
对于E9-71，将溶液中的E9-71用Amicon离心滤器浓缩至60mg/ml。在25℃未观察到沉淀或浑浊，在5℃储存1天后也未观察到。
通过近UV-CD结果的三级结构表征。
在E9、E9-19、E9-71、E9-2B和E9-1F样品上以1mg/ml进行近UV-CD。谱的情况显示正常折叠的抗体通常观察到的S形模式。从该技术，观察到对于抗体没有显示错误折叠。
差示扫描量热法(DSC)的内在稳定性表征。
在E9、E9-19、E9-71、E9-2B和E9-1F样品上以1mg/ml进行DSC。结果在表27中给出。Onset是未折叠起始的温度。另外，IgG抗体通常显示三个未折叠转换(Tm)：完整抗体的未折叠与Fc片段的CH2结构域的变性、Fc片段CH3结构域的变性和Fab片段的变性相关。Onset值表明E9、E9-19和E9-71是最稳定的。通常地，具有较高Tm值的克隆比具有较低值的克隆优选。
表27.通过DSC以1mg/ml的抗-DLL4E9克隆的固有稳定性。
抗体 Tm1(℃) Tm2(℃) Tm3(℃) Onset(℃)
E9 64.45 72.12 80.04 54
E9-19 65.66 77 --- 56
E9-71 65.65 75.36 81.24 54
E9-2B 64.74 80.58 83.27 52.5
E9-1F 63.84 80.51 83.26 51.3
对冻融压力的稳定性评估
对于E9、E9-19、E9-71、E9-2B和E9-1F样品以1mg/ml评估对冻融压力的稳定性。表28显示样品五次冻融循环之后SEC分析结果。所有测试的抗体对冻融压力稳定。甚至在5次冻融循环后未观察到单体明显损失。
表28.对于抗-DLL4克隆，在-80℃冷冻之前和在-80℃冷冻和在30℃水浴融化五次循环之后通过SEC定量的单体种类的百分比。
在升高的温度的稳定性评估加速的稳定性)。
对于E9、E9-19、E9-71、E9-2B和E9-1F样品以1mg/ml在升高的温度评估稳定性。表29显示在0时间点和在7天和21天之后在40℃和50℃样品的SEC分析结果。所有抗体的降解动力学显示在21天后在50℃单体百分比的约8％下降。
表29.对于抗-DLL4克隆，在0时间点和在7天和21天在40℃和50℃孵育之后通过SEC定量的不同种类的百分比。(样品配置为1mg/ml。)
实施例9：抗-DLL4抗体的啮齿动物PK评价。
为了评价抗-DLL4抗体的药物动力学性质，SCID-Beige小鼠(n＝3/抗体)以5或30mg/kg浓度抗体以单一腹膜内(IP)剂量施用，取决于抗体对鼠DLL4的交叉反应性。经历21天从每个动物收集纵向血清样品(每个时间点将5μl全血以1∶50稀释在HBS-EP+缓冲液中)。使用DLL4-特异的Biacore平台测定血清浓度。简言之，人DLL4固定至感应器芯片并将样品以5μl/分钟持续5分钟注射经流动细胞，其具有测定的并与标志物比较而得到的结合水平。血清浓度时间概况用于评估药物动力学参数Cmax(峰值血清浓度)、CL(清除)和t1/2(抗体半衰期)，如表30所概括。对于E9和A10PROfusion抗体二者，在亲和力成熟方法处理中通过CDR-工程化，它们的药物动力学性质得到改进。
表30.在SCID-beige小鼠中抗-DLL4抗体的药物动力学参数。
实施例10：抗-DLL4抗体处理体外增加内皮细胞出芽
进行纤维蛋白凝胶珠出芽测定以检测HUVEC第2-3代，Lonza)的体外血管发生活性，如所述进行(Nakatsu等人，Microvasc.Res.，66：102-112(2003))。简言之，纤维蛋白原溶液与抑肽酶(aprotinin)(4U/ml)和凝血酶(thrombin)(50U/ml)重构。Cytodex3珠(AmershamPharmaciaBiotech)用350-400个HUVEC/珠包被过夜。在96孔组织培养板的每个孔中，约20个HUVEC包被珠在纤维蛋白结块中包埋。源自80％汇合度的正常人成纤维细胞(NHLF，Lonza)的条件培养基铺于凝胶之上。以15μg/ml的DLL4抗体和对照抗体KLH加入孔。在第10天和第12天，用倒置显微镜和NikonCCD照相机获得图像。E9和A10抗体的DLL4抑制导致体外内皮细胞出芽的增强(数据未显示)。
实施例11：DLL4抗体处理体内抑制肿瘤生长。
对植入SCID-Beige小鼠的皮下Calu-6异种移植肿瘤，评估抗-DLL4抗体对肿瘤生长的作用。简言之，2x106个细胞皮下接种至雌性SCID-Beige小鼠的右后侧。使肿瘤生长14-18天以建立，在这一点使用电子卡尺测量来肿瘤体积。使用公式：LxW2/2计算肿瘤大小。将小鼠分配到处理组(n＝10/组)以使每个组动物在治疗起始前具有相等的平均肿瘤体积(通常180和250mm3)。然后对动物腹膜内施用抗-DLL4抗体一周两次持续两周(共4次剂量)。在实验过程中，平局一周两次测量肿瘤体积直到每组的平均肿瘤体积达到≥2,000mm3的终点。结果显示于表31。对于PROfusion抗体的E9系列，改进的药物动力学的那些(如实施例9所示)倾向于具有更强的体内抗肿瘤活性。
表31.在Calu-6人非小细胞肺癌异种移植模型中抗-DLL4抗体的效力。
a.％T/C＝处理组的平均肿瘤体积/处理对照组的肿瘤体积x100。P值(如星号所示)源自处理组与处理对照组的Student′sT测试比较。基于第25/26/27天测量。
b.％ILS＝(T-C)/Cx100，其中T＝达到处理组终点的中值时间和C＝达到处理对照组终点的中值时间。P值(如星号所示)源自处理组与处理对照组的KaplanMeier对数级比较。基于终点为2000mm3。
*p＜0.05；**p＜0.01
可能在本申请自始至终引用的所有引用的参考文献(包括文献参考、专利、专利申请和网站)的内容都为了所有目的在此明确地整体引入作为参考，其中引用的参考文献也如此。
等同方案
本发明在不背离其精神或基本特征的情况下可以以其他具体形式具体化。前述实施方案因此在所有方面被视为是示例性的，而不是限制此处所述的本发明。本发明的范围因而由所附的权利要求而不是由前述说明书指出，且在权利要求的等价含义和范围内的所有改变因而预期包含在其中。

Claims (10)

1.包含能够结合人DLL4的抗原结合结构域的结合蛋白，所述抗原结合结构域包含选自下述的至少一个或多个CDR：
CDR-H1：X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7(SEQIDNO:99)，其中；
X1是S或N；
X2是S、G或N；
X3是S、N、T、G或R；
X4是Y；
X5是Y或H；
X6是W；和
X7是G；
CDR-H2：X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–X10–X11–X12–X13–X14–
X15–X16(SEQIDNO:100)，其中；
X1是D；
X2是I；
X3是Y、N或S；
X4是Y；
X5是T、N、A、I、S或R；
X6是G；
X7是S、N、T或G；
X8是T；
X9是Y；
X10是Y；
X11是N；
X12是P；
X13是S；
X14是L；
X15是K；和
X16是S、N、D或G；
CDR-H3：X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–X10–X11(SEQIDNO:101)，其中；
X1是E、Y、F、Q、W、L或A；
X2是D、A、S、G、V、E或N；
X3是V、M、L、P或A；
X4是I、A、P、R、S、K、Q、V、G、M或E；
X5是L、Y、F或M；
X6是R、G、S、Q或A；
X7是G；
X8是G、A或S；
X9是S、A、L、V、R或G；
X10是D；和
X11是Y、D、S、N、H、E、R、L、P、C、I、M、T、Q或K；
CDR-L1：X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–X10–X11(SEQIDNO:102)，其中；
X1是S；
X2是G；
X3是Q、E或D；
X4是R、S、G、M、K、L或T；
X5是L；
X6是G；
X7是D或E；
X8是K；
X9是Y；
X10是A或V；和
X11是S；
CDR-L2：X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7(SEQIDNO:103)，其中；
X1是E或Q；
X2是D；
X3是S、L、T、A、E或F；
X4是K、T、E、N、Q、S或M；
X5是R；
X6是P；和
X7是S；
和
CDR-L3：X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9(SEQIDNO:104)，其中；
X1是Q；
X2是A；
X3是W；
X4是D；
X5是R、S、M、E、N、G或K；
X6是D或E；
X7是T、V、A、S或M；
X8是G、A或C；和
X9是V。
2.根据权利要求1的结合蛋白，其中所述至少一个CDR包含选自下述的氨基酸序列：
SEQIDNO:1的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:1的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:1的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:111的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:111的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:111的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO:117(CDR-H1)；SEQIDNO:118(CDR-H2)；SEQIDNO:119(CDR-H3)；
SEQIDNO:121(CDR-H1)；SEQIDNO:122(CDR-H2)；SEQIDNO:123(CDR-H3)；
SEQIDNO:125(CDR-H1)；SEQIDNO:126(CDR-H2)；SEQIDNO:127(CDR-H3)；
SEQIDNO:129(CDR-H1)；SEQIDNO:130(CDR-H2)；SEQIDNO:131(CDR-H3)；
SEQIDNO:133(CDR-H1)；SEQIDNO:134(CDR-H2)；SEQIDNO:135(CDR-H3)；
SEQIDNO:137(CDR-H1)；SEQIDNO:138(CDR-H2)；SEQIDNO:139(CDR-H3)；
SEQIDNO:141(CDR-H1)；SEQIDNO:142(CDR-H2)；SEQIDNO:143(CDR-H3)；
SEQIDNO:145(CDR-H1)；SEQIDNO:146(CDR-H2)；SEQIDNO:147(CDR-H3)；
SEQIDNO:149(CDR-H1)；SEQIDNO:150(CDR-H2)；SEQIDNO:151(CDR-H3)；
SEQIDNO:153(CDR-H1)；SEQIDNO:154(CDR-H2)；SEQIDNO:155(CDR-H3)；
SEQIDNO:157(CDR-H1)；SEQIDNO:158(CDR-H2)；SEQIDNO:159(CDR-H3)；
SEQIDNO:161(CDR-H1)；SEQIDNO:162(CDR-H2)；SEQIDNO:163(CDR-H3)；
SEQIDNO:165(CDR-H1)；SEQIDNO:166(CDR-H2)；SEQIDNO:167(CDR-H3)；
SEQIDNO:169(CDR-H1)；SEQIDNO:170(CDR-H2)；SEQIDNO:171(CDR-H3)；
SEQIDNO:173(CDR-H1)；SEQIDNO:174(CDR-H2)；SEQIDNO:175(CDR-H3)；
SEQIDNO:177(CDR-H1)；SEQIDNO:178(CDR-H2)；SEQIDNO:179(CDR-H3)；
SEQIDNO:181(CDR-H1)；SEQIDNO:182(CDR-H2)；SEQIDNO:183(CDR-H3)；
SEQIDNO:185(CDR-H1)；SEQIDNO:186(CDR-H2)；SEQIDNO:187(CDR-H3)；
SEQIDNO:189(CDR-H1)；SEQIDNO:190(CDR-H2)；SEQIDNO:191(CDR-H3)；
SEQIDNO:193(CDR-H1)；SEQIDNO:194(CDR-H2)；SEQIDNO:195(CDR-H3)；
SEQIDNO:197(CDR-H1)；SEQIDNO:198(CDR-H2)；SEQIDNO:199(CDR-H3)；
SEQIDNO:201(CDR-H1)；SEQIDNO:202(CDR-H2)；SEQIDNO:203(CDR-H3)；
SEQIDNO:205(CDR-H1)；SEQIDNO:206(CDR-H2)；SEQIDNO:207(CDR-H3)；
SEQIDNO:209(CDR-H1)；SEQIDNO:210(CDR-H2)；SEQIDNO:211(CDR-H3)；
SEQIDNO:213(CDR-H1)；SEQIDNO:214(CDR-H2)；SEQIDNO:215(CDR-H3)；
SEQIDNO:217(CDR-L1)；SEQIDNO:218(CDR-L2)；SEQIDNO:219(CDR-L3)；
SEQIDNO:221(CDR-L1)；SEQIDNO:222(CDR-L2)；SEQIDNO:223(CDR-L3)；
SEQIDNO:225(CDR-L1)；SEQIDNO:226(CDR-L2)；SEQIDNO:227(CDR-L3)；
SEQIDNO:229(CDR-L1)；SEQIDNO:230(CDR-L2)；SEQIDNO:231(CDR-L3)；
SEQIDNO:233(CDR-L1)；SEQIDNO:234(CDR-L2)；SEQIDNO:235(CDR-L3)；
SEQIDNO:237(CDR-L1)；SEQIDNO:238(CDR-L2)；SEQIDNO:239(CDR-L3)；
SEQIDNO:241(CDR-L1)；SEQIDNO:242(CDR-L2)；SEQIDNO:243(CDR-L3)；
SEQIDNO:245(CDR-L1)；SEQIDNO:246(CDR-L2)；SEQIDNO:247(CDR-L3)；
SEQIDNO:249(CDR-L1)；SEQIDNO:250(CDR-L2)；SEQIDNO:251(CDR-L3)；
SEQIDNO:253(CDR-L1)；SEQIDNO:254(CDR-L2)；SEQIDNO:255(CDR-L3)；
SEQIDNO:257(CDR-L1)；SEQIDNO:258(CDR-L2)；SEQIDNO:259(CDR-L3)；
SEQIDNO:261(CDR-L1)；SEQIDNO:262(CDR-L2)；SEQIDNO:263(CDR-L3)；
SEQIDNO:265(CDR-L1)；SEQIDNO:266(CDR-L2)；SEQIDNO:267(CDR-L3)；
SEQIDNO:269(CDR-L1)；SEQIDNO:270(CDR-L2)；SEQIDNO:271(CDR-L3)；
SEQIDNO:273(CDR-L1)；SEQIDNO:274(CDR-L2)；SEQIDNO:275(CDR-L3)；
SEQIDNO:277(CDR-L1)；SEQIDNO:278(CDR-L2)；SEQIDNO:279(CDR-L3)；
SEQIDNO:281(CDR-L1)；SEQIDNO:282(CDR-L2)；SEQIDNO:283(CDR-L3)；
SEQIDNO:285(CDR-L1)；SEQIDNO:286(CDR-L2)；SEQIDNO:287(CDR-L3)；
SEQIDNO:289(CDR-L1)；SEQIDNO:290(CDR-L2)；SEQIDNO:291(CDR-L3)；
SEQIDNO:293(CDR-L1)；SEQIDNO:294(CDR-L2)；SEQIDNO:295(CDR-L3)；
SEQIDNO:297(CDR-L1)；SEQIDNO:298(CDR-L2)；SEQIDNO:299(CDR-L3)；
SEQIDNO:301(CDR-L1)；SEQIDNO:302(CDR-L2)；SEQIDNO:303(CDR-L3)；
SEQIDNO:305(CDR-L1)；SEQIDNO:306(CDR-L2)；SEQIDNO:307(CDR-L3)；
SEQIDNO:309(CDR-L1)；SEQIDNO:310(CDR-L2)；SEQIDNO:311(CDR-L3)；
SEQIDNO:313(CDR-L1)；SEQIDNO:314(CDR-L2)；SEQIDNO:315(CDR-L3)；
SEQIDNO:334的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:334的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:334的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:335的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:335的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:335的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO:336的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:336的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:336的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:337的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:337的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:337的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO:338的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:338的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:338的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:339的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:339的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:339的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO:340的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:340的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:340的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:341的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:341的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:341的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO:342的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:342的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:342的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:343的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:343的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:343的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO:344的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:344的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:344的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:345的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO:345的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO:345的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO:346的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:346的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:346的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:347的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:347的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:347的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO:348的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:348的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:348的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:349的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO:349的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO:349的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO:350的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:350的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:350的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:351的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO:351的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO:351的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO:352的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:352的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:352的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:353的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO:353的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO:353的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO:354的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:354的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:354的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:355的残基24-34(CDR-L1)；SEQIDNO:355的残基50-56(CDR-L2)；SEQIDNO:355的残基89-97(CDR-L3)；
SEQIDNO:356的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:356的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:356的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:357的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:357的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:357的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO:358的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:358的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:358的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:359的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:359的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:359的残基88-96(CDR-L3)；
SEQIDNO:360的残基31-37(CDR-H1)；SEQIDNO:360的残基52-67(CDR-H2)；SEQIDNO:360的残基100-110(CDR-H3)；
SEQIDNO:361的残基23-33(CDR-L1)；SEQIDNO:361的残基49-55(CDR-L2)；SEQIDNO:361的残基88-96(CDR-L3)。
3.根据权利要求2的结合蛋白，其中所述结合蛋白包含至少3个CDR。
4.根据权利要求3的结合蛋白，其中所述至少3个CDR包含选自下述的可变结构域CDR组：
VHE9CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:1的残基31-37
CDR-H2:SEQIDNO:1的残基52-67
CDR-H3SEQIDNO:1的残基100-110
VLE9CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:111的残基23-33
CDR-L2:SEQIDNO:111的残基49-55
CDR-L3:SEQIDNO:111的残基88-96
VHE9.4CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:117
CDR-H2:SEQIDNO:118
CDR-H3:SEQIDNO:119
VLE9.4CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:229
CDR-L2:SEQIDNO:230
CDR-L3:SEQIDNO:231
VHE9.11CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:121
CDR-H2:SEQIDNO:122
CDR-H3:SEQIDNO:123
VLE9.11CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:233
CDR-L2:SEQIDNO:234
CDR-L3:SEQIDNO:235
VHE9.14CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:125
CDR-H2:SEQIDNO:126
CDR-H3:SEQIDNO:127
VLE9.14CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:237
CDR-L2:SEQIDNO:238
CDR-L3:SEQIDNO:239
VHE9.17CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:129
CDR-H2:SEQIDNO:130
CDR-H3:SEQIDNO:131
VLE9.17CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:241
CDR-L2:SEQIDNO:242
CDR-L3:SEQIDNO:243
VHE9.18CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:133
CDR-H2:SEQIDNO:134
CDR-H3:SEQIDNO:135
VLE9.18CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:245
CDR-L2:SEQIDNO:246
CDR-L3:SEQIDNO:247
VHE9.19CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:137
CDR-H2:SEQIDNO:138
CDR-H3:SEQIDNO:139
VLE9.19CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:249
CDR-L2:SEQIDNO:250
CDR-L3:SEQIDNO:251
VHE9.22CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:141
CDR-H2:SEQIDNO:142
CDR-H3:SEQIDNO:143
VLE9.22CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:253
CDR-L2:SEQIDNO:254
CDR-L3:SEQIDNO:255
VHE9.48CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:145
CDR-H2:SEQIDNO:146
CDR-H3:SEQIDNO:147
VLE9.48CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:257
CDR-L2:SEQIDNO:258
CDR-L3:SEQIDNO:259
VHE9.65CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:149
CDR-H2:SEQIDNO:150
CDR-H3:SEQIDNO:151
VLE9.65CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:261
CDR-L2:SEQIDNO:262
CDR-L3:SEQIDNO:263
VHE9.66CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:153
CDR-H2:SEQIDNO:154
CDR-H3:SEQIDNO:155
VLE9.66CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:265
CDR-L2:SEQIDNO:266
CDR-L3:SEQIDNO:267
VHE9.71CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:157
CDR-H2:SEQIDNO:158
CDR-H3:SEQIDNO:159
VLE9.71CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:269
CDR-L2:SEQIDNO:270
CDR-L3:SEQIDNO:271
VHE9.13CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:161
CDR-H2:SEQIDNO:162
CDR-H3:SEQIDNO:163
VLE9.13CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:217
CDR-L2:SEQIDNO:218
CDR-L3:SEQIDNO:219
VHE9.16CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:165
CDR-H2:SEQIDNO:166
CDR-H3:SEQIDNO:167
VLE9.16CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:221
CDR-L2:SEQIDNO:222
CDR-L3:SEQIDNO:223
VHE9.38CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:169
CDR-H2:SEQIDNO:170
CDR-H3:SEQIDNO:171
VLE9.38CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:225
CDR-L2:SEQIDNO:226
CDR-L3:SEQIDNO:227
VHE9.2BCDR组
CDR-H1:SEQIDNO:173
CDR-H2:SEQIDNO:174
CDR-H3:SEQIDNO:175
VLE9.2BCDR组
CDR-L1:SEQIDNO:273
CDR-L2:SEQIDNO:274
CDR-L3:SEQIDNO:275
VHE9.1FCDR组
CDR-H1:SEQIDNO:177
CDR-H2:SEQIDNO:178
CDR-H3:SEQIDNO:179
VLE9.1FCDR组
CDR-L1:SEQIDNO:277
CDR-L2:SEQIDNO:278
CDR-L3:SEQIDNO:279
VHE9.10HCDR组
CDR-H1:SEQIDNO:181
CDR-H2:SEQIDNO:182
CDR-H3:SEQIDNO:183
VLE9.10HCDR组
CDR-L1:SEQIDNO:301
CDR-L2:SEQIDNO:302
CDR-L3:SEQIDNO:303
VHE9.5ECDR组
CDR-H1:SEQIDNO:185
CDR-H2:SEQIDNO:186
CDR-H3:SEQIDNO:187
VLE9.5ECDR组
CDR-L1:SEQIDNO:293
CDR-L2:SEQIDNO:294
CDR-L3:SEQIDNO:295
VHE9.10CCDR组
CDR-H1:SEQIDNO:189
CDR-H2:SEQIDNO:190
CDR-H3:SEQIDNO:191
VLE9.10CCDR组
CDR-L1:SEQIDNO:281
CDR-L2:SEQIDNO:282
CDR-L3:SEQIDNO:283
VHE9.7ECDR组
CDR-H1:SEQIDNO:193
CDR-H2:SEQIDNO:194
CDR-H3:SEQIDNO:195
VLE9.7ECDR组
CDR-L1:SEQIDNO:289
CDR-L2:SEQIDNO:290
CDR-L3:SEQIDNO:291
VHE9.12BCDR组
CDR-H1:SEQIDNO:197
CDR-H2:SEQIDNO:198
CDR-H3:SEQIDNO:199
VLE9.12BCDR组
CDR-L1:SEQIDNO:297
CDR-L2:SEQIDNO:298
CDR-L3:SEQIDNO:299
VHE9.10ECDR组
CDR-H1:SEQIDNO:201
CDR-H2:SEQIDNO:202
CDR-H3:SEQIDNO:203
VLE9.10ECDR组
CDR-L1:SEQIDNO:285
CDR-L2:SEQIDNO:286
CDR-L3:SEQIDNO:287
VHE9.6ACDR组
CDR-H1:SEQIDNO:205
CDR-H2:SEQIDNO:206
CDR-H3:SEQIDNO:207
VLE9.6ACDR组
CDR-L1:SEQIDNO:305
CDR-L2:SEQIDNO:306
CDR-L3:SEQIDNO:307
VHE9.7ACDR组
CDR-H1:SEQIDNO:209
CDR-H2:SEQIDNO:210
CDR-H3:SEQIDNO:211
VLE9.7ACDR组
CDR-L1:SEQIDNO:309
CDR-L2:SEQIDNO:310
CDR-L3:SEQIDNO:311
VHE9.8HCDR组
CDR-H1:SEQIDNO:213
CDR-H2:SEQIDNO:214
CDR-H3:SEQIDNO:215
VLE9.8HCDR组
CDR-L1:SEQIDNO:313
CDR-L2:SEQIDNO:314
CDR-L3:SEQIDNO:315
VHE9.1CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:334的残基31-37
CDR-H2:SEQIDNO:334的残基52-67
CDR-H3:SEQIDNO:334的残基100-110
VLE9.1CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:335的残基23-33
CDR-L2:SEQIDNO:335的残基49-55
CDR-L3:SEQIDNO:335的残基88-96
VHE9-SE1CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:336的残基31-37
CDR-H2:SEQIDNO:336的残基52-67
CDR-H3:SEQIDNO:336的残基100-110
VLE9-SE1CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:337的残基23-33
CDR-L2:SEQIDNO:337的残基49-55
CDR-L3:SEQIDNO:337的残基88-96
VHE9-SE2CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:338的残基31-37
CDR-H2:SEQIDNO:338的残基52-67
CDR-H3:SEQIDNO:338的残基100-110
VLE9-SE2CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:339的残基23-33
CDR-L2:SEQIDNO:339的残基49-55
CDR-L3:SEQIDNO:339的残基88-96
VHE9-SE3CDR组
CDR-H1:SEQIDNO:340的残基31-37
CDR-H2:SEQIDNO:340的残基52-67
CDR-H3:SEQIDNO:340的残基100-110
VLE9-SE3CDR组
CDR-L1:SEQIDNO:341的残基23-33
CDR-L2:SEQIDNO:341的残基49-55
CDR-L3:SEQIDNO:341的残基88-96
VHE9-SE4CDR组
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CDR-L3:SEQIDNO:361的残基88-96。
5.根据权利要求4的结合蛋白，其包含至少两个可变结构域CDR组。
6.根据权利要求5的结合蛋白，其中所述至少2个可变结构域CDR组选自：
VHE9CDR组和VLE9CDR组，
VHE9.4CDR组和VLE9.4CDR组，
VHE9.11CDR组和VLE9.11CDR组，
VHE9.14CDR组和VLE9.14CDR组，
VHE9.17CDR组和VLE9.17CDR组，
VHE9.18CDR组和VLE9.18CDR组，
VHE9.19CDR组和VLE9.19CDR组，
VHE9.22CDR组和VLE9.22CDR组，
VHE9.48CDR组和VLE9.48CDR组，
VHE9.65CDR组和VLE9.65CDR组，
VHE9.66CDR组和VLE9.66CDR组，
VHE9.71CDR组和VLE9.71CDR组，
VHE9.13CDR组和VLE9.13CDR组，
VHE9.16CDR组和VLE9.16CDR组，
VHE9.38CDR组和VLE9.38CDR组，
VHE9.2BCDR组和VLE9.2BCDR组，
VHE9.1FCDR组和VLE9.1FCDR组，
VHE9.10HCDR组和VLE9.10HCDR组，
VHE9.5ECDR组和VLE9.5ECDR组，
VHE9.10CCDR组和VLE9.10CCDR组，
VHE9.7ECDR组和VLE9.7ECDR组，
VHE9.12BCDR组和VLE9.12BCDR组，
VHE9.10ECDR组和VLE9.10ECDR组，
VHE9.6ACDR组和VLE9.6ACDR组，
VHE9.7ACDR组和VLE9.7ACDR组，
VHE9.8HCDR组和VLE9.8HCDR组，
VHE9-SE1CDR组和VLE9-SE1CDR组，
VHE9-SE2CDR组和VLE9-SE2CDR组，
VHE9-SE3CDR组和VLE9-SE3CDR组，
VHE9-SE4CDR组和VLE9-SE4CDR组，
VHE9-SE5CDR组和VLE9-SE5CDR组，
VHE9-SE6CDR组和VLE9-SE6CDR组，
VHE9-SE7CDR组和VLE9-SE7CDR组，
VHE9-SE8CDR组和VLE9-SE8CDR组，
VHE9-FR1CDR组和VLE9-FR1CDR组，
VHE9-FR2CDR组和VLE9-FR2CDR组，
VHE9.71CDR组和VLE9.71CDR组，
VHE9.71(M)CDR组和VLE9.71(M)CDR组，和
VHE9.71(L)CDR组和VLE9.71(L)CDR组。
7.根据权利要求1-6中任一项的结合蛋白，其进一步包含人接纳体构架。
8.根据权利要求7的结合蛋白，其中所述人接纳构架包含选自下述的氨基酸序列：
重链接纳体构架序列SEQIDNO:6-22,
重链接纳体序列SEQIDNO:35-62,
轻链接纳体序列SEQIDNO:23-34，和
轻链接纳体序列SEQIDNO:63-98。
9.根据权利要求7或8的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含至少一个构架区氨基酸取代，其中所述构架的氨基酸序列与所述人接纳体构架的序列至少65％等同，并且包含与所述人接纳体构架等同的至少70个氨基酸残基。
10.根据权利要求8的结合蛋白，其中所述人接纳体构架包含在关键残基处的至少一个构架区氨基酸取代，所述关键残基选自：
与CDR接近的残基；
糖基化位点残基；
稀有残基；
能够与人DLL4相互作用的残基；
规范残基；
在重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；
在Vernier区内的残基；和
在Chothia定义的可变重链CDR1和Kabat定义的第一个重链构架之间重叠的区域中的残基。
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