KR20100113112A - 개선된 포유동물 발현 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 포유동물 세포 배양 시의 재조합 단백질 발현용 핵산을 특징으로 한다. 본 발명의 에피솜 벡터는 SV40 T Ag 또는 엡스타인-바 바이러스 핵 항원을 발현하는 포유동물 세포(예, COS7 또는 HEK293-6E 세포)에서 높은 단백질 생산을 촉진한다. 상기 방법 및 시스템은 제약 약물 개발 및 클로닝 등에, 특히 항체 생산에 유용하다.

Description

개선된 포유동물 발현 벡터 및 이의 용도{Improved mammalian expression vectors and uses thereof}
관련 출원
본 출원은 2008년 1월 15일에 출원된 미국 임시출원 일련번호 61/021282 및 2008년 10월 10일에 출원된 미국 임시 출원 일련번호 61/104546을 우선권으로 주장하며, 각 내용들은 전체가 인용된다.
생물제제를 비롯한 단백질의 안정한 생산은 단백질을 암호화하는 DNA를 함유한 벡터로 숙주 세포를 형질감염시켜 수행할 수 있다. 세포주에 벡터의 유지는 에피솜 복제 오리진을 통한 염색체외 복제를 비롯해서 다양한 수단을 통해 달성할 수 있다. 에피솜 벡터는 복제 개시 인자에 의해 서열이 결합할 때 벡터의 복제를 촉진하는 복제 오리진을 함유한다. 에피솜 벡터는 숙주 게놈에 삽입되어야 하는 벡터보다 여러 가지 장점이 있다. 예를 들어, 에피솜 벡터는 숙주 게놈에 벡터의 통합으로 인해 초래될 수 있는 세포에서의 표현형 변화를 저하시킨다. 또한, 에피솜 벡터는 형질감염된 세포로부터 표준 DNA 추출 프로토콜을 이용해 분리할 수 있다.
치료 단백질, 즉 생물제제의 중요성이 발달함으로 인해, 단백질 생산을 최적화하면서 전체 생산 공정의 효율을 향상시키려는 노력이 이루어져야 한다. 따라서, 효율의 향상은 벡터의 단백질 생산능에 대하여 따져보아야 한다. 원하는 단백질 산물의 높은 수준뿐 아니라 효율적인 클로닝 옵션을 제공하는 우수한 발현 시스템이 필요하다. 생물제제, 특히 항체의 생산에 관여하는 클로닝 단계의 수를 감소시키고, 시간 요건을 개선하고, 비용을 최소화하는 것이 유익할 것이다. 또한, 소규모 및 대규모 세포 배양에서 적당한 단백질 생산을 제공하는 벡터를 마련하는 것도 유익할 것이다. 본 발명은 이하 상세한 설명에서 분명하게 드러나는 추가 장점을 제공함으로써 종래 벡터의 한계를 극복하는 것이다.
재조합 단백질은 특히 약제학적 약물 발견 과정 동안, 포유동물 세포 일시 형질감염에 의해 생산할 수 있다. 단백질 발현을 위해 다양한 숙주 세포를 사용할 수 있으며, 그 예로는 COS 및 사람 배아 신장(HEK) 세포와 같은 포유동물 세포가 있다. 에피솜 벡터는 복제 오리진과 이 오리진에 결합하는 트랜스-작용성 복제 개시 인자 모두에 의존적이다. 복제 개시 인자, 예컨대 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스의 OriP에 결합하는 엡스타인-바 바이러스 핵 항원(EBNA)은 에피솜 벡터에 클로닝될 수 있고, 또는 대안적으로 이 벡터가 형질감염된 숙주 세포에 의해 발현될 수 있다. 따라서, 에피솜 벡터는 복제 오리진을 통해 복제를 활성화시키는데 필요한 트랜스-작용성 인자를 발현하는 특정 세포주에 특이적일 수 있다.
본 발명은 재조합 단백질 발현에 여러 에피솜 벡터 골격(backbone)의 필요성을 제거한다. 본 발명은 2 이상의 다른 에피솜 복제 오리진을 포함하여, 단백질을 발현하기 위한 다른 세포 종류에 동일 벡터를 사용할 수 있게 하는 에피솜 벡터를 제공한다. 다른 복제 오리진은 필수적인 트랜스-작용성 복제 인자를 구비하는 다른 종류의 포유동물 세포에서 벡터가 사용될 수 있게 하고 벡터가 복제될 수 있게 한다. 단백질 생산을 위해 관심있는 유전자를 재클로닝할 필요를 제거함으로써, 본 발명은 효율을 향상시키고, 단백질 생산 수준을 유지하면서 다수의 벡터와 관련된 비용을 절감시킨다. 본 발명의 놀라운 관점은 벡터에 뉴클레오타이드의 부가, 즉 제2 복제 오리진의 부가가 단백질을 원하는 수준으로 생산하는 벡터의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것이다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는 항체 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 함유한다. 따라서, 항체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 각각 경쇄 또는 중쇄 불변 영역의 상류 벡터에 클로닝되어, 발현계의 효율을 더욱 향상시킬 수 있다. 에피솜 벡터는 SV40 T Ag 또는 엡스타인-바 바이러스 핵 항원(예, COS7 또는 HEK293-6E 세포)을 발현하는 포유동물 세포에서 단백질 생산을 높이 촉진한다.
본 발명은 단백질 수율, 생산 효율 및 비용 절감을 위한 인자들의 최적 조합을 제공하는 것으로, 특히 약제 산업에서 단백질 생산 및 항체와 같은 생물학적 단백질의 생산에 모든 중요한 인자들이다. 본 발명의 다른 특징 및 장점은 이하 상세한 설명 및 특허청구범위에 설명된다.
제1 관점으로, 본 발명은 (a) 엡스타인-바 바이러스(EBV) 유래의 OriP 복제 오리진; (b) SV40 복제 오리진; (c) 관심있는 유전자를 삽입하기 위한 삽입 부위; 및 (d) 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 항체 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 한 양태에서, 관심있는 유전자는 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 예컨대 쥐, 사람화된, 키메라 또는 사람 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이다. 특정 양태에서, 항체 중쇄 가변 영역은 아달리무마브, ABT-325 및 ABT-874로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체의 중쇄 가변 영역이다. 다른 특정 양태에서, 항체 경쇄 가변 영역은 아달리무마브, ABT-325 및 ABT-874로 이루어진 그룹 중에서 선택된 항체의 경쇄 가변 영역이다. 항체 중쇄 불변 영역은 예컨대 쥐, 사람화된, 키메라 또는 사람 항체 중쇄 불변 영역이고, 항체 중쇄 불변 영역은 감마 1,z,a; 감마 1,z,non-a; 감마 2,n+; 감마 1,n-; 및 감마 4로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 감마 1,z,non-a 항체 중쇄 불변 영역은 중쇄 불변 영역의 위치 234에서 알라닌 돌연변이를 추가로 함유할 수 있다. 다른 양태에서, 감마 1,z,non-a 항체 중쇄 불변 영역은 항체 중쇄 불변 영역의 위치 235 또는 237에서 알라닌 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
한 양태에서, 항체 경쇄 불변 영역은 사람 카파 이소타입 또는 사람 람다 이소타입이다. 한 양태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 쥐 감마 1 이소타입 또는 쥐 감마 2a 이소타입이다. 다른 양태에서, 항체 경쇄 불변 영역은 쥐 카파 이소타입이다. 한 양태에서, 항체 중쇄 불변 영역은 Fc 도메인이다. 한 양태에서, 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 영역은 삽입 부위에 대해 5'이다.
한 양태에서, 발현 벡터는 추가로 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 프로모터를 추가로 함유하고, 이 프로모터는 EF-1α 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터이다.
한 양태에서, 발현 벡터는 추가로 선택 마커, 예컨대 앰피실린 내성 유전자를 포함한다.
한 양태에서, CMV 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 608과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, CMV 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 608을 포함한다.
한 양태에서, EF-1α 프로모터는 사람 EF-1α 프로모터이다. 한 양태에서, EF-1α 프로모터는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 76 내지 1267과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, EF-1α 프로모터는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 76 내지 1267을 포함한다.
한 양태에서, OriP 복제 오리진은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1795 내지 3545와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
한 양태에서, SV40 복제 오리진은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 5834 내지 6140과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, SV40 복제 오리진은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 5834 내지 6140을 포함한다.
본 발명의 예시적 발현 벡터는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 및 32로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 핵산 서열을 포함한다. 특정 양태에서, 발현 벡터는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 및 32로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 또한 도 1, 2 및 14 내지 25에 제시되어 있다. 본 발명의 또 다른 벡터는 도 8 내지 13에 기술되어 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 함유하는 포유동물 숙주 세포를 제공한다. 포유동물 숙주는 COS 세포, 예컨대 COS7 세포, 또는 사람 배아 신장(HEK) 세포, 예컨대 HEK-293 세포일 수 있다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 벡터를 함유하는 키트(kit)를 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입시키는 단계, 단백질을 발현시키기에 적당한 조건 하에서 포유동물 숙주 세포를 배양하는 단계 및 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 시그널 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 한 양태에서, 관심있는 유전자는 시그널 펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동가능하게 결합된다.
이상의 목적 및 여타 목적, 본 발명의 특징 및 장점뿐 아니라 본 발명 자체는 첨부 도면과 함께 이하 본 발명의 상세한 설명으로부터 더 상세하게 이해될 것이다.
도 1은 pHyb-C 공벡터의 지도를 도시한 것이다. 특징으로는, SV40 진핵생물 복제 오리진, 사이토메갈로바이러스 진핵생물 발현 프로모터(pCMV), 3원 리더 서열(TPL), 스플라이스 공여체 부위(SD), 아데노바이러스 주요 후기 인핸서 인자(enh MLP), 스플라이스 수용체 부위(SA), 관심있는 유전자의 개방 판독 프레임(ORF) 영역 및 후속되는 폴리 A 시그널(pA), 이분염색체(dyad) 대칭 인자(DS), 엡스타입-바 바이러스 유래 진핵생물의 복제 오리진(OriP), 반복 영역(FR), 앰피실린 내성 마커(AmpR), 및 세균 복제 오리진(pMB1ori)을 포함한다.
도 2는 pHyb-E 공벡터의 지도를 도시한 것이다. 특징으로는, SV40 진핵생물 복제 오리진, EF-1a 진핵생물 프로모터, 관심있는 유전자의 개방 판독 프레임(ORF) 영역 및 후속되는 폴리 A 시그널(pA), 이분염색체 대칭 인자(DS), 엡스타입-바 바이러스 유래 진핵생물의 복제 오리진(OriP), 반복 영역(FR), 앰피실린 내성 마커(AmpR), 및 세균 복제 오리진(pMB1ori)을 포함한다.
도 3은 전기천공을 통해 pBOS, pTT3, pHybC 및 pHybE 벡터로 형질감염된 COS 세포에 의해 생산된 재조합 Fc 융합 단백질 역가를 나타낸 것이다.
도 4는 PEI를 이용하여 pBOS, pTT3, pHybC 및 pHybE 벡터로 형질감염시킨 HEK-293-6E 세포에 의해 생산된 재조합 Fc 융합 단백질 역가를 도시한 것이다.
도 5는 PEI를 이용하여 IgG 항체를 발현하도록 작제된 pBOS, pTT3, pHybC 및 pHybE 벡터로 형질감염시킨 HEK-293-6E에 의해 생산된 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 6은 IgG 항체를 발현하도록 작제된 pBOS, pTT3, pHybC 및 pHybE 벡터로 전기천공을 통해 형질감염된 COS 세포에 의해 생산된 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 7은 IgG 항체를 발현하는 pHyb-E-SwaI(v1) 또는 pHyb-E(v2) 벡터 작제물을 이용하여 전기천공을 통해 형질감염된 COS 세포에 의해 생산된 항체 역가를 나타낸 것이다.
도 8은 pHybC-mBR3-mCg2a 벡터(별칭 "pHybC-mBR3-Fc")의 지도를 도시한 것이다.
도 9는 pHybE-mBR3-mCg2a 벡터(별칭 "pHybE-mBR3-Fc")의 지도를 도시한 것이다.
도 10은 pHybC-E7-hCk 벡터(별칭 "pHybC-E7")의 지도를 도시한 것이다.
도 11은 pHybC-D2-hCg1,z,a 벡터(별칭 "pHybC-D2")의 지도를 도시한 것이다.
도 12는 pHybE-D2-hCg1,z,a 벡터(별칭 "pHybE-D2")의 지도를 도시한 것이다.
도 13은 pHybE-E7-hCk 벡터(별칭 "pHybE-E7")의 지도를 도시한 것이다.
도 14는 pHybE-hCg1,z,a V2(별칭 "pJP182")의 지도를 도시한 것이다.
도 15는 pHybE-hCg1,z,non-a V2(별칭 "pJP183")의 지도를 도시한 것이다.
도 16은 pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235) V2(별칭 "pJP184")의 지도를 도시한 것이다.
도 17은 pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237) V2(별칭 "pJP185")의 지도를 도시한 것이다.
도 18은 pHybE-hCg2,n+ V2(별칭 "pJP186")의 지도를 도시한 것이다.
도 19는 pHybE-hCg2,n- V2(별칭 "pJP187")의 지도를 도시한 것이다.
도 20은 pHybE-hCg4 V2(별칭 "pJP188")의 지도를 도시한 것이다.
도 21은 pHybE-mCg1 V2(별칭 "pJP189")의 지도를 도시한 것이다.
도 22는 pHybE-mCg2a V2(별칭 "pJP190")의 지도를 도시한 것이다.
도 23은 pHybE-hCk V2(별칭 "pJP191")의 지도를 도시한 것이다.
도 24는 pHybE-hCl V2(별칭 "pJP192")의 지도를 도시한 것이다.
도 25는 pHybE-mCk V2(별칭 "pJP192")의 지도를 도시한 것이다.
I. 정의
본 발명이 더 쉽게 이해될 수 있기 위해, 먼저 특정 용어들은 다음과 같은 정의된다.
본 발명에 사용된 "핵산" 또는 "핵산 분자"란 용어는 DNA, RNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA 및 이의 유사체를 포함하려 한다. 핵산 분자는 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있지만, 이본쇄 DNA가 바람직하다. 핵산은 분리될 수도 있고, 또는 다른 핵산 분자, 예컨대 발현 벡터 또는 진핵생물 숙주 세포의 염색체에 통합될 수 있다.
"분리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 근원에 존재하는 다른 핵산 분자와 분리해낸 것이다. 예를 들어, 게놈 DNA와 관련하여, "분리된"이란 용어는 게놈 DNA가 자연 결합되어 있는 염색체로부터 분리해낸 핵산 분자를 포함한다. "분리된" 핵산은 이 핵산이 유래된 유기체의 게놈 DNA에서 상기 핵산에 자연적으로 인접해 있는 서열(즉, 핵산의 5' 및 3' 말단에 위치한 서열)이 없는 것이 바람직하다. 더욱이, "분리된" 핵산 분자, 예컨대 cDNA 분자는 다른 세포 물질 또는 재조합 기술로 생산되었을 때는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성되었을 때에는 화학 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 것일 수 있다.
본 명세서에서 호환해서 사용된 "재조합 벡터" 또는 "벡터"란 용어는 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 한 종류는 "플라스미드"로, 추가 DNA 분절이 연결될 수 있는 원형 이본쇄 DNA 루프(loop)를 의미한다. 대안적으로, 벡터는 선형일 수도 있다. 벡터의 다른 종류는 바이러스 벡터로, 추가 DNA 분절은 바이러스 게놈에 연결될 수 있다. 특정 벡터는 이 벡터가 도입되는 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예컨대, 세균 복제 오리진을 보유한 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입된 후에 숙주 세포의 게놈 내로 통햅될 수 있고, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 벡터는 에피솜 포유동물 벡터이다. 본 명세서에 사용된 "작제물"이란 용어는 벡터를 의미한다.
특정 벡터는 작동가능하게 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. "발현 벡터" 또는 "재조합 발현 벡터"는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 암호화하는 핵산 분자로, 또한 이 유전자의 발현을 제어하는데 필요한 인자도 함유한다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 관심있는 유전자 및 전사 종결인자를 포함한다. 유전자 발현은 보통 프로모터의 제어 하에 위치하고, 이러한 유전자는 프로모터에 "작동가능하게 결합"되어 있다라고 한다. 이와 마찬가지로, 조절 인자 및 코어 프로모터는 조절 인자가 코어 프로모터의 활성을 조절한다면 작동가능하게 결합되어 있는 것이다. 한 양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 하나보다 많은 복제 오리진을 함유하여, 벡터를 한 세포 종류에만 제한시키지 않는다.
본 명세서에 사용된, "에피솜 복제 벡터" 또는 "에피솜 벡터"는 전형적으로 매우 바람직하게는, 숙주 세포의 게놈 내에 통합되지 않고 병존하는 벡터를 의미한다. 본 명세서에 사용된 에피솜 복제 벡터는 세포 주기 동안 복제되고, 이 복제 과정에 벡터 카피는 세포 분열 전과 후에 존재하는 카피 수에 따라 최종 세포에 통계적으로 분포되어 있다. 바람직하게는, 에피솜 복제 벡터는 숙주 세포의 핵에서 나타날 수 있고, 바람직하게는 세포 주기의 S기 동안 복제한다. 또한, 에피솜 복제 벡터는 세포 주기의 S기 동안 숙주 세포의 핵에서 적어도 1회, 즉 1회 이상 복제한다. 매우 바람직한 양태에서, 에피솜 복제 벡터는 세포 주기의 S기 동안 숙주 세포의 핵에서 1회 복제한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 여기서 호환해서 사용된 "복제 오리진 서열" 또는 "복제 오리진"이란 용어는 벡터에 존재할 때 복제를 개시하는 서열을 의미한다. 복제 오리진은 복제 개시 인자 또는 대안적으로 DNA 헬리카제에 의해 인식될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "재조합"은 핵산 물질, 예컨대 DNA가 예컨대 미생물에서 두 핵산 분자 간에 교환되는 과정을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "상동 재조합"은 서열 상동성 또는 바람직하게는 서열 동일성(예컨대, 고도의 서열 동일성)의 영역 또는 분절을 통해 두 핵산 분자 간에 핵산 물질이 교환되는 과정을 의미한다. 예시적 양태에서, 핵산 물질은 염색체에 존재하거나 미생물의 에피솜에 존재한다. 다른 예시적 양태에서, 핵산 물질은 염색체외, 예컨대 플라스미드 상에 위치한다. 재조합은 선형 및/또는 원형 DNA 분자 사이에서 일어날 수 있다.
본 명세서에 사용된, "관심있는 유전자"란 용어는 본 발명의 벡터에 부가되는 외인성 DNA 서열을 의미한다. 관심있는 유전자, 예컨대 인트론에 의해 이격될 수 있고 또는 개방 판독 프레임을 암호화하는 cDNA인 암호화 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "관심있는 유전자"는 궁극적인 단백질 발현을 위해 본 발명의 벡터에 부가되는 DNA 서열을 의미한다. 관심있는 유전자가 클로닝되는 벡터의 영역은 본 명세서에서 "삽입 부위"라고 부른다. 관심있는 유전자는 본 발명의 벡터를 이용하여 발현되는 항체 또는 융합 단백질의 일부를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 항체 아달리무마브의 중쇄 가변 영역, 즉 관심있는 유전자는 중쇄 불변 영역을 함유하는 본 발명의 벡터에 클로닝된다.
본 발명의 한 양태에서, 벡터는 관심있는 유전자의 삽입 부위에 대해 3'이고 작동가능하게 결합된 항체 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 포함한다. 즉, 한 양태에서, 관심있는 유전자는 본 발명의 벡터에서 암호화된 항체 경쇄 또는 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 결합된 항체 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역이다.
뉴클레오타이드 서열은 다른 뉴클레오타이드 서열과 기능적 관계로 위치했을 때 "작동가능하게 결합된" 것이다. 예를 들어, 시그널 펩타이드를 암호화하는 DNA가 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA에 작동가능하게 결합되면, 발현 시에 상기 서열들은 상기 단백질 또는 폴리펩타이드와 프레임내에 시그널 펩타이드를 암호화한다. 이와 마찬가지로, 프로모터 또는 인핸서는 단백질 또는 폴리펩타이드의 발현이 촉진 또는 증진되면 그 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동가능하게 결합된 것이다. 한 양태에서, 작동가능하게 결합된 뉴클레오타이드 서열은 인접해 있다(예컨대, 시그널 서열의 경우). 대안적으로, 작동가능하게 결합된 뉴클레오타이드 서열은 비인접성(예컨대, 인핸서의 경우)일 수 있다. 한 양태에 따르면, 항체 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열은 관심있는 유전자, 예컨대 중쇄 또는 경쇄 가변 영역에 작동가능하게 결합되어 있다.
"프로모터"란 용어는 진핵생물 세포에서 전사를 유도하기에 충분한 임의의 핵산 서열을 포함하고, 그 예로는 유도성 프로모터, 억제성 프로모터 및 구성적 프로모터가 있다. 일반적으로, 프로모터는 프로모터-의존적 유전자 발현을 세포 종류-특이적, 조직-특이적 또는 시간 특이적 방식으로 조절할 수 있도록 하거나 외부 시그널 또는 요인에 의해 유도할 수 있도록 하기에 충분한 인자를 포함한다. 이러한 인자들은 특정 유전자의 5' 또는 3' 또는 인트론 서열 영역에 위치할 수 있다. 보통, 유전자 발현은 구성적일 수 있으나, 바람직하다면 조절성 프로모터가 본 발명에 이용될 수도 있다. 유전자 발현은 또한 열, 빛 또는 금속을 이용한 전사-조절에 의해, 예컨대 메탈로티오네인 유전자 또는 열쇼크 유전자를 이용하여 제어할 수도 있다.
"상류(upstream)" 및 "하류(downstream)"는 뉴클레오타이드 서열 또는 벡터에 존재하는 두 인자들 간의 상대적 배향을 설명하는데 사용된 용어이다. 다른 인자의 "상류"인 인자는 다른 인자보다 서열의 5' 말단에 더 가까운(즉, 분자가 선형인 경우 리보스 또는 데옥시리보스 골격의 5' 탄소에 포스페이트 그룹이 부착되어 있는 분자의 말단에 더 가까운) 위치에 존재한다. 인자가 다른 인자와 비교했을 때 서열의 3' 말단(즉, 선형 분자에서 리보스 또는 데옥시리보스 골격의 3' 탄소에 부착되어 있는 하이드록실 그룹을 갖는 분자의 말단)에 더 가까운 위치에 존재할 때에는 "하류"라고 한다.
본 발명에 사용된, "스터퍼(stuffer) 서열"이란 용어는 5' 및 3' 말단 양쪽에서 제한효소 부위 옆에 위치하는, 바람직하게는 벡터에 있는, 핵산 서열을 의미한다. 스터퍼 서열은 벡터 내에서 관심있는 유전자를 암호화하는 핵산의 삽입 부위에 위치한다. 클로닝 과정 동안 스터퍼 서열은 적당한 제한효소에 의해 벡터로부터 절단되고, 관심있는 유전자를 암호화하는 핵산은 스터퍼 서열의 이전 위치에서 벡터에 연결되거나 또는 상동 재조합된다. 스터퍼 서열은 제한효소가 벡터를 효과적으로 절단할 수 있도록 5' 및 3' 제한효소 부위 사이에 충분한 거리를 제공하기에 충분하게 큰 것이 바람직하다. 또한, 스터퍼 서열의 길이는 관심있는 유전자를 암호화하는 핵산 크기와 다른 것이 바람직하며, 예컨대 약 300 염기쌍 이하 또는 약 400 염기쌍 이상의 스터퍼 서열은 약 350 염기쌍인 관심있는 유전자를 암호화하는 핵산에 사용될 수 있다. 다른 양태에서, 스터퍼 서열은 크기가 약 1kb이다.
본 명세서에 사용된 "재조합 숙주 세포"(또는 간단하게 "숙주 세포")란 용어는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 의미하려는 것이다. 이러한 용어들은 특정 피검체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 의미하려는 것으로 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 후속 세대에서는 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본 발명에 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범주에 포함된다.
본 발명에 언급된 "항체"란 용어는 완전 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편(즉, "항원 결합부") 또는 이의 단일 쇄를 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 상호결합된 적어도 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L), 또는 이의 항원결합부를 포함하는 당단백질을 의미한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(약칭, VH) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(약칭 VL) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 다시 프레임워크 영역(FR)이라 불리는 더욱 보존적인 영역이 산재해 있는, 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변성 영역으로 세분될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 다음과 같은 순서로 배열되는 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. VH 및 VL 조합물의 6개의 CDR은 항원결합부위를 형성한다. 2개의 H 쇄와 2개의 L 쇄로 구성된 항체인 경우, 이 항체는 2개의 동일한 항원 결합 부위, 동일한 항원에 결합하는 2개의 다른 항원결합부위, 또는 다른 항원에 결합하는 2개의 항원결합부위를 함유할 수 있다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예, 효과기 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분(C1q)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자들에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용된 항체의 "항원결합부"(또는 단순히 "항체부")란 용어는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다(예, IL-1α, IL-1β). 항체의 항원결합 기능은 전체 길이의 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체의 "항원결합부"란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지(hinge) 영역에서 이황화 가교에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) VH 또는 VL 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al.(1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH는 다른 유전자에 의해 암호화될지라도, VL 및 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성하고 있는 단일 단백질 쇄로 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연합될 수 있다(단일 쇄 Fv(scFv)라고도 알려짐; 예컨대, Bird et al.(1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). 이러한 단일 쇄 항체는 또한 항체의 "항원결합부"란 용어에도 포함될 수 있다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상의 기술을 이용하여 수득하고, 단편은 본래 항체와 같은 방식으로 유용성에 대해 선별한다. 본 발명의 한 양태에 따르면, 항체 단편은 Fab, Fd, Fd', 단일 쇄 Fv(scFv), scFva 및 도메인 항체(dAb)로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
또한, 항체 또는 이의 항원결합부는 이 항체 또는 항체부를 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 공유 또는 비공유 결합시켜 형성된 더 큰 면역부착 분자의 일부일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예로는 4량체 scFv 분자를 제조하는 스트렙트아비딘 코어 영역의 이용(Kipriyanov et al.(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101) 및 2가의 비오틴화된 scFv 분자를 제조하는 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 이용(Kipriyanov et al . (1994) Mol. Immunol . 31:1047-1058)을 포함한다. 항체부, 예컨대 Fc, Fab 및 F(ab')2 단편은 완전 항체의 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상의 기술로 완전 항체로부터 각각 제조될 수 있다. 또한, 항체, 항체부 및 면역부착 분자는 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수도 있다.
"도메인"이란 용어는 단백질의 나머지와 별개로 3차 구조를 유지하는 폴딩된 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 분리된 기능적 성질을 담당하고, 많은 경우에 단백질의 나머지 및/또는 도메인의 기능을 상실함이 없이 다른 단백질에 부가되거나, 제거되거나 또는 전이될 수 있다. 단일 항체 가변 도메인이란, 항체 가변 도메인의 특이적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩타이드 도메인을 의미한다. 따라서, 완전한 항체 가변 도메인은 물론, 예를 들어 하나 이상의 루프(loop)가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 교체된 변형 가변 도메인 또는 절두되었거나 N-말단 또는 C-말단 연장부를 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전체 길이의 도메인의 결합 활성 및 특이성을 적어도 부분적으로 보유하는 가변 도메인의 폴딩된 단편도 포함한다.
본 발명의 가변 도메인은 조합되어 도메인 그룹을 형성할 수 있고; 예컨대 상보성 도메인이 조합될 수 있으며, 예를 들어 VL 도메인은 VH 도메인과 조합될 수 있다. 비-상보성 도메인, 예컨대 VH 도메인과 제2 VH 도메인도 조합될 수 있다. 도메인은 다수의 방식, 예컨대 공유 또는 비공유 수단에 의한 도메인의 결합을 수반하는 방식으로 조합될 수 있다.
"dAb" 또는 "도메인 항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 단일 항체 가변 도메인(VH 또는 VL) 폴리펩타이드를 의미한다. 한 양태에서, 본 발명의 벡터는 dAb를 발현하는데 사용된다.
"재조합 항체"란 어구는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체, 예컨대 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터를 이용하여 발현시킨 항체, 재조합체 조합 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 사람 면역글로불린 유전자에 돌연변이성인 동물(예, 마우스)로부터 분리된 항체(예컨대, Taylor et al.(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295) 또는 다른 DNA 서열에 특정 면역글로불린 유전자 서열(예컨대, 사람 면역글로불린 유전자 서열)의 스플라이싱을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 의미한다. 재조합 항체의 예에는 키메릭, CDR-이식된 및 사람화된 항체를 포함한다.
"사람 항체"란 용어는 문헌[Kabat, et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]에 기술된 바와 같이, 사람 생식계열 면역글로불린 서열에 대응하거나 그 서열에서 유래되는 가변 및 불변 영역을 보유하는 항체를 의미한다. 하지만, 본 발명의 사람 항체는 사람 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기(예컨대, 시험관내 랜덤 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를, 예컨대 CDR 및 특히 CDR3 내에 포함할 수 있다.
본 발명의 재조합 사람 항체는 생식계열 면역글로불린 서열에서 유래되는, 가변 영역을 보유하고, 또한 불변 영역을 포함할 수 있다(Kabat et al . (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242. 참조). 하지만, 특정 양태에 따르면, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발로 처리되고(또는 사람 Ig 서열에 대해 돌연변이성인 동물이 사용되면 생체내 체세포 돌연변이유발), 이에 따르면 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 사람 생식계열 VH 및 VL 서열에서 유래되고 관련이 있지만 생체내 사람 항체 생식계열 목록에는 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 하지만, 특정 양태에서 이러한 재조합 항체는 선택적 돌연변이유발 또는 복귀돌연변이, 또는 이 둘 모두의 결과이다.
"복귀돌연변이"란 용어는 사람 항체의 체세포 돌연변이된 아미노산의 일부 또는 전부가 상동성 생식계열 항체 서열 유래의 대응하는 생식계열 잔기와 교체되는 과정을 의미한다. 본 발명의 사람 항체의 중쇄 및 경쇄 서열을 VBASE 데이터베이스의 생식계열 서열과 각각 정렬하여 최고의 상동성인 서열을 동정한다. 본 발명의 사람 항체 중의 차이는 다른 아미노산을 암호화하는 특정 뉴클레오타이드 위치를 변이시켜 생식계열 서열로 복귀시킨다. 이와 같이 복귀돌연변이의 후보로 동정된 각 아미노산의 역할은 항원 결합의 직접 또는 간접 역할에 대해 조사되어야 하고 돌연변이 후에 사람 항체의 임의의 바람직한 특징에 영향을 미치는 것으로 발견된 모든 아미노산은 최종 사람 항체에 포함되지 않아야 한다. 복귀돌연변이되는 아미노산의 수를 최소화하기 위해서는 가장 근접한 생식계열 서열과는 다르지만 제2 생식계열 서열의 대응 아미노산과는 동일한 것으로 발견된 아미노산 위치는, 제2 생식계열 서열이 본 발명의 사람 항체의 서열과 문제의 아미노산의 양측에서 적어도 10개, 바람직하게는 12개 아미노산과 동일하고 공동선상이면 남겨둘 수 있다. 복귀돌연변이는 항체 최적화의 임의의 단계에서 일어날 수 있다.
"키메라 항체"란 용어는 한 종의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열과 다른 종의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예컨대 쥐 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 사람 불변 영역에 결합되어 있는 항체를 의미한다.
"CDR-이식된 항체"란 용어는 한 종의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 하나 또는 그 이상의 서열이 다른 종의 CDR 서열로 교체된 항체, 예컨대 쥐 CDR 중 하나 이상(예, CDR3)이 사람 CDR 서열로 교체된 쥐 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 보유하는 항체를 의미한다.
"사람화된 항체"란 용어는 비-사람 종(예, 마우스) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 더욱 "사람같은", 즉 사람 생식계열 가변 서열과 더욱 유사한 서열로 변경된 항체를 의미한다. 사람화된 항체의 한 종류는 CDR-이식된 항체로, 사람 CDR 서열이 이에 대응하는 비-사람 CDR 서열을 교체하기 위해 비-사람 VH 및 VL 서열에 도입된 항체이다.
본 명세서에 사용된, "결합된", "융합된" 또는 "융합체"란 용어는 호환해서 사용된다. 이 용어는 화학적 접합 또는 재조합 수단을 비롯한 어떠한 수단에 의해서든지 2 이상의 인자 또는 성분이 함께 연합된 것을 의미한다. "프레임내 융합" 또는 "작동가능하게 결합된"은 본래 ORF의 정확한 판독 프레임을 유지하는 방식으로, 2 이상의 개방 판독 프레임(ORF)이 연합하여 더 긴 연속 ORF를 형성하는 것을 의미한다. 즉, 최종적으로 수득되는 재조합 융합 단백질은 본래 ORF에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대응하는 분절(이 분절은 보통 자연에서는 이와 같인 연합되지 않는다)을 2 이상 함유하는 단일 단백질이다. 판독 프레임이 융합된 분절을 통해 연속성으로 제조되었지만, 분절들은 물리적 또는 공간적으로, 예컨대 프레임내 링커 서열에 의해 분리될 수 있다.
본 명세서에 사용된, "Fc 영역"이란 용어는 항체 중쇄의 불변 영역에서 유래되는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 양태에 따르면, Fc 영역은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외한 항체의 불변 영역을 함유하는 폴리펩타이드를 포함한다.
Fc 영역은 Fc 영역의 기능적 등가 유사체일 수 있다. Fc 영역의 기능적 등가 유사체는 야생형 또는 자연상에 존재하는 Fc 영역에 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변형 Fc 영역일 수 있다. 일부 양태에 따르면, 변형 Fc 영역은 자연에서 존재하는 Fc 영역과 적어도 50%의 상동성을 보유하고, 바람직하게는 약 80% 내지 99%의 상동성을 보유하며, 예컨대 적어도 약 85% 상동성, 적어도 약 90% 상동성, 적어도 약 95% 상동성, 적어도 약 96% 상동성, 적어도 약 97% 상동성, 적어도 98% 상동성 또는 적어도 약 99% 상동성을 포함한다. Fc 영역의 기능적 등가 유사체는 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 부가되거나 결실된 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 30개 이하, 가장 바람직하게는 10개 이하의 잔기를 포함할 수 있다. Fc 영역의 기능성 등가 유사체는 융합 파트너에 작동가능하게 결합된 Fc 영역을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "Fc 융합체" 또는 "Fc 융합 단백질"이란 용어는 하나 이상의 단백질, 폴리펩타이드 또는 소분자가 Fc 영역 또는 이의 유도체에 작동가능하게 결합된 단백질을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "Fc 융합체"란 용어는 종래 기술에 사용된 "Ig 융합체", "Ig 키메라" 및 "수용체 글로불린"(때로는 대시 기호(-)를 포함해서)과 같은 용어와 동의어인 것으로 간주한다(Chamow et al ., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200). Fc 융합체는 면역글로불린의 하나 이상의 Fc 영역, 또는 이의 변형체(들)를, 일반적으로 임의의 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 또는 소분자일 수 있는 융합 파트너와 조합한 것이다. 일부 양태에서, Fc 융합체의 비-Fc 부분, 즉 융합 파트너의 역할은 표적 결합을 매개하는 것일 수 있고, 이에 따르면 항체의 가변 영역과 기능적으로 유사한 것일 수 있다.
Fc 폴리펩타이드를 융합 또는 접합 파트너에 공유 결합시키거나 또는 Fc 융합체를 제조하기 위해 본 발명에서는 다양한 링커를 사용할 수 있다. 본 명세서에 사용된, "링커", "링커 서열", "스페이서", "테더링(tethering) 서열" 또는 이의 등가물이란 용어는 두 분자를 연결하고 두 분자를 바람직한 배열로 배치하는 작용을 할 수 있는 분자 또는 분자 그룹(예컨대 단량체 또는 중합체)을 의미한다. 분자를 함께 공유 결합시키는 데에는 다수의 전략이 이용될 수 있다. 그 예로는 단백질 또는 단백질 도메인의 N-말단 및 C-말단 간의 폴리펩타이드 결합, 이황화 결합을 통해 결합 및 화학적 가교 시약을 통한 결합이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
II . 본 발명의 벡터
본 발명은 포유동물 숙주 세포에서 단백질을 발현하기 위한 에피솜 벡터를 제공한다. 본 발명의 벡터는 2개의 에피솜 복제 오리진을 포함하는 것을 기반으로 하고, 이로써 벡터는 어느 하나의 복제 오리진에 대해 트랜스-작용성 복제 개시 인자를 함유하는 모든 세포주에서 사용할 수 있게 된다. 이 벡터는 또한 복제 오리진에 결합하는 복제 개시 인자를 함유할 수 있지만, 숙주 세포에 의해 트랜스-작용성 복제 인자가 제공되는 것이 바람직한 양태이다. 또한, 한 양태에 따르면, 본 발명의 벡터는 관심있는 유전자에 작동가능하게 결합된 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 함유하고 있는 바, 항체 및 Fc 융합 단백질의 생산에 효율적이고 효과적인 수단을 제공한다. 본 발명의 벡터의 예는 도 1, 2 및 8 내지 25에 설명되어 있다. 또한, 예시적 벡터의 서열은 서열번호 1 내지 32에 제공된다. 도 1과 2(이에 대응하는 서열번호 1 및 2)는 항체 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 및 관심있는 유전자를 함유하지 않는 본 발명의 벡터인 "개방" 벡터를 설명한다. 도 8 내지 25는 관심있는 유전자를 클로닝할 부위와 함께 다양한 쥐 또는 사람 불변 영역을 추가로 포함하는 본 발명의 벡터의 지도를 제공한다.
본 발명의 벡터는 적어도 2개의 상이한 복제 오리진, 예컨대 엡스타인-바 바이러스(EBV) 유래의 OriP 복제 오리진 및 SV40 복제 오리진을 포함한다. 복제 오리진은 DNA 바이러스에서 유래될 수 있고, 더욱 바람직하게는 에피솜 복제를 허용하는 DNA 바이러스에서 유래될 수 있고, 그 예로는 엡스타인-바 바이러스, 헤르페스 단순 바이러스, 헤르페스바이러스 사이미리, 쥐 감마헤르페스바이러스 68, 사람 사이토메갈로바이러스, 마우스 사이토메갈로바이러스, 슈도라비스바이러스, 시미안 바이러스 40, 폴리오마 바이러스, 사람 BK 바이러스, 소 파필로마 바이러스 및 아데노관련 바이러스에서 유래되는 복제 오리진이 있다.
한 양태에서, 복제 오리진은 엡스타인-바 바이러스 유래인 것, 예컨대 oriP 또는 이의 기능성 부분(엡스타인-바 기능성 오리진의 예는 Aiyar et al.(1998) EMBO Journal, 17: 6394에 설명되어 있다)이다. 엡스타인-바 바이러스 복제 오리진(OriP)은 2개의 주요 인자 및 세포에 의한 DNA 합성을 촉진하는 다수의 시스-작용성 인자 및 바이러스 유지 인자로 구성된다. 2개의 주요 인자 중 제1 인자는 EBNA 결합 부위를 포함하는 반복체 패밀리(FR)를 포함한다(도 1 및 2에 도시됨). EBNA는 OriP(EBNA 서열은 진뱅크 등록번호 V01555(gi:94734074)를 참조)를 통해 벡터의 복제를 개시하는 복제 개시 인자이다. OriP에 함유된 제2 인자는 소위 이분염색체 대칭(DS)을 함유하고, 이의 기능은 오리진 인식 인자로 작용하는 것이다. 일반적으로, DS 인자와 FR 인자는 여러 염기쌍, 일반적으로 1000bp에 의해 이격되어 있다. OriP의 상대적 배향, 특히 DS와 FR의 상대적 배향은 OriP 기능에 영향을 미침이 없이 변경될 수 있다. 본 발명의 발현 벡터에 위치한 다른 인자에 상대적인 OriP의 배향, 특히 DS 및 FR의 배향은 OriP 기능에 영향을 미침이 없이 변경될 수 있다. 복제 오리진이 엡스타인-바 바이러스 복제 오리진(OriP)이고 OriP가 반복체 패밀리(FR) 및 이분염색체 대칭(DS)을 포함하는 본 발명의 바람직한 양태에서, 연속 순서는 DS 인자가 관심있는 유전자와 FR 인자 사이에 있는 순서이다. 한 양태에서, 본 발명의 벡터는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1795 내지 3545를 포함하거나, 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 OriP(엡스타인-바 바이러스) 복제 오리진을 포함한다.
다른 양태에서, 벡터는 SV40 복제 오리진을 포함한다. SV40(시미안 바이러스 40) 복제 오리진(예컨대, 도 1과 2에 "SV40 Ori"로 기술된 것)은 이 오리진을 통해 벡터의 복제를 개시하는데 큰 T-항원인 단일 바이러스 단백질을 필요로 한다. SV40 복제 오리진은 에피솜 벡터에 사용되어 이 벡터를 복제하고 유지할 수 있다(Calos (1996) Trends Genetics 12: 462; Harrison et al . (1994) J Virol 68:1913; Cooper et al . (1997) PNAS 94:6450; 및 Ascenziono et al . (1997) Cancer Lett 118:135). 한 양태에서, 본 발명의 벡터는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 5834 내지 6140을 포함하거나 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 서열을 포함하는 SV40 복제 오리진을 포함한다.
여기에 기술된 복제 오리진의 기능성 변형체도 본 발명에 따른 복제 오리진의 의미에 포함된다.
에피솜 복제 오리진 외에, 본 발명의 벡터는 세균에서 벡터를 복제하기 위한 복제 오리진도 포함할 수 있다. 도 1 및 2에 제시된 바와 같고 이에 국한되지 않는 한 예는 이.콜라이에서 기능하는 pMB1 ori이다.
본 발명의 벡터는 추가로 선택 마커를 포함할 수 있다. 선택 마커는 원핵생물 및 진핵생물 유기체에서 벡터 서열의 클로닝 및 증폭을 용이하게 할 수 있다. 특정 양태에 따르면, 선택 마커는 화합물 또는 화합물 클래스, 예컨대 항생제에 내성을 부여할 것이다. 본 발명의 핵산 분자 및 발현 시스템과 사용될 수 있는 선택 마커의 예는 퓨로마이신에 대한 내성을 부여하는 것이다. 대안적으로, 선택 마커는 하이그로마이신, gpt, 네오마이신, 제오신, 와베인, 블라스티시딘, 카나마이신, 제네티신, 젠타마이신, 앰피실린, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 날리딕산, 리팜피신, 클로람페니콜, 제오신 또는 블레오마이신에 대한 내성을 부여하는 것, 또는 DHRF, hisD, trpB 또는 글루타민 신테타제와 같은 마커가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 벡터에는 관심있는 유전자의 단백질로의 전사 및 해독에 필요한 조절 인자(및 선택 마커)도 포함된다. 전사 조절 인자는 보통 발현될 유전자 서열의 5' 프로모터, 전사 개시 및 종결 부위, 및 폴리아데닐화 시그널 서열을 포함한다. "전사 개시 부위"란 용어는 1차 전사체, 즉 mRNA 전구체에 혼입된 제1 핵산에 대응하는 작제물 중의 핵산을 의미하고; 전사 개시 부위는 프로모터 서열과 중첩될 수 있다. "전사 종결 부위"란 용어는 RNA 폴리머라제가 전사를 종결하게 하는, 전사될 서열의 스트레치 또는 관심있는 유전자의 3' 말단에서 보통 나타나는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 폴리아데닐화 시그널 서열 또는 폴리-A 부가 시그널은 진핵생물 mRNA의 3' 말단에 있는 특정 부위에서의 절단 및 절단된 3' 말단에 약 100 내지 200개 아데닌 뉴클레오타이드(폴리A 테일)의 서열을 핵 내에서 전사후 부가하기 위한 시그널을 제공한다. 폴리아데닐화 시그널은 절단 부위로부터 약 10 내지 30개 뉴클레오타이드 상류에 위치한 서열 AATAAA, 및 하류 서열을 포함한다.
본 발명의 벡터에 포함될 수 있는 조절 인자는 프로모터이다. 이 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 인핸서(즉, 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는 시스-작용성 DNA 인자)는 프로모터 단독에 의해 수득되는 발현 수준을 증가시키기 위해 프로모터와 연계하여 기능을 하는데 필요할 수 있고, 전사 조절 인자로서 포함될 수 있다. 종종, 프로모터를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 분절은 또한 인핸서 서열(예, CMV IE P/E; SV40 P/E; MPSV P/E)을 포함할 것이다. 스플라이스 시그널은 스플라이싱된 전사체를 수득하기 위해 필요한 곳에 포함될 수 있다. 분비 폴리펩타이드를 생산하기 위해, 선택 서열은 일반적으로 새로 합성된 폴리펩타이드가 분비를 위해 거쳐나갈 수 있는 ER 막으로 향하고 이 막을 통과하게 하는 리더(leader) 펩타이드를 암호화하는 시그널 서열을 포함할 것이다. 이 리더 펩타이드는 종종이지만 보편적이지 않게 분비 단백질의 아미노 말단에 위치하고 단백질이 ER 막을 통과한 후에 시그널 펩티다제에 의해 절단된다. 선택 서열은 일반적으로 자신의 시그널 서열을 포함하지만, 반드시 그런 것은 아니다. 천연의 시그널 서열이 없는 경우에는, 선택 서열에 이종 시그널 서열을 융합시킬 수도 있다. 다수의 시그널 서열이 당업계에 공지되어 있고 진뱅크 및 EMBL과 같은 서열 데이터베이스에서 입수할 수 있다. 해독 조절 인자는 발현될 각각의 개별 폴리펩타이드를 위해 해독 개시 부위(AUG), 종결 코돈 및 폴리 A 시그널을 포함한다. 내부 리보솜 진입 부위(IRES)는 일부 작제물에 포함되어 있다.
본 발명에 사용하기 위한 프로모터는 바이러스, 포유동물 및 효모의 프로모터를 포함하며, 그 예로는 쥐 베타 글로빈 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 폴리오마 프로모터, 포유동물 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 효모 알콜 옥시다제, 포스포글리세로키나제 프로모터, 락토스 유도성 프로모터, 갈락토시다제 프로모터, 아데노-관련 바이러스 프로모터, 폭스바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, SV40 프로모터, 하이드록시메틸글루타릴 조효소 A 프로모터, 티미딘 키나제 프로모터, H5R 폭스바이러스 프로모터, 아데노바이러스 타입 2MPC 후기 프로모터, 알파-안트립신 프로모터, 폭스 IX 프로모터, 면역글로불린 프로모터, CFTR 계면활성제 프로모터, 알부민 프로모터 및 트랜스페린 프로모터가 있다. 본 발명의 핵산 및 발현 벡터와 함께 사용하기 위해 선택한 프로모터는 (1) 관심있는 유전자의 발현 유도 등에서 높은 발현 수준, 또는 (2) 선택 마커 유전자의 발현 유도 등에서 감소된 발현 수준(변형으로 약화된 후)을 제공할 수 있다. 관심있는 유전자를 유도하는 프로모터는 관심있는 산물의 발현을 증가시키고 정확한 스플라이싱을 촉진하기 위해 강한 프로모터, 예컨대 유비퀴틴, CMV, EF-1α 및 SR 알파 프로모터이다.
한 양태에서, 본 발명의 벡터는 관심있는 유전자의 발현을 유도하는 CMV 프로모터를 포함한다. CMV 프로모터의 사용에 대해서는 본 발명에 참고 인용된 미국 특허 5,385,839 및 5,849,522에 기술되어 있다. 한 양태에서, 본 발명의 벡터에 사용된 CMV 프로모터는 관심있는 유전자 및 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 608에 작동가능하게 결합된다. 또한, 본 발명의 범위에는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 608과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 CMV 프로모터 서열이 포함된다.
본 발명의 벡터에 사용될 수 있는 다른 프로모터는 연장인자-1α(EF-1α), 예컨대 사람 EF-1α의 프로모터이다. 사람 EF-1α 프로모터의 서열은 진뱅크 등록번호 NM_001402(gi:83367078)에서 찾아볼 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 벡터는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 76 내지 1267을 포함한다. 또한, 본 발명의 범위에는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 608과 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 EF-1α 프로모터 서열도 포함된다.
한 양태에서, 벡터는 클로닝 목적의 SwaI 제한효소 부위를 포함한다.
전형적으로, 유전자(선택 마커 및 GOI)는 프로모터와 폴리아데닐화 부위 사이에 개재된다. 사용된 폴리 A 서열은 관심있는 유전자에서 유래될 수 있고(즉, 천연 폴리 A 서열이 사용될 수 있다) 또는 이종 폴리 A 서열(즉, GOI와 다른 유전자 유래), 예컨대 BGH 폴리A 및 SV40 폴리A 등이 사용될 수 있다. mRNA는 프로모터로부터 전사되고, 암호화 영역의 3'에 위치한 폴리아데닐화 시그널에 의해 안정화된다. 폴리A 시그널은 당업계에 공지되어 있고 본 발명에 이용된 벡터 및 숙주 세포와의 사용 적합성에 기초하여 선택할 수 있다. 사용될 수 있는 폴리A 시그널의 예로는 사람 BGH 폴리A, SV40 폴리A, 사람 베타 액틴 폴리A, 토끼 베타 글로빈 폴리A 및 면역글로불린 카파 폴리A를 포함한다.
본 발명의 벡터는 세포 배양에서 발현을 위한 수단으로서의 벡터로, 관심있는 유전자를 포함한다. 관심있는 유전자는 기능성 핵산 분자(예, RNA, 예컨대 안티센스 RNA 분자)를 암호화하거나, 또는 더 전형적으로는 생산 증가가 필요한 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질을 암호화할 수 있다. 본 발명의 벡터는 관심있는 유전자가 조절성 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어 관심있는 유전자의 발현을 허용하도록, 관심있는 유전자가 삽입 부위에 삽입된 것일 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 벡터는 본질적으로 관심있는 임의의 유전자, 특히 치료적으로 유용한 활성 또는 다른 상업적 관련 용도가 있는 재조합 단백질을 암호화하는 유전자를 발현하는데 이용될 수 있다.
관심있는 유전자의 비제한적 예로는 호르몬, 케모킨, 사이토킨, 림포킨, 항체, 수용체, 부착 분자 및 효소가 포함된다. 원하는 산물의 비제한적 목록에는, 예컨대 사람 성장 호르몬, 소 성장 호르몬, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 난포 자극 호르몬 성장, 황체형성 호르몬; 호르몬 방출 인자; 지단백; 알파-1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 칼시토닌; 글루카곤; 레닌과 같은 분자; VIIIC 인자, IX 인자, 조직 인자 및 폰 빌레브란트 인자와 같은 응고인자; 단백질 C, 심방 나트륨이뇨 인자, 폐 계면활성제와 같은 항-응고인자; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 우로키나제 또는 사람 소변 또는 조직별 플라스미노겐 활성인자(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; RANTES(Regulated on Activation Normally T-cell Expressed and Secreted); 사람 대식세포 염증 단백질(MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 사람 혈청 알부민; 뮬러관 억제 물질; 릴랙신 A- 또는 B-쇄; 프로릴랙신; 마우스 고나도트롭신-관련 펩타이드; DNase; 인히빈; 액티빈; 호르몬 또는 성장인자의 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 향신경성 인자, 예컨대 소 유래 향신경성 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 혈관내피성장인자, 신경성장인자, 예컨대 NGF-베타를 비롯한 성장인자; 혈소판-유래 성장인자(PDGF); 섬유아세포 성장인자, 예컨대 aFGF, bFGF, FGF-4, FGF-5, FGF-6; 상피성장인자(EGF); 전환 성장인자(TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-베타, 구체적으로 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5; 인슐린-유사 성장인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-1), 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질; CD 단백질, 예컨대 CD-3, CD-4, CD-8 및 CD-19; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 소 형태형성 단백질(BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인터루킨(IL), 예컨대 IL-1 내지 IL-33; 슈퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질, 예컨대 HER2; 붕괴가속인자; 바이러스 항원, 예컨대 AIDS 엔벨로프의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신(addressin); 성장인자, 사이토킨, 케모킨 및 림포킨의 수용체; 조절 단백질; 항체; 키메라 단백질, 예컨대 면역부착소 및 앞서 열거한 임의의 폴리펩타이드의 단편이 포함된다. 세균 폴리펩타이드 또는 단백질의 예로는, 예컨대 알칼리성 포스파타제 및 베타-락타마제를 포함한다.
본 발명의 한 관점에서, 벡터는 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 항체 중쇄 또는 경쇄 영역을 포함한다. 2개의 에피솜 복제 오리진과 항체의 경쇄 또는 중쇄 불변 영역을 함유하는 벡터의 예는 서열번호 3 내지 32에 있다.
본 발명의 한 양태는 완전한 항체, 즉 가변 영역이 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역에 결합되어 있는 항체를 발현시키는데 사용할 수 있는 벡터를 포함한다. 즉, 관심있는 유전자는 쥐, 키메릭, 사람화된 및 사람 항체 중 임의의 항체 종류일 수 있는 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화할 수 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 암호화하는 관심있는 유전자는 전체 길이의 가변 영역을 포함하거나, 대안적으로 중쇄 또는 경쇄의 단편, 예컨대 항원결합부 영역만을 암호화할 수 있다. 한 양태에서, 관심있는 유전자는 쥐 또는 사람 항체 가변 영역을 암호화한다. 이러한 경우에, 불변 영역은 가변 영역의 종에 부합하는 것일 수 있다(서열번호 3 내지 8, 27 및 28은 쥐 불변 영역을 암호화하는 반면, 서열번호 9 내지 26 및 29 내지 32는 사람 불변 영역을 암호화한다).
한 양태에서, 본 발명의 벡터는 특정 이소타입 및/또는 알로타입 특성이 있는 항체 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 예를 들어 감마 이소타입(IgG), 예컨대 감마 1, 감마 2, 감마 3 또는 감마 4일 수 있다. 한 양태에서, 중쇄 감마 1 불변 영역은 특정 알로타입으로, 예컨대 알로타입 z, a 및 z, non-a를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. z, a, 알로타입은 또한 G1m17 및 G1m1 알로타입으로도 알려져 있고, 위치 214(CH1 내에)에 Lys, 356(CH3)에 Asp 및 358(CH3)에 Leu(번호는 EU 넘버 시스템에 따른 것이다)을 보유하는 IGHG1에 해당한다. G1m17이라고도 알려진 z, non-a 알로타입, 및 nG1m1 알로타입은 위치 214(CH1 내에)에 Lys, 356(CH3)에 Glu, 358(CH3)에 Met를 보유하는 IGHG1에 해당한다(번호는 EU 넘버 시스템에 따른 것이다).
다른 양태에서, 중쇄 감마 2 불변 영역(hcG2)은 특정 알로타입으로, 예컨대 n- 또는 n+를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. G2m(n) 또는 G2m(23)으로도 알려진 hcG2의 n+ 알로타입은 CH1의 위치 189에 있는 Thr 및 위치 282의 Met을 보유하는 IGHG2에 해당한다(번호는 EU 넘버 시스템에 따른다). G2m(n-)로도 알려진 hcG2의 n- 알로타입은 CH1의 위치 189에 있는 Pro와 위치 282의 Val을 보유하는 IGHG2에 해당한다(번호는 EU 넘버 시스템에 따른다). n+ 및 n- 알로타입의 추가 세부 사항은 문헌[Hougs et al.(2001) Immunogenetics 52: 242 및 Brusco et al.(1995) Immunogenetics 42: 414]에 기술되어 있다.
다른 양태에서, 중쇄 불변 영역은 IgM, IgA(IgA1 또는 IgA2), IgD 또는 IgE 이소타입일 수 있다.
한 양태에서, 중쇄 불변 영역은 다음과 같은 사람 이소타입 및 알로타입 특성을 나타낼 수 있다: 감마 1, z, a; 감마 1, z, non-a; 감마 2, n+; 감마 2, n-; 또는 감마 4. 한 양태에 따르면, 이소타입/알로타입 감마 1, z, non-a는 중쇄 불변 영역의 위치 234에 돌연변이를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 이소타입/알로타입 감마 1, z, non-a는 중쇄 불변 영역의 234 및 235 또는 234 및 237 위치에 돌연변이를 포함할 수 있다. 이러한 벡터의 예는 도 8 내지 25에 제시되어 있다.
다른 예에서, 본 발명의 벡터에서 암호화된 경쇄 불변 영역은 카파 이소타입 또는 람다 이소타입을 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터에 의해 암호화된 불변 영역은 사람에만 제한되지 않고, 대신 쥐 또는 여타 종의 불변 영역을 포함할 수도 있다. 한 양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 쥐 감마 1 이소타입 또는 쥐 감마 2a 이소타입인 중쇄 불변 영역 또는 쥐 카파 이소타입인 경쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산을 포함한다.
본 발명의 두 벡터, pHybC 및 pHybE는 불변 영역을 포함하지 않는 공벡터(empty vector)로, 관심있는 유전자를 클로닝하는데 사용할 수 있다. pHybC 및 pHybE에 대한 설명은 이하에 제시하며, 이 벡터들의 지도는 도 1과 2에 있다.
pHybC pHybC 벡터(공벡터)는 이 벡터가 여러 세포주에서 복제할 수 있도록 2개의 바이러스 복제 오리진을 함유한다. pHybC는 다음 인자를 함유한다: SV40의 큰 T 항원 단백질을 발현하는 세포(예, COS7 세포)에서 벡터 플라스미드 복제를 허용하는 SV40 복제 오리진("SV40 Ori"); 관심있는 유전자의 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 CMV 프로모터("pCMV"); 3원 리더 서열(TPL); 스플라이스 공여체 부위(SD); 아데노바이러스 주요 후기 인핸서 인자(enh MLP); 스플라이스 수용체 부위(SA); 관심있는 유전자의 개방 판독 프레임(ORF) 영역 및 후속되는 폴리 A 시그널(pA); 이분염색체 대칭 인자(DS); 바이러스 EBNA-1 단백질을 발현하는 세포(예, HEK-293-6E 세포)에서 벡터 플라스미드의 복제를 허용하는 엡스타입-바 바이러스 유래 진핵생물의 복제 오리진(OriP); 반복 영역(FR); 앰피실린 내성 마커(AmpR); 및 세균 복제 오리진(pMB1ori). pHybC 벡터는 입수할 수 있는 가장 강한 프로모터 인자 중 하나인 pCMV 프로모터를 이용한다. pHybC(공벡터)의 벡터 지도는 도 1에 설명되어 있다. pHybC 벡터의 핵산 서열은 서열번호 1에 제시되어 있다.
pHybE pHybE 벡터(공벡터)는 이 벡터가 여러 세포주에서 복제할 수 있도록 2개의 복제 오리진을 함유한다. pHybE는 다음 인자를 함유한다: SV40의 큰 T 항원 단백질을 발현하는 세포(예, COS7 세포)에서 벡터 플라스미드 복제를 허용하는 SV40 복제 오리진("SV40 Ori"); 관심있는 유전자의 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 EF-1a 진핵생물 프로모터; 관심있는 유전자의 개방 판독 프레임(ORF) 영역 및 후속되는 폴리 A 시그널(pA); 이분염색체 대칭 인자(DS); 엡스타입-바 바이러스 유래 진핵생물의 복제 오리진(OriP); 반복 영역(FR); 앰피실린 내성 마커(AmpR); 및 세균 복제 오리진(pMB1ori). pHybE(공벡터)의 벡터 지도는 도 2에 설명되어 있다. pHybE는 관심있는 유전자의 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 EF-1a 프로모터를 함유한다는 점에서 CMV 프로모터를 함유하는 pHybC와 다르다. pHybE 벡터의 핵산 서열은 서열번호 2에 제시되어 있다.
이하에 언급된 벡터는 pHybE 또는 pHybC 중 어느 하나를 기반으로 하고, 추가로 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 함유한다. pHybE 및 pHybC와 마찬가지로, 다음 벡터는 관심있는 유전자, 예컨대 면역글로불린 가변 영역의 암호화 서열, 또는 이의 항원결합부의 삽입에 사용될 수 있는 클로닝 부위를 보유한다. 각 경우마다, 관심있는 유전자의 클로닝 부위는 벡터 내에 함유된 불변 영역의 암호화 서열에 인접한 부위이다. 따라서, 이하의 벡터는 특정 불변 영역과 특정 가변 영역을 함유하는 항체 경쇄 또는 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybC 및 pHybE와 마찬가지로, 이하에 언급되는 본 발명의 벡터는 각각 다수의 복제 오리진을 함유하여, 다른 세포주에서 동일한 벡터를 이용하여 항체 경쇄 또는 중쇄를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 다른 벡터들에 대한 설명은 이하에 제시된다(또한, 벡터 지도는 도 8 내지 25에 제시되어 있다). 버전 1(V1)로 표현된 pHyb 벡터는 SrfI 제한효소 부위의 상류에 추가로 SwaI 부위를 보유하는 반면, 버전 2(V2)로 표현된 pHyb 벡터는 추가 SwaI 부위를 보유하지 않음을 유의해야 한다.
쥐 불변 영역을 함유하는 본 발명의 벡터
pHybC - mCg2a 벡터 pHybC-mCg2a는 pHybC 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybC에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 2a 중쇄 불변 영역에 대한 쥐 면역글로불린 암호화 서열을 포함한다. 따라서, 한 양태에 따르면, pHybC-mCg2a 벡터는 면역글로불린 중쇄 가변 영역(또는 이의 일부) 및 쥐 감마 2 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybC-mCg2는 감마 2 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. 도 8은 관심있는 유전자로서 쥐 BR3 단백질의 세포외 도메인(ECD)에 대한 암호화 서열을 포함하는 pHybC-mBR3-mCg2a의 지도를 보여준다. pHybC-mBR3-mCg2a의 핵산 서열은 서열번호 27에 제시했다.
pHybE - mCk 벡터 pHybE-mCk는 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). pHybE-mCk는 또한 카파 경쇄 불변 영역에 대한 쥐 면역글로불린 암호화 서열을 포함한다. 따라서, 한 양태에 따르면, pHybE-mCk 벡터는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 쥐 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 항체 경쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-mCk는 쥐 카파 경쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-mCk V2의 벡터 지도는 도 25에 제시했다. pHybE-mCk V1의 핵산 서열은 서열번호 3에 제시했고, pHybE-mCk V2의 핵산 서열은 서열번호 4에 제시했다.
pHybE - mCg1 pHybE-mCg1은 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 1 중쇄 불변 영역에 대한 쥐 면역글로불린 암호화 서열을 포함한다. 따라서, 한 양태에 따르면, pHybE-mCg1 벡터는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 쥐 감마 1 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-mCg1은 쥐 감마 1 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-mCg1 V2의 벡터 지도는 도 21에 제시했다. pHybE-mCg1 V1의 핵산 서열은 서열번호 5에 제시했고, pHybE-mCg1 V2의 핵산 서열은 서열번호 6에 제시했다.
pHybE - mCg2a pHybE-mCg2a는 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 2a 중쇄 불변 영역에 대한 쥐 면역글로불린 암호화 서열을 포함한다. 따라서, 한 양태에 따르면, pHybE-mCg2a 벡터는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 쥐 감마 2 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-mCg2a는 감마 2 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-mCg2a V2의 벡터 지도는 도 22에 제시했다. pHybE-mCg2a V1의 핵산 서열은 서열번호 7에 제시했고, pHybE-mCg2a V2의 핵산 서열은 서열번호 8에 제시했다. pHybE-mCg2a가 사용될 수 있는 방식의 한 양태에 대한 예로서, 도 9는 pHybE-mBR3-mCg2a의 지도를 보여준다. 도 9에 기술된 지도는 쥐 BR3 단백질의 세포외 도메인(ECD)에 대한 암호화 서열을 함유한다. pHybE-mBR3-mCg2a의 핵산 서열은 서열번호 28에 제시했다.
사람 불변 영역을 포함하는 본 발명의 벡터
pHybC - E7 - hCk pHybC-E7-hCk는 pHybC 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybC에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 카파 경쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 포함한다. 또한, pHybC-E7-hCk는 아달리무마브의 경쇄 가변 영역의 암호화 서열("E7"이라고도 불림)을 함유한다. pHybC-E7-hCk의 벡터 지도는 도 10에 제시했고, pHybC-E7-hCk의 핵산 서열은 서열번호 29에 제시했다.
pHybC - D2 - hCg1 ,z,a pHybC-D2-hCg1,z,a는 pHybC 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybC에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 1,z,a 중쇄 불변 영역에 대한 암호화 서열을 함유한다. 또한, pHybC-D2-hCg1,z,a는 아달리무마브의 중쇄 가변 영역의 암호화 서열(또한 "D2"라고도 불림)을 함유한다. pHybC-D2-hCg1,z,a의 벡터 지도는 도 11에 제시했다. pHybC-D2-hCg1,z,a의 핵산 서열은 서열번호 30에 제시했다.
pHybE - hCk pHybE-hCk는 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 카파 경쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 포함한다. 따라서, 예컨대, pHybE-hCk 벡터는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 사람 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 항체 경쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-hCk는 카파 경쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-hCk V2의 벡터 지도는 도 23에 제시했다. pHybE-hCk V1의 핵산 서열은 서열번호 9에 제시했고, pHybE-hCk V2의 핵산 서열은 서열번호 10에 제시했다. 또한, pHybE-E7-hCk의 벡터 지도는 도 13에 제시했다. 전술한 pHybE-hCk 벡터의 모든 인자들 외에, pHybE-E7-hCk는 아달리무마브의 경쇄 가변 영역의 암호화 서열("E7"이라고도 불림)을 함유한다. pHybE-E7-hCk의 핵산 서열은 서열번호 32에 제시했다.
pHybE - hCl pHybE-hCl은 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 람다 경쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 함유한다. 따라서, 한 양태에 따르면, pHybE-hCl 벡터는 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 사람 람다 경쇄 불변 영역을 함유하는 항체 경쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-hCl은 람다 경쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자를 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-hCl V2의 벡터 지도는 도 24에 제시했다. pHybE-hCl V1의 핵산 서열은 서열번호 11에 제시했고, pHybE-hCl V2의 핵산 서열은 서열번호 12에 제시했다.
pHybE - hCg1 ,z,a pHybE-hCg1,z,a는 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 1,z,a 중쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 함유한다. 따라서, 한 양태에 따르면, pHybE-hCg1,z,a 벡터는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 사람 감마 1,z,a 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-hCg1,z,a는 감마 1,z,a 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-hCg1,z,a의 벡터 지도는 도 14에 제시했다. pHybE-hCg1,z,a V1의 핵산 서열은 서열번호 13에 제시했고, pHybE-hCg1,z,a V2의 핵산 서열은 서열번호 14에 제시했다. pHybE-D2-hCg1,z,a의 벡터 지도는 도 12에 제시했다. 전술한 pHybE-hCg1,z,a의 인자들 외에도, pHybE-D2-hCg1,z,a는 아달리무마브의 중쇄 가변 영역의 암호화 서열("D2"라고도 불림)을 함유한다. pHybE-D2-hCg1,z,a의 핵산 서열은 서열번호 31에 제시했다.
pHybE - hCg1 ,z,non-a pHybE-hCg1,z,non-a는 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 1,z,non-a 중쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 함유한다. 따라서, 한 양태에 따르면 pHybE-hCg1,z,non-a 벡터는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 및 사람 감마 1,z,non-a 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-hCg1,z,non-a는 감마 1,z,non-a 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-hCg1,z,non-a V2의 벡터 지도는 도 15에 제시했다. pHybE-hCg1,z,non-a V1의 핵산 서열은 서열번호 15에 제시했고, pHybE-hCg1,z,non-a V2의 핵산 서열은 서열번호 16에 제시했다.
pHybE - hCg1 ,z, non -a, mut (234,235) pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235)는 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 1,z,non-a,mut(234,235) 중쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 함유한다. 따라서, 한 양태에 따르면 pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235) 벡터는 면역글로불린 가변 중쇄 영역 및 사람 감마 1,z,non-a,mut(234,235) 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235)는 감마 1,z,non-a,mut(234,235) 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235) V2의 벡터 지도는 도 16에 제시했다. pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235) V1의 핵산 서열은 서열번호 17에 제시했고, pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,235) V2의 핵산 서열은 서열번호 18에 제시했다.
pHybE - hCg1 ,z, non -a, mut (234,237) pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237)은 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 1,z,non-a,mut(234,237) 중쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 함유한다. 따라서, 한 양태에 따르면 pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237) 벡터는 면역글로불린 가변 중쇄 영역 및 사람 감마 1,z,non-a,mut(234,237) 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237)은 감마 1,z,non-a,mut(234,237) 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237) V2의 벡터 지도는 도 17에 제시했다. pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237) V1의 핵산 서열은 서열번호 19에 제시했고, pHybE-hCg1,z,non-a,mut(234,237) V2의 핵산 서열은 서열번호 20에 제시했다.
pHybE - hCg2 ,n- pHybE-hCg2,n-는 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 2,n- 중쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 함유한다. 따라서, 한 양태에 따르면 pHybE-hCg2,n- 벡터는 면역글로불린 가변 중쇄 영역 및 사람 감마 2,n- 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-hCg2,n-는 감마 2,n- 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-hCg2,n- V2의 벡터 지도는 도 19에 제시했다. pHybE-hCg2,n- V1의 핵산 서열은 서열번호 21에 제시했고, pHybE-hCg2,n- V2의 핵산 서열은 서열번호 22에 제시했다.
pHybE - hCg2 ,n+ pHybE-hCg2,n+는 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마 2,n+ 중쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 함유한다. 따라서, 한 양태에 따르면 pHybE-hCg2,n+ 벡터는 면역글로불린 가변 중쇄 영역 및 사람 감마 2,n+ 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-hCg2,n+는 감마 2,n+ 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-hCg2,n+의 벡터 지도는 도 18에 제시했다. pHybE-hCg2,n+ V1의 핵산 서열은 서열번호 23에 제시했고, pHybE-hCg2,n+ V2의 핵산 서열은 서열번호 24에 제시했다.
pHybE - hCg4 pHybE-hCg4는 pHybE 벡터를 기반으로 한다(이에 따라 pHybE에 대해 전술한 바와 같은 모든 인자를 함유한다). 이 벡터는 또한 감마4 중쇄 불변 영역에 대한 사람 면역글로불린 암호화 서열을 함유한다. 따라서, 한 양태에 따르면 pHybE-hCg4 벡터는 면역글로불린 가변 중쇄 영역 및 사람 감마4 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체 중쇄를 발현시키는데 사용될 수 있다. 대안적으로, pHybE-hCg4는 감마4 중쇄 불변 영역에 융합된 관심있는 유전자, 예컨대 Fc 융합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있다. pHybE-hCg4의 벡터 지도는 도 20에 제시했다. pHybE-hCg4 V1의 핵산 서열은 서열번호 25에 제시했고, pHybE-hCg4 V2의 핵산 서열은 서열번호 26에 제시했다.
본 발명의 벡터 서열은 서열번호 1 내지 32에 제시되어 있다. 한 양태에 따르면, 본 발명의 벡터는 서열번호 1 내지 32 중 어느 하나에 제시된 서열 또는 이 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
본 발명은 특정 세포 표적, 예컨대 전술한 임의의 단백질, 사람 EGF 수용체, her-2/neu 항원, CEA 항원, 전립선 특이적 막 항원(PSMA), CD5, CD11a, CD18, NGF, CD20, CD45, CD52, Ep-cam, 여타 암세포 표면 분자, TNF-알파, TGF-b1, VEGF, 다른 사이토킨, 알파 4 베타 7 인테그린, IgE, 바이러스 단백질(예컨대, 사이토메갈로바이러스)을 면역특이적으로 인식하는 사람 및/또는 사람화된 항체의 생산에 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 이용하여 생산할 수 있는 항체의 예로는 항-TNFα 항체, 항-IL-12 항체, 항-IL-18 항체 및 항-EPO 수용체(EPO-R) 항체가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다. 한 양태에서, 항-TNFα 항체는 완전 사람 항-TNFα 항체, 예컨대 아달리무마브/D2E7(참고인용된 미국 특허 6,090,382 참조; Humira®; Abbott Laboratories)이다. 한 양태에서, 항-IL-12 항체는 완전 사람, 항-IL-12 항체, 예컨대 ABT-874(Abbott Laboratories; 참고인용된 미국 특허 6,914,128 참조). 한 양태에서, 항-IL-18 항체는 완전 사람 IL-18 항체(예, ABT-325)로, 예컨대 참고인용된 US20050147610 A1에 기술된 항체를 참고한다. 한 양태에 따르면, 항-EPO/R(ABT-007이라고도 불림) 항체는 참고인용된 미국 특허 공개번호 US20060018902 A1에 기술된 것과 같은 완전 사람 항체이다.
또한, 벡터에서 암호화된 불변 영역은 불변 영역, 예컨대 Fc 도메인을 단백질에 작동가능하게 연결하여 융합 단백질, 예컨대 Fc 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있는 단백질 종류의 다른 예로는 융합 단백질이 포함된다. 이러한 융합 단백질의 예로는 면역글로불린 분자의 일부와 융합체로 발현되는 단백질, 지퍼 모이어티(moiety)와 융합 단백질로 발현되는 단백질, 및 사이토킨과 성장인자의 융합 단백질(즉, GM-CSF 및 IL-3, MGF 및 IL-3)과 같은 신규 다작용성 단백질이 포함된다. WO 93/08207 및 WO 96/40918은 CD40L이라 불리는 분자의 다양한 용해성 올리고머 형태, 예컨대 각각 면역글로불린 융합 단백질 및 지퍼 융합 단백질의 제조에 대해 설명하고 있다; 여기에 논의된 기술은 다른 단백질에도 적용될 수 있다. 다른 융합 단백질은 엔타너셉트(entanercept)로도 알려진 재조합 TNFR:Fc이다. 엔타너셉트(또는 Enbrel®; Amgen/Wyeth)는 p75 TNF 알파 수용체의 세포외 부위 2분자의 이량체로, 각 분자는 사람 IgG1의 232 아미노산 Fc 부위에 융합된 235 아미노산 TNFR-유래의 폴리펩타이드로 이루어진다. 실제, 모든 분자는 세포 수용체 분자의 세포외 도메인, 효소, 호르몬, 사이토킨, 면역글로불린 분자의 일부, 지퍼 도메인 및 에피토프를 포함하되, 이에 국한되지 않는 융합 단백질로 발현될 수 있다.
또한, 핵산 및 아미노산 "서열 동일성"을 측정하는 기술은 당업계에 알려져 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 유전자의 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 측정하고/하거나 이에 의해 암호화된 아미노산 서열을 측정하는 단계, 및 이 서열들을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 단계를 포함한다. 일반적으로, "동일성"은 두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 대응성을 의미한다. 2 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 이의 "동일성%"를 측정하여 비교할 수 있다. 핵산이든 아미노산 서열이든 간에 두 서열의 동일성%는 정렬된 두 서열 간에 정확한 일치(match) 수를 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 값이다. 핵산 서열의 대략적인 정렬은 스미스와 워터만(Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489(1981))의 국소 상동성 알고리듬에 의해 제공된다. 이 알고리듬은 데이호프[Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA]에 의해 개발되고 그립스코프[Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 표준화된 스코어링 행렬을 이용하여 아미노산 서열에 적용할 수 있다. 서열의 동일성%를 측정하기 위한 상기 알고리듬의 예시적 실행은 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, Madison, Wis.)에 의해 "BestFit" 유틸리티 어플리케이션으로 제공된다. 이 방법의 디폴트 파라미터는 매뉴얼[Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (Genetics Computer Group(Madison, Wis.)에서 입수용이함)]에 기술되어 있다. 본 발명의 정황에서 동일성%를 확인하기에 바람직한 방법은 University of Edinburgh가 저작권을 갖고 있고, John F. Collins와 Shane S. Sturrok이 개발했고, IntelliGenetics, Inc.(Mountain View, Calif.) 사에서 배급하는 프로그램의 MPSRCH 패키지를 이용하는 것이다. 이러한 한 조의 패키지로부터 채점표에 디폴트 파라미터가 사용되는 경우에는 Smith-Waternan 알고리듬을 이용할 수 있다(예컨대, 갭 오픈 패널티 = 12, 갭 연장 패널티 = 1 및 갭 = 6). 수득된 데이터로부터 "일치" 값은 "서열 동일성"을 반영한다. 서열 간에 동일성 또는 유사성 %를 계산하기에 적합한 다른 프로그램은 일반적으로 당업계에 알려져 있다.
두 핵산 단편은 본 명세서에 기술된 바와 같이 "선택적으로 하이브리드화"하는 것으로 생각된다. 두 핵산 분자 간에 서열 동일성의 정도는 두 분자 간에 하이브리드화 사건의 효율과 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 완전 동일한 서열이 표적 분자에 하이브리드하는 것을 적어도 부분적으로 저해할 것이다. 완전 동일한 서열의 하이브리드화 저해는 당업계에 공지된 하이브리드화 분석을 이용하여 평가할 수 있다(예컨대, 서던 블롯, 노던 블롯, 용액 하이브리드화 등, 예컨대 Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York; 또는 Ausubel et al.(Eds.), Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York(1997)). 이러한 분석법은 변동성 선택도를 이용하여, 예컨대 낮은 엄중도 내지 높은 엄중도의 변동성 조건을 이용하여 수행할 수 있다. 낮은 엄중도 조건이 이용되면, 비특이적 결합의 부재는 부분적인 서열 동일성 정도가 부족한 2차 프로브(예컨대, 표적 분자와 서열 동일성이 약 30% 이하인 프로브)를 이용하여 평가할 수 있고, 이로써 비특이적 결합 사건의 부재 시에는 2차 프로브는 표적에 하이브리드화하지 않을 것이다.
하이브리드화 기반의 검출 시스템을 이용할 때, 핵산 프로브는 표적 핵산 서열에 상보적인 것으로 선택하고, 그 다음 적당한 조건을 선택하여 프로브와 표적 서열을 서로 "선택적으로 하이브리드화" 또는 결합시켜 하이브리드 분자를 형성시킨다. "중간 엄중도" 하에 표적 서열에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자는 일반적으로 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 약 70% 서열 동일성이 있는 적어도 약 10 내지 14 뉴클레오타이드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 허용하는 조건 하에 하이브리드화한다. 엄중한 하이브리드화 조건은 일반적으로 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90 내지 95% 이상의 서열 동일성이 있는 적어도 약 10 내지 14 뉴클레오타이드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 허용한다. 프로브와 표적이 특정한 서열 동일성 정도는 보유하는 프로브/표적 하이브리드화에 유용한 하이브리드화 조건은 당업계에 공지된 바와 같이 측정할 수 있다(예컨대, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J.Higgins,(1985) Oxford; Washington, D.C.: IRL Press).
하이브리드화의 엄중도 조건과 관련하여, 특정 엄중도를 정하기 위해, 예컨대 다음과 같은 요인들을 변동시켜 다수의 동등한 조건을 이용할 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다: 프로브와 표적 서열의 길이 및 성질, 다양한 서열의 염기 조성, 염 및 다른 하이브리드화 용액 성분의 농도, 하이브리드화 용액에 차단제 또는 세정제의 존재 또는 부재(예컨대, 포름아미드, 덱스트란 설페이트 및 폴리에틸렌 글리콜 및 소듐 도데실 설페이트), 하이드리드화 반응 온도 및 시간 매개변수, 뿐만 아니라 세척 조건의 변동. 하이브리드화 조건의 특정 세트의 선택은 당업계의 표준 방법에 따라 선택한다(예컨대, Sambrook et al., 상기 참조 또는 Ausubel et al., 상기 참조). 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드의 일정 영역, 이의 cDNA, 이의 상보체와 동일하거나 거의 동일한 염기쌍 서열을 갖고 있다면, 또는 전술한 바와 같은 서열 동일성을 나타낸다면 제2 폴리뉴클레오타이드"에서 유래되는" 것이다.
또한, 본 발명은 바이알과 같은 적당한 용기에 본 발명의 하나 이상의 벡터를 함유하는 키트를 제공한다. 발현 벡터는 관심있는 선택된 서열을 삽입하기 위한 적어도 하나의 클로닝 부위를 함유할 수 있고, 또는 벡터에 이미 존재하는 관심있는 특정 유전자를 보유할 수 있다. 벡터는 탈수 형태 또는 동결건조 형태로 또는 수용액 형태로 제공될 수 있다. 키트는 탈수된 폴리뉴클레오타이드를 복원시키기 위한 완충액을 포함할 수 있다. 다른 시약, 예컨대 반응 완충액, 비교를 위한 양성 및 음성 대조 벡터도 키트에 포함될 수 있다. 일반적으로, 키트는 시약의 사용 지침서를 포함할 수도 있다.
III . 본 발명의 벡터의 용도
본 발명은 본 명세서에 기술된 벡터를 이용하여 단백질을 발현하는 방법을 포함한다. 즉, 본 발명은 본 발명의 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입시키는 단계, 이 포유동물 숙주 세포를 단백질을 발현하기에 적합한 조건 하에 배양하는 단계, 및 단백질을 회수하는 단계를 포함하여 재조합 단백질을 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명의 벡터의 장점은 포유동물 세포 배양 시스템을 이용하여 높은 단백질 생산을 제공하는 점이다.
본 발명의 핵산 또는 발현 벡터를 통해 유전자 발현할 수 있는 모든 세포 종류는 숙주 세포로서 본 발명에 이용될 수 있다. "숙주 세포"란 용어는 재조합 DNA 기술을 이용해 작제한 벡터로 형질전환된 세포를 의미한다.
당업자는 본 발명의 벡터를 통해 GOI 및 선택 마커 유전자를 발현하기에 가장 적합한 특정 숙주 세포를 선택할 수 있다. 본 발명에 이용될 수 잇는 세포로는 포유동물 세포 및 세포주와 이로부터 유래된 세포 배양물을 포함한다. 포유동물 세포, 예컨대 생식세포 또는 체세포는 마우스, 래트 또는 다른 설치류와 같은 포유동물, 또는 사람이나 원숭이 같은 영장류에서 유래될 수 있다. 원시 세포 배양물 또는 무한증식화된 세포는 본 발명의 기술을 수행하는데 이용될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
특정 양태에서, 세포 종류는 포유동물 기원인 것, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO)(예, DG44 및 DUXB11; Urlaub et al., Som. Cell Molec. Genet. 12:555, 1986; Haynes et al., Nuc. Acid. Res. 11:687-706, 1983; Lau et al., Mol. Cell. Biol. 4:1469-1475, 1984; Methods in Enzymology, 1991, vol. 185, pp537-566. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.), 중국 햄스터 섬유아세포(예, R1610), 사람 자궁경부암(예, HELA), 원숭이 신장 세포주(예, CVI 및 COS), 쥐 섬유아세포(예, BALBc/3T3), 쥐 골수종(P3.times.63-Ag3.653; NS0; SP2/O), 햄스터 신장 세포주(예, HAK), 쥐 L 세포(예, L-929), 사람 림프구(예, RAJI), 사람 신장(예, 293 및 293T)을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다. 숙주 세포주는 일반적으로 시판되거나(예, BD Biosciences, Lexington, Ky.; Promega, Madison, Wis.; Life Technologies, Gaithersburg, Md.) 또는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(ATCC, Manassas, Va.)에서 입수할 수 있다.
바람직한 양태에 따르면, 본 발명에 사용된 숙주 세포는 본 발명의 벡터에 포함된 적어도 하나의 복제 오리진에 대응하는 복제 개시 인자를 트랜스로(in trans) 제공한다. 예를 들어, 벡터가 SV40 오리진 및 OriP 오리진에 대응하는 2개의 복제 오리진을 포함한다면, 큰 T- 항원 또는 EBNA 단백질을 발현하는 모든 세포주, 바람직하게는 포유동물 세포가 사용될 수 있다. 한 양태에서, 벡터는 COS 세포 또는 사람 태아 신장(HEK) 세포에 형질전환된다. 예를 들어, COS7 세포는 SV40의 오리진-결손 돌연변이체(Sigma-Aldrich)에 의해 형질전환된 CV-1 시미안 세포로부터 유래된다. EBNA는 HEK-293-6E 세포 등을 이용하여 제공할 수 있다.
복제 개시 인자가 게놈 내에 안정하게 통합된 세포주는 복제 개시 인자를 안정하게 장기 발현시키고, 복제를 지속적으로 지지하며 복제 오리진을 함유하는 플라스미드를 유지시키는 장점이 있다. EBNA-1을 발현하는 시판 세포주의 예는 ATCC: 293HEK-EBNA1 및 CV1-EBNA1이다. 적어도 하나의 복제 개시 인자, 바람직하게는 EBNA1 단백질 또는 SV40 큰 T-항원을 과잉발현하는 특정 세포주는 안정한 세포 클론을 형질감염 및 선택하여 수득할 수 있다.
핵산 및 발현 벡터는 당업계에 공지된 다양한 기술로 적당한 숙주 세포에 도입시키거나 형질전환될 수 있다(예컨대, Ridgway, 1973, Vectors: Mammalian Expression Vectors, Chapter 24.2, pp. 470-472, Rodriguez and Denhardt eds., Butterworths, Boston, Mass.; Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; 및 Chu et al., 1981, Gene 13:197). "형질전환" 및 "형질감염, 및 이의 문법적 변형어는 본 명세서에서 호환되고, 세포가 실행가능한 임의의 수단으로 이종 DNA를 흡수하는 것을 의미한다. 외인성 핵산이 세포막 내에 도입되었을 때, 세포는 "형질전환"된 것이다. 핵산의 흡수는 이 흡수를 실행하는 수단, 예컨대 형질감염(전기천공 포함), 원형질 융합, 인산칼슘 침전, 엔벨로프형 DNA와의 세포 융합, 미량주사 및 순수 바이러스에 의한 감염 등에 상관없이 안정한 형질감염체를 산출한다. 정상 수준보다 높은 수준에서의 일시적인 발현도 기능 연구 또는 관심있는 단백질의 생산 및 회수에 유용하다. 형질전환된 세포는 관심있는 단백질(예, 한 양태에 따르면 항체 중쇄 및/또는 경쇄)의 생산에 적당한 조건 하에서 증식시키고, 암호화된 관심있는 폴리펩타이드를 동정하는 분석을 수행한다. 유전자 산물을 동정하고 정량분석하기 위한 분석 기술의 예로는 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA) 또는 형광 활성 세포분류기 분석(FACS), 면역조직화학 등을 포함한다.
본 발명에 사용된 세포는 표준 세포 배양 기술에 따라 배양할 수 있고, 예컨대 고체 표면에 고정시키거나 또는 적당한 영양 배지에서 현탁 증식시킬 수 있다.
또한, 본 발명에는 본 명세서에 기술된 벡터를 포함하는 포유동물 숙주 세포도 포함된다.
본 발명은 실행에는 별다른 언급이 없는 한 당업계의 기술에 속하는 통상의 분자생물학 기술 등이 이용될 것이다. 이러한 기술은 다음 문헌들에 충분히 설명되어 있다. 예컨대, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. Ausubel et al., eds., 1987 updated); Essential Molecular Biology (T. Brown ed., IRL Press 1991); Gene Expression Technology (Goeddel ed., Academic Press 1991); Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes (A. Bothwell et al. eds., Bartlett Publ. 1990); Gene Transfer and Expression (M. Kriegler, Stockton Press 1990); Recombinant DNA Methodology (R. Wu et al. eds., Academic Press 1989); PCR: A Practical Approach (M. McPherson et al., IRL Press at Oxford University Press 1991); Oligonucleotide Synthesis (M. Gait ed., 1984); Cell Culture for Biochemists (R. Adams ed., Elsevier Science Publishers 1990); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. Miller & M. Calos eds., 1987); Mammalian Cell Biotechnology (M. Butler ed., 1991); Animal Cell Culture (J. Pollard et al. eds., Humana Press 1990); Culture of Animal Cells, 2.sup.nd Ed. (R. Freshney et al. eds., Alan R. Liss 1987); Flow Cytometry and Sorting (M. Melamed et al. eds., Wiley-Liss 1990); the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); and Animal Cell Culture (R. Freshney ed., IRL Press 1987); 및 Wirth M. and Hauser H. (1993) Genetic Engineering of Animal Cells, In: Biotechnology Vol. 2 Puhler A (ed.) VCH, Weinhcim 663-744 참조.
실시예
이하 실시예는 다른 포유동물 숙주 세포, 예컨대 COS7 및 HEK-293-6E 세포를 위해 별도의 벡터를 작제할 필요를 없애기 위한 혁신적 해법을 예증한다. 또한, 이하 실시예는 항체의 전체 경쇄 또는 중쇄의 발현 또는 Fc 융합 단백질의 발현에 사용되는, 항체의 불변 영역을 암호화하는 핵산을 함유하는 벡터도 제공한다.
pHyb-C 및 pHyb-E라는 2가지 새 벡터 골격은 다양한 다른 벡터, 즉 pBOS 및 pTT3 벡터로부터 선택한 특징을 조합시켜 작제했다(예컨대, US 임시출원번호 60/878,165, "DUAL-SPECIFIC IL-1A/IL-1b ANTIBODIES"라는 표제하에 2007년 12월 28일에 출원된 국제출원번호 PCT/US2007/26482, 및 USSN 12/006,068 참조, 모두 본 발명에 참고인용됨). 대조용 벡터 pBOS는 관심있는 유전자의 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 EF-1a 프로모터를 함유하고 SV40 복제 오리진을 운반한다. 대조용 벡터 pTT3은 관심있는 유전자의 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 CMV 프로모터 및 EBNA 복제 오리진(OriP)을 함유한다.
본 발명은 벡터는 COS7 및 HEK-293-6E 세포 모두에서 마우스 BR3-Fc 융합체 및 사람 항체(아달리무마브) 모두의 단백질 발현을 평가하여 시험했다. COS7 및 HEK-293-6E 세포에서 성공적인 단백질 발현은 두 세포 종류 모두에서 재조합체 발현을 위한 단일화된 벡터 시스템을 입증한다.
실시예 1: 벡터 pHybC 및 pHybE 의 작제
도 1 및 2는 2개의 복제 오리진을 각각 함유하는 새 벡터의 지도를 제공한다. 도 1 및 2는 "공(empty)" 벡터 버전을 나타내며, 즉 관심있는 유전자의 핵산이나 항체 불변 영역을 함유하지 않는다(이하 실시예 4에 더 상세하게 설명됨). pHybC는 관심있는 유전자의 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 CMV 프로모터를 함유하는 반면, pHybE는 EF-1a 프로모터를 함유한다.
pHybC-mBR3-Fc 작제를 위해("mBR3"은 제3 BLyS 수용체의 쥐 버전을 의미하고; 본 명세서에 사용된 것처럼 구체적으로 mBR3 단백질의 세포외 도메인(ECD) 부의 암호화 서열을 의미한다), pEF-BOS 벡터 유래의 SV40 복제 오리진 영역을 프라이머로 PCR 증폭시켜 증폭된 DNA 단편의 5' 및 3' 말단 모두에 PspXI 제한효소 부위를 도입시켰다. 이 삽입 단편은 그 다음 PspXI로 분해했다. CMV 프로모터의 상류에 Sal I 제한효소 부위를 보유하는 pTT3-mBR3-Fc 작제물은 Sal I로 분해했다. 그 다음, PspX I-분해된 삽입 단편을 pTT3-mBR3-Fc의 SalI 부위에 연결시켜 pHybC-mBR3-Fc 벡터를 생성했다.
pHybE-mBR3-Fc 작제물은 먼저 mBR3 세포외 도메인을 통해 SV40 복제 오리진 영역을 함유하는 5'-말단 PspXI 변형된 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭시켜 생성했다. 이 산물은 그 다음 mBR3 세포외 도메인 서열의 상류 리더 서열에 부위가 있는 Bsp68 I로 3' 및 PspXI로 5'를 분해했다. 이와 같이 분해된 단편을 이어서 SalI 및 Bsp68 I-분해된 pTT3-mBR3-Fc 작제물에 서브클로닝하여 pHybE-mBR3-Fc 작제물을 생산했다.
수용체-Fc 융합 단백질 mBR3-Fc를 각각 발현하는 pHybC-mBR3-Fc 및 pHybE-mBR3-Fc의 지도는 도 8과 9에서 찾아볼 수 있다.
D2E7 항체(아달리무마브)의 경쇄 단백질을 발현하는 pHybC-E7 벡터는 pHybC-mBR3-Fc처럼 유사하게 작제했으며, 즉 pHybC-mBR3-Fc(전술함)의 생성 동안 분리 및 분해된 동일한 PspXI 분해된 SV40 Ori 영역을 SalI로 사전분해된 종래 작제된 pTT3-E7 벡터에 연결시켜 작제했다.
pHybE-E7 벡터 작제를 위해, 삽입 단편은 기존의 pBOS-E7 벡터를 HindIII 및 BsiWI 제한효소로 분해하여 수득했다. 이 삽입 단편을 그 다음 동일 효소로 사전분해한 pHybC-E7 벡터에 연결시켜, D2E7 경쇄 단백질의 발현을 위한 pHybE-E7 벡터를 수득했다.
pHybC-D2 및 pHybE-D2 벡터 작제를 위해, D2E7 항체(아달리무마브)(즉, D2 중쇄 암호화 서열)의 중쇄 가변 및 불변 암호화 영역으로 이루어진 삽입 단편은 기존의 pTT3-D2 벡터를 Bsp68 I 및 Not I 제한효소로 분해하여 수득했다. 이 삽입 단편은 동일 효소로 사전분해한 pHybC-mBR3-Fc 및 pHybE-mBR3-Fc 벡터에 연결시켜, D2E7 항체(아달리무마브)의 중쇄 단백질의 발현을 위한 pHybC-D2 및 pHybE-D2를 각각 수득했다.
실시예 2: 단백질 수율의 비교
2개의 복제 오리진의 부가로 인한 벡터 크기의 증가가 벡터에 의한 단백질 생산에 영향을 미치는지를 측정하기 위해, 전술한 pHyb-E 및 pHyb-C 벡터를 대조용 벡터, 즉 각각 하나의 복제 오리진만을 함유하는 pBOS 및 pTT3과 비교했다. pBOS, pTT3, pHyb-C 및 pHyb-E로부터의 발현을 비교하기 위해, 이 4개의 벡터 골격에 마우스 BAFF 수용체-사람 Fc 융합 단백질 작제물(mBR3-Fc)을 서브클로닝하고 endo-free DNA prep 키트로 동시에 제조했다.
mBR3-Fc 서열을 함유하는 4개의 벡터를 COS 세포에 전기천공하거나 또는 HEK-293-6E 세포에 형질감염시켰다(프로토콜은 이하에 설명됨). 이 세포들을 5일 또는 7일 동안 항온배양했다. 배지 시료를 취해 배지 중의 mBR3-Fc 분비 단백질의 농도를 측정했다. 역가는 IgG ELISA로 측정하고 IgG 단백질 표준물과 COS7 세포의 경우에는 5일 후, HEK-293-6E 세포의 경우에는 7일 후에 조정 배지로부터의 mBR3-Fc 단백질 간의 분자량의 차이로 조정했다. 역가 조정은 ELISA에서 표준물로 훨씬 큰 사람 IgG 단백질을 사용함으로 인한 mBR3-Fc 단백질 역가의 과대평가를 방지하는데 필요하다.
293 형질감염
본 실험에 사용된 293 일시 형질감염 절차는 문헌[Durocher et al. (2002); Nucleic Acids Research 30(2):E9 및 Pham et al. (2005); Biotechnology Bioengineering 90(3):332-44]에 공개된 방법의 변법이었다. 이 형질감염에 사용된 시약은 다음을 포함한다:
·HEK 293-6E 세포(EBNA1을 안정하게 발현하는 사람 태아 신장 세포주; National Research Council Canada에서 입수)는 일회용 에를렌마이어 플라스크에 주입하여 130rpm, 37℃ 및 5% CO2로 설정된 가습 항온배양기에서 배양했다.
·배양 배지: FreeStyle 293 발현 배지(Invitrogen 12338-018) + 25㎍/ml 제네티신(G418) (Invitrogen 10131-027) 및 0.1% Pluronic F-68(Invitrogen 24040-032).
·형질감염 배지: FreeStyle 293 발현 배지 + 10mM HEPES(Invitrogen 15630-080).
·폴리에틸렌이민(PEI) 스톡: 1mg/ml 멸균 스톡 용액, pH 7.0, 선형 25kDa PEI(Polysciences)로 제조하고 -15℃ 미만에서 보관함.
·트립톤 피드 배지: FreeStype 293 발현 배지에 트립톤 N1(Organotechnie, 19554)의 5% w/v 멸균 스톡.
형질감염용 세포 제조물: 형질감염 전 약 2 내지 4시간 전에, HEK293-6E 세포를 원심분리로 수거하여 1ml당 약 1x106 생육 세포의 세포 밀도로 배양 배지에 재현탁시켰다. 각 형질감염을 위해, 세포 현탁액 40ml를 일회용 250ml 에를렌마이어 플라스크로 전달하여 2 내지 4시간 동안 항온배양했다.
형질감염: 형질감염 배지 및 PEI 스톡은 실온(RT)으로 예비가온시켰다. 각 형질감염을 위해, 플라스미드 DNA 25㎍ 및 폴리에틸렌이민(PEI) 50㎍을 형질감염 배지 5ml에 넣어 배합하고 DNA:PEI 복합체가 형성되도록 RT에서 15 내지 20분 동안 항온처리했다. BR3-Ig 형질감염을 위해, 형질감염당 BR3-Ig 플라스미드 25㎍을 사용했다. 각 5ml의 DNA:PEI 복합체 혼합물을 사전 제조한 40ml 배양물에 첨가하고 다시 130rpm, 37℃ 및 5% CO2 로 설정된 가습 항온배양기로 복귀시켰다. 20 내지 28시간 후, 트립톤 피드 배지 5ml를 각 형질감염에 첨가하고 배양은 6일 동안 지속했다.
COS7 세포 형질감염
작제물당 2개의 COS7 150mm 평판을 디음과 같은 표준 전기천공 조건 하에 형질감염시켰다. COS7 형질감염 실험을 위해, COS 세포를 DMEM + 10% FBS + 1X 글루타민에서 배양했다. 한 융합성 T-150 플라스크 유래의 세포를 전기천공에 사용했다. 이 세포를 트립신처리하고, 배지+혈청에서 스핀다운시켜 혈청을 불활성화시켰다. 그 다음, 세포를 1X PBS로 세척했다.
각 T-150마다, 펠릿은 0.8ml 전기천공 완충액에 재현탁시켰다. COS 전기천공 완충액은 20mM Hepes(또는 P3 완충액), 137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM Na2HPO4 및 6mM 덱스트로스를 포함했다. 전기천공 완충액은 pH를 7.0으로 조정하고 여과 멸균했다. 각 전기천공에 DNA 60㎍(각 중쇄 및 경쇄 플라스미드 DNA 30㎍ 또는 Fc 융합 단백질인 경우에 DNA 60㎍)을 이용했다. 각 큐벳(cuvette)(0.4cm 큐벳-Biorad)에 세포/완충액/DNA 0.8ml를 혼합했다. 또한, 한 큐벳에는 블랭크로 사용하기 위해 완충액만을 세팅했다. 큐벳은 얼음상에 놓았다. 세포를 250V, 950μF로 15 내지 25 밀리초 동안 전기천공시켰다. 그 다음, 큐벳을 다시 얼음에 넣었다. 2 큐벳의 내용물은 20ml 하이브리도마 SFM을 함유하는 하나의 50ml 원추형 튜브에 담았다. 덩어리를 깨기 위해 10ml 피펫을 사용했고, 각각 다른 20ml 배지를 함유하는 2개의 150ml 조직 배양 디쉬로 옮겨 담았다. 각 디쉬의 총 배지 부피는 30ml였다. 이 디쉬들은 37℃, 5% CO2 에서 3일 동안 배양했다.
COS 세포 조정 배지(상청액)를 50ml 원추형 튜브에 수집한 뒤 스핀다운시켰다. 스핀 후, 상청액은 2 미크론(㎛) 필터로 여과했다. ELISA 분석을 위해 샘플을 채취했다. 5일 후, 상청액을 수집하여 표준 IgG ELISA로 분석하여 각각의 단백질 수율을 측정했다.
벡터의 pBOS, pTT3, pHybC 및 pHybE 버전은 mBR3 및 아달리무마브(D2E7) 실험으로 각각 시험했다.
단백질 검사
배양 상청액 중의 mBR3-Fc 융합 단백질 농도는 형질감염후 5일(COS7 세포의 경우) 또는 7일(293-6E 세포의 경우) 후에 ELISA 및/또는 Poros A를 이용하여 검사했다.
결과
형질감염 실험과 대조군으로부터 수득되는 단백질 발현 수준을 나타내는 데이터는 도 3(COS 세포) 및 도 4(HEK-293 세포)에 제시했다. 도 3의 데이터는 pHybC 및 pHybE가 COS 세포에서 융합 단백질을 생산하는데 모두 효과적이었고, 두 벡터가 대조용 벡터 pTT3보다 높은 수준으로 발현되었음을 보여준다. 도 4에 제시된 데이터는 pHyb-E로 형질감염된 HEK 세포 유래의 발현 수준이 다른 3 벡터에 의해 관찰되는 발현 수준을 초과했고 pHyb-C 단백질 생산 수준은 대조군과 비슷했음을 보여준다. 따라서, pHyb-C 및 pHyb-E는 대조용 벡터 pTT3 및 pBOS보다 우수하지는 않지만 mBr3-Fc 융합 단백질을 발현할 수 있었다.
실시예 3: 두 DNA 작제물의 공동형질감염을 필요로 하는 단백질 수율의 비교
TNFα(아달리무마브)/D2E7에 대한 사람 IgG1/κ 모노클로날 항체는 4개의 벡터 골격에 서브클로닝하여 endo-free DNA prep 키트로 동시에 준비했다.
아달리무마브의 발현 서열을 함유하는 4개의 벡터는 COS 세포에 전기천공하고; HEK-293-6E 세포는 폴리(에틸렌이민)(PEI)을 이용하여 형질감염시켰다.
293 일시 형질감염 절차는 실시예 3에 기술한 것과 동일한 절차를 사용하되, 아달리무마브 형질감염 시에는 D2E7 중쇄("D2"로도 지칭함) 플라스미드 10㎍ 및 D2E7 경쇄("E7"로도 지칭함) 플라스미드 15㎍을 형질감염마다 사용했다.
COS7 형질감염 실험은 평판 형질감염당 각 중쇄 및 경쇄 벡터 30㎍을 사용하는 것을 제외하고는 전술한 바와 같이 수행했다.
배양 상청액 중의 아달리무마브 항체 농도는 ELISA 및/또는 Poros A를 이용하여 형질감염 후 7일째에 검사했다. 역가는 COS7 세포의 경우에는 5일 후에 HEK-293-6E 세포의 경우에는 7일 후에 조정 배지로부터 IgG ELISA로 측정했다.
대조군 및 실험군의 형질감염 유래의 단백질 발현 수준을 나타내는 데이터는 도 5(HEK-293 세포) 및 도 6(COS 세포)에 제시했다. 도 5의 데이터는 pHybC 및 pHybE 골격 벡터가 대조용 벡터 pBOS보다는 많고 대조용 벡터 pTT3보다는 비슷하거나(pHybC) 또는 훨씬 많은(pHybE) 양의 아달리무마브를 생산할 수 있다는 것을 보여준다(Durocher, Y. et al. Nucleic Acids Res. 30:E9(2002)). 이와 마찬가지로, 도 6의 데이터는 pHybC 및 pHybE 골격 벡터가 대조용 벡터 pTT3보다는 많고 대조용 벡터 pBOS와는 비슷한 수준의 단백질을 생산할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4: pHyb -E 항체 불변 영역 벡터의 작제
새로운 pHyb-E 벡터 골격을 이용하여 항체 생산에 사용할 수 있는 벡터의 작제를 용이하게 하기 위해, 12가지 다른 중쇄 및 경쇄 벡터의 패널을 제조했다(표 2와 3에 전체가 게재됨). 사람 및 마우스 IgG 발현을 허용하는 12가지 마스터 주형 pHybE 벡터를 작제했다.
도 14 내지 25에 기술된 벡터를 생성하기 위해, pHybE-스터퍼-hCg1,z,a(pJP167)로부터 6123bp srfI/NotI 단편을 분리하고, 시그널 펩타이드 암호화 영역, 람다 스터퍼 및 불변 영역 암호화 영역으로 이루어진 pBOS 벡터로부터의 SrfI/NotI 제한효소 단편과 연결시켰다. SrfI/NotI 제한효소 단편을 생성하기 위해, SrfI/NotI 제한효소 분해를 수행하여 시그널 펩타이드 암호화 영역, 람다 스터퍼 및 불변 영역 암호화 영역으로 이루어진 삽입 단편을 수득했다(불변 영역 서열의 경우, 표 1 참조). 이 단편은 pEF-BOS 플라스미드 DNA에 작제된 pBOS 마스터 주형에서 유래되었다(Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res . 18:5322 (1990); 본 발명에 참고 인용된 미국 임시출원번호 60/878165, "DUAL-SPECIFIC IL-1A/IL-1b ANTIBODIES"라는 표제 하에 2007년 12월 28일에 출원된 국제출원번호 PCT/US2007/026482, 및 USSN 12/006,068에도 기술되어 있음). pHybE-hCl 작제물용 삽입 단편은 먼저 이 벡터에 클로닝을 용이하게 하기 위해, 중첩 PCR로 변형시켜 J 영역의 3' 말단에 AfeI 제한효소 부위를 생성했다. 모든 삽입 단편은 SrfI 및 NotI으로 사전분해한 종래 서열 확인된 pHyBE 작제물에 연결시켜 다음과 같은 벡터를 수득했다.
새로운 불변 영역 함유 벡터는 그 다음 마우스 및 사람 항체 불변 영역에 대하여 서열 확인했다(서열번호 3 내지 32 참조).
표 2와 3에 기술된 벡터는 모두 가변 영역 서열에 의해 교환될 수 있는 약 1kb '스터퍼' 서열(λ 파지 DNA 유래)을 보유한다. 이 신규 마스터 벡터는 또한 SrfI 부위의 바로 상류에 새로운 Swa I 제한효소 부위를 함유한다. 이 신규 SwaI 부위는 항체 개방 판독 프레임을 pHyb-E로부터 클로닝 목적으로 Swa I 부위를 이용하는 다른 발현 벡터, 예컨대 CHO 발현 벡터로 전달하는데 유용하다. 대체 클로닝 부위의 유연성 외에, 상기 벡터는 기존의 pBOS, pTT3 및 CHO 벡터와 역 융화성이다.
도 7에서 볼 수 있듯이, COS7 세포에서의 예비 형질감염 데이터는 이 추가 SwaI 부위(v1 벡터)가 추가 SwaI 부위가 없는 작제물(v2 벡터)과 비교했을 때 아달리무마브의 발현 수준에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 보여주었다.
Figure pct00001
Figure pct00002
요약: 실시예 1 내지 4에 기술한 상기 실험들은 pHyb-C 벡터와 pHyb-E 벡터가 하나 이상의 세포주에서 기능성이면서, 종종 기본 pBOS 및 pTT3 벡터에서 관찰되는 발현 수준을 초과하는 광대한 단백질 발현을 제공한다는 것을 보여준다. 이와 같이 강화된 발현은 pHyb-E 벡터가 HEK-293-6E 세포에서 저수율의 mBR3-Fc 융합 단백질을 발현하는데 사용되었을 때 특히 현저했다. 이 데이터로 입증되는 것처럼, pHyb-C 및 pHyb-E 벡터는 종래 사용된 벡터보다 벡터 기술의 현저한 진보를 나타낸다.
표 3: 본 발명의 벡터의 개요
버전 1로 표시된 pHyb 벡터는 SrfI 제한효소 부위의 상류에 추가로 SwaI 부위를 보유한다.
버전 2로 표시된 pHyb 벡터는 추가 SwaI 부위를 보유하지 않는다.
Figure pct00003

등가물
당업자는 통상의 실험만으로 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 양태들에 대한 많은 등가물을 이해하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 이하 특허청구범위에 포함되는 것으로 간주한다.
참고문헌 인용
본 출원을 통해 인용되어 있는 모든 인용문헌의 내용(예컨대, 참고문헌, 특허, 특허출원 및 웹사이트 포함)은 참고문헌이 인용된 것처럼 어떠한 목적에서든지 전문이 분명하게 참고 인용되었다. 본 발명의 실시에는 특별한 언급이 없는 한, 당업계에 공지된 면역학, 분자생물학, 세포생물학 및 약물 제조 및 전달에 관한 통상의 기술이 이용될 것이다. 이러한 기술들은 다음 공개문헌에 설명된 기술을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
<110> Abbott Laboratories <120> Improved mammalian expression vectors and uses thereof <130> BBI-316PC <150> US 61/021,282 <151> 2008-01-15 <150> US 61/104,546 <151> 2008-10-10 <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 6381 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct: pHybC-empty <220> <221> misc_feature <222> (1143)..(1242) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag 60 cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc 120 caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg 180 gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca 240 tcaagtgtat catatgccaa gtccgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc 300 ctggcattat gcccagtaca tgaccttacg ggactttcct acttggcagt acatctacgt 360 attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata 420 gcggtttgac tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt 480 ttggcaccaa aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc 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Sequence <220> <223> Synthetic construct: pHybE-empty <220> <221> misc_feature <222> (1320)..(1391) <223> n is a, c, g, or t <400> 2 agctttgcaa agatggataa agttttaaac agagaggaat ctttgcagct aatggacctt 60 ctaggtcttg aaaggagtgg gaattggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc 120 gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag 180 gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg 240 tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt 300 tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg 360 ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc 420 cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc 480 gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg 540 gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg 600 acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca 660 cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac 720 atgttcggcg aggcggggcc 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gggggaggct tggtacagcc cggcaggtcc ctgagactct cctgtgcggc ctctggattc 1380 acctttgatg attatgccat gcactgggtc cggcaagctc cagggaaggg cctggaatgg 1440 gtctcagcta tcacttggaa tagtggtcac atagactatg cggactctgt ggagggccga 1500 ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac tccctgtatc tgcaaatgaa cagtctgaga 1560 gctgaggata cggccgtata ttactgtgcg aaagtctcgt accttagcac cgcgtcctcc 1620 cttgactatt ggggccaagg taccctggtc accgtctcga gtgcgtcgac caagggccca 1680 tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc 1740 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg 1800 accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct caggactcta ctccctcagc 1860 agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat 1920 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 1980 cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 2040 cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 2100 gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 2160 gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 2220 agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 2280 tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 2340 cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc 2400 agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 2460 aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 2520 ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 2580 tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 2640 tctccgggta aataagcggc cgctcgaggc cggcaaggcc ggatcccccg acctcgacct 2700 ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg ttggaatttt ttgtgtctct 2760 cactcggaag gacatatggg agggcaaatc atttggtcga gatccctcgg agatctctag 2820 ctagaggatc gatccccgcc ccggacgaac taaacctgac tacgacatct ctgccccttc 2880 ttcgcggggc agtgcatgta atcccttcag ttggttggta caacttgcca actgggccct 2940 gttccacatg tgacacgggg ggggaccaaa cacaaagggg ttctctgact gtagttgaca 3000 tccttataaa tggatgtgca catttgccaa cactgagtgg ctttcatcct ggagcagact 3060 ttgcagtctg tggactgcaa cacaacattg cctttatgtg taactcttgg ctgaagctct 3120 tacaccaatg ctgggggaca tgtacctccc aggggcccag gaagactacg ggaggctaca 3180 ccaacgtcaa tcagaggggc ctgtgtagct accgataagc ggaccctcaa gagggcatta 3240 gcaatagtgt ttataaggcc cccttgttaa ccctaaacgg gtagcatatg cttcccgggt 3300 agtagtatat actatccaga ctaaccctaa ttcaatagca tatgttaccc aacgggaagc 3360 atatgctatc gaattagggt tagtaaaagg gtcctaagga acagcgatat ctcccacccc 3420 atgagctgtc acggttttat ttacatgggg tcaggattcc acgagggtag tgaaccattt 3480 tagtcacaag ggcagtggct gaagatcaag gagcgggcag tgaactctcc tgaatcttcg 3540 cctgcttctt cattctcctt cgtttagcta atagaataac tgctgagttg tgaacagtaa 3600 ggtgtatgtg aggtgctcga aaacaaggtt tcaggtgacg cccccagaat aaaatttgga 3660 cggggggttc agtggtggca ttgtgctatg acaccaatat aaccctcaca aaccccttgg 3720 gcaataaata ctagtgtagg aatgaaacat tctgaatatc tttaacaata gaaatccatg 3780 gggtggggac aagccgtaaa gactggatgt ccatctcaca cgaatttatg gctatgggca 3840 acacataatc ctagtgcaat atgatactgg ggttattaag atgtgtccca ggcagggacc 3900 aagacaggtg aaccatgttg ttacactcta tttgtaacaa ggggaaagag agtggacgcc 3960 gacagcagcg gactccactg gttgtctcta acacccccga aaattaaacg gggctccacg 4020 ccaatggggc ccataaacaa agacaagtgg ccactctttt ttttgaaatt gtggagtggg 4080 ggcacgcgtc agcccccaca cgccgccctg cggttttgga ctgtaaaata agggtgtaat 4140 aacttggctg attgtaaccc cgctaaccac tgcggtcaaa ccacttgccc acaaaaccac 4200 taatggcacc ccggggaata cctgcataag taggtgggcg ggccaagata ggggcgcgat 4260 tgctgcgatc tggaggacaa attacacaca cttgcgcctg agcgccaagc acagggttgt 4320 tggtcctcat attcacgagg tcgctgagag cacggtgggc taatgttgcc atgggtagca 4380 tatactaccc aaatatctgg atagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatagg 4440 ctatcctaat ctatatctgg gtagcatatg ctatcctaat ctatatctgg gtagtatatg 4500 ctatcctaat ttatatctgg gtagcatagg ctatcctaat ctatatctgg gtagcatatg 4560 ctatcctaat ctatatctgg gtagtatatg ctatcctaat ctgtatccgg gtagcatatg 4620 ctatcctaat agagattagg gtagtatatg ctatcctaat ttatatctgg gtagcatata 4680 ctacccaaat atctggatag catatgctat cctaatctat atctgggtag catatgctat 4740 cctaatctat atctgggtag cataggctat cctaatctat atctgggtag catatgctat 4800 cctaatctat atctgggtag tatatgctat cctaatttat atctgggtag cataggctat 4860 cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag tatatgctat 4920 cctaatctgt atccgggtag catatgctat cctcatgata agctgtcaaa catgagaatt 4980 ttcttgaaga cgaaagggcc tcgtgatacg cctattttta taggttaatg tcatgataat 5040 aatggtttct tagacgtcag gtggcacttt tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg 5100 tttatttttc taaatacatt caaatatgta tccgctcatg agacaataac cctgataaat 5160 gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat 5220 tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt 5280 aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg agtgggttac atcgaactgg atctcaacag 5340 cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa 5400 agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg tgttgacgcc gggcaagagc aactcggtcg 5460 ccgcatacac tattctcaga atgacttggt tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct 5520 tacggatggc atgacagtaa gagaattatg cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac 5580 tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca 5640 caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat 5700 accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact 5760 attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc 5820 ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt ttattgctga 5880 taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg 5940 taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta tggatgaacg 6000 aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac tgtcagacca 6060 agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta 6120 ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca 6180 ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg 6240 cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt gtttgccgga 6300 tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc agataccaaa 6360 tactgttctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc 6420 tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg 6480 tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cgggctgaac 6540 ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct 6600 acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc 6660 ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg 6720 gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg 6780 ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct 6840 ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga 6900 taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg 6960 cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc 7020 gcgttggccg attcattaat gcagctggca cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag 7080 tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg ctttacactt 7140 tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa 7200 cagctatgac catgattacg ccaagctcta gctagaggtc gagtccctcc ccagcaggca 7260 gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc ctaactccgc 7320 ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 7380 tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag aagtagtgag 7440 gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctttg caaagatgga taaagtttta 7500 aacagagagg aatctttgca gctaatggac cttctaggtc ttgaaagg 7548 <210> 32 <211> 6845 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct: pHybE-E7-hCk <400> 32 agctttgcaa agatggataa agttttaaac agagaggaat ctttgcagct aatggacctt 60 ctaggtcttg aaaggagtgg gaattggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc 120 gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag 180 gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg 240 tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt 300 tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg 360 ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc 420 cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc 480 gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg 540 gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg 600 acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca 660 cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac 720 atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca 780 agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc 840 ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc 900 tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc 960 cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta 1020 ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg 1080 ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt 1140 taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc 1200 ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc 1260 gtgaggaatt ctctagagat ccctcgacct cgagatccat tgtgcccggg cgcaccatgg 1320 acatgcgcgt gcccgcccag ctgctgggcc tgctgctgct gtggttcccc ggctcgcgat 1380 gcgacatcca gatgacccag tctccatcct ccctgtctgc atctgtaggg gacagagtca 1440 ccatcacttg tcgggcaagt cagggcatca gaaattactt agcctggtat cagcaaaaac 1500 cagggaaagc ccctaagctc ctgatctatg ctgcatccac tttgcaatca ggggtcccat 1560 ctcggttcag tggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc agcctacagc 1620 ctgaagatgt tgcaacttat tactgtcaaa ggtataaccg tgcaccgtat acttttggcc 1680 aggggaccaa ggtggaaatc aaacgtacgg tggctgcacc atctgtcttc atcttcccgc 1740 catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct 1800 atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc 1860 aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga 1920 cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg 1980 gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttgagcg gccgctcgag 2040 gccggcaagg ccggatcccc cgacctcgac ctctggctaa taaaggaaat ttattttcat 2100 tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga aggacatatg ggagggcaaa 2160 tcatttggtc gagatccctc ggagatctct agctagagga tcgatccccg ccccggacga 2220 actaaacctg actacgacat ctctgcccct tcttcgcggg gcagtgcatg taatcccttc 2280 agttggttgg tacaacttgc caactgggcc ctgttccaca tgtgacacgg ggggggacca 2340 aacacaaagg ggttctctga ctgtagttga catccttata aatggatgtg cacatttgcc 2400 aacactgagt ggctttcatc ctggagcaga ctttgcagtc tgtggactgc aacacaacat 2460 tgcctttatg tgtaactctt ggctgaagct cttacaccaa tgctggggga catgtacctc 2520 ccaggggccc aggaagacta cgggaggcta caccaacgtc aatcagaggg gcctgtgtag 2580 ctaccgataa gcggaccctc aagagggcat tagcaatagt gtttataagg cccccttgtt 2640 aaccctaaac gggtagcata tgcttcccgg gtagtagtat atactatcca gactaaccct 2700 aattcaatag catatgttac ccaacgggaa gcatatgcta tcgaattagg gttagtaaaa 2760 gggtcctaag gaacagcgat atctcccacc ccatgagctg tcacggtttt atttacatgg 2820 ggtcaggatt ccacgagggt agtgaaccat tttagtcaca agggcagtgg ctgaagatca 2880 aggagcgggc agtgaactct cctgaatctt cgcctgcttc ttcattctcc ttcgtttagc 2940 taatagaata actgctgagt tgtgaacagt aaggtgtatg tgaggtgctc gaaaacaagg 3000 tttcaggtga cgcccccaga ataaaatttg gacggggggt tcagtggtgg cattgtgcta 3060 tgacaccaat ataaccctca caaacccctt gggcaataaa tactagtgta ggaatgaaac 3120 attctgaata tctttaacaa tagaaatcca tggggtgggg acaagccgta aagactggat 3180 gtccatctca cacgaattta tggctatggg caacacataa tcctagtgca atatgatact 3240 ggggttatta agatgtgtcc caggcaggga ccaagacagg tgaaccatgt tgttacactc 3300 tatttgtaac aaggggaaag agagtggacg ccgacagcag cggactccac tggttgtctc 3360 taacaccccc gaaaattaaa cggggctcca cgccaatggg gcccataaac aaagacaagt 3420 ggccactctt ttttttgaaa ttgtggagtg ggggcacgcg tcagccccca cacgccgccc 3480 tgcggttttg gactgtaaaa taagggtgta ataacttggc tgattgtaac cccgctaacc 3540 actgcggtca aaccacttgc ccacaaaacc actaatggca ccccggggaa tacctgcata 3600 agtaggtggg cgggccaaga taggggcgcg attgctgcga tctggaggac aaattacaca 3660 cacttgcgcc tgagcgccaa gcacagggtt gttggtcctc atattcacga ggtcgctgag 3720 agcacggtgg gctaatgttg ccatgggtag catatactac ccaaatatct ggatagcata 3780 tgctatccta atctatatct gggtagcata ggctatccta atctatatct gggtagcata 3840 tgctatccta atctatatct gggtagtata tgctatccta atttatatct gggtagcata 3900 ggctatccta atctatatct gggtagcata tgctatccta atctatatct gggtagtata 3960 tgctatccta atctgtatcc gggtagcata tgctatccta atagagatta gggtagtata 4020 tgctatccta atttatatct gggtagcata tactacccaa atatctggat agcatatgct 4080 atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt agcataggct 4140 atcctaatct atatctgggt agcatatgct atcctaatct atatctgggt agtatatgct 4200 atcctaattt atatctgggt agcataggct atcctaatct atatctgggt agcatatgct 4260 atcctaatct atatctgggt agtatatgct atcctaatct gtatccgggt agcatatgct 4320 atcctcatga taagctgtca aacatgagaa ttttcttgaa gacgaaaggg cctcgtgata 4380 cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt cttagacgtc aggtggcact 4440 tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg 4500 tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt 4560 atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 4620 gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 4680 cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 4740 gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 4800 cgtgttgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 4860 gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 4920 tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 4980 ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 5040 gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 5100 cctgcagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 5160 tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 5220 tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 5280 cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 5340 acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 5400 tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat 5460 ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg 5520 accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc 5580 aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa 5640 ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag 5700 gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta 5760 ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta 5820 ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag 5880 ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg 5940 gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg 6000 cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag 6060 cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc 6120 cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa 6180 aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg 6240 ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct 6300 gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa 6360 gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc cgattcatta atgcagctgg 6420 cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag 6480 ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga 6540 attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccaagctc 6600 tagctagagg tcgagtccct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 6660 gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 6720 cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 6780 ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 6840 caaaa 6845

Claims (45)

  1. (a) 엡스타인-바 바이러스(EBV) 유래의 OriP 복제 오리진;
    (b) SV40 복제 오리진;
    (c) 관심있는 유전자를 삽입하기 위한 삽입 부위; 및
    (d) 상기 삽입 부위에 작동가능하게 결합된, 항체 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산
    을 포함하는 발현 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 관심있는 유전자가 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역인 발현 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역이 쥐, 사람화된, 키메라 및 사람 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 발현 벡터.
  4. 제2항에 있어서, 항체 중쇄 가변 영역이 아달리무마브, ABT-325 및 ABT-874로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 항체의 중쇄 가변 영역인 발현 벡터.
  5. 제3항에 있어서, 항체 경쇄 가변 영역이 아달리무마브, ABT-325 및 ABT-874로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 항체의 경쇄 가변 영역인 발현 벡터.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역이 쥐 또는 사람 항체 중쇄 불변 영역인 발현 벡터.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역이 감마 1,z,a; 감마 1,z,non-a; 감마 2,n+; 감마 2,n-; 및 감마 4로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 발현 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 감마 1,z,non-a 항체 중쇄 불변 영역이 중쇄 불변 영역의 위치 234에 알라닌 돌연변이를 추가로 포함하는 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역의 위치 235 또는 237에 알라닌 돌연변이를 추가로 포함하는 발현 벡터.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 경쇄 불변 영역이 사람 카파 이소타입 또는 사람 람다 이소타입인 발현 벡터.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역이 쥐 감마 1 이소타입 또는 쥐 감마 2a 이소타입인 발현 벡터.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 경쇄 불변 영역이 쥐 카파 이소타입인 발현 벡터.
  13. 제1항에 있어서, 항체 중쇄 불변 영역이 Fc 도메인인 발현 벡터.
  14. 제2항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 영역이 삽입 부위에 대해 5'인 발현 벡터.
  15. 제1항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입 부위에 작동가능하게 결합된 프로모터를 추가로 포함하고, 상기 프로모터는 EF-1α 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터인 발현 벡터.
  16. 제1항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 선택 마커를 추가로 포함하는 발현 벡터.
  17. 제16항에 있어서, 선택 마커가 앰피실린 내성 유전자인 발현 벡터.
  18. 제15항에 있어서, CMV 프로모터가 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 608과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  19. 제15항에 있어서, CMV 프로모터가 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 608과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  20. 제15항에 있어서, CMV 프로모터가 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 608과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  21. 제15항에 있어서, CMV 프로모터가 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1 내지 608을 포함하는 발현 벡터.
  22. 제15항에 있어서, EF-1α 프로모터가 사람 EF-1α 프로모터인 발현 벡터.
  23. 제15항에 있어서, EF-1α 프로모터가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 76 내지 1267과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  24. 제15항에 있어서, EF-1α 프로모터가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 76 내지 1267과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  25. 제15항에 있어서, EF-1α 프로모터가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 76 내지 1267과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  26. 제15항에 있어서, EF-1α 프로모터가 서열번호 2의 뉴클레오타이드 76 내지 1267을 포함하는 발현 벡터.
  27. 제1항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, OriP 복제 오리진이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1795 내지 3545와 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  28. 제1항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, OriP 복제 오리진이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1795 내지 3545와 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  29. 제1항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, OriP 복제 오리진이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 1795 내지 3545와 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  30. 제1항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, SV40 복제 오리진이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 5834 내지 6140과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  31. 제1항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, SV40 복제 오리진이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 5834 내지 6140과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  32. 제1항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, SV40 복제 오리진이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 5834 내지 6140과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  33. 제1항 내지 제5항 및 제13항 중 어느 한 항에 있어서, SV40 복제 오리진이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 5834 내지 6140을 포함하는 발현 벡터.
  34. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 및 32로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열과 적어도 80% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  35. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 및 32로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열과 적어도 90% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  36. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 및 32로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열과 적어도 95% 동일한 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  37. 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 및 32로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터.
  38. 도 1, 2 및 14 내지 25 중 어느 하나에 도시된 발현 벡터.
  39. 제1항 내지 제5항, 제13항 및 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 시그널 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
  40. 제1항 내지 제5항, 제13항 및 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 키트.
  41. 제1항 내지 제5항, 제13항 및 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는 포유동물 숙주 세포.
  42. 제41항에 있어서, COS 세포 또는 사람 태아 신장(HEK) 세포인 포유동물 숙주 세포.
  43. 제42항에 있어서, COS7 세포인 포유동물 숙주 세포.
  44. 제42항에 있어서, HEK-293-6E 세포인 포유동물 숙주 세포.
  45. 재조합 단백질의 생산 방법으로서, 제1항 내지 제5항, 제13항 및 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포 내로 도입시키는 단계, 상기 포유동물 숙주 세포를 상기 단백질을 발현시키기에 적당한 조건 하에 배양하는 단계, 및 상기 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법.
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